專利名稱：Fas受體功能的調(diào)節(jié)劑－有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的cash(卡斯酶同系物)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及屬于TNF/NGF受體超家族的受體及其生物功能控制領(lǐng)域。TNF/NGF受體超家族包括的受體例如有p55和p75腫瘤壞死因子受體(TNF-R，也分別稱為CD120a和CD120b，但是在本文中稱為p55-R和p75-R)和FAS配體受體(也稱為FAS/APO1或FAS-R或CD95，但是在本文中稱為FAS-R)和其它受體。更具體地說，本發(fā)明進(jìn)一步涉及與本身結(jié)合MORT-1(或FADD)蛋白的其它蛋白(它們也稱為MORT-1-結(jié)合蛋白)結(jié)合的新蛋白、或直接結(jié)合MORT-1的新蛋白。更具體地說，本發(fā)明涉及這樣一種蛋白，它在本文中命名為G1(現(xiàn)在也命名為“CASH”，即“CASPASE HOMOLOG(卡斯酶同系物)”，但是在本文中稱為G1)，它與MORT-1結(jié)合蛋白Mch4(也命名為/稱為CASP-10)結(jié)合，并且可能還與稱為MACH的另一MORT-1結(jié)合蛋白(也命名為/稱為CASP-8)結(jié)合，并且可能本身直接和MORT-1結(jié)合。
因此，本發(fā)明總地涉及能直接或間接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)MORT-1的功能或結(jié)合MORT-1的其它蛋白的功能的新蛋白。具體地說，本發(fā)明涉及G1、其制備及其用途以及G1的各種新的同種型、其制備及其用途。
相關(guān)技術(shù)背景腫瘤壞死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)(在下文中TNF指TNF-α和TNF-β)是多功能促炎細(xì)胞因子，它主要由單核吞噬細(xì)胞形成，對細(xì)胞有多種作用(Wallach，D.(1986)，Interferon 7(Ion Gresser編輯)，83-122頁，Academic Press，London；和Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通過結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體來發(fā)揮其作用。其中一些作用可能對生物體有利它們可能會破壞(例如)腫瘤細(xì)胞或感染了病毒的細(xì)胞，并增強(qiáng)粒細(xì)胞的抗菌活性。通過這種方式，TNF對于保護(hù)生物體抵御腫瘤和感染性因子以及從損傷中恢復(fù)有貢獻(xiàn)。因此，TNF可用作抗腫瘤劑，在該應(yīng)用中，它結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面上的受體，從而啟動了導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的行為。TNF還可用作抗感染劑。
然而，TNF-α和TNF-β均有有害的作用。有證據(jù)表明，過度產(chǎn)生TNF-α?xí)趲追N疾病中起主要致病作用。例如，已經(jīng)知道，TNF-α主要作用于脈管結(jié)構(gòu)，這是膿毒休克的主要病因(Tracey等，1986)。在一些疾病中，TNF可能會通過抑制脂肪細(xì)胞的活性和引起缺乏食欲而導(dǎo)致體重過度減輕(惡液質(zhì))，因此TNF-α稱為惡液質(zhì)素。另外，它還被描述成是風(fēng)濕性疾病中組織損傷的一種中介體(mediator)(Beutler和Cerami，1987)，以及移植物抗宿主反應(yīng)中所見破壞的主要中介體(Piquet等，1987)。此外，已知TNF參與發(fā)炎過程和其它許多疾病。
兩種不同的、獨(dú)立表達(dá)的受體p55和p75 TNF-R(它們與TNF-α和TNF-β特異性結(jié)合)啟動和/或介導(dǎo)了TNF的上述生物學(xué)效應(yīng)。這兩種受體在結(jié)構(gòu)上有不相似的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，這暗示它們的信號傳導(dǎo)方式不同(參見Hohmann等，1989；Engelmann等1990；Brockhaus等，1990；Leotscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990；和Heller等，1990)。然而，例如涉及p55和p75 TNF-R胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的各種蛋白和可能存在的其它因子的細(xì)胞機(jī)制還沒有得到闡明。正是該胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)(通常在配體(即TNFα或β)結(jié)合受體后發(fā)生)致使級聯(lián)反應(yīng)開始并最終導(dǎo)致所見的細(xì)胞對TNF的反應(yīng)。
關(guān)于上述TNF殺細(xì)胞作用，就目前研究的大多數(shù)細(xì)胞而言，該作用主要由p55 TNF-R引發(fā)?？筽55 TNF-R胞外結(jié)構(gòu)域(配體結(jié)合域)的抗體本身可引發(fā)殺細(xì)胞效應(yīng)(見EP 412486)，該效應(yīng)與受體交聯(lián)抗體的效率相關(guān)，認(rèn)為這是胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程產(chǎn)生的第一步。而且，誘變研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)已經(jīng)表明，p55 TNF-R的生物功能取決于其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的完整性，因此，已提出導(dǎo)致TNF殺細(xì)胞效應(yīng)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)啟動的發(fā)生是p55 TNF-R的兩個或多個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域締合的結(jié)果。而且，TNF(α和β)形成均三聚體，因此，已提出通過p55TNF-R以結(jié)合和交聯(lián)受體分子(即引起受體聚集)的方式來誘導(dǎo)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。
TNF/NGF受體超家族的另一個成員是FAS受體(FAS-R)(也稱為FAS抗原)，它是在各種組織中表達(dá)的一種細(xì)胞表面蛋白，它與許多細(xì)胞表面受體(包括TNF-R和NGF-R)同源。FAS-R以細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡(凋亡)方式介導(dǎo)細(xì)胞死亡(Itoh等，1991)，并且好象是自身反應(yīng)T細(xì)胞的陰性選擇物，即，在T細(xì)胞成熟期間，F(xiàn)AS-R介導(dǎo)了識別自身抗原的T細(xì)胞發(fā)生凋亡。也已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS-R基因(lpr)中的突變在小鼠中引起了與人自身免疫疾病—系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)—相似的淋巴細(xì)胞增生疾病(Watanabe-Fukunaga等，1992)。FAS-R的配體看來是其它細(xì)胞中殺傷性T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞-CTL)中攜帶的細(xì)胞表面相關(guān)分子，因此，當(dāng)該CTL接觸攜帶FAS-R的細(xì)胞，它們能誘導(dǎo)攜帶FAS-R的細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。另外，已經(jīng)制得對FAS-R有特異性的單克隆抗體，該單克隆抗體能誘導(dǎo)攜帶FAS-R的細(xì)胞(包括被編碼人FAS-R的cDNA轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡(Itoh等，1991)。
盡管淋巴細(xì)胞的一些細(xì)胞毒性效應(yīng)是通過淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的配體與廣泛存在的細(xì)胞表面受體FAS-R(CD95)(它能引發(fā)細(xì)胞死亡)的相互作用而誘導(dǎo)的，但是也已發(fā)現(xiàn)，除T淋巴細(xì)胞外的其它各種正常細(xì)胞也在其表面表達(dá)FAS-R，并且能通過觸發(fā)該受體而被殺死。懷疑是由于對該殺死過程的失控性誘導(dǎo)而導(dǎo)致了某些疾病中組織破壞(例如急性肝炎中的肝細(xì)胞破壞)。因此，尋找方法來抑制FAS-R的細(xì)胞毒性活性可能會有治療潛力。
相反，由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些惡性細(xì)胞和HIV感染的細(xì)胞在其表面攜帶了FAS-R，因此可利用抗FAS-R的抗體或FAS-R配體來引發(fā)這些細(xì)胞中的FAS-R介導(dǎo)的胞毒作用，從而提供了一種抵抗這些惡性細(xì)胞或HIV-感染的細(xì)胞的方法(見Itoh等，1991)。因此，尋求其它方法來增強(qiáng)FAS-R胞毒活性可能也會有治療潛力。
提供一種調(diào)節(jié)對TNF(α或β)和FAS-R配體的細(xì)胞反應(yīng)的方法是人們長期以來的需求。例如，在上述病理場合下，當(dāng)TNF或FAS-R配體過度表達(dá)時，就需要抑制TNF或FAS-R配體誘導(dǎo)的殺細(xì)胞效應(yīng)，而在其它場合，例如傷口愈合的應(yīng)用中，則希望增強(qiáng)TNF的效應(yīng)，或在FAS-R情況下，在腫瘤細(xì)胞或HIV感染的細(xì)胞中，希望增強(qiáng)FAS-R介導(dǎo)的效應(yīng)。
申請人已經(jīng)用了各種方法(例如參見歐洲專利申請No.EP 186833，EP 308378，EP398327和EP412486)來調(diào)節(jié)TNF的有害作用，方法是用抗TNF抗體或可溶性TNF受體(基本上是此受體的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域)與TNF競爭和細(xì)胞表面TNF-R結(jié)合，從而抑制TNF與其受體結(jié)合。另外，由于TNF與其受體的結(jié)合是TNF誘導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)所需的，因此申請人已經(jīng)設(shè)法通過調(diào)節(jié)TNF-R的活性來調(diào)節(jié)TNF的作用(例如參見EPO 568925)。
簡言之，EPO568925涉及一種調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或TNF-R中斷裂的方法，從而肽或其它分子可與受體本身或與該受體起反應(yīng)的效應(yīng)蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)了TNF-R的正常功能。在EPO 568925中，描述了在p55 TNF-R的胞外、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中有突變的各種p55 TNF-R突變體的構(gòu)建和性質(zhì)分析。這樣，p55TNF-R的上述結(jié)構(gòu)域內(nèi)的區(qū)域被確定為受體功能(即與配體(TNF)結(jié)合以及隨后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致所見的TNF對細(xì)胞的效應(yīng))所必需的。而且，該文還描述了許多分離和鑒定蛋白、肽或其它因子的方法，這些蛋白、肽或其它因子能結(jié)合TNF-R上述結(jié)構(gòu)域內(nèi)的不同區(qū)域，可能參與了TNF-R活性的調(diào)節(jié)或調(diào)控。在EPO 568925中還描述了分離和克隆編碼這些蛋白和肽的DNA序列的一些方法；構(gòu)建表達(dá)載體來產(chǎn)生這些蛋白和肽的方法；與TNF-R或與結(jié)合TNF-R不同區(qū)域的上述蛋白和肽相互作用的抗體或其片段的制備方法。然而，EPO568925沒有指明結(jié)合TNF-R(如p55 TNF-R)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的實際蛋白和肽，也沒有描述用來分離和鑒定結(jié)合了TNF-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的這些蛋白和肽的酵母雙雜交方法。同樣，EPO 568925也沒有公開能結(jié)合FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的蛋白或多肽。
因此，當(dāng)希望抑制TNF或FAS-R配體的作用時，需要減少細(xì)胞表面的TNF-R或FAS-R的活性量，而當(dāng)需要增強(qiáng)TNF或FAS-R配體的效應(yīng)時，希望增加TNF-R或FAS-R的活性量。出于這一目的，已經(jīng)對p55 TNF-R和p75 TNF-R的啟動子進(jìn)行了測序分析，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多對不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有特異性的一些關(guān)鍵序列基序，因此可以在其啟動子水平來控制這些TNF-R的表達(dá)，即通過抑制啟動子的轉(zhuǎn)錄來減少受體數(shù)量，增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄來增加受體數(shù)量(EP 606869和WO9531206)。關(guān)于在FAS-R基因的啟動子水平上控制FAS-R的相應(yīng)研究還未有報道。
盡管已經(jīng)知道腫瘤壞死因子(TNF)受體和結(jié)構(gòu)上相關(guān)的受體FAS-R在受白細(xì)胞產(chǎn)生的配體刺激時在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞自身死亡的破壞性活性，但是對該引發(fā)的機(jī)制仍知之甚少。突變研究表明，在FAS-R和p55 TNF受體(p55-R)中，細(xì)胞毒性的信號傳導(dǎo)涉及其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的不同區(qū)域(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)。這些區(qū)域(“死亡域”或“死亡效應(yīng)域”，稱為“DED”)的序列相似。FAS-R和p55-R的“死亡域”均有自身締合(self-associate)的趨勢。它們的自身締合明顯促進(jìn)了信號傳導(dǎo)作用啟動所需的受體聚集(見Song等，1994；Wallach等，1994；Boldin等，1995)，且高水平的受體表達(dá)會導(dǎo)致引發(fā)不依賴于配體的信號傳導(dǎo)(Boldin等，1995)。
