專利名稱：去?；^孢菌素的發(fā)酵生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及N-去?；^孢菌素類化合物如7-ADCA的發(fā)酵生產(chǎn)的領(lǐng)域發(fā)明背景β-內(nèi)酰胺類抗生素是抗生素類化合物中最重要的一組，具有很長的臨床應(yīng)用史。該組中杰出的代表是青霉素類和頭孢菌素類。這些化合物分別由絲狀真菌產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和Acremoniumchrysogenum天然產(chǎn)生。
通過經(jīng)典性菌株改良技術(shù)，在過去的數(shù)十年中產(chǎn)黃青霉和Acremonium chrysogenum中的抗生素生產(chǎn)水平大大提高。隨著對(duì)青霉素類和頭孢菌素類的生物合成途徑知識(shí)的不斷增加以及重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，出現(xiàn)了用于提高菌株產(chǎn)量和化合物體內(nèi)衍生化的新工具。
參與β-內(nèi)酰胺生物合成的大多數(shù)酶已經(jīng)被鑒別，且其相應(yīng)的基因已經(jīng)被克隆。如Ingolia與Queener在醫(yī)學(xué)研究綜述(Medd.Res.Rev.)9(1989),245-264(生物合成路線和酶)，以及Aharonowitz,Cohen與Martin在Ann.Rev.Microbiol.46(1992),461-495(基因克隆)中所述。
在產(chǎn)黃青霉中青霉素生物合成的頭兩步是三個(gè)氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A),L-半胱氨酸(C)和L-纈氨酸(V)縮合形成一個(gè)三肽LLD-ACV，接著該三肽環(huán)化形成異青霉素N。此化合物含有典型的β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。
青霉素生物合成的頭兩步在生產(chǎn)青霉素、頭霉素和頭孢菌素的真菌及細(xì)菌中是相同的。
第三步涉及異青霉素N的親水性D-α-氨基己二酸側(cè)鏈通過?；D(zhuǎn)移酶(AT)的作用與L-5-氨基-5-羧基戊酸交換。通過AT調(diào)節(jié)的酶促交換反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞的細(xì)胞器微體中，如EP-A-0448180中所述。
在產(chǎn)頭孢菌素的生物中，第三步是異青霉素N在差向異構(gòu)酶作用下異構(gòu)化形成青霉素N，于是，青霉素類特征性的五元環(huán)結(jié)構(gòu)通過擴(kuò)環(huán)酶(expandase)的作用形成了頭孢菌素類特征性的六元環(huán)結(jié)構(gòu)。
僅通過直接發(fā)酵生產(chǎn)的具有工業(yè)意義的青霉素是青霉素V和青霉素G，它們分別是通過在產(chǎn)黃青霉發(fā)酵過程中添加疏水性側(cè)鏈前體物質(zhì)苯氧乙酸或苯乙酸而得到的，藉此由苯氧乙酸或苯乙酸取代了天然β-內(nèi)酰胺類的側(cè)鏈。
頭孢菌素類比青霉素類要貴許多。一個(gè)原因就是一些頭孢菌素(如頭孢氨芐)是通過大量的化學(xué)轉(zhuǎn)化由青霉素衍生而來的。至今在這方面仍是最重要的起始原料的頭孢菌素C在任何pH條件下均易溶于水，這暗示著要應(yīng)用繁重而昂貴的柱層析技術(shù)來進(jìn)行時(shí)間更長、成本更高的分離過程。以這種方式獲得的頭孢菌素C又不得不通過大量的化學(xué)和酶學(xué)轉(zhuǎn)化而形成具有治療價(jià)值的其它頭孢菌素。
目前通過青霉素G的化學(xué)衍生化生產(chǎn)頭孢菌素的中間體7-ADCA。這個(gè)必需的生產(chǎn)7-ADCA的化學(xué)步驟包括了由青霉素五元環(huán)結(jié)構(gòu)向頭孢菌素六元環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的擴(kuò)環(huán)。
近來，已公開了獲得7-ADCA的發(fā)酵方法。
在EP-A-0532341中己二酸(5-羧基戊酸)原料的應(yīng)用表明可以形成一種帶己二?；鶄?cè)鏈的青霉素衍生物，即己二?；?6-氨基青霉烷酸。這種整合是由于酰基轉(zhuǎn)移酶已被證實(shí)了的具有廣泛的底物特異性(Behrens等人，生物化學(xué)雜志(J.Bio.chem.)175(1948),751-809；Cole，生物化學(xué)方法(Process Biochem.)1(1966),334-338；Ballio等人，自然(Nature)185(1960),97-99)。另外，當(dāng)己二酸被加入到一種表達(dá)一種擴(kuò)環(huán)酶的重組產(chǎn)黃青霉菌株中時(shí)，己二?；?6-APA被擴(kuò)環(huán)形成了其相應(yīng)的頭孢菌素衍生物。最終，建議將己二酰側(cè)鏈消除，產(chǎn)生作為終產(chǎn)物的7-ADCA。
