專利名稱：非水介質(zhì)中穩(wěn)定的多肽連接酶及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領(lǐng)域，更具體地，涉及適用于非水介質(zhì)的新的多肽連接酶。
研究表明，枯草桿菌蛋白酶BPN′的活性中心Ser221被Cys取代后，就由水解酶變成多肽連接酶。在這些多肽連接酶中，Subtiligase是目前最好的變體酶，并且已應(yīng)用于RNase A酶及環(huán)肽的合成(JacksonJ.Am.Chem.Soc.1995，117，819-20及Science 1994，266，243-7；ChangProc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，12544-8)。Subtiligase這一突變體是BPN′經(jīng)Ser221Cys/Pro225Ala雙突變而得的用于水溶液中的多肽連接酶(AbrahmsenWO 94/18329；美國專利No.5,403,737；Biochemistry 1991，30，4151-9)。此外，在此(指Subtiligase)基礎(chǔ)上還得到了其他一些突變體，但都沒有提及這些突變體的穩(wěn)定性，尤其是在非水介質(zhì)中的穩(wěn)定性，得到了提高。
然而，除了在水中進行多肽合成之外，常常還需要在非水介質(zhì)(尤其是有機溶劑)中進行多肽合成。因此，本領(lǐng)域一直迫切需要能夠適用于非水介質(zhì)的多肽連接酶。
本發(fā)明的目的就是克服已有技術(shù)中的上述缺點，提供一種在非水介質(zhì)中穩(wěn)定性高的、具有多肽連接活性的酶，從而解決多肽連接酶在非水介質(zhì)中的穩(wěn)定性差的問題，并有利于提高化學(xué)修飾-酶連接工藝中底物的溶解性。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種多肽連接酶，它是枯草蛋白酶E的變體酶，其特征在于，它含有Ser221Cys、Met222Ala和Pro225Ala突變。較佳地，該多肽連接酶還含有選自下組的突變Asn118Ser，和Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼一種多肽連接酶，該連接酶是枯草蛋白酶E的變體酶，而且它含有Ser221Cys、Met222Ala和Pro225Ala突變。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種表達載體，它含有上述的編碼本發(fā)明多肽連接酶的DNA序列。此外，還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞被上述的表達載體所轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的新型多肽連接酶的方法，該方法包括步驟(a)將編碼該多肽連接酶的DNA序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成多肽連接酶表達載體；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)化入宿主細胞；(c)在適合表達該多肽連接酶的條件下進行培養(yǎng)，從而表達出該多肽連接酶；(d)分離純化出該多肽連接酶。
在另一方面，提供了本發(fā)明多肽連接酶的用途，它被用于非水介質(zhì)中的多肽連接反應(yīng)。
此外，本發(fā)明還提供了分離純化本發(fā)明多肽連接酶的新工藝，它包括將發(fā)酵上清用30％-60％硫酸銨沉淀，沉淀物用pH6.0-7.4的磷酸緩沖液溶解后經(jīng)DEAE-Dextran A-25柱和Acrylex P-150柱。
在所附的附圖中，

圖1是本發(fā)明的一種變體酶BHG在60℃，60％DMF中的穩(wěn)定性曲線圖；圖2是在不同濃度的DMF下，變體酶BHG活性曲線圖；圖3是在不同濃度的DMF下，本發(fā)明另一種變體酶BW活性曲線圖。
本發(fā)明是基于以下意外發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的將枯草(桿菌)蛋白酶E中第222位的甲硫氨酸(Met)突變?yōu)楸彼?Ala)之后，可顯著提高蛋白在非水介質(zhì)中的穩(wěn)定性。結(jié)合Ser221Cys和Pro225Ala(這兩個突變將枯草桿菌蛋白酶由水解酶變?yōu)槎嚯倪B接酶)，就形成了本發(fā)明的在非水介質(zhì)中穩(wěn)定性高且具有多肽連接活性的連接酶。
在本發(fā)明中，“枯草桿菌蛋白酶E”指來自枯草桿菌的蛋白酶E，它可以是天然的野生型的蛋白酶E，也可以是生物衍生或重組的蛋白酶E。天然的野生型的枯草桿菌蛋白酶E的氨基酸序列示于SEQ ID No.3中。
如本文所用，術(shù)語“非水介質(zhì)”指含有有機溶劑的介質(zhì)，該介質(zhì)可以是只含有一種有機溶劑，也可以是兩種或多種有機溶劑所組成的混合有機溶劑。此外可以是有機溶劑和水的構(gòu)成的混合溶劑。代表性是有機溶劑有乙腈、二甲亞砜、二甲基甲酰胺(DMF)等。較佳地，該非水介質(zhì)中含有DMF。