一些淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)受淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的配體和FAS-R(CD-95)相互作用所介導(dǎo)，F(xiàn)AS-R是一種廣泛存在的細(xì)胞表面受體，它能引發(fā)細(xì)胞死亡(另見Nagata和Golstein，1995)；而單核吞噬細(xì)胞殺死細(xì)胞作用涉及配體-受體結(jié)合(TNF及其受體p55-R(CD120))，它們在結(jié)構(gòu)上于FAS-及其配體相關(guān)(另見Vandenabeele等，1995)。和其它受體誘導(dǎo)的效應(yīng)一樣，TNF受體和FAS-R通過一系列蛋白-蛋白相互作用(從配體-受體結(jié)合到最終激活酶促效應(yīng)功能)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，在研究中已經(jīng)描述啟動細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)作用的非酶促蛋白-蛋白相互作用TNF或FAS-R配體三聚體分子與受體結(jié)合，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)由于死亡域基序(或死亡效應(yīng)域，DED)自身締合的趨勢而增強(qiáng)(Boldin等，1995a)，并誘導(dǎo)兩種細(xì)胞質(zhì)蛋白(這兩種蛋白也能相互結(jié)合)與受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合-MORT-1(或FADD)與FAS-R結(jié)合(Boldin等，1995b；Chinnaiyan等，1995；Kischkel等，1995)，TRADD與p55-R結(jié)合(Hsu等，1995；Hsu等，1996)。用酵母雙雜交篩選程序鑒定出三種蛋白，這些蛋白與FAS-R和p55-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的“死亡域”結(jié)合，通過同源區(qū)域的異質(zhì)性締合來參與受體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且還能獨(dú)立地引發(fā)細(xì)胞死亡。它們中的一種蛋白是MORT-1(Boldin等，1995b)，也稱為FADD(Chinnaiyan等，1995)，它能特異性地結(jié)合FAS-R。第二種是TRADD(另見Hsu等，1995)，它與p55-R結(jié)合，第三種是RIP(另見Stanger等1995)，它于FAS-R和p55-R結(jié)合。這些蛋白除了能結(jié)合FAS-R和p55-R外，它們還能相互結(jié)合，從而在FAS-R和p55-R之間提供了功能性“串話(crosstalk)”。這些結(jié)合發(fā)生在受體及其締合蛋白中共有的保守序列基序—“死亡域組件”(也稱為“死亡效應(yīng)域”，即“DED”)中。另外，盡管在酵母雙雜交測試中，MORT-1顯示出自發(fā)結(jié)合FAS-R，但是在哺乳動物細(xì)胞中，這一結(jié)合只有在受體受刺激后才會發(fā)生，這暗示MORT-1參與了FAS-R信號傳導(dǎo)的啟動行為。MORT-1不含酶活性特征的序列基序，因此，它引發(fā)細(xì)胞死亡的能力看來似乎并不是MORT-1本身固有的活性，而是激活了結(jié)合MORT-1的其它一些蛋白，并進(jìn)一步作用于信號級聯(lián)途徑的下游。分子缺少N端部分的MORT-1突變體的細(xì)胞表達(dá)已經(jīng)顯示出能阻斷FAS/APO1(FAS-R)或p55-R誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，這說明此N端區(qū)域通過蛋白-蛋白的相互作用傳遞了兩種受體殺細(xì)胞效應(yīng)的信號。
最近的研究已經(jīng)暗示了一組胞質(zhì)硫醇蛋白酶，它們在各種生理性細(xì)胞死亡過程開始時與Caenorhabdits elegans蛋白酶CED3和哺乳動物白介素-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)在結(jié)構(gòu)上相關(guān)(回顧見Kumar，1995和Kenkart，1996)。也有一些跡象表明該家族的蛋白酶可能參與了FAS-R和YNF-R誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)這些蛋白酶的特異性肽抑制劑以及封閉其功能的兩種病毒編碼的蛋白(牛痘蛋白crmA和桿狀病毒p35蛋白)為細(xì)胞提供了抗此細(xì)胞毒性的保護(hù)(Enari等，1995；Los等，1995；Tewari等，1995；Xue等，1995；Beidler等，1995)。某些特異性細(xì)胞蛋白的迅速斷裂明顯是由CED3/ICE家族蛋白酶介導(dǎo)的，這可在FAS-R或TNF-R刺激后不久在細(xì)胞內(nèi)得到證實。
應(yīng)當(dāng)注意，這些CED3/ICE蛋白酶(也稱為卡斯酶)以無活性前體形式產(chǎn)生，并在誘導(dǎo)死亡時被蛋白水解加工激活。這些卡斯酶是保守的半胱氨酸蛋白酶，它們特異性切割天冬氨酸殘基下游的細(xì)胞蛋白，從而在所有已知的編程性細(xì)胞死亡過程中起關(guān)鍵作用。除了從成熟蛋白酶衍生的同源C端區(qū)域，該前體蛋白還含有獨(dú)特的N-端區(qū)域。這些“前域(prodomain)”與特異性調(diào)節(jié)分子相互作用，使得各種卡斯酶被不同的死亡誘導(dǎo)信號差異性地激活(Boldin等，1996；Muzio等，1996；Duan和Dixit，1997；Van Criekinge等，1996；Ahmad等，1997)。
最近，已經(jīng)分離、克隆并鑒定出這樣一種蛋白酶及其各種同種型(包括抑制性的同種型)，命名為MACH(也稱為CASP-8)，它是一種MORT-1結(jié)合蛋白，作用是調(diào)節(jié)MORT-1活性進(jìn)而調(diào)節(jié)FAS-R和p55-R的活性，它還能獨(dú)立地作用于MORT-1，關(guān)于其可能的用途在共同擁有的待批以色列專利申請No.IL 114615，114986，115319，116588和117932及其對應(yīng)的PCT申請No.PCT/US96/10521和本發(fā)明者最近的出版文獻(xiàn)(Boldin等，1996)中有詳細(xì)描述，它們?nèi)考{入本文作參考。本發(fā)明者(未公開)和其它人(Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)最近還分離和鑒定出另一種此類蛋白酶及其各種同種型(包括抑制的同種型)，其命名為Mch4(也稱為CASP-10)。該Mch4蛋白也是一種MORT-4結(jié)合蛋白，其作用是調(diào)節(jié)MORT-1的活性，因此可能也能調(diào)節(jié)FAS-R和p55-R的活性，它也能獨(dú)立作用于MORT-1。因此，上述文獻(xiàn)中也描述了關(guān)于Mch4的所有方面、特征、性質(zhì)和用途，所有這些文獻(xiàn)均全部納入本文作參考。
還應(yīng)注意，卡斯酶、MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)具有相似的前域(見Boldin等，1996；Muzio等，1996；Fernandes-Alnemri等，1996；Vincent和Dixit，1997)，它們通過其前域與MORT-1相互作用，該作用是通過MORT-1 N端部分中的、和MACH(CASP-8)與Mch4(CASP-10)中重復(fù)存在的“死亡域基序”或“死亡效應(yīng)域”DED而發(fā)生(見Boldin等，1995b；Chinnalyan等，1995)。
還應(yīng)提到的是，從上文來看，涉及胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程導(dǎo)致細(xì)胞死亡的各種蛋白/酶/受體有不同的名稱，為了理清混亂，下面是各種名稱的一覽表，包括這些蛋白的每一個或部分按新規(guī)則所確定的新名稱、以及為方便起見在本文所用的名稱。常用或首次名稱其它名稱 新慣例名稱 本文所用名稱p55 TNF受體 p55-RCD120a p55-Rp75 TNF受體 p75-RCD120 p75-RFAS受體 FAS-R，F(xiàn)AS/APO1 CD95FAS-RMORT-1FADD - MORT-1MACH FLICE1，Mch5 CASP-8 MACHMch4 FLICE2 CASP-10 Mch4G1-CASHG1“死亡域” 死亡域基序，MORT基序，死亡- 死亡域/死亡域基效應(yīng)域(DED)，MORT組件 序/MORT組件CED3/ICE蛋白酶 卡斯酶CASPCED3/ICE蛋白酶發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供新的蛋白質(zhì)，包括其所有的同種型、類似物、片段或衍生物，它們能與MORT-1結(jié)合蛋白(例如上述Mch4和MACH蛋白)及其同種型結(jié)合，或能和MORT-1本身結(jié)合。由于MORT-1本身和FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，本發(fā)明的新蛋白質(zhì)通過結(jié)合MORT-1結(jié)合蛋白因而間接地結(jié)合MORT-1、或直接結(jié)合MORT-1蛋白，因此它們能影響由FAS配體結(jié)合其受體而啟動的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程，因此，本發(fā)明的新蛋白是FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。由于MORT-1還通過參與調(diào)節(jié)p55-R來參與調(diào)節(jié)TNF對細(xì)胞的效應(yīng)，因此本發(fā)明的新蛋白也被認(rèn)作是由p55-R介導(dǎo)的TNF對細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。同樣，按照上述對FAS-R和p55-R介導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用類推，本發(fā)明的蛋白可能也是其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑的中介體或調(diào)節(jié)劑，通過本發(fā)明的蛋白(例如G1及其同種型)所涉及的共同的或相關(guān)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑來運(yùn)作。本發(fā)明的這些新蛋白被命名為“G1”蛋白，如上所述，包括G1蛋白(下文列舉的蛋白)、它的所有的同種型、類似物、片段或衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述新的G1蛋白、其同種型、類似物、片段和衍生物的拮抗劑(例如抗體、肽、有機(jī)化合物或者甚至是一些同種型)，該拮抗劑可在需要時用來抑制信號傳導(dǎo)過程(或更具體地說是細(xì)胞毒性)。
本發(fā)明的另一個目的是用上述新的G1蛋白、其同種型、類似物、片段和衍生物來分離鑒定可能參與調(diào)節(jié)受體活性的其它蛋白或因子(例如切割新蛋白使其具有生物活性的其它蛋白酶)，和/或用來分離和鑒定處于信號傳遞過程更上游的其它受體，這些受體(如其它FAS-R或相關(guān)受體)與這些新蛋白、類似物、片段和衍生物結(jié)合，且因此在其功能中也被牽涉到。
本發(fā)明的另一目的是提供一些抑制劑，這些抑制劑能被引入細(xì)胞，與G1蛋白及其可能的有蛋白酶活性的G1同種型(該G1蛋白具有與Mch4和MACH蛋白水解區(qū)同源的區(qū)域)結(jié)合或相互作用，并抑制它們的胞內(nèi)活性(對于至少一些可能的G1同種型來說可能有蛋白水解活性)。
此外，本發(fā)明的另一目的是運(yùn)用上述的新的G1蛋白、其同種型和類似物、片段和其衍生物作為抗原，來制備針對它們的多克隆抗體或/和單克隆抗體。反過來，這些抗體(例如)可用于從不同來源(如細(xì)胞提抽物、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系)中純化這些新的蛋白質(zhì)。
并且，這些抗體可用于診斷目的，如在鑒定由FAS-R或其它相關(guān)受體介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)功能異常有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一些藥物組合物，它們含有上述新的G1蛋白、其同種型、或類似物、片段或衍生物，而且還提供了含有上述抗體或其它拮抗劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明，分離出一種新的G1蛋白，它能與本身結(jié)合MORT-1的Mch4結(jié)合或相互作用，而MORT-1與FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。G1還能和稱為MACH的另一MORT-1結(jié)合蛋白相互作用，也能直接和MORT-1結(jié)合或相互作用。G1可能作為FAS配體與細(xì)胞表面FAS-R的結(jié)合而啟動的細(xì)胞死亡通路的調(diào)節(jié)劑組分而發(fā)揮功能，這憑以下事實，即G1具有類似于Mch4和MACH蛋白水解區(qū)域的蛋白水解區(qū)域而知，因此G1也可以是活性細(xì)胞內(nèi)蛋白酶。而且，根據(jù)G1(尤其是其蛋白水解區(qū)域)表達(dá)中的轉(zhuǎn)錄/翻譯過程，可能會表達(dá)出一些沒有活性蛋白水解區(qū)域的G1同種型，因此這些同種型可作為(例如)Mch4和MACH介導(dǎo)的蛋白水解活性的拮抗劑。在FAS-R引發(fā)的凋亡過程中已經(jīng)牽連到CED3/ICE家族的蛋白酶。MORT-1(或FADD)在FAS-R激活時與該受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而本發(fā)明的新的G1蛋白則與MORT-1結(jié)合蛋白(如Mch4)結(jié)合，可能也和MACH結(jié)合或直接與MORT-1結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明克隆和鑒定出的G1蛋白可能以多種同種型形式存在，其中一些同種型具有CED3/ICE同源區(qū)，其具有類似于Mch4和MACH的一些同種型的蛋白水解活性(蛋白水解區(qū)域)，當(dāng)其在細(xì)胞中表達(dá)時可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，該新的CED3/ICE同系物(即具有蛋白水解區(qū)的各種G1同種型)被FAS-R激活(通過直接或間接作用于MORT-1)看來是構(gòu)成了FAS-R-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑的效應(yīng)元件。
而且，G1看來還是作為由TNF和細(xì)胞表面p55-R結(jié)合而啟動的細(xì)胞死亡途徑的效應(yīng)元件而起作用，其利用的間接機(jī)理是MORT-1與結(jié)合p55-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的TRADD(Hsu等，1995)結(jié)合，然后是G1與MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4或MACH)結(jié)合、或直接與MORT-1結(jié)合，從而將G1激活成影響細(xì)胞死亡的活性蛋白酶。
應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管G1表現(xiàn)出至少一些CED3/ICE蛋白酶功能的關(guān)鍵序列特征，但是它也有其自身的某些區(qū)別性序列特征，這些區(qū)別性序列特征賦予其獨(dú)特而可能的組織/細(xì)胞特異性作用模式。
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種命名為G1的新蛋白。該G1蛋白通過雙雜交篩選試驗被分離并克隆，并經(jīng)鑒定是結(jié)合Mch4的分子。上述Mch4是一種MORT-1結(jié)合蛋白，它能影響細(xì)胞的死亡，但是也應(yīng)注意，Mch4的一些同種型有相反的效應(yīng)，即，它們抑制細(xì)胞的殺傷。而且，對G1進(jìn)行測序還發(fā)現(xiàn)，G1的N端區(qū)域有兩個所謂的“MORT組件(mort module)(MM)，這兩個組件也發(fā)現(xiàn)存在于MORT-1結(jié)合蛋白MACH和Mch4中。G1中的這些MORT組件看來是其能與Mch4結(jié)合的原因，還可能是它能直接結(jié)合MORT-1以及結(jié)合MACH或特異性MACH同種型(MACH的特異性剪接變體)的基礎(chǔ)。在G1序列中，在含有MORT組件的N端區(qū)域下游看來還有一個較長的區(qū)域，該區(qū)域顯示出與MACH和Mch4蛋白水解區(qū)域有相似性。而且，從G1序列在人染色體中可能位置的原始分析來看，似乎G1位于第2條染色體上，這非常接近Mch4和MACH的位置，這也暗示了G1、MACH和Mch4之間的關(guān)系。