專利申請(qǐng)EP-A-0540210描述了一種相似的制備7-ACA的方法，包括將ADCA環(huán)的3-甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)化成為ACA的3-乙酸基甲基基團(tuán)的額外的步驟。
WO95/04148和WO95/04149公開了加入一種特定的含硫基團(tuán)的二羧酸原料到表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌株中，使得這些前體物質(zhì)被整合到青霉素骨架上并隨后擴(kuò)環(huán)形成了相應(yīng)的7-ADCA衍生物。
然而，我們通常認(rèn)為，在青霉素N和頭孢菌素生物合成過程中提供至關(guān)重要的紐帶的擴(kuò)環(huán)酶應(yīng)具有窄的特異性(Maea，等人，酶和微生物技術(shù)(Enyme and Micoobiol.Technology)(1995)17:231-234；Baldwin等人，J.Chem.Soc.Chem.Commu.374-375,1987)，這樣可以防止用非天然側(cè)鏈催化青霉素N氧化性擴(kuò)環(huán)的可能性。
本發(fā)明公開了一種使用新型側(cè)鏈前體物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素類化合物的方法，該方法較現(xiàn)有的上述方法就產(chǎn)量和副產(chǎn)物水平的減少而言具有諸多優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)N-去?；^孢菌素化合物的方法，其包括下述步驟*發(fā)酵一種微生物菌株，該菌株能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺并表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶及擴(kuò)環(huán)酶活性、且選擇性地表達(dá)乙?；D(zhuǎn)移酶和/或羥化酶活性，在如下述分子式(1)的側(cè)鏈前體物質(zhì)存在下HOOC-X-COOH(1)其中X是(CH2)m-CH=A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中m和n各自獨(dú)立地是0、1、2或3，且m+n=2或3，且A是CH或N，或者X是(CH2)p-CH=CH-CH=C-(CH2)q，其中p和q各自獨(dú)立地是0或1，且p+q=0或1，或在該前體物質(zhì)以此分子的一種鹽、酯或酰胺的形式存在下，該側(cè)鏈前體物質(zhì)產(chǎn)生整合有該前體物質(zhì)的?；?6-APA衍生物，該?；?6-APA衍生物在原位擴(kuò)環(huán)形成相應(yīng)的?；?7-ADCA衍生物，由此進(jìn)一步選擇性地反應(yīng)形成?；?7-ADAC或酰基-7-ACA衍生物，并且*從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收酰基-7-頭孢菌素衍生物*將該?；?7-頭孢菌素衍生物進(jìn)行去酰基化處理，并且*回收結(jié)晶的N-去?；^孢菌素化合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了一種通過對(duì)N-去?；^孢菌素衍生物(7-ADCA,7-ADAC或7-ACA)的N-酰基化對(duì)應(yīng)物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)而制備N-去酰基化頭孢菌素衍生物的方法，該方法應(yīng)用了一種新型側(cè)鏈前體物質(zhì)原料。通過使用這些前體物質(zhì)，形成了新型N-?；^孢菌素衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，在具有1或2個(gè)不飽和鍵的二羧酸存在下，能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺、表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶和擴(kuò)環(huán)酶活性、并選擇性地表達(dá)羥化酶或羥化酶以及乙?；D(zhuǎn)移酶活性的微生物菌株的發(fā)酵，能使該側(cè)鏈前體物質(zhì)被更好地整合到頭孢菌素骨架中。因此，在本發(fā)明的方法中只檢測到少量非預(yù)期的?；?6-APA衍生物。另外，與基于己二酸的產(chǎn)量相比，基于不飽和前體物質(zhì)的本發(fā)明可以獲得更高產(chǎn)量的N-?；^孢菌素衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，該側(cè)鏈前體物質(zhì)結(jié)構(gòu)如下述分子式(1)HOOC-X-COOH (1)其中X是(CH2)m-CH=A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中m和n各自獨(dú)立地是0、1、2或3，且m+n=2或3，同時(shí)A是CH或N，或者X是(CH2)p-CH=CH-CH=C-(CH2)q，其中p和q各自獨(dú)立地是0或1，且p+q=0或1。
