專(zhuān)利名稱(chēng)：含有重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子b(vegf－b)dna的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有重組DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和來(lái)自該動(dòng)物的細(xì)胞，其中該DNA具有來(lái)自血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-B)基因的修飾的核苷酸序列。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞對(duì)于血管發(fā)生和腫瘤形成的研究和進(jìn)展，且特別是對(duì)于測(cè)定物質(zhì)的VEGF-B樣活性有用。
背景技術(shù)：
正如其名稱(chēng)所暗示的，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性促細(xì)胞分裂原。它具有潛在的血管發(fā)生活性，即它促進(jìn)新血管的生長(zhǎng)。生命的生理過(guò)程，血管發(fā)生涉及許多血液和血管細(xì)胞的蛋白質(zhì)。在血管發(fā)生過(guò)程中，促細(xì)胞分裂因子，如VEGF，起重要作用。然而，這些因子所起作用的生化細(xì)節(jié)并不總是唾手可得的。
VEGF被鑒定和表征后，許多重要的發(fā)現(xiàn)將注意力集中在血管生成因子的活性和新因子的闡述上。早期的發(fā)現(xiàn)表明血管發(fā)生是正常發(fā)育和生理學(xué)所必需的。具體地說(shuō)，諸如胚胎發(fā)生，傷口愈合和黃體形成的過(guò)程均涉及血管發(fā)生和血管生成因子。例如，在傷口愈合期間，VEGF mRNA水平升高，這表明VEGF的表達(dá)和愈合過(guò)程直接相關(guān)。另外，VEGF調(diào)節(jié)的缺陷可能與傷口愈合的紊亂相關(guān)。(Frank，S.，等，生物學(xué)化學(xué)雜志，270512607-12613(1995)。)與血管生成因子相關(guān)的其它重要發(fā)現(xiàn)表明，持久的且不受調(diào)節(jié)的血管發(fā)生會(huì)惡化和引起許多疾病。例如，關(guān)節(jié)炎涉及新的毛細(xì)血管侵入關(guān)節(jié)并破壞軟骨。在糖尿病中，視網(wǎng)膜中的新毛細(xì)血管侵入玻璃體液，引起出血和失明。(Folkman，J.和Shing，Y，生物學(xué)化學(xué)雜志，267(16)10931-10934(1992))。血管生成因子在這些和其它疾病中的作用尚未清楚確定。
另一重要發(fā)現(xiàn)涉及血管發(fā)生和腫瘤進(jìn)展間的聯(lián)系。腫瘤生長(zhǎng)和癌轉(zhuǎn)移均是血管發(fā)生依賴性過(guò)程。(Folkman，J.和Shing，Y.，生物學(xué)化學(xué)雜志，267(16)10931-10934(1992))。例如，當(dāng)腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物時(shí)，VEGF mRNA的表達(dá)方式表明在壞死的腫瘤生長(zhǎng)區(qū)外周的細(xì)胞中以最高水平表達(dá)。在這些區(qū)域內(nèi)鑒定了許多血管。在這些區(qū)域中VEGF的表達(dá)表明低氧血癥(缺陷型氧合癥狀)觸發(fā)壞死的腫瘤中VEGF的表達(dá)和釋放。在下文更充分討論的另一血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂素，VEGF-B也與腫瘤生長(zhǎng)，特別是黑素瘤直接相關(guān)。(1996年3月1日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08/609,443)。
VEGF是在結(jié)構(gòu)上與血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)相關(guān)的蛋白質(zhì)家族的一個(gè)成員。PDGF是平滑肌細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和其它一些細(xì)胞類(lèi)型的潛在促細(xì)胞分裂原。在一個(gè)方面，以存在8個(gè)保守的半胱氨酸殘基來(lái)鑒定PDGF家族的成員。在其有活性的生理學(xué)狀態(tài)下，該蛋白質(zhì)在8個(gè)半胱氨酸殘基上以分子間和分子內(nèi)鍵經(jīng)二硫鍵形成二聚體。在另一方面，該家族成員在其促細(xì)胞分裂作用(特別是對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型的作用)上相關(guān)。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-B)，一種非糖基化的高堿性生長(zhǎng)因子是一種新鑒定的PDGF家族的成員。由于與VEGF，PDGF-A，PDGF-B，和PlGF(胎盤(pán)生長(zhǎng)因子)密切的結(jié)構(gòu)相似性，VEGF-B在成年和胚胎組織，特別是在肌肉組織的血管發(fā)生中發(fā)揮作用。VEGF-B也是一種血管發(fā)生促細(xì)胞分裂原。VEGF-B在哺乳動(dòng)物的許多組織中表達(dá)，但在心臟，骨骼肌和胰臟中最豐富。VEGF-B的表達(dá)情況不同于VEGF，盡管兩者均在許多組織中表達(dá)。(Olofsson，B.等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，932576-2581(1996))。
與其相關(guān)的促細(xì)胞分裂蛋白質(zhì)一樣，VEGF-B在體內(nèi)以二硫鍵連接的二聚體存在。作為結(jié)構(gòu)相似性的證明，VEGF-B與VEGF形成雜二聚體，這與參與PDGF-類(lèi)蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)二硫鍵結(jié)合的8個(gè)半胱氨酸殘基保守一致。而且，VEGF-B和VEGF在許多組織中共同表達(dá)表明在天然狀態(tài)下存在VEGF-B-VEGF雜二聚體。VEGF也與PlGF形成雜二聚體。(DiSalvo，等，生物學(xué)化學(xué)雜志，2707717-7723(1995))。在該生長(zhǎng)因子家族成員間產(chǎn)生的雜二聚體復(fù)合物可提供一系列血管發(fā)生或調(diào)節(jié)分子的基礎(chǔ)。
正如所述，VEGF-B在許多組織和細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。例如，本文作為參考文獻(xiàn)特別引用1996年3月1日申請(qǐng)的共同未決的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08/649,443，其詳細(xì)描述的RT-PCR試驗(yàn)證實(shí)了在黑素瘤，正常皮膚和肌肉中存在VEGF-B mRNA。另外，Northern印跡顯示了在各種小鼠和人組織，包括心臟，大腦和骨骼肌中的mRNA。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型對(duì)于研究蛋白質(zhì)的功能和生理學(xué)活性是有用的工具，已產(chǎn)生了各種各樣的這類(lèi)動(dòng)物用于該目的。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種具體技術(shù)涉及同源重組方法。在同源重組中，全部或部分基因組序列被含有同源序列的另一DNA取代。通過(guò)轉(zhuǎn)基因操作和同源重組，可改變動(dòng)物細(xì)胞中的基因或基因的一部分。將基因改變?yōu)榫幋a不再具有天然蛋白質(zhì)功能的蛋白質(zhì)可產(chǎn)生無(wú)效突變體或無(wú)效等位基因。(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,557,032。)為了研究VEGF的功能和生理學(xué)，已報(bào)道了含有VEGF基因無(wú)效突變體的轉(zhuǎn)基因胚胎。(Carmetliet，P.，等，自然，380435-439(1996))。并得到了一些重要發(fā)現(xiàn)。在VEGF無(wú)效突變體雜合的胚胎中，血管發(fā)生異常但未喪失。VEGF無(wú)效突變體純合的胚胎表明血管發(fā)生受到更大的損傷。純合胚胎在妊娠中期死亡。在種系傳遞產(chǎn)生的雜合后代胚胎中觀察到相似的表型。然而，由于Carmetliet等的研究局限于胚胎，所以沒(méi)有報(bào)道動(dòng)物的表型或使用。而且，VEGF轉(zhuǎn)基因胚胎的產(chǎn)生尚未發(fā)現(xiàn)所有VEGF-樣蛋白質(zhì)的血管發(fā)生特征或腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)特征。