更具體地說，根據(jù)本發(fā)明，至少發(fā)現(xiàn)了G1的三種可能的同種型(見下文實施例1)。其中兩種已被分離和克隆，看來它們是新蛋白(命名為G1(或CASH))的兩種剪接變體。這兩種同種型，較大的同種型稱為G1α(或CASHα)，較小的同種型稱為G1β(CASHβ)(雖然表現(xiàn)出一個以上的短同種型，因此G1β也命名為G1β1，另一個短的同種型被命名為G1β2—見下文實施例1)。這些G1α和β同種型各自含有兩個N端死亡域基序/MORT組件，并能通過這些死亡域基序相互結(jié)合，還能通過這些死亡域基序與MORT1、MACH和Mch4結(jié)合。較長的G1α同種型具有獨(dú)特的C端部分(與較短的G1β同種型相比)，該獨(dú)特的C端部分的序列與卡斯酶蛋白酶活性區(qū)域的序列同源。關(guān)于生物活性，較短的G1β同種型抑制由p55-R和FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞死亡/細(xì)胞毒性，而相反，較長的G1α同種型對至少一些類型的細(xì)胞(如293細(xì)胞)有細(xì)胞毒性效應(yīng)，該細(xì)胞毒性涉及其蛋白酶同源區(qū)域。然而，也應(yīng)注意，較長的G1α同種型也能抑制其它類型細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞)中FAS-R和p55-R介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明，G1(即其各種同種型)可作為p55-R和FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)的減毒劑/抑制劑和/或引導(dǎo)劑(initiator)/增強(qiáng)劑。
也應(yīng)注意，為了描述清楚，G1的各種同種型(例如G1α和G1β)在本文中通常簡單地稱為“G1”，但是也應(yīng)理解，在這些情況下，“G1”的意思包括了G1所有的同種型，這樣這可以指細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)劑/增強(qiáng)劑，也可指細(xì)胞毒性的抑制劑/減毒劑。當(dāng)指特定的G1同種型時，則會具體地指出名字，例如G1α或G1β。因此，當(dāng)用籠統(tǒng)地用“G1”來指各種同種型時，在本文中“G1”也常被稱為“調(diào)節(jié)劑”，這意味著它對所談?wù)摰纳锘钚杂幸种苹蛟鰪?qiáng)作用。
鑒于上述內(nèi)容，因此如上文和下文所述的，G1明顯是MORT-1活性的調(diào)節(jié)劑，因此是FAS-R、p55-R、TNF/NGF受體家族中可能的其它受體、以及可能享有共同的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)元件和機(jī)制的其它受體所介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。
因此，由于G1明顯有蛋白酶類似區(qū)域(至少是其長的同種型)，因此它可能直接負(fù)責(zé)由各種刺激(包括通過TNF/NGF受體家族的受體和其它可能的受體傳遞的刺激)引起或誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和炎癥。
G1還可能通過其作為和其它蛋白形成的復(fù)合體中的一部分來起細(xì)胞毒性和炎癥抑制劑的作用，因此可能影響了這些其它蛋白(如MACH和Mch4或甚至是MORT-1)的細(xì)胞毒性或炎性效應(yīng)，最終導(dǎo)致抑制它們的細(xì)胞毒性活性或炎癥活性。
G1還可作為細(xì)胞毒性和炎癥的增強(qiáng)劑或促進(jìn)劑，它通過與其它蛋白(例如Mch4和MACH或甚至是MORT-1)結(jié)合來增強(qiáng)它們的活性，增強(qiáng)它們與MORT-1的結(jié)合或獨(dú)立作用于MORT-1，在這兩種情況下，均起著增強(qiáng)各種蛋白的細(xì)胞毒性或炎性的作用。
同樣，G1還能以類似方式起著也有G1激活所涉及途徑的其它胞內(nèi)中介體或調(diào)節(jié)劑的抑制劑或增強(qiáng)劑的作用。
MORT-1(“受體毒性的中介體”，Boldin等，1995b)能與FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。該FAS-結(jié)合蛋白看來可作為FAS-R配體對細(xì)胞效應(yīng)的中介體或調(diào)節(jié)劑，它能介導(dǎo)或調(diào)節(jié)通常發(fā)生于FAS-R配體結(jié)合到細(xì)胞表面之后的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程。除了其FAS-結(jié)合特異性外，MORT-1還顯示出有其它特征(見參考實施例1)，例如，它具有與p55-TNF-R和FAS-R“死亡域”(DD)(p55-DD和FAS-DD)同源的區(qū)域，從而還能自身締合。MORT-1還能激活其自身的細(xì)胞毒性，該活性可能與其自身締合的能力有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)，MORT-1中含有“死亡域”同源序列的區(qū)域(MORT-DD，存在于MORT-1的C端部分)的共同表達(dá)強(qiáng)烈地干擾了FAS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這可從其能與FAS-IC的“死亡域”結(jié)合預(yù)計到。而且，在同一實驗條件下，發(fā)現(xiàn)不含MORT-DD區(qū)域的MORT-1部分(MORT-1的N端部分，氨基酸1-117，“MORT-1頭部”)的共同表達(dá)不會干擾FAS-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而且還一定程度地增強(qiáng)了FAS-誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
因此，MORT-1可能還與參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的其它蛋白結(jié)合。因此，這些MORT-1結(jié)合蛋白也可能作為FAS-R配體對細(xì)胞效應(yīng)的間接中介體或調(diào)節(jié)劑通過介導(dǎo)或調(diào)節(jié)MORT-1的活性起作用；或者，這些MORT-1結(jié)合蛋白可能直接作為MORT-1相關(guān)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的中介體或調(diào)節(jié)劑通過介導(dǎo)或調(diào)節(jié)MORT-1的活性起作用，如上所述，它具有激活細(xì)胞毒性的明顯獨(dú)立的能力。這些MORT-1結(jié)合蛋白還可用于各種標(biāo)準(zhǔn)篩選程序中，以分離、鑒定和分析其它蛋白、肽、因子、抗體等，這些蛋白、肽、因子、抗體等可能參與MORT-1相關(guān)的或FAS-R相關(guān)的信號傳導(dǎo)過程，或者可能是其它胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的元件。已經(jīng)分離出這些MORT-1結(jié)合蛋白，它們在上述的共同擁有待批以色列專利申請No.IL114615，114986，115319，116588和117932及其對應(yīng)的PCT申請No.PCT/US96/10521(關(guān)于MACH及其同種型)和Fernandes-Alnemr等(1996)以及Srinivasula等(1996)(關(guān)于Mch4和其它此類＂Mch＂蛋白)的文獻(xiàn)中有所描述。這些MORT-1結(jié)合蛋白中的一種(上述的MACH)已被先克隆、測序并作了部分性質(zhì)鑒定，具有下列性質(zhì)MACHcDNA編碼ORF-B開放讀框；MACH以非常強(qiáng)的和特異性方式結(jié)合MORT-1；MORT-1中MACH結(jié)合位點(diǎn)在MORT-1“死亡域”基序的上游；MACH的ORF-B區(qū)是和MORT-1相互作用的部分；MACH能自身締合并且其自身能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。而且，上述共同擁有的、待批專利申請以及Boldin等(1996)中提出的后期分析表明，MACH確實以多種同種型形式存在。而且，上述MACH ORF-B實際上是一種MACH同種型，其命名為位MACHβ1。在關(guān)于Mch4的上述出版物中，也表明該蛋白也與MORT-1(或FADD)結(jié)合，并直接涉及MORT-1的細(xì)胞毒性或不依賴MORT-1而是利用其蛋白水解活性的細(xì)胞毒性。
因此，本發(fā)明提供了一種DNA序列，該序列編碼的G1蛋白、其類似物或片段能直接或間接和MORT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4或MACH)結(jié)合或相互作用，所述G1蛋白、其類似物或片段能介導(dǎo)由FAS-R或p55-TNF-R介導(dǎo)的胞內(nèi)效應(yīng)，所述G1蛋白、其類似物或片段還能介導(dǎo)或調(diào)節(jié)其能直接或間接結(jié)合的其它胞內(nèi)蛋白的胞內(nèi)效應(yīng)。
具體地說，本發(fā)明提供了一種選自下列的DNA序列(a)衍生自天然G1蛋白編碼區(qū)的cDNA序列；(b)能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)序列雜交并編碼有生物活性的G1蛋白的DNA序列；和(c)與(a)和(b)所確定的DNA序列遺傳密碼簡并的、且能編碼有生物活性的G1蛋白的DNA序列。
本發(fā)明上述DNA序列的另一個具體的實例是這樣一種DNA序列，它至少包含編碼(至少)一種G1蛋白同種型的序列部分。上述DNA序列的另一個實例是編碼
圖1所示G1蛋白(G1α同種型)的序列。另一個這樣的實例是圖2所示第2種G1同種型(G1β同種型)。
本發(fā)明提供的G1蛋白及其類似物、片段或衍生物由本發(fā)明上述任一序列編碼，所述蛋白、類似物、片段和衍生物能直接或間接和MORT-1和/或任一MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4或MACH)結(jié)合或相互作用，能介導(dǎo)由FAS-R或p55-TNF-R或所述G1蛋白、類似物、片段或衍生物能直接或間接與之結(jié)合的任何其它細(xì)胞毒性誘導(dǎo)介質(zhì)所介導(dǎo)的胞內(nèi)效應(yīng)。
本發(fā)明的具體實例是G1蛋白、其類似物、片段和衍生物。另一個實例是G1蛋白、其類似物、片段和衍生物的任一同種型。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明上述G1蛋白、其類似物、片段和衍生物的載體，該載體含有本發(fā)明的上述DNA序列，這些載體能在合適的真核或原核宿主細(xì)胞中表達(dá)；本發(fā)明還提供了含有這些載體的轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生本發(fā)明的G1蛋白、或類似物、片段或衍生物的方法，該方法是使這些經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適合表達(dá)所述蛋白、類似物、片段或衍生物的條件下生長，實現(xiàn)獲得所述蛋白所需的翻譯后修飾，從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基或所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞抽提物中抽提出所述表達(dá)的蛋白、類似物、片段或衍生物。上述定義包括G1蛋白的所有同種型。
另一方面，本發(fā)明提供了對本發(fā)明的G1蛋白、其類似物、片段和衍生物有特異性的抗體或其活性衍生物或片段。
本發(fā)明還有一個方面是提供上述DNA序列或其編碼蛋白的各種用途，總地來說，根據(jù)本發(fā)明，這些用途包括下列(A)一種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的方法，該方法包括用本發(fā)明上述一種或多種G1蛋白、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞的所述處理包括將所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物以適合細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物的核苷酸序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)；和(B)一種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程方法，該方法包括用介導(dǎo)所述細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的一種或多種蛋白/酶的一種或多種抑制劑處理所述細(xì)胞，所述抑制劑選自(i)能抑制所述細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的一種或多種本發(fā)明的G1蛋白、類似物、片段或衍生物；和(ii)當(dāng)所述一種或多種G1蛋白促進(jìn)/增強(qiáng)或介導(dǎo)所述細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程時選自本發(fā)明的一種或多種G1蛋白的抑制劑。
更具體地說，本發(fā)明的上述方法包括下列具體的實例(i)一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞效應(yīng)的方法，該方法包括用本發(fā)明的一種或多種G1蛋白、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述G1蛋白、類似物、片段或衍生物能直接或間接地結(jié)合MORT-1或能與MORT-1結(jié)合蛋白(如Mch4或MACH)結(jié)合，而MORT-1則直接與FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合；或能直接或間接與MORT-1結(jié)合或與上述MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合，而MORT-1則與結(jié)合p55-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的TRADD結(jié)合，從而能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)所述FAS-R或p55TNF-R的活性，其中對所述細(xì)胞的所述處理包括將所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物以適合細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)。
(ii)一種調(diào)節(jié)上文(i)所述FAS-R配體或TNF對細(xì)胞效應(yīng)的方法，其中所述細(xì)胞的所述處理包括將所述G1蛋白、或其類似物、片段或衍生物以適合細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述G1蛋白、或類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)。
(iii)如上文(ii)所述的方法，其中對所述細(xì)胞的所述處理是用重組動物病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，其包括下列步驟(a)構(gòu)建重組動物病毒載體，該載體攜帶的序列所編碼的病毒表面蛋白(配體)能與攜帶FAS-R或p55-R細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合，該載體攜帶的第二序列所編碼的蛋白選自G1蛋白、及其類似物、片段和衍生物，當(dāng)其在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，它能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)所述FAS-R或p55-R的活性；和(b)用(a)所述的載體感染所述細(xì)胞。
(iv)一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞效應(yīng)的方法，該方法包括用本發(fā)明的抗體或其活性片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述處理是向所述細(xì)胞施加含有所述抗體、其活性片段或衍生物的合適組合物，其中當(dāng)至少部分G1蛋白暴露在細(xì)胞表面時，所述組合物被配制成細(xì)胞外應(yīng)用，當(dāng)所述G1蛋白完全是細(xì)胞內(nèi)時，所述組合物被配制成胞內(nèi)應(yīng)用。
(v)一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞效應(yīng)的方法，該方法包括用編碼至少部分本發(fā)明G1蛋白序列的反義序列的寡核苷酸序列處理所述細(xì)胞，所述寡核苷酸序列能封閉G1蛋白的表達(dá)。
