專利名稱：新型枯草桿菌蛋白酶及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領域，更具體地，涉及新的熱穩(wěn)定性提高的枯草桿菌蛋白酶。
枯草桿菌堿性蛋白酶E是一種絲氨酸水解酶，它在洗滌劑、制革等工業(yè)中有廣泛的應用，是一種重要的工業(yè)用酶。但也有穩(wěn)定性差等缺點，國內(nèi)外已有提高其穩(wěn)定性的報道。
Asn218Ser突變既可提高枯草蛋白酶BPN’的活性及穩(wěn)定性(BryanProteinsStruct.，F(xiàn)unct.，Genet.1986，1，326-34)，也可提高堿性蛋白酶E的活性和穩(wěn)定性(Chen KeqinProc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，5618-22)。
Asn118Ser突變同樣可提高堿性蛋白酶E的活性和熱穩(wěn)定性(朱榴琴中國專利CN 1113953A)，這是國內(nèi)唯一一例在未知位點上進行突變而使蛋白酶性能得到改良的報道。
然而，現(xiàn)有的枯草桿菌蛋白酶E及其變異蛋白的熱穩(wěn)定性仍不能令人滿意，因此迫切需要熱穩(wěn)定性進一步提高的枯草桿菌蛋白酶E。
本發(fā)明的目的就是克服已有技術中的上述缺點，提供一種在熱穩(wěn)定性高的枯草桿菌蛋白酶E，從而解決熱穩(wěn)定性差的問題，擴大了在洗滌、制革等領域的應用范圍。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白，其特征在于，它含有Ser236Cys突變。此外，它還可以含有選自下組的突變Ala15Asp/Gly20His和Ser24His/Lys27Asp。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼上述的含有Ser236Cys突變的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種表達載體，它含有上述的編碼本發(fā)明新型枯草桿菌蛋白酶E的DNA序列。此外，還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞被上述的表達載體所轉化。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明新型枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的方法，該方法包括步驟(a)將編碼本發(fā)明新型枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的DNA序列可操作地連于表達調控序列，形成枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白表達載體；
(b)將步驟(a)中的表達載體轉化入宿主細胞；(c)在適合表達該枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的條件下進行培養(yǎng)，從而表達出該枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白；(d)分離純化出該枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白。
此外，還提供了本發(fā)明新型枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的用途，它被用于蛋白質水解反應。
在所附的附圖中，

圖1是本發(fā)明新型枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白BP-1和BW-1，以及野生型蛋白酶E的熱穩(wěn)定性曲線圖。
圖2是本發(fā)明的新型枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白以及野生型蛋白酶E在二甲基甲酰胺(DMF)中穩(wěn)定性曲線圖。
圖3是在不同濃度的DMF下，本發(fā)明的新型枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白以及野生型蛋白酶E的活性曲線圖。
圖4是天然枯草桿菌蛋白酶E的DNA序列。
本發(fā)明是基于以下意外發(fā)現(xiàn)的基礎上完成的將枯草(桿菌)蛋白酶E中第236位的絲氨酸(Ser)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)之后，可顯著提高蛋白的熱穩(wěn)定性。并且本發(fā)明的新型突變蛋白在非水介質中的穩(wěn)定性也有顯著提供。
在本發(fā)明中，“枯草桿菌蛋白酶E”指來自枯草桿菌的蛋白酶E，它可以是天然的野生型的蛋白酶E，也可以是生物衍生或重組的蛋白酶E。天然的野生型的枯草桿菌蛋白酶E的氨基酸序列示于SEQ ID No.2中，其核苷酸序列(包括兩側的部分非編碼區(qū)域)示于圖4。
如本文所用，術語“非水介質”指含有有機溶劑的介質，該介質可以是只含有一種有機溶劑，也可以是兩種或多種有機溶劑所組成的混合有機溶劑。此外可以是有機溶劑和水的構成的混合溶劑。代表性是有機溶劑有乙腈、二甲亞砜、二甲基甲酰胺(DMF)等。較佳地，該非水介質中含有DMF。
本發(fā)明的新型蛋白酶(變體酶)可以這樣進行制備根據(jù)已公開的枯草桿菌蛋白酶E的序列來合成引物，通過PCR法從枯草桿菌中擴增出枯草桿菌蛋白酶E的編碼序列。然后，以枯草桿菌蛋白酶E的DNA序列，按本發(fā)明中指出的突變形式進行遺傳修飾，進行遺傳修飾的技術是本領域中已知的，例如可參見“Mutagenesisa Practical Approach”，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，其中例如包括定點誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(PCR)誘變。