因此，盡管本領(lǐng)域努力解釋了血管生成因子的功能和生理學(xué)，但這些因子仍然尚未完全了解，且仍然需要一些方法用于評(píng)價(jià)諸如VEGF-B的血管發(fā)生生長(zhǎng)因子的活性以及其在上述各種疾病狀態(tài)中的作用，和/或用于開(kāi)發(fā)和/或評(píng)價(jià)其它的血管發(fā)生肽。
發(fā)明小結(jié)在其一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)含有突變VEGF-B基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。VEGF-B基因通過(guò)同源重組方法進(jìn)行突變。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有許多用途。例如，對(duì)該動(dòng)物的研究可對(duì)治療應(yīng)用和VEGF-B多肽，其片段或諸如小分子的類(lèi)似物的用藥提供重要的信息。特別是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于解釋VEGF-B和/或其它細(xì)胞因子對(duì)諸如通透性，炎癥和/或組織修復(fù)的生理現(xiàn)象的影響。動(dòng)物或該動(dòng)物的細(xì)胞在鑒定血管發(fā)生和/或腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)化合物的篩選試驗(yàn)中有用。該動(dòng)物也可用于檢測(cè)VEGF-B拮抗劑的體內(nèi)分布和功能以及試驗(yàn)無(wú)毒性且含有VEGF-B的分子的方法中。
在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)含有至少一種非功能性突變VEGF-B等位基因的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的方法。該方法包含將轉(zhuǎn)基因DNA導(dǎo)入非人類(lèi)動(dòng)物，優(yōu)選小鼠的胚胎干細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因DNA具有與VEGF-B序列同源的區(qū)域。然后，選擇轉(zhuǎn)基因DNA在至少一個(gè)拷貝的內(nèi)源性基因組VEGF-B序列位點(diǎn)已整合進(jìn)干細(xì)胞基因組DNA的細(xì)胞。將該細(xì)胞導(dǎo)入發(fā)育中動(dòng)物的胚泡并使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
在另一方面，本發(fā)明提供了從上述方法生產(chǎn)的動(dòng)物。
在另一方面，還提供了從上述方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離的細(xì)胞。
在本發(fā)明方法的任意實(shí)施方案中使用的轉(zhuǎn)基因DNA含有以本領(lǐng)域已知的許多方式改變，突變或修飾的VEGF-B基因的核苷酸序列。因此，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的DNA可含有許多不同的DNA序列。合適序列的選擇取決于所需的效果。例如，至少可改變或缺失一個(gè)半胱氨酸密碼子。所得的動(dòng)物可產(chǎn)生與天然VEGF-B或另一PDGF類(lèi)蛋白質(zhì)形成二聚體的能力被改變的VEGF-B。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，VEGF-B的8個(gè)半胱氨酸殘基中有7個(gè)被缺失，產(chǎn)生一個(gè)VEGF-B的無(wú)效突變體。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于篩選影響血管發(fā)生或調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)或進(jìn)展或者增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物心臟肌肉系統(tǒng)之能力的化合物的方法。該方法包含將化合物導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物并檢測(cè)動(dòng)物中的血管發(fā)生。另外，該方法包含將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，向該動(dòng)物中導(dǎo)入一種化合物，并檢測(cè)動(dòng)物中的腫瘤形成。
上述方法的許多實(shí)施方案均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可想到用于篩選恢復(fù)或可檢測(cè)地影響VEGF-B基因產(chǎn)物活性之能力的化合物的方法，包括將化合物加入合適的細(xì)胞系或?qū)⒒衔飳?dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞系可用于這些方法。這些動(dòng)物和細(xì)胞系系統(tǒng)也可用于選擇能恢復(fù)或調(diào)節(jié)VEGF-B基因活性和/或血管發(fā)生的化合物。該化合物可以是蛋白質(zhì)形式(例如，重組的或體外合成的)或編碼VEGF-B或VEGF-B類(lèi)似物的DNA形式。它可以是裸露的基因組DNA或有效連接到啟動(dòng)子上且可以進(jìn)一步連接到病毒或細(xì)菌載體上的cDNA。該DNA可摻入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，如在Lui等，自然生物技術(shù)，15167-172(1997)中所述。也可在8-16細(xì)胞胚胎期給剔除了VEGF-B的小鼠胚胎提供DNA或蛋白質(zhì)。
用突變VEGF-B基因序列(野生型或其突變的片段)獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于產(chǎn)生雙重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。為達(dá)到該目的，可將突變VEGF-B轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與相同種類(lèi)的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或與該種類(lèi)的天然存在的突變體動(dòng)物雜交。所得的雙重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或其細(xì)胞可用于與突變體親本轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相同的應(yīng)用。
突變或修飾核酸序列的已知方法可用于與本發(fā)明結(jié)合以產(chǎn)生有用的VEGF-B突變體動(dòng)物，細(xì)胞系，或序列。這類(lèi)方法包括，但不限于點(diǎn)突變，定點(diǎn)誘變，缺失突變，插入突變，可從同源重組獲得的突變，以及可從化學(xué)或放射處理DNA或攜帶該DNA的細(xì)胞而獲得的突變。如果希望或必需，可用PCR分析或DNA測(cè)序來(lái)測(cè)定產(chǎn)生的突變。然后將突變體動(dòng)物，細(xì)胞系或序列用于所述的DNA序列，系統(tǒng)，試驗(yàn)，方法或過(guò)程。突變或修飾的DNA按定義可以是與基因組DNA不同或不一致。突變體動(dòng)物也可經(jīng)過(guò)將含有本文所述的或可按本發(fā)明制備的序列的第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與第二動(dòng)物雜交產(chǎn)生。第二種動(dòng)物含有的DNA可不同于第一種動(dòng)物所含的DNA。以這種方式，可產(chǎn)生突變體動(dòng)物的各種品系。
而且，重組DNA技術(shù)可用于突變上述DNA序列，將這些DNA序列與表達(dá)載體連接并表達(dá)VEGF-B蛋白質(zhì)或突變體。從而可分析VEGF-B突變體的生化或行為活性。以這種方式，可產(chǎn)生突變的DNA序列以防止有效的VEGF-B表達(dá)。
本發(fā)明的“修飾的VEGF-B DNA”指來(lái)自VEGF-B基因的核苷酸序列，該序列已經(jīng)過(guò)體外或重組DNA技術(shù)修飾。該修飾的VEGF-B DNA不含有與將要導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因DNA的胚胎干細(xì)胞之基因完全相同的核苷酸序列。然而，具體包括的修飾包括對(duì)VEGF-B DNA序列引入核苷酸的缺失，取代和插入。作為例子，一個(gè)具體修飾的VEGF-B DNA含有小鼠VEGF-B DNA序列部分外顯子3和全部外顯子4的缺失。經(jīng)過(guò)缺失至少一個(gè)限制性片段可將VEGF-B基因座的限制性圖譜(

圖1和3)用于設(shè)計(jì)許多修飾的VEGF-B DNA。