(vi)一種上文(ii)所述處理腫瘤細(xì)胞或HIV感染的細(xì)胞或其它患病細(xì)胞的方法，該方法包括(a)構(gòu)建一個重組動物病毒載體，該載體攜帶的序列所編碼的病毒表面蛋白能與特異性腫瘤細(xì)胞表面受體或HIV感染的細(xì)胞表面受體或其它患病細(xì)胞攜帶的受體結(jié)合，載體還包含了編碼選自本發(fā)明G1蛋白、類似物、片段和衍生物的蛋白的序列，當(dāng)其在所述腫瘤細(xì)胞、HIV感染的細(xì)胞或其它患病細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時它能殺死所述細(xì)胞；和(b)用(a)所述的載體感染所述腫瘤細(xì)胞、HIV感染的細(xì)胞或其它患病細(xì)胞。
(vii)一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對細(xì)胞效應(yīng)的方法，該方法包括采用核酶步驟，將載體以允許所述核酶序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，該載體編碼的核酶序列能與編碼本發(fā)明G1蛋白的細(xì)胞mRNA序列相互作用，其中當(dāng)所述核酶序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，它與所述細(xì)胞mRNA序列相互作用并切割所述mRNA序列，從而抑制所述G1蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
(viii)一種選自本發(fā)明方法的方法，其中所述編碼G1蛋白的序列包含本發(fā)明的G1同種型、類似物、片段和衍生物中至少一種的編碼序列，這些G1同種型、類似物、片段和衍生物能直接或間接和MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4和MACH)結(jié)合，而MORT-1再與FAS-IC特異性結(jié)合；或能直接或間接和MORT-1或上述MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合，而MORT-1再結(jié)合TRADD，TRADD再結(jié)合p55-IC。
(ix)一種分離和鑒定本發(fā)明蛋白的方法，該蛋白能直接或間接結(jié)合MORT-1蛋白或MORT-1結(jié)合蛋白，該方法包括采用酵母雙雜交步驟，其中一個雜交載體攜帶了編碼所述MORT-1蛋白或MORT-1結(jié)合蛋白的序列，第二個雜交載體攜帶了來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，然后用這些載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離出陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后抽提所述第二雜交載體，以獲得編碼和所述MORT-1蛋白或所述MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合的蛋白的序列。
(x)根據(jù)上文(i)-(ix)所述的方法，其中所述G1蛋白是G1、其類似物、片段和衍生物的任何一種同種型。
(xi)根據(jù)上文(i)-(x)所述的方法，其中G1蛋白或其任何同種型、類似物、片段或衍生物參與調(diào)節(jié)由其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑介導(dǎo)或調(diào)節(jié)的細(xì)胞效應(yīng)，所述G1蛋白、同種型、類似物、片段或衍生物能直接或間接與這些中介體或誘導(dǎo)劑結(jié)合。
(xii)一種篩選其它物質(zhì)(例如肽、有機(jī)化合物、抗體等)來獲得特異性藥物的方法，該藥物能抑制G1的活性，例如抑制G1α蛋白酶活性，從而抑制細(xì)胞毒性，或抑制G1β活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性。
上述(xii)的篩選方法的實例包括(1)一種篩選能和本發(fā)明上述G1蛋白結(jié)合的配體的方法，該方法包括使連接了所述蛋白的親和層析基質(zhì)與細(xì)胞抽提物接觸，從而使配體與所述基質(zhì)結(jié)合，然后洗脫、分離并分析所述配體。
(2)一種篩選DNA序列的方法，該序列編碼的配體能與本發(fā)明G1蛋白結(jié)合，該方法包括采用酵母雙雜交步驟，其中一個雜交載體攜帶編碼所述蛋白的序列，第二個雜交載體攜帶了來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，用這些所述載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離出陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并抽提所述第二雜交載體，以獲得編碼所述配體的序列。
(3)一種鑒定和生產(chǎn)配體的方法，該配體能調(diào)節(jié)由MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選能結(jié)合多肽的配體，該多肽包含至少部分MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白，該MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白選自MACH蛋白、Mch4蛋白和其它MORT-1結(jié)合蛋白；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合、但非MORT-1或所述MORT-1結(jié)合蛋白或TNF/NGF受體家族受體一部分的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
(4)一種鑒定和產(chǎn)生配體的方法，該配體能調(diào)節(jié)由本發(fā)明G1蛋白調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選出能與多肽結(jié)合的配體，該多肽包含圖1所示G1α序列的至少一部分或圖2所示G1β序列的至少一部分；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白或TNF/NGF受體家族受體一部分的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
(5)一種鑒定和產(chǎn)生配體的方法，該配體能調(diào)節(jié)由G1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選出能與圖1所示G1α序列的至少一部分或圖2所示G1β序列的至少一部分結(jié)合的配體；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合但非MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白或TNF/NGF受體家族受體一部分的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
(6)一種鑒定和產(chǎn)生分子的方法，該分子能直接或間接調(diào)節(jié)由G1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選出能調(diào)節(jié)受G1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)鑒定和特征分析所述分子；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
(7)一種鑒定和產(chǎn)生分子的方法，該分子能直接或間接調(diào)節(jié)由本發(fā)明的G1蛋白調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選出能調(diào)節(jié)受所述G1蛋白調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)鑒定和特征分析所述分子；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
本發(fā)明還提供了用于調(diào)節(jié)上述FAS-R配體或TNF對細(xì)胞的效應(yīng)或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑對細(xì)胞的效應(yīng)的藥物組合物，該組合物含有下列任何一種物質(zhì)作為活性組分(i)本發(fā)明的G1蛋白，及其生物活性片段、類似物、混合性衍生物；(ii)一種重組動物病毒載體，該載體編碼的蛋白能結(jié)合細(xì)胞表面受體，該載體還編碼本發(fā)明的G1蛋白或其有生物活性的片段或類似物；(iii)編碼本發(fā)明的G1蛋白序列的反義序列的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸可以是上述(ii)的重組動物病毒載體的第二序列。
本發(fā)明還提供I.一種調(diào)節(jié)MORT-1誘導(dǎo)的或MORT-1結(jié)合蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)、或任何其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑對細(xì)胞的效應(yīng)的方法，該方法包括根據(jù)上述(i)-(x)任一方法，用G1蛋白、其類似物、片段或衍生物或編碼G1蛋白、其類似物或片段的序列處理所述細(xì)胞，所述處理導(dǎo)致增強(qiáng)或抑制了所述MORT-1介導(dǎo)的效應(yīng)，從而也增強(qiáng)或抑制了FAS-R或p55-R或所述其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的效應(yīng)。
II.如上所述的一種方法，其中所述G1蛋白、其類似物、片段或衍生物是G1蛋白中參與特異性結(jié)合MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白、或所述其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑的那一部分，或編碼G1蛋白中參與特異性結(jié)合MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白、或所述其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑的該部分的所述G1蛋白序列。
III.如上所述的一種方法，其中所述G1蛋白是任何一種G1同種型，所述同種型能增強(qiáng)與MORT-1相關(guān)的或與其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑相關(guān)的對細(xì)胞的效應(yīng)，從而也能增強(qiáng)與FAS-R或p55-R相關(guān)的或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑對細(xì)胞的效應(yīng)。
IV.如上所述的一種方法，其中所述G1蛋白是任何一種G1同種型，所述同種型能抑制與MORT-1相關(guān)的或與其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑相關(guān)的對細(xì)胞的效應(yīng)，從而也能抑制與FAS-R或p55-R相關(guān)的或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑的細(xì)胞效應(yīng)。
從所有上述內(nèi)容和下文詳細(xì)描述可以得出，G1還可以MORT-1非依賴型方式用于處理細(xì)胞或組織。G1蛋白的分離及其鑒定和特性分析可用任何用于分離和鑒定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)篩選技術(shù)(例如酵母雙雜交方法、親和層析方法以及用于此目的的其它任何熟知的標(biāo)準(zhǔn)步驟)來進(jìn)行。
另外，G1的一些同種型可能只有蛋白酶樣區(qū)域(與上述其它已知蛋白酶的蛋白酶區(qū)域同源)，但是沒有真正的蛋白酶活性，結(jié)果如上所述，這些同種型可能主要是起抑制作用。
另外，由于G1或其任何同種型可能參與調(diào)節(jié)MORT-1非依賴型胞內(nèi)途徑，因此G1或其任何同種型可能參與了其它胞內(nèi)途徑或機(jī)制的信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。
還提供了本發(fā)明的其他方面及實例，正如下文中本發(fā)明詳述中所描述的那樣。
應(yīng)當(dāng)指出，全文中所使用的下列術(shù)語“FAS-配體或TNF對細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)”以及”“MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白對細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)”應(yīng)被理解成包括體內(nèi)處理和體外處理，而且還包括抑制作用或增強(qiáng)/強(qiáng)化作用。
附圖簡述圖1A示出了實施例1所述G1蛋白的一種同種型的基本核苷酸序列。
圖1B示出了從圖1A所示同種型推斷出的氨基酸序列。
圖2示出了實施例1所述G1蛋白的第二種同種型的基本核苷酸序列和推斷出的氨基酸序列。
圖3示出了人(hCASHα，hCASHβ)G1(或CASH)和小鼠(mCASHα)剪接變體的氨基酸序列比較，以及這些蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的保守性基序。圖3中顯示了小鼠G1α(mCASHα)、人G1α(hCASHα)和G1β(hCASHβ)、CASP-8(MACH/FLICE1/Mch5)、CASP-10(Mch4/FLICE2)、CASP-3(CPP32/Apopain/Yama)和CASP-1(ICE)的共線氨基酸序列對比。顯示出CASP-1和CASP-3沒有其“前域(prodomain)”區(qū)域。氨基酸殘基編號在每個序列的右側(cè)。帶點(diǎn)線表示序列中允許最優(yōu)匹配的間距。“死亡域”組件(DED)用陰影表示。在超過三個蛋白質(zhì)中相同的氨基酸被框起來。在蛋白酶同源區(qū)域中，與CASP-1殘基排列對比的經(jīng)X-射線晶體學(xué)方法測得有催化活性的氨基酸表示如下所述推斷參與催化的殘基(對應(yīng)于CASP-1中的His237和Cys285)用深陰影表示，并在對比序列下用實心圓標(biāo)記。組成P1 Asp羧酸側(cè)鏈的結(jié)合口袋的殘基(對應(yīng)于CASP-1中的Arg179，Gln238，Arg341和Ser347)用較淺的陰影表示，并用空心圓標(biāo)記。已知和建議的Asp-x切割位點(diǎn)以及發(fā)現(xiàn)在G1(CASH)相似位置處的潛在切割位點(diǎn)用陰影表示。水平箭頭表示小的和大的CASP-1亞單位的N端和C端。蛋白的C端用星號表示。
圖4(A，B)顯示了Northern印跡法的放射自顯影再生結(jié)果，其顯示了G1轉(zhuǎn)錄物在各種人組織(心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸和外周血淋巴細(xì)胞-PBL)中的鑒定。Northern印跡分析按以下方式進(jìn)行用T7RNA聚合酶(Promega)制備對應(yīng)于G1“死亡域”(DED)組件區(qū)(G1β中核苷酸編號482-1070(見圖2))(克隆的G1(CASH)剪接變體中共有的區(qū)域)的放射性標(biāo)記的mRNA探針，并用于分析含有各種人組織ploy(A)+RNA(每條泳道2μg)的人多組織印跡(Clontech)。
圖5顯示了G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)在轉(zhuǎn)染的酵母中和含有“死亡域”(DED)的其它蛋白(例如MORT1/FADD，MACHα1(CASP-8α1)，MACHβ1(CASP-8β1)，MACHβ4(CASP-8β4)，Mch4(CASP-10)，G1α(CASHα)，G1β(CASHβ)，p55-R(p55ic)，RIP，TRADD和Lamin(陰性對照))相互作用的結(jié)果。在酵母SFY526報道物菌株(Clontech)中，用pGBT9-GAL4 DNA結(jié)合域和pGAD1318和pGADGH-GAL4激活域載體評價G1β(CASHβ)和G1α(CASHα)的結(jié)合性能。如參考實施例1-3中所述的那樣，用β-半乳糖苷酶表達(dá)過濾試驗定量分析酵母中的表達(dá)。結(jié)果以產(chǎn)生深色所需的時間表示。在測試的所有情況中，當(dāng)將測試插入物置于組合的DNA結(jié)合域和激活域構(gòu)建物中時，獲得相同的結(jié)果。檢測的插入物與幾種對照蛋白(包括人p55-R(CD120a)，p75-R(CD120b)，CD40，核纖層蛋白和Gal4空載體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)均不相互作用。