在獲得了定點突變后的編碼本發(fā)明新變體酶的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，在轉入合適的宿主細胞。最后，培養(yǎng)轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的突變蛋白酶。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新變體酶的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是原核細胞，更佳地是枯草桿菌。
本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，將118Ser，222Ala，60Asn，218Ser，103Arg等各種突變形式及其組合引入枯草桿菌蛋白酶E中，并結合計算機研究了堿性蛋白酶E-PMSF復合物的晶體結構(ChuProtein Eng.1995，8，211-5)。研究發(fā)現(xiàn)，Ser221處于同一α-螺旋上的Ser236也位于酶分子的表面，與活性中心的距離比較遠，因此，引入Ser236Cys突變對活性中心不應該產(chǎn)生大的影響。然而，將Ser236Cys突變引入枯草桿菌蛋白酶E后，意外發(fā)現(xiàn)可顯著提高突變蛋白的熱穩(wěn)定性和/或在非水介質中的穩(wěn)定性，從而在此發(fā)現(xiàn)基礎上完成了本發(fā)明。
此外，通過在其他位點上的進一步誘變，還產(chǎn)生在非水介質中穩(wěn)定性更高和/或活性更高的枯草桿菌蛋白酶。
在本發(fā)明的一個實施例中，對236位進行了突變，從而形成了Ser236Cys突變體，該突變體酶(簡稱為變體酶)被命名為BP-1。
在本發(fā)明的另一個實施例中，還對15和20位進行了突變，從而形成了Ala15Asp/Gly20His/Ser236Cys突變體，該突變體酶(簡稱為變體酶)被命名為BU-1。
在另一實施例中，還對24和27位進行了突變，從而形成了Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys突變體，該突變體酶(簡稱為變體酶)被命名為BW-1。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1變體酶BP-1的制備將堿性蛋白酶E基因(包括信號肽和導肽部分的基因，共1.9Kb，SEQ ID No.3)插入pAlter-I(購自Promega公司)的EcoR I/Sal I位點。在定點突變時，參照Promega公司突變說明書進行突變，其中，所用的誘變引物為5’-GCG TTA ATTCTT TGCAAG CAC CCG(引入Ser236Cys突變)在上述引物序列中，斜黑體字表示突變位點，“Ser236Cys”表示將原氨基酸序列中第236位的Ser變?yōu)镃ys，其余突變位點用類似方式進行表示。
用EcoR I/Sal I分別切出突變后的1.9Kb片段，插入pBE-2穿梭質粒中(郭興華生物工程學報1991，7，224-9)，構建得到表達質粒pBP-1，轉入枯草桿菌DB104，轉化后的枯草桿菌表達變體酶BP-1。
表達變體酶BP-1的枯草桿菌BP-1(AprE)于1998年12月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC(中國，武漢)，保藏號為CCTCC M98021。
此外，變體酶BP-1成熟后的氨基酸序列分別示于SEQ ID No.1中。
實施例2變體酶BU-1和BW-1的制備基本上按實施例1的相同的步驟，不同點在于以實施例1中獲得的Ser236Cys突變體基因為模板，用引物5’-G CCG GAT CTT CAC TCT CAACACTAC ACA GG引入Ala15Asp/Gly20His突變(產(chǎn)生BU-1)；同樣以Ser236Cys突變體基因為模板，用引物5’-C ACA GGCCAT AAC GTAGACGTA GCT GT引入Ser24His/Lys27Asp突變(產(chǎn)生BW-1)其中，在上述引物序列中，斜黑體字表示突變位點，“Ser236Cys”表示將原氨基酸序列中第236位的Ser變?yōu)镃ys，其余突變位點用類似方式進行表示。
結果制得表達質粒pBU-1和pBW-1和相應的轉化后的宿主細胞，并制得變體酶BU-1和BW-1。
實施例3性能測定(1)熱穩(wěn)定性將本發(fā)明的變體酶BP-1和BW-1以及野生型枯草桿菌蛋白酶E置于水中，于50℃保溫，每隔一定時間取樣測定剩余酶活力，從而得出相對的熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，結果示于圖1。
由圖1可見，BP-1的半壽期超過1小時，BW-1的半壽期約為0.5小時，而堿性蛋白酶E的半壽期不超過20分鐘，BP-1的耐熱性比天然酶高約3倍。因此，與天然酶相比，236位發(fā)生Ser236Cys突變的蛋白酶BP-1和BW-1的耐熱性都有大幅提高，尤其是BP-1的熱穩(wěn)定性更高。
(2)在非水介質中的穩(wěn)定性將各變體酶和野生型蛋白酶E置于不同濃度的DMF中，間隔一定時間后取樣并測定剩余酯解活性。結果表明，本發(fā)明的變體酶(尤其BP-1)在非水介質中的穩(wěn)定性也有顯著提高(圖2)。
(3)在非水介質中的酶活性按AbrahmsenBiochemistry(1991)，30，4151-9中所述的方法，以s-Ala-ala-Pro-Phe-pNA為底物，對酰氨鍵水解活性進行測定。測定各變體酶和野生型蛋白酶E在DMF中的酯解活性，其中體系中DMF濃度如表1所示。
測定數(shù)據(jù)列于表1和圖3。如圖3所示，可見，BP-1、BW-1、BU-1及WT的活性都隨DMF溶度的升高而降低，其中BP-1的穩(wěn)定性最高，BW-1與WT相似，而BU-1最低。由此可見，Ser236Cys突變體的耐熱性及活性都得到了提高。
綜上所述，具有Ser236Cys突變的變體酶是耐熱性及活性都比堿性蛋白酶E高的蛋白酶，在DMF中的穩(wěn)定性也比天然酶高，尤其是堿性蛋白酶E經(jīng)Ser236Cys突變所產(chǎn)生的變體酶BP-1，性能尤為出色。