本發(fā)明的方法和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供了用于解釋血管發(fā)生和包括諸如VEGF-B的血管發(fā)生生長(zhǎng)因子的各種物質(zhì)的腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性的有用模型。VEGF-B的治療，診斷和調(diào)節(jié)用途可從采用改變了VEGF-B基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的模型系統(tǒng)來(lái)確定。特別是，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可在以VEGF-B影響諸如通透性，炎癥和/或組織修復(fù)的生理學(xué)現(xiàn)象之能力為基礎(chǔ)的治療方案形成中有用。另外，本發(fā)明的方法和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于評(píng)價(jià)其它多肽或小分子的VEGF-B樣活性，如血管發(fā)生活性或VEGF-B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)所具有的活性，其中該表達(dá)可影響其基礎(chǔ)特征，例如，從血流中將養(yǎng)分吸收到特定的組織的特征。
經(jīng)過(guò)監(jiān)測(cè)和比較對(duì)野生型(+/+)，雜合子(+/-)和無(wú)效等位基因(-/-)動(dòng)物的不同生理學(xué)應(yīng)急的效果，可將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于解釋VEGF-B的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能。例如，VEGF-B對(duì)凝血時(shí)間的影響可通過(guò)使用創(chuàng)傷試驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)；VEGF-B對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響可通過(guò)監(jiān)測(cè)植入的腫瘤細(xì)胞的增生來(lái)測(cè)定；VEGF-B對(duì)身體活性的影響可通過(guò)比較身體活性研究來(lái)揭示，和/或VEGF-B對(duì)應(yīng)急反應(yīng)的影響可通過(guò)應(yīng)用諸如接觸壓縮空氣的重度應(yīng)急來(lái)測(cè)定。另外，VEGF-B對(duì)心率，心輸出(例如，血壓)和/或心臟動(dòng)力學(xué)特征的影響可經(jīng)過(guò)使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物按Zhou等，自然醫(yī)學(xué)，4201-07(1998)所述類(lèi)似的程序來(lái)測(cè)定。
附圖的簡(jiǎn)要描述下文參考附圖將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中圖1是產(chǎn)生小鼠VEGF-B基因無(wú)效突變之策略的示意圖；圖2顯示了PCR擴(kuò)增來(lái)自同胎交配的純合子VEGF-B(+/+)，雜合子(+/-)和純合的剔除VEGF-B基因座的小鼠(-/-)的F2后代尾DNA的瓊脂糖凝膠電泳；圖3顯示了小鼠VEGF-B基因座的詳細(xì)限制性圖譜。限制性酶和相應(yīng)的標(biāo)記在下面列出；圖4顯示了用于產(chǎn)生靶向小鼠VEGF-B基因座的轉(zhuǎn)基因載體的方法的示意圖。下面描述的各構(gòu)建體A-E在產(chǎn)生靶向小鼠VEGF-B基因座的轉(zhuǎn)基因載體的舉例的方法中顯示；圖5a和5b是來(lái)自野生型(+/+)，雜合子(+/-)，和剔除(-/-)的小鼠心臟和骨骼肌組織RNA的Northern印跡，圖6是在同胎交配的純合VEGF-B(+/+)和VEGF-B缺陷型(-/-)小鼠中移植的腫瘤生長(zhǎng)的比較圖。
舉例性實(shí)施方案的詳細(xì)描述下面的描述和實(shí)施例是本發(fā)明實(shí)施方案和范圍的舉例。本發(fā)明并不局限于該描述的范圍。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可修改下面的實(shí)施例和實(shí)施方案。例如，用已知方法在不改變發(fā)明人所示的效果或優(yōu)勢(shì)的前提下可產(chǎn)生所述或所要求保護(hù)的核酸序列中的變化。因此這些變化包括在本說(shuō)明書(shū)和發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外，本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)的詳細(xì)方案在下列文獻(xiàn)中描述Ansubel，F(xiàn).M.等編輯，分子生物學(xué)常規(guī)方法，Greene PublishingAssociates和Wiley-Interscience，John Wiley&Sons，Boston，MA(1989)，和其1997年1月的增刊，下文稱(chēng)為“Ausubel(1989)”；Sambrook，J.，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約冷泉港，(1989)，下文稱(chēng)為“Sambrook(1989)”和小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Constantini和E.Lacy，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1994)，下文稱(chēng)為“Hogan(1994)”。本文特別引入這些文獻(xiàn)作為參考。依靠這些文獻(xiàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案。
短語(yǔ)“無(wú)效等位基因”，“無(wú)效突變”和“無(wú)效突變體”指編碼與野生型蛋白質(zhì)相比有改變的蛋白質(zhì)的基因序列。一般來(lái)說(shuō)，“無(wú)效突變體”的改變方式導(dǎo)致蛋白質(zhì)基本上不具有其原始功能。例如，VEGF-B無(wú)效突變體是編碼不再刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)或不再表現(xiàn)出上述VEGF-B的任何其它作用的蛋白質(zhì)的DNA序列。然而，與VEGF-B的其它生化功能，如肝素結(jié)合和二聚體化相關(guān)的結(jié)構(gòu)可存在于由該無(wú)效等位基因編碼的蛋白質(zhì)中。另外，“無(wú)效突變體”可指攜帶上述改變的蛋白質(zhì)的基因序列的動(dòng)物或細(xì)胞。
轉(zhuǎn)基因DNA指能導(dǎo)入細(xì)胞使其摻入細(xì)胞基因組的DNA。該細(xì)胞能產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因DNA作為載體，轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建，用于施加進(jìn)特定的細(xì)胞。該載體不必是特定的結(jié)構(gòu)形式，如環(huán)形。
重組基因或序列指以本領(lǐng)域已知的任意一種重組DNA技術(shù)操作基因或序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“修飾的VEGF-B DNA”指來(lái)自動(dòng)物的VEGF-B核苷酸序列，它以一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，定點(diǎn)誘變，缺失突變，插入突變，可從同源重組獲得的突變，和/或可從化學(xué)或放射處理DNA或攜帶該DNA的細(xì)胞獲得的突變被修飾，或與另一DNA序列，如標(biāo)記序列相連，該標(biāo)記序列在自然界中不與野生型VEGF-B DNA相連。修飾的VEGF-B DNA可保留野生型VEGF-B DNA的一些或全部活性，例如，F(xiàn)lt-1受體結(jié)合基序。
本文提及的VEGF-B基因和DNA序列不限于來(lái)自小鼠或人的基因或序列。任何動(dòng)物種類(lèi)均可用作VEGF-B基因的來(lái)源。在插入轉(zhuǎn)基因DNA的重組序列中，與特定胚胎干細(xì)胞的VEGF-B基因同源的序列不必來(lái)自與胚胎干細(xì)胞相同的種類(lèi)。
不考慮所涉及的物種時(shí)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法基本上是相同的。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在能整合轉(zhuǎn)染細(xì)胞的時(shí)期，例如，在胚泡期，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞注射進(jìn)胚胎。然后，將胚胎再植入替代母親中，產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)基因DNA的嵌合后代。因此，所需要的是來(lái)自動(dòng)物的合適的胚胎干細(xì)胞。