圖6(A-d)顯示的結(jié)果表示G1α(CASHα)、G1β(CASHβ)和G1α(CASHα)突變體對細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的效應(yīng)。如實施例1所述的那樣，用所示構(gòu)建物轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，定量分析HeLa-Fas細(xì)胞(結(jié)果在圖5A中以條狀圖表示)和293-T細(xì)胞(結(jié)果在圖5B和5C中以條狀圖表示)中誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。用所述蛋白以及pCMV-β-gal的cDNA以磷酸鈣沉淀方法瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞(每個6cm碟中有5×105293T細(xì)胞或3×105HeLa細(xì)胞)。每個碟采用5μg感興趣的pcDNA3構(gòu)建物轉(zhuǎn)染，或用兩種不同的構(gòu)建物時2.5μg，以及1.5μg β-半乳糖苷酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6-10小時清洗細(xì)胞，然后進(jìn)一步培育14小時而不作其它處理。將抗-CD95(抗-Fas-R)單克隆抗體(CH11(Oncor(Gaithersburg，MD))，0.5μg/ml)和人重組TNFα(100ng/ml)和環(huán)己酰亞胺(CHX，10μg/ml)一起施加給細(xì)胞，再培育4小時。然后用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)對細(xì)胞染色，用相差顯微術(shù)檢測。在所有所示試驗中，對于HeLa-Fas細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后評價死亡，對于293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染20小時后評價死亡。數(shù)據(jù)(平均值+SD；n等于至少三次試驗)表示所計數(shù)的顯示出膜泡的藍(lán)色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖6D顯示了瞬時表達(dá)所述構(gòu)建物的293-T細(xì)胞形態(tài)的重復(fù)顯微圖片。圖片于轉(zhuǎn)染20小時后拍攝。
發(fā)明詳述本發(fā)明一方面涉及新的G1蛋白，它能直接或間接和MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4和MACH)結(jié)合或相互作用，從而能與MORT-1所結(jié)合的FAS-受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或能與p55TNF-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與TRADD蛋白結(jié)合，而TRADD蛋白與MORT-1結(jié)合。因此，認(rèn)為本發(fā)明的G1蛋白是FAS-R的中介體或調(diào)節(jié)劑，它在由FAS配體與FAS-R的結(jié)合所啟動的信號傳導(dǎo)過程中起作用，同樣，它也在由TNF和p55-R結(jié)合所啟動的信號傳導(dǎo)過程中起作用。本發(fā)明的G1蛋白包括新發(fā)現(xiàn)的G1及其同種型。
更具體地說，本發(fā)明公開了一種新的G1蛋白(也稱為CASH)，它顯然是線蟲蛋白酶CED3的一種同系物。這一新的G1蛋白盡管與之密切相關(guān)，但是它表現(xiàn)出一些結(jié)構(gòu)差異和底物特異性差異，因此可在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮不同功能。實際上，已經(jīng)知道該蛋白酶的兩種不同的活性。ICE(也稱為CASP-1)的主要作用看來是加工IL-1β前體，而CED3卻已經(jīng)清楚地表明是作為編程性細(xì)胞死亡的效應(yīng)物起作用。后一作用看來似乎也至少是一些哺乳動物同系物(例如上述共同擁有的待批專利申請中的某些MACH(也稱為CASP-8)同種型以及上述的與本發(fā)明G1蛋白結(jié)合的Mch4(也稱為CASP-10))的作用。MACHα1的氨基酸序列顯示出與CPP32(已知的最接近CED3的哺乳動物同系物，也稱為CASP-3)最相似。MACH的底物特異性也與CPP32相似，只是看來MACHα1具有比CPP32更高的限制性底物特異性。CPP32優(yōu)先切割底物肽于相應(yīng)聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)中的切割位點(diǎn)，但是對于底物肽中相應(yīng)于IL-1β前體中的ICE切割位點(diǎn)也具有某些蛋白水解活性。然而，好象MACHα1只能切割PARP衍生的序列。MACHα1與CPP32和CED3的這些關(guān)系及其與ICE的不相似之處符合下述觀點(diǎn)，即MACHα1類似于CED3，起著細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑的作用。但是，MACHα1表現(xiàn)出與CED3和CPP32以及CED3/ICE家族中其它所有成員不同的一些序列特征。MACHα1的CED3/ICE同源區(qū)上游的C端部分與其它同系物的上游區(qū)域一點(diǎn)也不相似。該蛋白的CED3/ICE同源區(qū)也有一些獨(dú)特的序列特征。這些差異表明MACHα1屬于該家族的不同進(jìn)化支系，它對細(xì)胞死亡的作用與前述的CED3/ICE同系物稍有不同。同樣，本發(fā)明的G1蛋白及其可能的同種型在G1序列CED3/ICE同源區(qū)中也表現(xiàn)出明顯不同，因此這些差別可能是反映G1在哺乳動物細(xì)胞中活性特異性的獨(dú)特特征。
一個重要的差別可能是蛋白酶功能受調(diào)節(jié)的方式。由于涉及發(fā)育中相關(guān)的細(xì)胞死亡過程和受體誘導(dǎo)的免疫溶細(xì)胞作用，CED3/ICE家族的蛋白酶切割蛋白應(yīng)易受細(xì)胞內(nèi)形成的信號以及細(xì)胞表面受體發(fā)出的信號的調(diào)節(jié)。在發(fā)育性細(xì)胞死亡過程中，這些蛋白酶的激活看來涉及到影響基因表達(dá)的機(jī)制，從而導(dǎo)致蛋白酶的合成增強(qiáng)，及拮抗其凋亡效應(yīng)的蛋白(如BCL-2)的合成減少。然而，這顯然不是由FAS-R或TNF受體引發(fā)細(xì)胞毒性所致。細(xì)胞甚至可在它們的蛋白合成活性受到完全封閉時被TNF或FAS-R配體殺死(實際上它們被更有效地殺死)，并在這些條件下保持刺激依賴型。因此，TNF受體和FAS-R激活CED3/ICE家族的蛋白酶可能以蛋白質(zhì)合成非依賴型機(jī)制發(fā)生。MACHα1的獨(dú)特序列性質(zhì)能使其參與該機(jī)制。同樣，本發(fā)明的G1蛋白的獨(dú)特序列性質(zhì)也會賦予它參與該機(jī)制的能力。
因此，新的G1蛋白可能是最近發(fā)現(xiàn)的蛋白酶組中的另一個成員，該蛋白酶組包括上述MACH(及其同種型)以及Mch4，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們能直接或通過銜接蛋白和細(xì)胞表面受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。從具有其它酶活性的受體結(jié)合蛋白的作用方式推斷，G1與Mch4或MACH(或同種型Machα1)結(jié)合，然后Mch4或Mach與MORT-1結(jié)合，或G1直接和MORT-1結(jié)合，從而在FAS-R被Fas配體引發(fā)時刺激了G1和/或Mch4和/或MACH蛋白酶活性，看來這似乎是合理的。它還能使蛋白酶被p55-R激活(通過MORT1和TRADD結(jié)合，TRADD與p55-R結(jié)合)。
發(fā)現(xiàn)CED3/ICE家族的其它成員僅僅在蛋白水解加工(通過其自身斷裂或該家族其它蛋白酶的作用產(chǎn)生(回顧見Kumas，1995；Henkart，1996))后才表現(xiàn)出全部活性。例如，如上述關(guān)于MACH的共同擁有待批專利申請中所述的那樣，MACHα1的兩種主要的潛在自身斷裂產(chǎn)物共同表達(dá)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用(與表達(dá)全長CED3/ICE同源區(qū)的細(xì)胞中沒有細(xì)胞毒性相反)符合這樣一個可能性，即MACHα1也只有在加工后才獲得全部活性。在表達(dá)全長區(qū)的細(xì)菌裂解液中發(fā)現(xiàn)的酶活性顯然反映出在這些條件下產(chǎn)生的該蛋白進(jìn)行了自身加工或被一些細(xì)菌蛋白酶加工。關(guān)于這種加工在哺乳動物細(xì)胞中以何種方式發(fā)生以及它怎樣由FAS-R和p55-R引發(fā)還未知曉，而MACHα1的蛋白酶活性對FAS-R和TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的相對貢獻(xiàn)也不明確。由于缺少CED3/ICE同源區(qū)的MACHβ1的表達(dá)也會導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性，使得對該作用的評價變得復(fù)雜。據(jù)推測，該細(xì)胞毒性反映了MACHβ1與MACHα1結(jié)合的能力。由于這種能力，轉(zhuǎn)染的MACH分子可能會在聚集時使MACHα1分子發(fā)生構(gòu)象變化，而該變化是對于轉(zhuǎn)染細(xì)胞來說是內(nèi)源性的。這種機(jī)制還很好地解釋了當(dāng)在MACH上游起作用的分子(MORT-1、TRADD或p55-R或FAS-R的死亡域)在細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)時所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞毒性。然而，此時不能排除在誘導(dǎo)MACH或在其上游起作用的分子表達(dá)時所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞毒性(除MACH中CED3/ICE同源區(qū)的蛋白水解活性外)，它反應(yīng)了還有其它一些激活機(jī)制，據(jù)信參與了FAS-R和p55-R的細(xì)胞毒性效應(yīng)(例如激活中性或酸性神經(jīng)鞘磷脂酶)。另外也不能排除CED3/ICE同源區(qū)的蛋白水解活性還起著除細(xì)胞毒性誘導(dǎo)作用以外的其它功能。鑒定在MACHα1激活時斷裂的內(nèi)源底物蛋白，就能更清楚地了解MACHα1的功能。尋找方法來消除MACHα1活性(例如通過抑制性分子的表達(dá))也有助于了解該蛋白的功能，當(dāng)需要時，該方法還可作為調(diào)節(jié)其活性的方法。
因此，本發(fā)明的G1蛋白及其可能的同種型能以與上述MACH蛋白的類似方式通過直接或非直接與其它蛋白相互作用來起作用，即，G1可通過結(jié)合MORT-1來直接起作用，或可通過結(jié)合Mch4和/或MACH、而Mch4和/或MACH再與MORT-1結(jié)合來間接起作用，或以其它一些還未闡明的G1特異性機(jī)制來起作用。類似地，G1活性的調(diào)節(jié)可能與上述MACH蛋白調(diào)節(jié)所預(yù)計的類似。
表達(dá)此類蛋白所包括的蛋白酶的G1天然抑制劑廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)。CED3/ICE家族其它成員中有一些成員的其它剪接同種型的存在顯示了一種從生理上限制這些蛋白酶功能的方式。據(jù)報道，這些其它蛋白酶的一些同種型作為全長同種型的天然抑制劑起作用，它們之間顯然形成了無活性的異二聚體。對于G1及其一些可能的同種型(例如N端切割位點(diǎn)丟失的那些同種型)也是如此。這些抑制型同種型的表達(dá)可能是細(xì)胞自我保護(hù)抵抗FAS-R和TNF細(xì)胞毒性的一種機(jī)制。
G1可能還有其它功能，例如G1或其任何同種型可能對具有酶活性的其它蛋白(例如各種Mch4和MACH同種型的蛋白水解活性)有增強(qiáng)或強(qiáng)化作用，這種活性的增強(qiáng)或強(qiáng)化利用的機(jī)制是G1起加強(qiáng)(recruit)其它蛋白(如Mch4和MACH蛋白)與MORT-1結(jié)合的作用。另外，G1或其同種型還起著與細(xì)胞毒性無關(guān)的作用，但是可能作為參與FAS-R和TNF的其它非細(xì)胞毒性效應(yīng)的?？坎课弧?br>
下文實施例1中列舉了本發(fā)明的一些特異性G1同種型。其中一個稱為G1α，自人和小鼠中分離而得(分別為hG1α/hCASHα和mG1α/mCASHα)，它顯然是具有蛋白酶同源區(qū)的1mg剪接變體，至少在一些細(xì)胞(例如293細(xì)胞)中有胞毒活性。另一種稱為G1β(CASHβ)，自人體中分離獲得，它顯然是一種短的剪接變體，沒有蛋白酶同源區(qū)，它實際上抑制細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)途徑。
由于FAS-R和TNF受體能獨(dú)特地引起細(xì)胞死亡，以及TNF受體能引發(fā)其它各種組織破壞性活性，因此這些受體的功能畸變可能對生物體特別有害。實際上，這些受體的功能過量和不足均已表明會導(dǎo)致各種疾病的病理表現(xiàn)。鑒定參與這些受體信號傳導(dǎo)活性的分子，以及尋找方法來調(diào)節(jié)這些分子的功能，這些都為這些疾病的治療新方法提供了潛在的線索。由于懷疑G1在FAS-R和TNF毒性中有重要作用，因此設(shè)計出能阻遏該分子蛋白水解功能的藥物似乎尤其重要，而對CED3/ICE家族的其它一些成員已經(jīng)采用這種做法。G1分子中包括的CED3/ICE同系物的獨(dú)特序列特征允許設(shè)計出這樣的藥物，這些藥物能提供保護(hù)防止過度的免疫介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而對CED3/ICE家族其它成員涉及的生理性細(xì)胞死亡過程沒有干擾。
如上所述，G1或其同種型還能以MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白非依賴型方式參與調(diào)節(jié)其它胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑(例如其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑或其它蛋白)。另外，G1或其至少具有蛋白酶樣區(qū)但沒有實際蛋白酶活性的同種型主要是具有抑制功能，即抑制那些途徑(例如總的來說是信號傳導(dǎo)途徑，或具體而言是細(xì)胞毒性途徑)，其中G1或其同種型直接和這些途徑的成員結(jié)合，或間接地和其它蛋白結(jié)合，而這些蛋白再與這些途徑的成員結(jié)合。
因此，本發(fā)明還涉及編碼G1蛋白的DNA序列以及該DNA序列所編碼的G1蛋白。
另外，本發(fā)明還涉及編碼G1蛋白的具有生物活性的類似物、片段和衍生物的DNA序列，以及其編碼的類似物、片段和衍生物。這些類似物、片段和衍生物的制備采用標(biāo)準(zhǔn)的步驟(例如參見，Sambrook等，1989)，其中編碼G1蛋白的DNA序列中一種或多種密碼子可以缺失、加入或被另一種取代，從而產(chǎn)生與天然蛋白至少有一個氨基酸殘基發(fā)生改變的類似物。
“基本對應(yīng)于”G1蛋白的多肽或蛋白質(zhì)不僅包括G1蛋白，也包括G1蛋白類似物的多肽或蛋白。
基本對應(yīng)于G1蛋白的類似物，是在G1蛋白的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被其它氨基酸取代、或被刪除、或被插入而形成的多肽，只要所得的蛋白質(zhì)基本上呈現(xiàn)出與其所對應(yīng)的G1蛋白同樣或更好的生物活性。