本發(fā)明的新的多肽連接酶可以這樣進行制備根據(jù)已公開的枯草桿菌蛋白酶E的序列來合成引物，通過PCR法從枯草桿菌中擴增出枯草桿菌蛋白酶E的編碼序列。然后，以枯草桿菌蛋白酶E的DNA序列，按本發(fā)明中指出的突變形式進行遺傳修飾，進行遺傳修飾的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，例如可參見“Mutagenesisa Practical Approach”，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，其中例如包括定點誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)誘變。在獲得了定點突變后的編碼本發(fā)明新多肽連接酶的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，在轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的多肽連接酶。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新多肽連接酶的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是原核細胞，更佳地是枯草桿菌。
本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，將118Ser，222Ala，60Asn，218Ser，103Arg等各種突變形式及其組合引入枯草桿菌蛋白酶E和221Cys/225Ala雙突變體中，并結(jié)合計算機研究突變蛋白在非水介質(zhì)環(huán)境下的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將枯草(桿菌)蛋白酶E中第222位的甲硫氨酸(Met)突變?yōu)楸彼?Ala)之后(如形成Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala三突變體)，可顯著提高蛋白在非水介質(zhì)中的穩(wěn)定性。此外，通過在其他位點上的進一步誘變，可產(chǎn)生在非水介質(zhì)中穩(wěn)定性更高和/或活性更高的多肽連接酶。
在本發(fā)明的一個實施例中，還對118位進行了突變，從而形成了Asn118Ser/Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala四突變體，該突變體酶(簡稱為變體酶)被命名為BHG。
在本發(fā)明的另一個實施例中，還對24、27和236位進行了突變，從而形成了Ser24His/Lys27Asp/Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala/Ser236Cys六突變體，該突變體酶(簡稱為變體酶)被命名為BW。
本發(fā)明的突變體多肽連接酶在能量上具有穩(wěn)定優(yōu)勢，因而不僅在水中，而且在非水介質(zhì)中也具有很高的穩(wěn)定性，非常適用于在含有機溶劑的體系中進行的多肽連接反應(yīng)(例如多肽合成反應(yīng))。
在本領(lǐng)域中，通常認為枯草桿菌蛋白酶E經(jīng)Ser221Cys突變后的變體酶在分泌表達時不能成熟(AbrahmsenBiochemistry 1991，30，4151-9)，因此在發(fā)酵過程中必須加入野生型的菌種共表達，以幫助變體酶的成熟。然而，這對純化工作極其不利，尤其是因為野生型酶與變體酶之間的性質(zhì)差異很小，所以難于分離；同時，野生型酶是一種蛋白酶，具有極強的水解活性，因此會水解變體酶，這對變體酶也不利。
然而，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新的多肽連接酶(例如Asn118Ser/Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala變體酶BHG)在表達、純化過程中可以自行成熟，無需野生型酶的幫助。因此，可以大大簡化分離純化程序，并大大提高純化效率和純度。在一個實施例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化后的宿主細胞在2YT中，37℃發(fā)酵30-36小時，發(fā)現(xiàn)成熟變體酶BHG約占總蛋白的36％。對發(fā)酵上清用30％-60％硫酸銨沉淀，沉淀物用pH6.2的磷酸緩沖液溶解后經(jīng)DEAE-Dextran A-25柱和Acrylex P-150柱，得到目的蛋白，純度可達電泳純(95％以上)。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1BHG和BW變體酶的質(zhì)粒構(gòu)建和表達將枯草蛋白酶E的基因(包括信號肽和導(dǎo)肽部分的基因，共1.9Kb)插入pAlter-I(購于Promega公司)的EcoR I/Pst I位點。在定點突變時，參照Promega公司突變說明書進行突變，其中，所用的誘變引物為Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala引物，5′-AAC GGA ACG TGCGCG GCGACT GCT CAC GTT GCC；