來(lái)自各種動(dòng)物的胚胎干(ES)細(xì)胞的生產(chǎn)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。胚胎干細(xì)胞可從各種來(lái)源獲得。它們包括小鼠，大鼠，奶牛，豬，綿羊和其它動(dòng)物。例如，Joyner A.L.，(1993)，基因靶向?qū)嶒?yàn)方法，Wood，R.和Hames，B.D.編輯，實(shí)驗(yàn)方法系列，第126卷，Oxford IRL Press(本文特別引用以供參考)描述了產(chǎn)生ES細(xì)胞的方法。另外，小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Constantini和E.Lacy，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1994)描述了小鼠胚胎的操作。此外，Couly和Le Douarin，發(fā)育，108543-555(1990)描述了分離和操作雞和鵪鶉胚胎的方法。Kimmel和Warga，自然，327234-237(1987)描述了斑馬魚(yú)胚胎的分離和操作。Ware等，“農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞系的發(fā)育”，繁殖研究協(xié)會(huì)，38241(1988)討論了適應(yīng)于許多種類(lèi)，如小鼠，牛，豬和羊胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件。因此，與具體舉例的小鼠一樣，本發(fā)明可應(yīng)用于其它動(dòng)物。
將DNA插入動(dòng)物細(xì)胞的各種方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，可將轉(zhuǎn)基因DNA顯微注射進(jìn)合適的細(xì)胞。病毒載體可用于將DNA導(dǎo)入合適的細(xì)胞和細(xì)胞基因組。(例如，參見(jiàn)，Tsukui等，自然生物技術(shù)，14982-985(1996)。)。并且，通過(guò)轉(zhuǎn)染和電穿孔方法可體外操作細(xì)胞。(參見(jiàn)Ausubel(1989)和Hogan(1994))。
一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因DNA通過(guò)隨機(jī)整合或同源重組插入細(xì)胞基因組。為了鑒定和分離已發(fā)生同源重組的細(xì)胞，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉增加ES細(xì)胞和其它細(xì)胞中同源重組對(duì)隨機(jī)整合的相對(duì)頻率的方法。(參見(jiàn)，例如，Ausubel(1989)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,557,032，和Hogan(1994))。轉(zhuǎn)基因DNA載體的設(shè)計(jì)涉及將細(xì)胞序列的某些部分，或與細(xì)胞序列同源的序列插入轉(zhuǎn)基因DNA。這一部分必需與細(xì)胞序列足夠同源以允許轉(zhuǎn)基因DNA與細(xì)胞DNA進(jìn)行體內(nèi)雜交，使其發(fā)生同源重組。
插入本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因DNA優(yōu)選包含5’和3’同源區(qū)。這些同源區(qū)所起的功能是允許在胚胎干細(xì)胞中發(fā)生同源重組過(guò)程。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可依靠的許多文獻(xiàn)討論了如何構(gòu)建同源區(qū)用于同源重組。例如，Thomas&Capecchi，細(xì)胞，51503-512(1987)，Mansour等，自然，317348-352(1988)，和Capecchi，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,487,992分別討論了在同源重組技術(shù)中設(shè)計(jì)同源區(qū)的方法。因此，設(shè)計(jì)同源重組序列的方法是本領(lǐng)域已知的。
然而，導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因DNA的每個(gè)細(xì)胞不會(huì)均發(fā)生同源重組。另外，情況常常是在細(xì)胞中存在一個(gè)以上拷貝的需要通過(guò)同源重組改變或取代的細(xì)胞DNA序列，例如，具有一個(gè)以上等位基因的基因。因此，通過(guò)同源重組，一些細(xì)胞僅僅可在一個(gè)細(xì)胞序列中插入轉(zhuǎn)基因DNA，而在其它細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因DNA被插入一個(gè)以上的細(xì)胞序列中，或者甚至插入每個(gè)細(xì)胞序列中。因此，從用轉(zhuǎn)基因DNA進(jìn)行了同源重組的ES細(xì)胞可產(chǎn)生純合以及雜合的動(dòng)物。純合動(dòng)物可與野生型動(dòng)物雜交以產(chǎn)生對(duì)于轉(zhuǎn)基因DNA雜合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
實(shí)施例為了分析在正常和疾病狀態(tài)下VEGF-B在體內(nèi)血管發(fā)育和維持中的作用，生產(chǎn)攜帶突變體VEGF-B等位基因的小鼠。以同源重組技術(shù)在功能上滅活小鼠的一個(gè)VEGF-B等位基因。因此，從這些細(xì)胞產(chǎn)生的小鼠攜帶一個(gè)突變型和一個(gè)野生型VEGF-B等位基因。
圖1由4個(gè)小部分，1A到1D組成，它是生產(chǎn)小鼠VEGF-B基因無(wú)效突變的方法示意圖。圖1A是小鼠VEGF-B基因的外顯子一內(nèi)含子組成的示意圖。圖1B是VEGF-B基因座的限制性圖譜，其中顯示了許多限制性酶的裂解位點(diǎn)。圖中的限制性酶表示如下N＝NotI；S＝SpeI；K＝KpnI；H＝HindIII；E＝EcoRI。在下文所述舉例的轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體中去除的SpeI-KpnI片段以黑框表示。圖1C的轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體用于產(chǎn)生突變體VEGF-B等位基因。該構(gòu)建體含有VEGF-B基因的5’同源片段(NotI/平末端化的SpeI)和3’同源片段(平末端化的KpnI/HindIII)，這兩個(gè)片段位于pPGK-新霉素序列盒(neo)的兩側(cè)。圖1D顯示了在Southern印跡分析中用于鑒定VEGF-B野生型和突變型等位基因的DNA探針的位置。
在圖2中，擴(kuò)增的野生型帶(wt)和從新霉素序列盒擴(kuò)增的帶(neo)的遷移顯示在右邊。
在下面部分中，描述了如何產(chǎn)生攜帶突變體VEGF-B等位基因的動(dòng)物的詳細(xì)方法和所得的小鼠表型的初步分析。
實(shí)施例1選擇用作轉(zhuǎn)基因的VEGF-B序列用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的DNA可含有許多不同的DNA序列。合適序列的選擇取決于所需的效果。例如，如果需要具有VEGF-B無(wú)效突變體的動(dòng)物，則轉(zhuǎn)基因DNA可含有編碼不具有血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂原的VEGF-B基本功能之蛋白質(zhì)的序列。盡管可使用測(cè)定突變蛋白質(zhì)分裂原活性的試驗(yàn)，但VEGF-B基因的結(jié)構(gòu)信息也可用于精確推導(dǎo)特定突變方案的效果。
在本實(shí)施例中，缺失了部分VEGF-B小鼠基因。缺失的部分含有對(duì)二硫鍵重要的8個(gè)半胱氨酸殘基中的7個(gè)。如上所述，VEGF-B是生長(zhǎng)因子PDGF家族的一個(gè)成員。由于該家族的成員在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，可推導(dǎo)突變對(duì)其它PDGF家族成員的效應(yīng)來(lái)提示對(duì)VEGF-B的影響。因此，產(chǎn)生特定效應(yīng)的VEGF中的突變可能在VEGF-B中產(chǎn)生相同或相似的效應(yīng)。同樣，在PDGF家族其它成員中的突變可用于在VEGF-B基因中產(chǎn)生突變。當(dāng)所有家族成員中，或者甚至對(duì)另一家族成員的結(jié)構(gòu)信息表明保守的結(jié)構(gòu)與特定活性相關(guān)時(shí)尤其如此?？紤]到這些情況，產(chǎn)生無(wú)效突變體，其中缺失了8個(gè)半胱氨酸殘基中的7個(gè)。由于從PDGF家族的資料已知這些半胱氨酸殘基與二硫鍵形成和二聚體化有關(guān)，可預(yù)期7個(gè)半胱氨酸的缺失產(chǎn)生無(wú)功能的，突變的VEGF-B蛋白質(zhì)。選擇用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因DNA中的序列的進(jìn)一步細(xì)節(jié)如下。