為了基本對應(yīng)于G1蛋白，在G1蛋白序列中的變化(如同種型)通常較小。雖然變化的數(shù)目可以多于10個，但較佳的不多于10個，更佳地不多于5個，最佳地不多于3個這樣的變化。盡管任何技術(shù)都可運(yùn)用于發(fā)現(xiàn)有潛在生物學(xué)活性且基本對應(yīng)于G1蛋白的蛋白質(zhì)，但是一種這樣的方法是對編碼該蛋白質(zhì)的DNA運(yùn)用常規(guī)的誘變方法，產(chǎn)生一些修飾形式。然后，根據(jù)它們與各種MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4和MACH)結(jié)合的能力、或直接和MORT-1結(jié)合的能力，和/或介導(dǎo)FAS-R和p55-R的活性，和/或以上述方式介導(dǎo)其它胞內(nèi)途徑的活性，對這些克隆表達(dá)的蛋白加以篩選。
“保守的”變化是指預(yù)計不會改變蛋白質(zhì)活性的那些變化，這些變化通常是首先要篩選的，因為這些變化預(yù)計不會明顯改變蛋白大小、電荷或構(gòu)型，因而預(yù)計不改變生物特性。
G1蛋白的保守取代形式包括多肽中至少一個氨基酸殘基被不同的氨基酸保守地取代。較佳地，這種取代是根據(jù)表1A中下列清單進(jìn)行，這些取代可用常規(guī)實驗方法來確定，從而使合成的多肽分子在保持G1蛋白生物活性的同時又在結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)上有所變化。
表 IA原來的殘基 代表性的取代殘基AlaGly；SerArgLysAsnGln；HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyAla；ProHisAsn；GlnIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；Tyr；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu
或者，另一類G1蛋白的取代形式是在多肽中刪去至少一個氨基酸殘基，然后再根據(jù)下表IB在其位置插入不同殘基。多肽中可進(jìn)行的取代類型可依據(jù)對不同種類中同源蛋白之間氨基酸變化頻率的分析結(jié)果，例如Schulz等，G.E.，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理”(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，NY，1978中的表1-2，以及Creighton，T.E.，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子性能”(ProteinsStructure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA 1983中的圖3-9中給出的分析結(jié)果。根據(jù)這一分析，本文另外定義了保守性取代，該取代能在下列5組任一組中進(jìn)行互換。
表 IB1.小的脂族非極性或弱極性殘基Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；2.極性帶負(fù)電荷的殘基及其酰胺Asp、Asn、Glu、Gln；3.極性帶正電荷的殘基His、Arg，Lys；4.大的脂族非極性殘基Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和5.大的芳族殘基Phe、Tyr、Trp。
上述括號中的3個氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中有特殊作用。Gly是唯一沒有側(cè)鏈的殘基，因而它賦予肽鏈柔韌性。然而，這會傾向于形成除α-螺旋外的二級結(jié)構(gòu)。Pro，因其不同尋常的幾何結(jié)構(gòu)，會緊密地約束肽鏈，并且通常會促進(jìn)類似于β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)，而在一些例子中，Cys能夠參與二硫鍵的形成(二硫鍵的形成在蛋白質(zhì)折疊中很重要)。應(yīng)注意，Schulz等(同上)將上面的第1和第2組合二為一。還應(yīng)注意，Tyr，因其有形成氫鍵的趨勢，因此與Ser和Thr等有顯著的親近關(guān)系。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的保守性氨基酸取代，例如上面所陳述的，都是本領(lǐng)域中已知的，并且預(yù)期在氨基酸取代之后可以維持多肽的生物學(xué)和結(jié)構(gòu)特性。本發(fā)明的大多數(shù)缺失和取代是那些不導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽分子特性發(fā)生根本變化的類型。“特性”以遍舉方式(non-inclusive)定義，其定義了二級結(jié)構(gòu)(如α-螺旋或β-折疊)的變化和生物活性(例如與MORT-1結(jié)合蛋白或MORT-1的結(jié)合或?qū)AS-R或TNF細(xì)胞效應(yīng)的介導(dǎo)作用)的變化。
可用于本發(fā)明來獲得G1蛋白類似物的在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸替換的例子包括任何已知的方法步驟，例如在授予Mark等的美國專利RE 33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的美國專利5,116,943；授予Namen等的美國專利4,965,195；授予Chong等的美國專利4,879,111；授予Lee等的美國專利5,017,691中給出的方法；以及在美國專利No.4,904,584(Shaw等)中給出的用賴氨酸取代的蛋白質(zhì)。
除了上述的不會明顯改變G1蛋白活性的保守性取代外，那些會增加G1蛋白類似物生物活性的保守性取代或保守性稍低而隨機(jī)性較高的改變，也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
當(dāng)需要證實取代或缺失的確切效果時，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以通過常規(guī)的結(jié)合和細(xì)胞死亡試驗來評估取代、缺失等的效果。用該標(biāo)準(zhǔn)測試方法進(jìn)行篩選并不需要過多的實驗。
可接受的類似物是至少能如上所述的那樣保留了和MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合或與MORT-1或其它蛋白結(jié)合的能力，從而能如上所述的那樣介導(dǎo)FAS-R和p55-R或上述其它蛋白活性的那些類似物。通過這種方式，可以產(chǎn)生具有所謂顯性陰性效應(yīng)的類似物，即該類似物在結(jié)合MORT-1結(jié)合蛋白(如Mch4或MACH)方面或結(jié)合MORT-1或其它蛋白方面、或在隨后的信號傳導(dǎo)或該結(jié)合后的蛋白酶活性方面有缺陷。這些類似物可通過與天然的MORT-1結(jié)合蛋白或其它蛋白競爭來(例如)抑制FAS-配體的效應(yīng)或其它蛋白的效應(yīng)。例如，似乎MACH同種型MACHα2和MACHα3是“天然的”類似物，它們的作用是通過與活性MACH(蛋白酶)同種型競爭結(jié)合MORT-1(MORT-1看來是這些MACH同種型激活所必需的)來抑制MACH的活性。一旦活性MACH同種型不能與MORT-1結(jié)合，那么由FAS-R和p55-R介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑也會被抑制。G1或其任何同種型也會通過和各種MORT-1結(jié)合蛋白競爭結(jié)合MORT-1或以防止它們結(jié)合MORT-1的方式與它們相互作用，從而以類似的方式作為FAS-配體效應(yīng)的抑制劑起作用。同樣，也可產(chǎn)生所謂的顯性陽性G1類似物，該類似物能增強(qiáng)FAS配體或TNF的效應(yīng)。它們具有相同或更佳的和MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合的能力，或者甚至相同或更佳的MORT-1結(jié)合性能，以及相同或更佳的天然G1蛋白的信號傳導(dǎo)性能。
在遺傳水平上，這些類似物通?？梢赃@樣制得對編碼G1蛋白的DNA中的核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變，從而產(chǎn)生編碼類似物的DNA，隨后合成DNA并在重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)多肽。類似物通常表現(xiàn)出與天然存在的蛋白相同或更高的生物活性，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications andWiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
制備本文所述的G1蛋白，或者制備能編碼相同多肽但與天然序列不同的其他核苷酸序列(因為遺傳密碼已知的簡并性允許這些變化)，都可以通過定點(diǎn)特異性誘變編碼早先制得的G1蛋白類似物或天然G1蛋白的DNA而實現(xiàn)。定點(diǎn)特異性誘變可以利用特異性的寡核苷酸序列來產(chǎn)生類似物，其中該特異性寡核苷酸序列具有所需突變的DNA序列以及足夠數(shù)目的毗鄰核苷酸，以提供具有足夠大小和序列復(fù)雜度(complexity)的引物序列，從而在被橫跨的缺失相接處兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈體。通常，較佳的是長度約20-25個核苷酸的引物，伴有在被改變的序列的每一側(cè)有約5-10個互補(bǔ)核苷酸。一般，定點(diǎn)特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，代表性的例子例如是Adelman等，DNA，2183(1983)，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容納入本文作參考。
正如人們所知曉的那樣，定點(diǎn)誘變技術(shù)通常采用單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體。用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括載體如M13噬菌體，例如公開在Messing等，Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton，Elsevier，Amsterdam編輯(1981)中，該文獻(xiàn)納入本文作參考。這些噬菌體易在商業(yè)上購得，且它們的用法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的?；蛘?，也可用含有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體來獲得單鏈DNA(Veira等，Meth.Enzymol.1533，1987)。
通常，本文所述的定點(diǎn)誘變這樣來進(jìn)行先獲得一單鏈載體，該載體序列中含有編碼有關(guān)多肽的DNA序列。用自動化DNA/寡核苷酸合成法制得攜帶所需突變序列的寡核苷酸引物。然后將該引物與含有蛋白質(zhì)編碼序列的單鏈載體退火，然后用有DNA聚合作用的酶(如大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段)作用，完成攜帶突變的鏈的合成。這樣，突變序列和第二條鏈就帶有所需的突變。然后用該異源雙鏈載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞(如大腸桿菌JM101細(xì)胞)，并選出含有帶突變序列重排的重組載體的克隆。
在選出了這樣的克隆后，可以取出有突變的G1蛋白序列，并置于合適的載體中，該載體通常是可用于轉(zhuǎn)染合適宿主的轉(zhuǎn)移載體或表達(dá)載體。
因此，利用已知的DNA或RNA擴(kuò)增技術(shù)(如PCR和化學(xué)寡核苷酸合成技術(shù))，在體外、原位和/或體內(nèi)檢測、獲得和/或修飾編碼G1蛋白的基因或核酸。PCR可以通過重復(fù)的DNA聚合酶反應(yīng)來擴(kuò)增特異的DNA序列(增加數(shù)目)。該反應(yīng)可用作克隆的替代手段；而所需的只是有關(guān)核酸序列的知識。為了進(jìn)行PCR，可設(shè)計與感興趣的序列互補(bǔ)的引物。然后通過自動化DNA合成法制得這些引物。因為引物可被設(shè)計成與基因任何部分雜交，因此可創(chuàng)造一些能夠容忍互補(bǔ)堿基對存在錯配的條件。擴(kuò)增這些錯配區(qū)域會導(dǎo)致合成出誘變的產(chǎn)物，從而產(chǎn)生具有新特性的肽(即定點(diǎn)誘變)。另見例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通過聯(lián)合互補(bǔ)DNA(cDNA)合成技術(shù)，并使用反轉(zhuǎn)錄酶和PCR反應(yīng)，可將RNA用作原料來合成催乳素受體的胞外結(jié)構(gòu)域，而不經(jīng)過克隆。
此外，PCR引物可被設(shè)計成含有新的限制性位點(diǎn)或具有其他特征，例如在待擴(kuò)增的基因片段末端處的終止密碼子。在擴(kuò)增的基因序列的5′和3′端安置限制性位點(diǎn)，可以使編碼G1蛋白或其片段的基因片段能按需進(jìn)行設(shè)計，以便連接其他序列和/或其他載體的克隆位點(diǎn)。
PCR及擴(kuò)增RNA和/或DNA的其它方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且根據(jù)此處所講述和給予的指導(dǎo)，無需過多試驗就可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用。已知的DNA或RNA擴(kuò)增方法包括(但并不限于)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和有關(guān)的擴(kuò)增方法(例如參見授予Mullis等的美國專利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等的美國專利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美國專利5,142,033；授予Wilson等的美國專利5,122,464；授予Innis的美國專利5,091,310；授予Gyllensten等的美國專利5,066,584；授予Gelfand等的美國專利4,889,818；授予Silver等的美國專利4,994,370；授予Biswas的美國專利4,766,067；授予Ringold的美國專利4,656,135；和Innis等編輯的PCR ProtocolsA Guide to Method and Applications)，以及RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，其中使用對靶序列反義的RNA作為模板來合成雙鏈DNA(授予Malek等的美國專利No.5,130,238，其商品名為NASBA)；以及結(jié)合了DNA擴(kuò)增和抗體標(biāo)記技術(shù)的免疫-PCR(Ruzicka等，Science 260487(1993)；Sano等，Science 258120(1992)；Sano等，Biotechniques 91378(1991))。這些專利和對比文獻(xiàn)的全部內(nèi)容納入本文作參考。
按類似的方式，G1蛋白的生物活性片段(例如G1或其同種型的任何片段)，可參考上述G1蛋白類似物所述的方式進(jìn)行制備。合適的G1蛋白片段是那些保留G1蛋白能力，并能如上所述介導(dǎo)FAS-R和p55-R或其它蛋白生物活性的片段。因此，可以制得上述相對于類似物而言具有顯性陰性或顯性陽性效應(yīng)的G1蛋白片段。應(yīng)注意，這些片段代表了本發(fā)明的一類特殊的類似物，即，它們是衍生自全長G1蛋白序列的G1蛋白的確定部分(如任何一種G1或其同種型獲得的片段)，每個片段或這樣的部分具有任一上述所需的活性。例如，這樣的片段可以是肽。