Asn118Ser引物，5′-ATTTCC AACTCT ATG GAT GTT；Ser236Cys引物，5′-GCG TTA ATT CTT TGCAAG CAC CCG；Ser24His/Lys27Asp引物，5′-CAC AG GCC ATA ACG TAGACG TAG CTGT；在上述引物序列中，斜黑體字表示突變位點，“Ser221Cys”表示將原氨基酸序列中第221位的Ser變?yōu)镃ys，其余突變位點用相同方式進行表示。
用EcoR I/Pst I切出突變后的1.9Kb片段，插入pBE-2穿梭質(zhì)粒中(郭興華生物工程學(xué)報1991，7(3)，224-9)，得到表達質(zhì)粒pBHG和pBW，它們在枯草桿菌DB104中分別表達變體酶BHG(Asn118Ser/Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala四突變體)和BW(Ser24His/Lys27Asp/Ser221Cys/Met222Ala/Pro225Ala/Ser236Cys)。
其中，表達變體酶BHG的枯草桿菌BHG(AprE)于1998年12月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC(中國，武漢)，保藏號為CCTCC M98022。
此外，變體酶BHG的DNA編碼序列和成熟后的氨基酸序列分別示于SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2中。
實施例2變體酶的分離純化對于工程菌BHG的2L發(fā)酵上清，用(NH4)2SO4沉淀(30％至60％飽和度)后，溶于15ml 10mM磷酸緩沖液(1mM CaCl2，1mM EDTA，pH6.5)，直接上DEAE-DextranA-25柱，用磷酸緩沖液(pH6.5)緩慢淋洗(20ml/hr.)，SDS-PAGE鑒定所需蛋白，超慮濃縮上AcrylexP-150柱，用磷酸緩沖液(pH6.5)緩慢淋洗，得到電泳純(95％)的變體酶BHG。
實施例3性能測定(a)動力學(xué)分析按AbrahmsenBiochemistry(1991)，30，4151-9中所述的方法，對酯解活性和酰氨鍵水解活性進行測定。測定變體酶BHG在DMF中的酯解活性時，體系中DMF分別占10％、20％、40％和60％。
(b)變體酶的穩(wěn)定性將變體酶置于60％DMF中，于60℃保溫，每1小時測樣品的剩余酯解活性。
此外，在同樣條件下測定Subtiligase的酯解活性及酰胺水解活性，作為對照。
測試數(shù)據(jù)列于表1和表2，結(jié)果表明變體酶的酰胺水解活性比Subtiligase高4.5倍，酯解活性高1.5倍，雖然變體酶的酯解活性與酰胺水解活性之比比Subtiligase低3倍，但在DMF-水的混合體系中，DMF對變體酶BHG活性影響不大，60％DMF體系中變體酶的活性僅下降約6倍(圖2)；而Subtiligase在DMF中很不穩(wěn)定，5％DMF體系中的活性下降約70倍。
圖1還表明，變體酶BHG在60℃，60％DMF中的半壽期長達17小時。以上說明該變體酶不但在DMF中有較好的穩(wěn)定性，而且也有較好的熱穩(wěn)定性。研究顯示，在BHG中118Ser的羥基氫和溶劑DMF的羰基形成氫鍵，在119Met主鏈上的羰基氧通過一分子水與溶劑DMF作用，27Lys的側(cè)鏈上的亞氨基的一個氫與溶劑DMF形成氫鍵，使主鏈趨于穩(wěn)定，彌補了從水相向有機相轉(zhuǎn)化所失去的氫鍵，因而在DMF中表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性。
圖3表明，BW在DMF中也具有較強的穩(wěn)定性，而且BW的活性隨溶劑濃度的升高而增加。
綜上所述。本發(fā)明的新的多肽連接酶，如變體酶BHG在由水溶液向非水體系轉(zhuǎn)化時，活性降低，但溶劑對活性的影響不大。在60％DMF、60℃條件下仍具有較高的穩(wěn)定性，因此是非水介質(zhì)中穩(wěn)定的多肽連接酶。這也是目前首次有關(guān)多肽連接酶在非水介質(zhì)中穩(wěn)定性的報道。
表1 BHG和BW在DMF中的酯解動力學(xué)常數(shù)
表2 BHG的水解酰胺和酯解的動力學(xué)常數(shù)