為了選擇本發(fā)明中修飾的DNA序列，首先使用pcif-2作探針從小鼠λFIXII-文庫(kù)(Stratagene；La Jolla，CA)克隆小鼠VEGF-B基因。該方法的細(xì)節(jié)在Olofsson等，生物學(xué)化學(xué)雜志，27119310-19317(1996)(本文特別作為參考文獻(xiàn)引用)中描述。分離和鑒定了3個(gè)λ-克隆，命名為10，11和12，各攜帶大約20kb的小鼠基因組DNA。經(jīng)過(guò)用不同的限制性酶消化λDNA，隨后以Southern印跡鑒定限制性片段可產(chǎn)生基因組DNA的詳細(xì)的限制性圖譜。從小鼠cDNA克隆序列獲得的各種32P-標(biāo)記的寡核苷酸探針用于Southern印跡。
從含有VEGF-B基因的λDNA的限制性圖譜獲得的信息用于選擇基因轉(zhuǎn)移的DNA。選擇的DNA取決于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有的特性，特征，基因型或表型?？尚枰鞣N特性，特征，基因型或表型。例如，其中VEGF-B DNA與諸如本領(lǐng)域已知的β-半乳糖苷酶，綠色熒光蛋白質(zhì)或熒光素酶等標(biāo)記序列連接的動(dòng)物可以是確定表達(dá)的VEGF-B蛋白質(zhì)的位置的試驗(yàn)所需的。具有與高度可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)的啟動(dòng)子有效相連的VEGF-B DNA的動(dòng)物可以是用于從該動(dòng)物獲得VEGF-B蛋白質(zhì)所需的?？墒褂玫脑S多啟動(dòng)子或表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的。另外，突變的VEGF-B序列，一旦有效插入到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，可提供用于確定血管發(fā)生或腫瘤發(fā)育的分子基礎(chǔ)研究動(dòng)物。
在一個(gè)轉(zhuǎn)基因方案中，需要VEGF-B基因的無(wú)效等位基因。該無(wú)效等位基因的基因產(chǎn)物在VEGF-B的血管發(fā)生特性方面是沒(méi)有功能的。具有VEGF-B無(wú)效等位基因的動(dòng)物可用于各種試驗(yàn)以鑒定，例如，在動(dòng)物中影響血管發(fā)生的化合物。
產(chǎn)生無(wú)效等位基因的方法涉及缺失或修飾DNA序列以防止形成分子內(nèi)或分子間，或分子內(nèi)和分子間二硫鍵。具體地說(shuō)，缺失編碼已知與或據(jù)信與二硫鍵有關(guān)的半胱氨酸殘基的區(qū)域?；蛘?，經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變或定點(diǎn)誘變方法突變單個(gè)的半胱氨酸殘基，本領(lǐng)域已知許多這類(lèi)方法。然而，以許多其它方法也可產(chǎn)生無(wú)效等位基因。例如，從VEGF-B的限制性圖譜，可選擇常規(guī)限制性位點(diǎn)用于產(chǎn)生缺失突變體。
原則上，有許多方法產(chǎn)生無(wú)效突變，包括，但不限于(i)缺失全部基因；(ii)缺失關(guān)鍵的編碼蛋白質(zhì)的序列；和(iii)缺失轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。如果突變影響剪接，mRNA的穩(wěn)定性等，也可出現(xiàn)無(wú)效突變。另外，改變閱讀框或?qū)氤墒烨敖K止密碼子的插入或取代也可引起無(wú)效突變。
從圖1所示的限制性圖譜，制備在VEGF-B基因中導(dǎo)入無(wú)效突變的靶向的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的一種方式是經(jīng)過(guò)缺失限制性片段。將PTKneo插入外顯子1的“B”位點(diǎn)可能產(chǎn)生無(wú)效突變。從更詳細(xì)的限制性圖譜圖3，可設(shè)計(jì)其它的方案。例如，也可設(shè)計(jì)任何外顯子1，2，3，4，或5的缺失，以及一個(gè)以上外顯子的聯(lián)合缺失。
產(chǎn)生無(wú)效突變體的另一方法涉及缺失與受體結(jié)合相關(guān)的那些區(qū)域。對(duì)于PDGF和VEGF，存在關(guān)于受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息且在本領(lǐng)域是已知的。這些信息可用于缺失VEGF-B基因的有關(guān)部分以產(chǎn)生無(wú)效等位基因。同樣，VEGF-B與受體Flt-1的結(jié)合和鑒定結(jié)合受體Flt-1的VEGF-B類(lèi)似物的方法在1996年12月21日申請(qǐng)的共同未決的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)60/033,697中討論，本文特別作為參考文獻(xiàn)引用。這些信息也可用于產(chǎn)生VEGF-B的無(wú)效等位基因。
從上面的討論，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)可用于設(shè)計(jì)VEGF-B的無(wú)效等位基因。因此，本發(fā)明并不限于在產(chǎn)生攜帶VEGF-B無(wú)效等位基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中具體舉例的缺失。
實(shí)施例2產(chǎn)生具有VEGF-B缺失突變體的轉(zhuǎn)基因載體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，去掉了VEGF-B氨基末端結(jié)構(gòu)域8個(gè)半胱氨酸殘基中的7個(gè)。該缺失破壞了用于成熟VEGF-B分子共價(jià)二聚體化的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和兩個(gè)分子間二硫鍵。為做到這點(diǎn)，缺失了330bp的SpeI-KpnI片段。該片段含有部分外顯子3和全部外顯子4。具體地說(shuō)，缺失了由外顯子3的3’部分編碼的33個(gè)氨基酸和外顯子4的全部24個(gè)氨基酸。由于缺少這些關(guān)鍵的氨基酸，從靶向等位基因產(chǎn)生的VEGF-B蛋白質(zhì)是無(wú)功能的，且該等位基因是無(wú)效等位基因。
用于產(chǎn)生缺少VEGF-B的SpeI\KpnI片段的重組轉(zhuǎn)基因載體的起始材料是亞克隆進(jìn)質(zhì)粒pBluescriptTM(Stratagene)的來(lái)自λ-克隆10的10kb NotI\HindIII片段(構(gòu)建體A)，和克隆進(jìn)pBluescript(的1.7kbpPGK-neo序列盒(Sibilia，M.科學(xué)269234-238(1995))構(gòu)建體B)。構(gòu)建體A-E的示意圖參見(jiàn)圖4。
經(jīng)過(guò)用KpnI消化構(gòu)建體A的10kb VEGF-B片段，用T4聚合酶從KpnI粘性末端產(chǎn)生平末端，并最后用HindIII裂解來(lái)分離用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因載體3’區(qū)的1.2kb KpnI/HindIII片段。這一片段和所有隨后的片段在1 x TBE(Tris Borate EDTA)緩沖液中制備的低凝膠溫度(LGT)瓊脂糖凝膠中分離。然后將分離的1.2kb片段連接進(jìn)EcoRV和HindIII消化的pBluescript載體中，產(chǎn)生構(gòu)建體C。
經(jīng)過(guò)用NotI/SpeI裂解從構(gòu)建體A分離轉(zhuǎn)基因載體的5’片段。然后將分離的片段連接進(jìn)NotI/SpeI消化的構(gòu)建體C中產(chǎn)生構(gòu)建體D。
經(jīng)過(guò)用NotI/HindIII消化構(gòu)建體B并用Klenow片段產(chǎn)生平末端分離pPGK-neo序列盒。凝膠純化所得的片段，然后連接進(jìn)用EcoRI消化并用Kenow片段平末端化的構(gòu)建體D中，產(chǎn)生構(gòu)建體E。選擇正向插入了pPGK-neo序列盒的11.2kb載體作為轉(zhuǎn)基因的靶向載體。
使用Southern印跡試驗(yàn)證實(shí)野生型與突變型等位基因的同一性。用EcoRI消化基因組DNA并制備用于印跡。用作上述篩選方法之探針的450bp放射標(biāo)記的片段主要包含編碼外顯子7和VEGF-B cDNA3’非翻譯區(qū)的序列。使用來(lái)自克隆10的DNA作模板經(jīng)過(guò)PCR產(chǎn)生該探針。用于PCR的引物是5’-GTGAAGCTCCAGCCGAGCA(有義鏈)(SEQ ID NO1)和5’-TAGTGTCTTCCATCTCTTT(反義鏈)(SEQ ID NO2)。突變等位基因產(chǎn)生6.5kb的基因組EcoRI限制性片段，而在這些條件下野生型等位基因產(chǎn)生＞20kb的片段。