根據(jù)本發(fā)明，在如分子式(1)所示的不飽和前體物質(zhì)或其鹽、酯或酰胺形式存在時(shí)，發(fā)酵可產(chǎn)生整合了該前體物質(zhì)的酰基-6-APA衍生物。該?；?6-APA衍生物隨后便在原位擴(kuò)環(huán)形成了相應(yīng)的酰基-7-ADCA衍生物。
特別地，本發(fā)明公開了已整合有本發(fā)明所用前體物質(zhì)的?；?6-APA化合物在隨后的擴(kuò)環(huán)反應(yīng)中是一種有效的底物。本發(fā)明方法中所形成的?；?6-APA的數(shù)量大大低于利用己二酸側(cè)鏈前體物質(zhì)生產(chǎn)己二?；?7-ADCA的方法所產(chǎn)生的副產(chǎn)物己二酰基-6-APA的數(shù)量。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種如分子式(1)的化合物被用作側(cè)鏈前體物質(zhì)，其中m和n均是1且A是CH。更優(yōu)選的，如分子式(1)的化合物是反式-β-氫化己二烯二酸。本發(fā)明顯示含有一個(gè)反式-β-氫化己二烯二?；鶄?cè)鏈的酰基-6-APA化合物可以非常有效地?cái)U(kuò)環(huán)形成相應(yīng)的7-ADCA衍生物，因?yàn)闆]有或僅有少量的6-APA衍生物可檢測到。另外，與基于己二酸為前體物質(zhì)的產(chǎn)量相比，基于此前體物質(zhì)的N-酰基化頭孢菌素的產(chǎn)量得以提高。
在本發(fā)明方法中適用的微生物菌株是那些可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺且表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶和擴(kuò)環(huán)酶活性的菌株。另外，該類微生物菌株也選擇性地表達(dá)出羥化酶或羥化酶加上乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性。前一種菌株能產(chǎn)生酰基-7-ADCA衍生物，而后一種菌株能產(chǎn)生?；?7-ADAC或?；?7-ACA衍生物。
這樣的微生物菌株實(shí)例包括帶有可提供擴(kuò)環(huán)酶表達(dá)的表達(dá)盒的產(chǎn)青霉素菌株和帶有可提供酰基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的表達(dá)盒的產(chǎn)頭孢菌素菌株。
易于應(yīng)用的擴(kuò)環(huán)酶基因可來源于Acremonium chrysogenum，帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)，抗生鏈霉菌(Streptomycesantibioticos)或Nocardia lactamdurans。?；D(zhuǎn)移酶基因可來源于產(chǎn)黃青霉，納地青霉(P.nalgiovense)或無冠構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用一種重組地表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)青霉素真菌菌株。更優(yōu)選地，使用黑曲霉屬(Aspergillus)或青霉屬(Penicillium)的真菌。最優(yōu)選地，使用一種產(chǎn)黃青霉菌株。產(chǎn)黃霉菌株P(guān)anlabs P14-B10,DS18541(保藏于CBS，保藏號(hào)為455.957)是一種適合擴(kuò)環(huán)酶表達(dá)的宿主的實(shí)例。