實施例4變體酶BHG在多肽連接反應(yīng)中的應(yīng)用在該實施例中，將變體酶BHG用于降鈣素的合成(24+8的片段偶聯(lián)合成降鈣素工藝)，具體過程如下12.7mg片段I(iNoc-CGNLSTCMLGTY)溶于500ul CH3CN，于0℃攪拌下滴加500ul乙酐，繼續(xù)攪拌1小時，冷凍干燥，加200ul DMF及600ul磷酸緩沖液(pH7.2)溶解，加入3.2mg片段II(TQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-amide)及40ul變體酶BHG(50uM)，室溫攪拌3小時。質(zhì)譜分析結(jié)果表明產(chǎn)物的分子量(3526)與理論值(3525.33)一致?？梢姡珺HG具有多肽連接活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人中國科學(xué)院上海生物工程研究中心(ii)發(fā)明名稱非水介質(zhì)中穩(wěn)定的多肽連接酶及制法和用途(iii)序列數(shù)目3(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度1146堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO.1GTGAGAAGCA AAAAATTGTG GATCAGCTTG TTGTTTGCGT TAACGTTAAT CTTTACGATG 60GCGTTCAGCA ACATGTCTGC GCAGGCTGCC GGAAAAAGCA GTACAGAAAA GAAATACATT 120GTTGGATTTA AACAGACAAT GAGTGCCATG AGTTCCGCCA AGAAAAAGGA TGTTATTTCT 180GAAAAAGGCG GAAAGGTTCA AAAGCAATTT AAGTATGTTA ACGCGGCCGC AGCAACATTG 240GATGAAAAAG CTGTAAAAGA ATTGAAAAAA GATCCGAGCG TTGCATATGT GGAAGAAGAT 300CATATTGCAC ATGAATATGC GCAATCTGTT CCTTATGGCA TTTCTCAAAT TAAAGCGCCG 360GCTCTTCACT CTCAAGGTTA CACAGGCTCT AACGTAAAAG TAGCTGTTAT CGACAGCGGA 420ATTGACTCTT CTCATCCTGA CTTAAACGTC AGAGGCGGAC GAAGCTTCGT ACCTTCTGAA 480ACAAACCCAT ACCAGGACGG CAGTTCTCAC GGTACGCATG TAGCCGGTAC GATTGCCGCT 540CTTAATAACT CAATCGGTGT TCTGGGCGTA CGGCCAAGCG CATCGTTATA TGCAGTAAAA 600GTGCTTGATT CAACAGGAAG CGGCCAATAT AGCTGGATTA TTAACGGCAT TGAGTGGGCC 660ATTTCCAACT CTATGGATGT TATTAACATG AGCCTTGGCG GACCTTCTGG TTCTACAGCG 720CTGAAAACAG TCGTTGATAA AGCCGTTTCC AGCGGTATCG TCGTTGCTGC CGCTGCCGGA 780AACGAAGGTT CGTCCGGAAG CTCAAGCACA GTCGGCTACC CTGCAAAATA TCCTTCTACT 840ATTGCAGTAG GTGCGGTAAA CAGCAGCAAC CAAAGAGCTT CATTCTCAAG CGCAGGTTCT 900GAGCTTGATG TGATGGCTCC TGGCGTATCC ATCCAAAGCA CACTTCCTGG AGGCACTTAC 960GGCGCTTATA ACGGAACGTG CGCGGCGACT GCTCACGTTG CCGGAGCAGC AGCGTTAATT 1020CTTTCTAAGC ACCCGACTTG GACAAACGCG CAAGTCCGTG ATCGTTTAGA AAGCACTGCA 1080ACATATCTTG GAAACTCTTT CTACTATGGA AAAGGGTTAA TCAACGTACA AGCAGCTGCA 1140CAATAA1146(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.2AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF 50VPSETNPYQD GSSHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVSPSASL YAVKVLDSTG 100SGQYSWIING IEWAISNSMD VINMSLGGPS GSTALKTVVD KAVSSGIVVA 150AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV NSSNQRASFS SAGSELDVMA 200PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT CAATAHVAGA AALILSKHPT WTNAQVRDRL 250ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ275(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.3AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF 50VPSETNPYQD GSSHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVSPSASL YAVKVLDSTG 100SGQYSWIING IEWAISNNMD VINMSLGGPS GSTALKTVVD KAVSSGIVVA 150AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV NSSNQRASFS SAGSELDVMA 200PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILSKHPT WTNAQVRDRL 250ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ27權(quán)利要求
1.一種多肽連接酶，它是枯草蛋白酶E的變體酶，其特征在于，它含有Ser221Cys、Met222Ala和Pro225Ala突變。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽連接酶，其特征在于，它含有選自下組的突變Asn118Ser，和Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽連接酶，其特征在于，它包括變體酶BHG和BW。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽連接酶，其特征在于，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.一種分離的DNA序列，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的多肽連接酶。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA序列，其特征在于，它包括選自下組的序列SEQ ID NO.1。
7.一種表達載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的DNA序列。
8.一種宿主細胞，其特征在于，它被權(quán)利要求7所述的表達載體所轉(zhuǎn)化。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，它是枯草桿菌BHG(AprE)CCTCC No.M98022。
10.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的多肽連接酶的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)將編碼該多肽連接酶的DNA序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成多肽連接酶表達載體；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)化入宿主細胞；(c)在適合表達該多肽連接酶的條件下進行培養(yǎng)，從而表達出該多肽連接酶；(d)分離純化出該多肽連接酶。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中所用的分離純化條件是將發(fā)酵上清用30％-60％硫酸銨沉淀，沉淀物用pH6.0-7.4的磷酸緩沖液溶解后經(jīng)DEAE-Dextran A-25柱和Acrylex P-150柱。
12.如權(quán)利要求1所述的多肽連接酶的用途，其特征在于，它被用于非水介質(zhì)中的多肽連接反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種衍生自枯草蛋白酶E的變體酶,它含有Ser221Cys、Met222Ala和Pro225Ala突變。較佳地,它還含有選自下組的突變:Asn118Ser和Ser24His/Lys27Asp/Ser236CYs。本發(fā)明的變體酶在非水介質(zhì)中的穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性都顯著提高,因而可用于非水介質(zhì)中的多肽連接反應(yīng)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的編碼序列、表達載體、轉(zhuǎn)化的宿主細胞和制備方法。
文檔編號C12N9/00GK1258744SQ9812674
公開日2000年7月5日 申請日期1998年12月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月31日
發(fā)明者楊永華, 蔣嵐, 楊勝利 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心