實(shí)施例3將轉(zhuǎn)基因載體插入動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)過(guò)電穿孔將含有突變VEGF-B的載體(構(gòu)建體E)轉(zhuǎn)染進(jìn)來(lái)自129/SW小鼠的E14.1細(xì)胞(Kuhn，R.等，科學(xué)254707-710(1991))。用標(biāo)準(zhǔn)方法分離新霉素抗性克隆并鑒定。小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Constantini和E.Lacy編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1994)描述了分離和操作胚胎的方法(本文特別引用作為參考)。分離幾百個(gè)克隆的基因組DNA，EcoRI消化，并經(jīng)過(guò)Southern印跡分析。使用這些方法，經(jīng)過(guò)檢測(cè)6.5kb帶和野生型20kb帶鑒定了3個(gè)陽(yáng)性克隆，命名為1a，8f和9h。對(duì)于克隆1a和9h，用放射標(biāo)記的PKG-neo序列盒探測(cè)Southern印跡也產(chǎn)生了預(yù)期6.5kb的帶。這些資料顯示ES細(xì)胞中的兩個(gè)VEGF-B等位基因中的一個(gè)等位基因已被該構(gòu)建體正確地靶向且產(chǎn)生了含有VEGF-B無(wú)效等位基因的ES細(xì)胞。
實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)方法將來(lái)自細(xì)胞系9h的細(xì)胞注射進(jìn)小鼠胚泡。小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，B.Hogan，R.Beddington，F(xiàn).Constantini和E.Lacy編輯，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1994)描述了注射細(xì)胞的方法(本文特別作為參考文獻(xiàn)引用)。以后代的外表顏色鑒定產(chǎn)生的嵌合小鼠，即那些具有轉(zhuǎn)基因DNA的小鼠。
例如，由于ES細(xì)胞來(lái)自具有栗色(白-黃)皮毛和野灰色(Agouti)基因座攜帶者的129/SW小鼠，而宿主胚泡來(lái)自具有黑色外觀且缺乏野灰色基因座的C57B1/6小鼠，因此，嵌合體將是栗色(僅由ES細(xì)胞貢獻(xiàn)的皮膚塊)，黑色(僅由宿主細(xì)胞貢獻(xiàn)的皮膚塊)和棕色或野灰色(具有129/SW和C57B1/6細(xì)胞混合體的皮膚塊)的混合體。嵌合動(dòng)物是棕色的，因?yàn)閺?29/SW細(xì)胞分泌的野灰色蛋白質(zhì)將刺激C57B1/6毛囊細(xì)胞以加工黑色素(黑色色素)使皮毛變成棕色。
雄性嵌合小鼠與C57B1/6野生型雌鼠交配。在這些雌性小鼠的后代中存在棕色小鼠，這顯示了轉(zhuǎn)基因DNA的種系傳遞。
以上述Southern印跡分析了從這些F1小鼠尾制備的DNA。一般來(lái)說(shuō)，手術(shù)切下0.5cm尾組織并用于制備DNA樣品。在50％的棕色小鼠中存在6.5kb EcoRI片段表明對(duì)靶向的VEGF-B無(wú)效等位基因沒(méi)有選擇。攜帶靶向的VEGF-B基因座的F1小鼠是雜合子，因?yàn)樗鼈円矓y帶了VEGF-B的野生型等位基因。存在攜帶一個(gè)失活的VEGF-B等位基因的正常發(fā)育的F1小鼠表明VEGF-B的基因劑量對(duì)于存活不是關(guān)鍵的。
使雜合子F1小鼠雜交并經(jīng)過(guò)Southern印跡和PCR分析后代的鼠尾DNA。使用兩種技術(shù)獲得的結(jié)果是相同的，并給出了PCR確定基因型方法的細(xì)節(jié)。用F2后代尾DNA作模板使用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用位于外顯子3和外顯子4的兩個(gè)引物將野生型等位基因鑒定為316bp的擴(kuò)增帶。這些引物分別為5’-GCCCAGCTGTGTGACTGT(正向)(SEQ ID NO3)和5’-CCCACCCCATGCTACACT(反向)(SEQ ID NO4)。使用位于新霉素抗性基因的兩個(gè)引物將靶向的等位基因鑒定為140bp的帶。這些引物分別是5’-TGTTCTCCTCTTCCTCATCTCC(正向)(SEQ IDNO5)和5’-ATTGTCTGTTGTGCCCAGTC(反向)(SEQ ID NO6)。PCR擴(kuò)增的結(jié)果在圖2中概括。分析表明VEGF-B靶向等位基因純合的小鼠可存活且分析F2后代的大量動(dòng)物后得到野生型，雜合子和攜帶無(wú)效等位基因的純合子動(dòng)物的比率為1∶2∶1。因此，無(wú)效等位基因以經(jīng)典的孟德?tīng)柗绞竭z傳。
對(duì)剔除VEGF-B的成年小鼠的第一外表檢查與野生型小鼠相比未顯示任何總體形態(tài)變化。然而，可觀察到有些轉(zhuǎn)基因VEGF-B突變體小鼠的心臟出現(xiàn)畸形。其心臟大小一般比野生型小且較大的血管似乎更擴(kuò)張。這些表型表明剔除VEGF-B的小鼠可用作篩選對(duì)心臟組織生長(zhǎng)或發(fā)育有影響的化合物的模型。
實(shí)施例5檢查細(xì)胞或組織標(biāo)本中的VEGF-B核酸可用本領(lǐng)域已知的許多常規(guī)方法獲得細(xì)胞或組織標(biāo)本。一般來(lái)說(shuō)，立即冷凍離心的細(xì)胞沉淀或組織樣品。以異硫氰酸胍方法[Chomczynski等，分析化學(xué)，162156-159(1987)]分離總RNA。使用0.2μg隨機(jī)六脫氧核苷酸引物，5單位的鼠逆轉(zhuǎn)錄酶，作為模板的5μg總RNA和第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia)合成cDNA。37℃溫育1小時(shí)后，反應(yīng)混合物在-70℃貯存。除了不加逆轉(zhuǎn)錄酶外，同樣制備PCR擴(kuò)增的陰性對(duì)照樣品。作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)也試驗(yàn)了β-肌動(dòng)蛋白，因?yàn)槠湟越M成型高水平表達(dá)，且其表達(dá)在不同細(xì)胞中顯示出無(wú)很大差異。
對(duì)于PCR擴(kuò)增，從VEGF-B和β-肌動(dòng)蛋白基因選擇引物序列如下VEGF-B有義5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(SEQ IDNO7)，VEGF-B反義5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC-3’(SEQID NO8)，β-肌動(dòng)蛋白有義5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO9)，β肌動(dòng)蛋白反義5’-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3’(SEQ ID NO10)[β-肌動(dòng)蛋白序列包含Ng等，分子細(xì)胞生物學(xué)，52720-732(1985)的核苷酸2105-2125和2411-2432]。來(lái)自cDNA反應(yīng)產(chǎn)物的4μl等分試樣加熱至94℃5分鐘并用作含有20pmole引物，10xPCR緩沖液，1μl 20mM dNTPs和2.5U Taq聚合酶的PCR擴(kuò)增的模板。用DEPC處理的水將終體積調(diào)至100μl。變性為在95℃1分鐘，在62℃退火45秒，在72℃聚合50秒，對(duì)于VEGF-B共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。每5個(gè)循環(huán)后，取15μl等分試樣用于分析。
在含有溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行5μl PCR反應(yīng)混合物的電泳。大小標(biāo)記DNA片段長(zhǎng)度范圍為24到726個(gè)堿基對(duì)(來(lái)自Promega，Madison，WI，USA)。
實(shí)施例6來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞和組織的應(yīng)用如上所述，剔除VEGF-B的小鼠心臟比野生型小，這特別顯示了其在心細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定，心率測(cè)定，心輸出測(cè)定或其它心臟動(dòng)力學(xué)特征的測(cè)定中的應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到在篩選試驗(yàn)中的其它用途。