重組表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的菌株的構(gòu)建在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之中。一些可用于重組表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的真菌菌株構(gòu)建的表達(dá)盒的實(shí)例被Crawford等人公開在EP-A-0532341(生物技術(shù)(Biotechnol.)13(1995),58-62)和WO95/04148。在選擇轉(zhuǎn)化子的菌株時(shí)應(yīng)注意選擇一種擴(kuò)環(huán)酶表達(dá)水平足夠高的菌株。例如，這樣的轉(zhuǎn)化子可通過測試它們產(chǎn)生己二?；?7-ADCA的能力來選擇，如Crowford等人(出處同前)所述。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用了一種重組地表達(dá)酰基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)頭孢菌素的菌株，例如一種產(chǎn)?；D(zhuǎn)移酶的A.chrysogenum菌株。因此，一種重組地表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶的A.chrysogenum菌株可產(chǎn)生一種酰基-7-ACA衍生物，這是因?yàn)檫@種菌株自身就可表達(dá)羥化酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶。
這些優(yōu)選的實(shí)施方案將會(huì)對(duì)減少青霉素副產(chǎn)物的數(shù)量作出巨大貢獻(xiàn)，否則注冊(cè)官員是不能接受那樣的7-ADCA終產(chǎn)物的。
本發(fā)明還描述了一種使用特異性溶劑從根據(jù)本發(fā)明的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中回收酰基-7-頭孢菌素衍生物的方法，例如，從表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中回收?；?7-ADCA衍生物。
特別地，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基濾液先用與水不混溶的有機(jī)溶劑在pH低于約4.5時(shí)進(jìn)行萃取操作，再用pH界于4～10之間的水對(duì)該有機(jī)相進(jìn)行反萃取，從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收?；?7-頭孢菌素衍生物。
培養(yǎng)基過濾后，將與水不混溶的有機(jī)溶劑加入到濾液中。為了從水層萃取?；?7-頭孢菌素衍生物，調(diào)整該濾液的pH值。pH值范圍必須低于4.5，優(yōu)選為4～1之間，更優(yōu)選的在2～1之間。這樣，?；?7-頭孢菌素衍生物便可從發(fā)酵培養(yǎng)基中的許多其它雜質(zhì)里分離出來。優(yōu)選的應(yīng)用體積較小的有機(jī)溶劑，例如相當(dāng)于水層體積一半的溶劑體積，從而得到?；?7-頭孢菌素衍生物的濃溶液，以使體積流率減少。另一種可能是在pH為4或更低時(shí)對(duì)整個(gè)培養(yǎng)基在進(jìn)行萃取。優(yōu)選地用與水不混溶的有機(jī)溶劑在pH范圍4～1之間萃取培養(yǎng)基。
任何不影響頭孢菌素分子的溶劑均可應(yīng)用。合適的溶劑是例如乙酸丁酯，乙酸乙酯，甲基異丁基酮，醇類如丁醇等。優(yōu)選地使用正丁醇或異丁醇。
由此，?；?7-頭孢菌素衍生物可以再用pH界于4～10之間優(yōu)選為pH6～9之間的水反萃取。最終體積被再次減少。回收可在0～50℃之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地為室溫。
由本發(fā)明方法生產(chǎn)的?；?7-頭孢菌素衍生物在半合成頭孢菌素類的化學(xué)合成中可方便地用作中間體，因?yàn)椋?-氨基基團(tuán)由于恰當(dāng)?shù)孽；鶄?cè)鏈的存在而被充分保護(hù)。
此外，?；?7-頭孢菌素衍生物可用合適的酶如假單胞菌(Pseudomonas)SE83?；D(zhuǎn)移酶在一步酶法中被去?；?br> 優(yōu)選地使用固定化酶以重復(fù)使用。這種顆粒的制備和酶的固定化的方法學(xué)已在EP-A-0222462中詳盡說明。水溶液具有如pH4～9的pH值，這樣可以減少頭孢菌素的降解反應(yīng)并且適于期望的酶促轉(zhuǎn)化。于是，當(dāng)頭孢菌素水溶液pH維持在合適的水平時(shí)加入該酶，pH值的維持可以通過例如加入一種無機(jī)堿，如KOH溶液，或應(yīng)用一種陽離子交換樹脂來實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)結(jié)束后固定化酶可通過過濾移去。另一種可能是在一種固定或流化床柱中應(yīng)用固定化酶，或在溶液中使用固定化酶，且通過膜過濾移走產(chǎn)物，隨后，在與水不混溶的有機(jī)溶劑存在下將反應(yīng)混合物酸化。pH調(diào)整為約0.1～1.5后，分離兩相，水層的pH再調(diào)整為2-5。頭孢菌素化合物的結(jié)晶便可過濾出來。