類似地，衍生物還可通過對G1蛋白及其類似物或片段的一個或多個氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)修飾，或者通過將G1蛋白及其類似物或片段偶聯(lián)于其他分子(例如抗體、酶、受體等)來制得，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域中熟知的。因此，本文所用的術(shù)語“衍生物”覆蓋了用本領(lǐng)域已知手段對位于殘基側(cè)鏈的官能團(tuán)或N-端或C-端基團(tuán)進(jìn)行修飾而制得的衍生物，這些衍生物均包括在本發(fā)明內(nèi)。衍生物可以具有化學(xué)分子部分，例如碳水化合物或磷酸殘基，只要這樣的組份具有與Gl蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包括羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通過與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得)、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠?例如烷?；?alkanoyl)或碳環(huán)類的芳?；?形成的N-?；苌?，或游離的羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基)與酰基部分形成的O-?；苌铩?br>
術(shù)語“衍生物”只包括那些沒有一個氨基酸變成20種常見的天然氨基酸中的某一種氨基酸的衍生物。
盡管G1蛋白是蛋白質(zhì)或多肽，但是它是氨基酸殘基序列。根據(jù)本文的定義，由包括了G1蛋白全部序列的更長序列所構(gòu)成的多肽，也被包括在該多肽范圍內(nèi)，只要所添加部分不影響本發(fā)明的基本特性和新的特性，即，它們保留或提高了G1蛋白的生物活性，或它們能夠被斷裂產(chǎn)生具有G1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。因此，例如，本發(fā)明包括G1蛋白與其他氨基酸或肽形成的融合蛋白。
新的G1蛋白、其類似物、片段和衍生物有許多可能的用途，例如(i)在需要增強(qiáng)FAS-R配體或TNF或其它蛋白效應(yīng)的場合下(例如在抗腫瘤、抗炎、抗HIV等應(yīng)用中)，在需要FAS-R配體或TNF或其它蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的場合下，G1蛋白、其類似物、片段和衍生物可用來模擬或增強(qiáng)MORT-1結(jié)合蛋白(例如Mch4和MACH(包括其各種同種型))或者甚至是MORT-1本身的功能，從而模擬或增強(qiáng)FAS-R配體或TNF或其它蛋白的功能。在這種情況下，可用將本來已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將增強(qiáng)FAS-R配體或TNF或其它蛋白效應(yīng)(即胞毒效應(yīng))的G1蛋白、其類似物、片段或衍生物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。例如，當(dāng)G1蛋白全部在細(xì)胞內(nèi)(如所懷疑的那樣)，并且應(yīng)僅僅導(dǎo)入需要FAS-R配體或TNF或其它蛋白效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)時，就需要將該蛋白特異性導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入系統(tǒng)。實現(xiàn)該目的的一種方法是產(chǎn)生一個重組動物病毒(例如從牛痘獲得)，在DNA中導(dǎo)入下列兩個基因編碼配體的基因，該配體能與細(xì)胞特異性表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白(例如一種是與一些細(xì)胞(CD4淋巴細(xì)胞和相關(guān)的白血病細(xì)胞)特異性結(jié)合的AID(HIV)病毒gp120蛋白)結(jié)合，或者是編碼與攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞特異性結(jié)合的任何其它配體的基團(tuán)，這樣重組病毒載體將能結(jié)合這些攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞；以及編碼G1蛋白的基因。這樣，細(xì)胞表面結(jié)合蛋白在病毒表面上的表達(dá)會使病毒特異性地靶向腫瘤細(xì)胞或其它攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞，然后編碼G1蛋白的序列(例如G1α序列)會通過病毒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而且它一旦在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，就會增強(qiáng)FAS-R配體或TNF效應(yīng)，導(dǎo)致希望殺死的腫瘤細(xì)胞或其它攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞死亡。這些重組動物病毒可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來構(gòu)建(例如參見，Sambrook等，1989)。另一種可能是將G1蛋白的序列(例如G1或其同種型的任何一種)以能被細(xì)胞吸收并在其中表達(dá)的寡核苷酸形式導(dǎo)入。
增強(qiáng)這類細(xì)胞毒性的另一種方法是抑制本身對細(xì)胞毒性有抑制作用的G1同種型(例如G1β)的活性。抑制這些G1同種型的方式有各種各樣，包括下文(ii)中用來特異性抑制這些抑制性G1同種型(例如G1β)所列舉的那些方式。
(ii)例如在膿毒休克、移植物抗宿主排斥反應(yīng)或急性肝炎中組織破壞的情況下，當(dāng)需要阻斷FAS-R配體或TNF誘導(dǎo)的FAS-R或p55-R胞內(nèi)信號傳導(dǎo)或其它蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)時，它們可用來抑制FAS-R配體、TNF或其它蛋白的效應(yīng)。在這種情況下，例如可用標(biāo)準(zhǔn)步驟將具有G1蛋白反義編碼序列的寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這會有效地阻斷編碼G1蛋白的mRNA的翻譯，從而阻斷了它的表達(dá)，并導(dǎo)致抑制FAS-R配體或TNF或其它蛋白的效應(yīng)。這些寡核苷酸可用上述重組病毒方法來導(dǎo)入細(xì)胞，病毒攜帶的第二種序列是寡核苷酸序列。
另外，如上文和下文所列舉的，已經(jīng)分離出至少一種G1同種型，它是細(xì)胞毒性的“天然抑制劑”，即G1β。因此可將這種G1同種型直接給予細(xì)胞，或?qū)y帶編碼該同種型的核苷酸序列的合適載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這樣，當(dāng)該G1同種型在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，它能抑制細(xì)胞毒性。
另一種可能是采用對G1蛋白有特異性的抗體來抑制其細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)活性。
抑制FAS-R配體或TNF效應(yīng)的還有一種方法是最近開發(fā)出來的核酶方法。核酶是具有催化性的RNA分子，它能特異性地切割RNA。核酶可被工程改造成切割所選的靶RNA(例如編碼本發(fā)明G1蛋白的mRNA)。這種核酶具有對G1蛋白mRNA有特異性的序列，并且能在切割mRNA后與其相互作用(互補(bǔ)結(jié)合)，從而導(dǎo)致G1蛋白表達(dá)的減少或完全喪失，而表達(dá)減少的水平取決于靶細(xì)胞中核酶表達(dá)的水平。為了將核酶導(dǎo)入所選細(xì)胞(例如攜帶FAS-R或p55-R的那些細(xì)胞)內(nèi)，可以采用任何合適的載體，例如通常用于此目的的質(zhì)粒、動物病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體(另見上文(i)，其中病毒具有的第二序列是編碼所選核酶序列的cDNA)。(關(guān)于有關(guān)核酶方法的回顧參見Chen等，1992；Zhao和Pick，1993；Shore等，1993；Joseph和Burk 1993；Shimayama等，1993；Cantor等，1993；Barinaga，1993；Crisell等，1993和Koizumi等，1993)。
(iii)G1蛋白、其類似物、片段或衍生物還可用來分離、鑒定和克隆同一類的其它蛋白，即與FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或功能上相關(guān)的受體結(jié)合的那些蛋白、或與上述MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合的那些蛋白、或與MORT-1結(jié)合從而和功能上相關(guān)的受體(如FAS-R和p55-R)結(jié)合并涉及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的那些蛋白。在這種應(yīng)用中，可采用上述酵母雙雜交系統(tǒng)，或可采用最近開發(fā)出的采用非嚴(yán)謹(jǐn)性Southern雜交隨后進(jìn)行PCR克隆的系統(tǒng)(Wilks等，1989)。在Wilks等的出版物中，描述了鑒定和克隆兩種推定蛋白-酪氨酸激酶的方法，該方法采用非嚴(yán)謹(jǐn)性的Southern雜交，然后根據(jù)激酶基序的已知序列(一種設(shè)想出的激酶序列)通過PCR克隆。該方法可用于本發(fā)明，用G1蛋白的序列來鑒定和克隆與MORT-1結(jié)合蛋白有關(guān)的那些蛋白。
(iv)利用本發(fā)明的G1蛋白、或其類似物、片段或衍生物的還有一種方法是將它們用于親和層析方法來分離和鑒定它們能結(jié)合的其它蛋白或因子，例如涉及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的MORT-1、MORT-1結(jié)合蛋白或其它蛋白或因子。在這種應(yīng)用中，本發(fā)明的G1蛋白、其類似物、片段或衍生物可單獨(dú)與親和層析基質(zhì)連接，然后使其與細(xì)胞抽提物或懷疑涉及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程的分離的蛋白或因子接觸。在親和層析步驟后，就可洗脫、分離并鑒定和本發(fā)明的G1蛋白、或其類似物、片段或衍生物結(jié)合的其它蛋白或因子。
(v)如上所述，本發(fā)明的G1蛋白或其類似物、片段或衍生物還可用作免疫原(抗原)來生產(chǎn)其特異性的抗體。這些抗體還可用來從細(xì)胞抽提物或產(chǎn)生G1蛋白、或其類似物或片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中純化G1蛋白(例如G1或其任何同種型)。另外，這些抗體還可用于診斷目的，用來鑒定與FAS-R配體或TNF系統(tǒng)功能異常有關(guān)的疾病，例如FAS-R配體或TNF誘導(dǎo)的過度活潑或不夠活潑的細(xì)胞效應(yīng)。因此，若這些疾病與涉及MORT-1蛋白、或上述其它各種MORT-1結(jié)合蛋白或G1蛋白本身的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)功能失常有關(guān)，那么這些抗體就可作為重要的診斷工具。
還應(yīng)注意，本發(fā)明的G1蛋白的分離、鑒定和特性分析可用任何熟知的標(biāo)準(zhǔn)篩選步驟來進(jìn)行。例如，這些篩選步驟中的一種(如下文所述的酵母雙雜交步驟)可用來鑒定MORT-1蛋白，隨后是各種MORT-1結(jié)合蛋白以及本發(fā)明的G1蛋白。同樣，如上文和下文所述，也可采用其它步驟，例如本領(lǐng)域熟知的親和層析、DNA雜交步驟，來分離、鑒定和特性分析本發(fā)明的G1蛋白，或來分離、鑒定和特性分析能與本發(fā)明的G1蛋白結(jié)合的其它蛋白、因子、受體等。
如上所述，G1蛋白可用來產(chǎn)生對G1蛋白(例如G1及其同種型)有特異性的抗體。這些抗體或其片段可如下文所述使用，應(yīng)理解，在這些應(yīng)用中，抗體或其片段是對G1蛋白有特異性的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)(即至少一些G1或其可能的同種型是與CED3/IDE蛋白酶家族的蛋白酶有關(guān)的蛋白酶)，預(yù)計這些G1蛋白和同種型有下列具體的醫(yī)學(xué)用途已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有其它CED3/ICE蛋白酶的特異性抑制劑存在，其中一些可滲入細(xì)胞，它們能有效阻斷編程性細(xì)胞死亡過程。因此，根據(jù)本發(fā)明，可設(shè)計出能夠防止G1蛋白酶同種型涉及的FAS-R配體或TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抑制劑。另外，鑒于這些新G1蛋白酶的獨(dú)特序列特征，看來可以設(shè)計出對TNF和FAS-R配體誘導(dǎo)的效應(yīng)高度特異性的抑制劑。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)還提供了一種方法來研究“致死性蛋白酶”在對FAS-R配體和TNF應(yīng)答反應(yīng)中被激活的機(jī)制，這樣就能隨后開發(fā)出控制該激活程度的藥物。該藥物對許多疾病都有很大的幫助。其中有急性肝炎，其中肝的急性破壞看來反映了FAS-R配體介導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡；自身免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，例如胰的β郎格罕氏細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致糖尿病；移植物排斥反應(yīng)(例如腎、心臟和肝)中的細(xì)胞死亡；大腦多發(fā)性硬化中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡；和引起AIDS病毒增殖從而導(dǎo)致AIDS病的AIDS抑制性T細(xì)胞自殺。
如上所述，G1或其一種或多種可能的同種型(例如G1β同種型)可作為G1蛋白酶或G1蛋白酶同種型的“天然”抑制劑，它們可如上所述用作這些G1蛋白酶的特異性抑制劑。同樣，還可篩選出其它物質(zhì)如肽、有機(jī)化合物、抗體等，以獲得能抑制G1蛋白酶的特異性藥物。
如何來設(shè)計和篩選G1蛋白酶的肽抑制劑的非限制性實施例所根據(jù)的以前的研究是ICE或ICE樣蛋白酶的肽抑制劑，ICE的底物特異性以及用肽合成法分析表位的策略。已發(fā)現(xiàn)，ICE有效切割肽的最低要求涉及切割位點(diǎn)左側(cè)的4個氨基酸，并且在P1位置強(qiáng)烈優(yōu)選天冬氨酸，在P1位的右側(cè)有足夠的甲胺(Sleath等，1990；Howard等，1991；Thornberry等，1992)。此外，一種縮寫為Ac-DEVD-AMC的熒光底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰(coumaryl)-7-酰胺)，它對應(yīng)于在FAS-R刺激和其他凋亡過程(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)之后不久在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的被切割的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，而且該底物可被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一個成員)和MACH蛋白酶有效地切割(同樣也可能被G1蛋白酶切割)。
因為底物P1位的Asp顯得很重要，因此可快速篩選第四個氨基酸殘基為Asp且在前3個殘基位置有各種組合的四肽是否與G1蛋白酶活性位點(diǎn)結(jié)合，例如采用Geysen開發(fā)的方法(Geysen，1985；Geysen等，1987)，在該方法中對固相載體上的大量肽進(jìn)行篩選，確定它們是否與抗體有特異性的相互作用。MACH蛋白酶與特異性肽的結(jié)合可用本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)各種熟知的檢測方法(例如對G1蛋白酶作放射標(biāo)記)來檢測。已表明，Geysen的這種方法每個工作日至少能測試4000種肽。