為了在這些篩選方法中使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞和組織，可使用來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞或組織的培養(yǎng)物，它含有來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞。該細(xì)胞作為外植體生長(zhǎng)或經(jīng)過(guò)機(jī)械分散分離且作為原代培養(yǎng)物生長(zhǎng)。另外，用本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法或經(jīng)過(guò)將轉(zhuǎn)基因小鼠與例如，Jat等，PNAS USA 885096-5100(1991)描述的H-2KtsA58小鼠進(jìn)行起始雜交，或用本領(lǐng)域已知的其它相關(guān)方法(參見(jiàn)，例如，McClean，J.S.，Tibtech 11232(1993))可將該細(xì)胞轉(zhuǎn)化成細(xì)胞系。以這種方式，剔除突變體與H-2KbtsA58轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交將產(chǎn)生各種細(xì)胞的條件永生細(xì)胞系。具體地說(shuō)，細(xì)胞在ts(溫度敏感性)A58 T-抗原許可的溫度下開(kāi)始生長(zhǎng)，使細(xì)胞可培養(yǎng)許多代。T-Ag使細(xì)胞永生。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到非許可溫度下使T-Ag失活時(shí)，細(xì)胞分化，從而潛在地從不同組織產(chǎn)生許多不同的細(xì)胞系。
實(shí)施例7血管發(fā)生和/或腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性的測(cè)定組織樣品，例如來(lái)自剔除VEGF-B的小鼠的心臟外植塊，它也可含有相應(yīng)的細(xì)胞，可將它用于試驗(yàn)VEGF-B類(lèi)似物。這些組織樣品或外植塊也可在本領(lǐng)域已知的溶液中維持。可向組織樣品或外植塊中加入化合物，例如VEGF-B類(lèi)似物或小分子，并分析其對(duì)組織樣品或外植塊的影響。以這種方式可試驗(yàn)諸如血管發(fā)生的生理學(xué)影響，抑制或幫助腫瘤生長(zhǎng)，肌肉系統(tǒng)增多或其它與VEGF-B有關(guān)的影響。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可依靠本領(lǐng)域已知的方法，例如Ausubel(1989)和Hogan(1994)中的方法設(shè)計(jì)特定的實(shí)施方案。
實(shí)施例8VEGF-B轉(zhuǎn)錄子表達(dá)的考察以Northern印跡在野生型小鼠(+/+)，雜合子小鼠(+/-)和純合子剔除小鼠(-/-)中考察VEGF-B轉(zhuǎn)錄子在心臟和骨骼肌中的表達(dá)。殺死VEGF-B缺陷和野生型C57B1/6小鼠，速凍不同的組織并貯存在-80℃?zhèn)溆?。使用硫氰酸?酸性酚方法[參見(jiàn)Chomczynski等，分析生物化學(xué)，162156-159(1987)]制備總細(xì)胞RNA。在1％瓊脂糖凝膠中每泳道使用20μg來(lái)自各樣品的RNA，在80V下電泳大約3小時(shí)。隨后將凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜(HybondTM-N+，Amersham)上，接著進(jìn)行紫外線交聯(lián)。在5xSSC，5xDenhardt溶液，0.5％SDS和100μg/ml單鏈DNA中進(jìn)行預(yù)雜交2小時(shí)，接著根據(jù)廠商方案(Amersham)用特異性探針在65℃雜交過(guò)夜。
所用的兩個(gè)探針是(a)全長(zhǎng)小鼠VEGF-B cDNA和(b)包括無(wú)效等位基因中VEGF-B基因的缺失部分的探針。用隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(Amersham)按推薦的方案將1.8kb的VEGF-B167cDNA片段用于制備第一探針。在Northern分析中使用的第二探針用VEGF-B外顯子3和4內(nèi)的148bp片段產(chǎn)生，該片段在無(wú)效等位基因/靶向載體中被Neo基因取代且經(jīng)過(guò)PCR方法被標(biāo)記[參見(jiàn)Konat等，PCR技術(shù)，第37-42頁(yè)，Griffin編輯，CRC出版，Boca Raton(1994)]。在標(biāo)記PCR中使用Taq DNA聚合酶和32P-dCTP，PCR為在94℃1分鐘，58℃下2分鐘及72℃下3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
洗滌后，將膜對(duì)X-射線膠片曝光2到6天。膜在煮沸的0.5％SDS中剝離并接觸磷酸Imager過(guò)夜以確保完全剝離。圖5a顯示了使用全長(zhǎng)小鼠VEGF-B cDNA探針進(jìn)行Northern印跡的結(jié)果。圖5b顯示了包含無(wú)效等位基因中VEGF-B缺失部分的探針?biāo)玫慕Y(jié)果。
結(jié)果表明，兩種探針均與從+/+小鼠獲得的豐富的1.4kb VEGF-BmRNA雜交且還檢測(cè)到豐度較低的兩個(gè)其它轉(zhuǎn)錄子。這兩個(gè)次要轉(zhuǎn)錄子長(zhǎng)度分別為3.0和6kb。在+/-小鼠中獲得的雜交信號(hào)明顯減少，而兩種探針均不能檢測(cè)從-/-小鼠獲得的RNA樣品中的任何VEGF-B轉(zhuǎn)錄子。這表明靶向的VEGF-B等位基因已被剔除并產(chǎn)生了無(wú)效等位基因，且-/-小鼠沒(méi)有VEGF-B蛋白質(zhì)的合成。雜合子中VEGF-B轉(zhuǎn)錄子水平下降也表明剩下的完整VEGF-B等位基因的轉(zhuǎn)錄未受到補(bǔ)償性正調(diào)。
實(shí)施例9腫瘤的移植和測(cè)量由于已知腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移形成取決于腫瘤組織的新血管發(fā)生，在同窩交配的野生型(+/+)和VEGF-B缺陷型(-/-)小鼠中考察了移植腫瘤的生長(zhǎng)。在該試驗(yàn)中使用了雄性的VEGF-B缺陷型(-/-)和同窩交配的純合子C57B1/6小鼠(+/+)。皮內(nèi)注射小鼠T241纖維肉瘤。植入腫瘤細(xì)胞前用甲氧氟烷麻醉6至8周齡小鼠。然后將生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的1×106T241小鼠纖維肉瘤細(xì)胞懸浮于100μl PBS中，并皮下植入各小鼠的背部中線。在各動(dòng)物中測(cè)量腫瘤的生長(zhǎng)。觀察腫瘤并使用卡鉗隔日測(cè)量。使用公式寬2×長(zhǎng)×0.52[參見(jiàn)Boehm等，自然，390404-407(1997)]計(jì)算腫瘤體積。
結(jié)果在圖6中表示。從圖中可看出腫瘤的生長(zhǎng)在-/-動(dòng)物中比+/+動(dòng)物中明顯緩慢。似乎在指數(shù)生長(zhǎng)期前是啟動(dòng)期，該時(shí)期在突變體動(dòng)物中更長(zhǎng)，+/+動(dòng)物中的天數(shù)大約為18-20天，而在-/-動(dòng)物中為30-32天。結(jié)果表明，VEGF-B很可能通過(guò)影響腫瘤的基質(zhì)而影響腫瘤的血管發(fā)生。這一結(jié)論的得出是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞很可能表達(dá)內(nèi)源性VEGF-B，而在突變體動(dòng)物中觀察到該效應(yīng)。
該結(jié)果有助于直接影響內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)或間接影響諸如細(xì)胞外基質(zhì)的遷移，降解等。在每種情況下，該結(jié)果表明VEGF-B在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮作用且表明根據(jù)對(duì)VEGF-B作用的抑制可開(kāi)發(fā)抗腫瘤方案，例如經(jīng)過(guò)使用單克隆抗體阻斷VEGF-B與VEGFR-1的結(jié)合，或以小分子結(jié)合VEGFR-1，或用抗VEGF-B療法，或結(jié)合兩種或更多種上述方法。
上面提供的描述和實(shí)施例僅僅用于說(shuō)明本發(fā)明且并不是用于限制。由于本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)引入本發(fā)明實(shí)質(zhì)和基礎(chǔ)的所公開(kāi)的實(shí)施方案進(jìn)行修飾，因此本發(fā)明的構(gòu)成應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的各種情況和其等價(jià)物。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人VON EULER，GabrielAASE，KarinBETSHOLTZ，ChristerERISKSSON，UlfPEKNY，MilosGEBRE-MEDHIN，SamuelLI，Xuri(ii)發(fā)明名稱(chēng)具有重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-B)DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其用途(iii)序列數(shù)10(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Evenson，McKeown，Edward &