去酰基化也可用如已知的先有技術(shù)的化學(xué)方法進(jìn)行，例如通過在低于10℃的溫度下加入五氯化磷，隨后在室溫或更低溫度下加入異丁醇而形成偕氯代亞胺側(cè)鏈。
實(shí)施例1重組產(chǎn)黃青霉的發(fā)酵產(chǎn)黃青霉菌株P(guān)anlabs P14-B10(保藏于CBS，保藏號(hào)455.95)用作擴(kuò)環(huán)酶表達(dá)盒構(gòu)建體的宿主菌株。
所用的表達(dá)盒含有由產(chǎn)黃青霉IPNS基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)所調(diào)控的擴(kuò)環(huán)酶基因，如Crawford等人(出處同前)所述。轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)條件如Crawford等人(出處同前)所述。純化轉(zhuǎn)化子，且通過測試它們產(chǎn)生己二?；?7-ADCA的能力分析擴(kuò)環(huán)酶的表達(dá)，如Crawford等人(出處同前)所述。
產(chǎn)?；?7-ADCA的轉(zhuǎn)化子以2×106個(gè)分子孢子/ml的濃度接種到一種種子培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有以下物質(zhì)(g/l)葡萄糖，30；Pharmamedia(棉籽粉)，10；玉米浸液，20；(NH4)2SO4,20；CaCO3,5；KH2PO4,0.5；乳糖，10；酵母提取物，10；滅菌處理前培養(yǎng)基pH為5.6。
該種子培養(yǎng)基(20ml，在250ml帶棉花塞的Erlemeyer瓶中)在25℃，以220轉(zhuǎn)/分的速度進(jìn)行培養(yǎng)。48小時(shí)后，取1ml接種于15ml的生產(chǎn)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有以下物質(zhì)(g/l)KH2PO4,0.5；K2SO4,5；(NH4)2SO4,17.5；乳糖，140；Pharmamedia,20；CaCO3,10；豬油，10；滅菌處理前培養(yǎng)基pH為6.6。
接種了種子培養(yǎng)基后，生產(chǎn)培養(yǎng)基中加入濃度為20％的所選前體物質(zhì)的貯備溶液，(該液體的pH已用KOH調(diào)整為6.5)，使其終濃度為0.5％～2％。
生產(chǎn)培養(yǎng)物在一種250ml以牛奶過濾器封口的Elemeyer瓶中在25℃以220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)168小時(shí)，每隔一天補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水。
發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，通過離心或過濾除去菌絲體并應(yīng)用HPLC對(duì)?；?6-APA和酰基-7-ADCA進(jìn)行分析。
實(shí)施例2發(fā)酵產(chǎn)物的分析應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)對(duì)來自經(jīng)轉(zhuǎn)化的青霉菌屬菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。該HPLC系統(tǒng)由下述成分組成P1000溶劑輸送系統(tǒng)(TSP)，基本馬拉松式(basic marathon)自動(dòng)進(jìn)樣器(SparkHolland)(注射體積3)，UV150(TSP)可變波長檢測器(設(shè)定為260nm)和一個(gè)PC1000數(shù)據(jù)系統(tǒng)(TSP)。固定相是YMC Pack ODSAQ柱(150×4.6mm)。流動(dòng)相由下述物質(zhì)組成加入了0.17％硫酸氫四丁基銨的pH6.0的84％磷酸鹽緩沖液和16％的乙腈。通過與預(yù)期的酰基-7-ADCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可定量發(fā)酵產(chǎn)物。
實(shí)施例3N-?；嗝顾睾皖^孢菌素衍生物的生產(chǎn)在不同濃度的己二酸(AA)或反式-β-氫化己二烯二酸(THMA)存在下，根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行產(chǎn)黃青霉發(fā)酵。按實(shí)施例2用HPLC分析N-?；?內(nèi)酰胺化合物。