表1 BP-1、BW-1、BU-1及WT在不同DMF體系中的動力學常數(shù)
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人中國科學院上海生物工程研究中心(ii)發(fā)明名稱新型枯草桿菌蛋白酶及制法和用途(iii)序列數(shù)目2(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.1AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF 50VPSETNPYQD GSSHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVSPSASL YAVKVLDSTG 100SGQYSWIING IEWAISNNMD VINMSLGGPS GSTALKTVVD KAVSSGIVVA 150AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV NSSNQRASFS SAGSELDVMA 200PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILCKHPT WTNAQVRDRL 250ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ 275(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度275個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.2AQSVPYGISQ IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF 50VPSETNPYQD GSSHGTHVAG TIAALNNSIG VLGVSPSASL YAVKVLDSTG 100SGQYSWIING IEWAISNNMD VINMSLGGPS GSTALKTVVD KAVSSGIVVA 150AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV NSSNQRASFS SAGSELDVMA 200PGVSIQSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILSKHPT WTNAQVRDRL 250ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAQ27權利要求
1.一種枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白，其特征在于，它含有Ser236Cys突變。
2.如權利要求1所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白，其特征在于，它還含有選自下組的突變Ala15Asp/Gly20His和Ser24His/Lys27Asp。
3.如權利要求1所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白，其特征在于，它是變體酶BP-1，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
4.如權利要求2所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白，其特征在于，它是變體酶BU-1或BW-1。
5.一種分離的DNA序列，其特征在于，它編碼權利要求1所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白。
6.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求5所述的DNA序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它被權利要求6所述的表達載體所轉化。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，它是枯草桿菌BP-1(AprE)CCTCC No.M98021。
9.一種生產(chǎn)權利要求1所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)將編碼權利要求1所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的DNA序列可操作地連于表達調控序列，形成枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白表達載體；(b)將步驟(a)中的表達載體轉化入宿主細胞；(c)在適合表達該枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的條件下進行培養(yǎng)，從而表達出該枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白；(d)分離純化出該枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白。
10.如權利要求1所述的枯草桿菌蛋白酶E突變蛋白的用途，其特征在于，它被用于蛋白質水解反應。
全文摘要
本發(fā)明提供了衍生自枯草蛋白酶E的變體酶,它含有Ser226CYs突變。它還含有選自下組的突變:Ala15Asp/Gly20His和Ser24His/Lys27Asp。本發(fā)明的變體酶熱穩(wěn)定性以及在非水介質中的穩(wěn)定性都顯著提高,因而可廣泛應用于蛋白水解反應。本發(fā)明還提供了相應的編碼序列、表達載體、轉化的宿主細胞和制備方法。
文檔編號C12N9/50GK1258745SQ9812674
公開日2000年7月5日 申請日期1998年12月31日 優(yōu)先權日1998年12月31日
發(fā)明者楊永華, 蔣嵐, 楊勝利 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心