Lenahan，P.L.L.C.
(B)街道1200G大街，N.W.，Suite 700(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國(guó)家USA(F)郵編20005(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型Floppy軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.25版
(vii)優(yōu)先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S60/038,202(B)申請(qǐng)日1997年2月18日(viii)代理人/律師信息(A)姓名EVANS，Joseph D(B)登記號(hào)26,269(C)案號(hào)1064/43342(ix)電信信息(A)電話(202)628-8800(B)電傳(202)628-8844(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGAAGCTCC AGCCGAGCA 19(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO2TAGTGTCTTC CATCTCTTT 19(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCCAGCTGT GTGACTGT18(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4CCCACCCCAT GCTACACT18(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5TGTTCTCCTC TTCCTCATCT CC 22(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6ATTGTCTGTT GTGCCCAGTC 20(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCATGTGTC ACCTTCGCAG 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8TGTCCCTGGA AGAACACAGC C21(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9CGGGAAATCG TGCGTGACAT 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO10GGAGTTGAAG GTAGTTTCGT G2權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生含有修飾的VEGF-B DNA的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的方法，所述的方法包含下列步驟a)將轉(zhuǎn)基因DNA導(dǎo)入非人類(lèi)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因DNA含有修飾的VEGF-B DNA且具有與胚胎干細(xì)胞基因組VEGF-B同源的5’區(qū)和3’區(qū)；b)選擇轉(zhuǎn)基因DNA已整合進(jìn)基因組DNA的胚胎干細(xì)胞；c)將來(lái)自步驟b)的所選的細(xì)胞導(dǎo)入發(fā)育中的動(dòng)物胚泡中，使胚泡發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中與基因組VEGF-B同源的5’區(qū)包含VEGF-B基因外顯子1。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中與基因組VEGF-B同源的3’區(qū)包含VEGF-B基因外顯子7。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中修飾的VEGF-B DNA包含VEGF-B基因的核苷酸序列，其中至少一個(gè)半胱氨酸密碼子被改變或缺失。
5.以權(quán)利要求1、2、3或4之一的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物。
6.一種轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，它是以權(quán)利要求1、2、3或4之一的方法產(chǎn)生的動(dòng)物的后代。
7.權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述的動(dòng)物是小鼠。
8.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述的動(dòng)物是小鼠。
9.含有攜帶修飾的VEGF-B DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物，其中所述修飾的VEGF-B DNA在胚胎期導(dǎo)入動(dòng)物或動(dòng)物的祖先。
10.權(quán)利要求9所述的動(dòng)物，其中修飾的VEGF-B DNA包含經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變，定點(diǎn)誘變，缺失，取代或插入而突變的VEGF-B基因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求10所述的動(dòng)物，其中修飾的VEGF-B DNA至少一個(gè)半胱氨酸密碼子被改變或缺失。
12.權(quán)利要求9所述的動(dòng)物，其中所述的動(dòng)物是嚙齒類(lèi)。
13.權(quán)利要求12所述的動(dòng)物，其中所述的嚙齒類(lèi)是小鼠。
14.從權(quán)利要求9、10、11、12或13之一所述的動(dòng)物分離的細(xì)胞。
15.從權(quán)利要求5所述的動(dòng)物分離的細(xì)胞。
16.含有修飾的VEGF-B DNA的胚胎干細(xì)胞。
17.篩選具有血管發(fā)生或抗血管發(fā)生活性的化合物的方法，所述的方法包括將化合物導(dǎo)入權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物并測(cè)定動(dòng)物中的血管發(fā)生。
18.篩選具有血管發(fā)生活性的化合物的方法，所述的方法包含將化合物與來(lái)自權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一個(gè)生長(zhǎng)細(xì)胞接觸并測(cè)定化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
19.在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中篩選具有腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，所述的方法包括將腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，將該化合物導(dǎo)入同一動(dòng)物并測(cè)定動(dòng)物中的腫瘤形成。
20.篩選具有腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，所述方法包括將化合物與來(lái)自權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞接觸，并測(cè)定對(duì)細(xì)胞的影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有重組DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其中該重組DNA具有來(lái)自血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF－B)基因的修飾的核苷酸序列,還涉及用于產(chǎn)生該動(dòng)物的細(xì)胞和方法,以及使用它們測(cè)定物質(zhì)的VEGF－B樣活性的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1248286SQ98802647
公開(kāi)日2000年3月22日 申請(qǐng)日期1998年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月18日
發(fā)明者加布麗埃勒·文奧伊勒, 卡琳·奧瑟, 克里斯特·貝茨霍爾茨, 烏爾夫·埃里克松, 米洛斯·皮耶克尼, 薩穆埃爾·加布雷-梅津, 李旭日 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所