HPLC分析表明在前體物質(zhì)THMA存在時(shí)經(jīng)過發(fā)酵，THMA可被整合到頭孢菌素骨架中，即形成了反式-β-氫化己二烯二?；?7-ADCA。
表1-所述的結(jié)果還顯示在THMA存在下進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，檢測不到反式-β-氫化己二烯二?；?6-APA。另外，與己二?；?7-ADCA相比，反式-β-氫化己二烯二?；?7-ADCA的產(chǎn)量提高，特別是當(dāng)應(yīng)用高濃度的前體物質(zhì)時(shí)。
表1．施以不同濃度AA和THMA時(shí)形成?；?6-APA和?；?7-ADCA的量
*結(jié)果以與施用0.5％己二酸時(shí)形成的酰基-7-ADCA的量的相對(duì)值來表示，該產(chǎn)量值設(shè)為100％。
nd=未檢測到
權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)N-去?；^孢菌素化合物的方法，其包括下述步驟*發(fā)酵一種微生物菌株，該菌株能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺并表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶和擴(kuò)環(huán)酶活性、且選擇性地表達(dá)乙?；D(zhuǎn)移酶和/或羥化酶活性，在如下述分子式(1)的側(cè)鏈前體物質(zhì)存在下HOOC-X-COOH(1)其中X是(CH2)m-CH=A-(CH2)n或(CH2)m-C≡C-(CH2)n，其中m和n各自獨(dú)立地是0、1、2或3，且m+n=2或3，并且A是CH或N，或者X是(CH2)p-CH=CH-CH=C-(CH2)q，其中p和q各自獨(dú)立地是0或1，且p+q=0或1，或者在該前體物質(zhì)以此分子的一種鹽、酯或酰胺的形式存在下，該側(cè)鏈前體物質(zhì)產(chǎn)生整合有該前體物質(zhì)的?；?6-APA衍生物，該酰基-6-APA衍生物在原位擴(kuò)環(huán)形成相應(yīng)的?；?7-ADCA衍生物，由此進(jìn)一步選擇性地反應(yīng)形成?；?7-ADAC或?；?7-ACA衍生物，并且*從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收?；?7-頭孢菌素衍生物*將該?；?7-頭孢菌素衍生物進(jìn)行去?；幚?，并且*回收結(jié)晶的N-去?；^孢菌素化合物。
2．權(quán)利要求1的方法，其中使用分子式(1)的一種不飽和側(cè)鏈前體物質(zhì)，該物質(zhì)的m和n是1且A是CH。
3．權(quán)利要求2的方法，其中該不飽和側(cè)鏈前體物質(zhì)是反式-β-氫化己二烯二酸。
4．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的方法，其中微生物菌株是一種帶有可提供擴(kuò)環(huán)酶表達(dá)的表達(dá)盒的產(chǎn)青霉素菌株。
5．權(quán)利要求4的方法，其中產(chǎn)青霉素菌株是產(chǎn)黃青霉。
6．權(quán)利要求4或5的方法，其中結(jié)晶的頭孢菌素化合物是7-ADCA。
7．權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的方法，其中微生物菌株是一種帶有可提供酰基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的表達(dá)盒的產(chǎn)頭孢菌素菌株。
8．權(quán)利要求7的方法，其中產(chǎn)頭孢菌素菌株是Acremoniumchrysogenum。
9．權(quán)利要求7或8的方法，其中結(jié)晶的頭孢菌素化合物是7-ADAC或7-ACA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過對(duì)N－去酰基化頭孢菌素類化合物的7－?；瘜?duì)應(yīng)物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)而制備N－去酰基化頭孢菌素類化合物的方法。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1224469SQ98800524
公開日1999年7月28日 申請(qǐng)日期1998年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月22日
發(fā)明者M·尼博爾, E·德弗魯姆, J·盧格特布格, D·希珀, A·W·H·沃勒里特, R·A·L·伯韋比格 申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯有限公司