因為設(shè)計出選擇性抑制G1蛋白酶而不干擾CED3/ICE家族蛋白酶的其它成員參與的生理性細(xì)胞死亡過程的肽抑制劑可能是有好處的，所以可以進(jìn)一步合成上述試驗中結(jié)合G1蛋白酶的肽庫作為熒光底物肽，以測試G1蛋白酶的選擇性切割，而不被其它CED3/ICE蛋白酶切割。然后可對經(jīng)測定可被G1蛋白酶選擇性切割的肽進(jìn)行修飾，以提高細(xì)胞通透性并可逆或不可逆地抑制G1的細(xì)胞死亡活性。Thornberry等(1994)報道了一種四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2，6-(CF3)]Ph，它是ICE的強(qiáng)效滅活劑。類似地，Milligan等(1995)報道，具有氯甲基酮的四肽抑制劑(不可逆地)或具有醛基團(tuán)的四肽抑制劑(可逆地)可抑制ICE。此外，已表明芐氧基羧基-Asp-CH2OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等，1995)。因此，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(O)-DCB基團(tuán)對選擇性地結(jié)合G1蛋白酶的四肽進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生G1蛋白酶活性的肽抑制劑。
盡管其它CED3/ICE蛋白酶的一些特異性抑制劑具有細(xì)胞通透性，但是肽抑制劑的細(xì)胞通透性可能仍需增強(qiáng)。例如，可對肽作化學(xué)修飾或衍生化，以增強(qiáng)其通過細(xì)胞膜的通透性，并使這些肽能傳遞通過膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。Muranishi等(1991)報道了用月桂酸衍生處理促甲狀腺釋放激素，形成一種親脂的、具有良好的通過細(xì)胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等(1991)還報道了將甲硫氨酸氧化成亞砜并用其酮亞甲基異酯(COCH2)(ketomethylene isoester)代替肽鍵，以幫助肽通過細(xì)胞膜。這些方法僅僅是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的修飾和衍生方法中的一些而已。
此外，能夠抑制G1或其可能的同種型的細(xì)胞死亡活性的藥物或肽抑制劑可以與促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞的分子偶聯(lián)或復(fù)合。
美國專利No.5,149,782公開了將待運(yùn)輸通過細(xì)胞膜的分子與膜共混劑(blending agent)偶連在一起，這些膜共混劑例如有融合性多肽、離子通道形成多肽、其他膜多肽、和長鏈脂肪酸如肉豆蔻酸和棕櫚酸。這些膜共混劑將分子偶聯(lián)物插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，并協(xié)助它們進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
Low等的美國專利5,108,921回顧了通過受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制來跨膜運(yùn)送分子(例如(但不局限于)蛋白質(zhì)、核酸)的已有方法。這些受體系統(tǒng)包括識別下列物質(zhì)的那些系統(tǒng)半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、運(yùn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、鈷胺傳遞蛋白(維生素B12)、α-2巨球蛋白、胰島素和其他的肽生長因子如表皮生長因子(EGF)。Low等講述了，營養(yǎng)物的受體(如生物素和葉酸的受體)可被有利地用于增強(qiáng)通過細(xì)胞膜的運(yùn)輸，因為在大多數(shù)細(xì)胞的膜表面上存在多種生物素和葉酸受體并且有相應(yīng)受體介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸過程。因此，待輸送入細(xì)胞質(zhì)的化合物與配體(如生物素或葉酸)形成的復(fù)合物與具有生物素或葉酸受體的細(xì)胞膜接觸之后，就啟動了受體所介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸機(jī)制，從而允許所需化合物進(jìn)入細(xì)胞。
已知ICE能容忍P2位置上自由替換，而且對自由替換的這種容忍性可被加以利用，以開發(fā)出強(qiáng)效和高選擇性的、含有生物素標(biāo)記的親和標(biāo)記(Thornberry等，1994)。因此，可以對四肽抑制劑的P2位以及可能的N-端進(jìn)行修飾或衍生處理，例如添加生物素分子，從而提高這些肽抑制劑通過細(xì)胞膜的通透性。
此外，本領(lǐng)域中已經(jīng)知道，可以使所需的肽序列與前導(dǎo)肽/信號肽序列融合，以產(chǎn)生“嵌合肽”，這就能使該“嵌合肽”運(yùn)輸通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
正如肽領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的那樣，本發(fā)明的抑制G1蛋白水解活性的肽抑制劑包括肽模擬型藥物或抑制劑，它們也能根據(jù)和G1蛋白酶的結(jié)合被迅速篩選，從而設(shè)計出可能更穩(wěn)定的抑制劑。
還應(yīng)理解，上述用于協(xié)助或增強(qiáng)肽抑制劑運(yùn)輸通過細(xì)胞膜的相同手段，也可用于G1蛋白或其同種型以及在胞內(nèi)發(fā)揮功效的其他肽和蛋白質(zhì)。
關(guān)于全文中提及的抗體，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合抗體、針對能夠以可溶或固定形式被標(biāo)記的抗體的抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體、以及用各種已知技術(shù)(例如(但并不限于)酶切、肽合成或重組技術(shù))所提供的它們的片段。
多克隆抗體是異質(zhì)的抗體分子群體，它們來自用抗原免疫的動物血清。單克隆抗體含有基本上均質(zhì)的、對抗原特異的抗體群體，該群體含有基本相似的表位結(jié)合位點(diǎn)。單克隆抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得。例如參見Kohler和Milstein，自然，256495-497(1975)；美國專利No.4,376,110；Ausubel等編，Harlow and Lane，抗體實驗手冊(ANTIBODIESA LABORATORYMANUAL)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等編，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都全部納入本文作參考。這些抗體可以是任何種類的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以在體外、原位或體內(nèi)培養(yǎng)。在體內(nèi)或原位生產(chǎn)高效價單克隆抗體的方法是目前較佳的生產(chǎn)方法。
嵌合抗體是這樣一種分子，它的不同部分來自不同的動物物種，例如具有鼠單克隆抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。嵌合抗體重要用于降低應(yīng)用中的免疫原性以及增加產(chǎn)量，例如當(dāng)鼠單克隆抗體在雜交瘤中有較高的產(chǎn)量但在人中具有較高免疫原性的情況下，可以使用這種人/鼠嵌合單克隆抗體。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域中已知的(Cabilly等，美國科學(xué)院院報813273-3277(1984)；Morrison等，美國科學(xué)院院報816851-6855(1984)；Boulianne等，自然，312643-646(1984)；Cabilly等，歐洲專利申請125023(1984年11月14日公開)；Neuberger等，自然，314268-270(1985)；Taniguchi等，歐洲專利申請171496(1985年2月19日公開)；Morrison等，歐洲專利申請173494(1986年3月5日公開)；Neuberger等，PCT申請WO 8601533(1986年3月13日公開)；Kudo等，歐洲專利申請184187(1986年6月11日公開)；Sahagan等，J.Immunol.1371066-1074(1986)；Robinson等，國際專利申請No.WO8702671(1987年5月7日公開)；Liu等，美國科學(xué)院院報843439-3443(1987)；Sun等，美國科學(xué)院院報84214-218(1987)；Better等，科學(xué)2401041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，抗體實驗手冊，同上)。這些文獻(xiàn)全部納入本文作參考。
抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體是這樣一種抗體，它識別通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的獨(dú)特決定簇。Id抗體可這樣制得，免疫與單克隆抗體來源動物相同的物種和基因型的動物(例如小鼠品種)，其中該單克隆抗體就是制備的抗-Id所針對的。被免疫的動物會識別免疫用抗體的獨(dú)特型決定簇，并通過產(chǎn)生針對這些獨(dú)特型決定簇的抗體(抗-Id抗體)而進(jìn)行應(yīng)答。例如參見美國專利No.4,699,880，該專利全部納入本文作參考。
抗-Id抗體還可用作“免疫原”，在另一動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生所謂的抗-抗-Id抗體。該抗-抗-Id抗體與最初誘導(dǎo)抗-Id的單克隆抗體在表位上相同。因此，通過使用針對mAb獨(dú)特型決定簇的抗體，就可鑒別出表達(dá)具有相同特異性的抗體的其它克隆。
因此，針對本發(fā)明的G1蛋白、其類似物、片段或衍生物而產(chǎn)生的單克隆抗體可用于在合適的動物(如BALB/c小鼠)中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-Id抗體?？捎迷摫幻庖咝∈蟮钠⒓?xì)胞來產(chǎn)生分泌抗-Id mAb的抗-Id雜交瘤。此外，抗-Id單克隆抗體還可與載體(如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH))偶聯(lián)，并用于免疫其他的BALB/c小鼠。這些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗體，該抗體具有最初單克隆抗體的結(jié)合特性，并對上述的G1蛋白、或其類似物、片段或衍生物的表位有特異性。
這樣，抗-Id單克隆抗體具有它們自己的獨(dú)特型表位，或有結(jié)構(gòu)上與被評價表位相似的“獨(dú)特位”(如GRB蛋白-a)。
術(shù)語“抗體”還包括完整的分子及其片段，例如能夠結(jié)合抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗體的Fc片段，能夠更迅速地從循環(huán)系統(tǒng)中清除，并且與完整抗體相比具有更低的非特異性組織結(jié)合性(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
應(yīng)理解，根據(jù)本文公開的用于完整抗體分子的方法，本發(fā)明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他的抗體片段也可用于檢測和定量測定G1蛋白。這些片段通?？捎媚竟厦?產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab′)2片段)通過蛋白酶水解切割來產(chǎn)生。
如果抗體能特異性地與某分子反應(yīng)從而使該分子與抗體結(jié)合，那么就稱該抗體“能夠結(jié)合”該分子。術(shù)語“表位”指任何分子中能被抗體識別且還能被抗體結(jié)合的部分。表位或“抗原決定簇”通常由分子表面化學(xué)活性基團(tuán)(如氨基酸或糖的側(cè)鏈)構(gòu)成，而且具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征和特異的電荷特征。
“抗原”是能被抗體結(jié)合、并且還能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能與該抗原表位結(jié)合的抗體的分子或分子一部分?？乖删哂幸粋€或多個表位。上述特異反應(yīng)指抗原會以高度選擇性的方式與其相應(yīng)的抗體反應(yīng)，而不會與大量由其他抗原產(chǎn)生的其他抗體反應(yīng)。
本發(fā)明中有用的抗體(包括抗體片段)可用于定量或定性地檢測樣品中的G1蛋白，或檢測表達(dá)本發(fā)明G1蛋白的細(xì)胞的存在與否。這可以用免疫熒光技術(shù)，利用熒光標(biāo)記的抗體(見下文)并結(jié)合光學(xué)顯微術(shù)、流式細(xì)胞計量術(shù)或熒光計量術(shù)檢測而實現(xiàn)。
用于本發(fā)明的抗體(或其片段)可在組織學(xué)上被采用，例如在免疫熒光或免疫電子顯微術(shù)中，用來原位檢測本發(fā)明的G1蛋白。原位檢測可這樣來實現(xiàn)從患者體內(nèi)取一份組織樣品，然后將經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明抗體供給該樣品?？贵w(或其片段)的提供最好是通過將經(jīng)標(biāo)記的抗體(及其片段)施加或覆蓋在生物樣品上。通過采用這種步驟，不僅可以確定是否存在G1蛋白，而且能確定其在受檢組織中的分布。采用了本發(fā)明，一般技術(shù)人員容易知道，可對各種組織學(xué)方法(例如染色步驟)加以改動來實現(xiàn)這種原位檢測。
對于本發(fā)明G1蛋白的這些試驗方法通常包括使生物樣品(如生物液體、組織抽提物、新收獲的細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞)、或已經(jīng)在組織培養(yǎng)中培育過的細(xì)胞)在能夠鑒別G1蛋白的可檢測標(biāo)記抗體存在下進(jìn)行培育，然后用本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任一種方法檢測抗體。
生物樣品可以用固相支持物或載體(如硝酸纖維素、或能固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍椎钠渌滔嘀С治锘蜉d體)來處理。然后用合適的緩沖液洗滌支持物或載體，再根據(jù)本發(fā)明上述那樣用可檢測的標(biāo)記抗體進(jìn)行處理。再用緩沖液第二次洗滌固相支持物或載體以除去未結(jié)合的抗體。然后可用常規(guī)方法檢測所述固相支持物或載體上所結(jié)合的標(biāo)記的量。
“固相支持物”、“固相載體”、“固體支持物”、“固體載體”、“支持物”或“載體”指能結(jié)合抗原或抗體的任何支持物或載體。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍淀粉酶、天然的和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵石。出于本發(fā)明的目的，載體的特性可以是不溶的，或在某種程度上可溶。載體材料可以有實際上所有可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合抗原或抗體。因此，支持物或載體的結(jié)構(gòu)可以是球形(如在玻珠內(nèi))、圓柱形(如試管的內(nèi)表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、測試條帶等。較佳的支持物或載體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知道用于結(jié)合抗體或抗原的其他許多合適的載體，或者能夠通過常規(guī)實驗來確定這些載體。
如上所述的本發(fā)明給定量抗體的結(jié)合活性可以用眾所周知的方法來測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常規(guī)實驗來確定每次測定的操作條件和最佳試驗條件。
其他的步驟，諸如洗滌、攪拌、振蕩、過濾等，可增加到試驗方法中，這些步驟都是常規(guī)的或是具體情況下所需的。
本發(fā)明的抗體能夠被可檢測地標(biāo)記的一種方法是將該抗體與酶相連，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，當(dāng)該酶與合適的底物接觸時，酶會與底物反應(yīng)，從而產(chǎn)生可被檢測(例如通過分光光度分析、熒光分析、或肉眼觀察)的化學(xué)物。可用于可檢測地標(biāo)記抗體的酶包括(但不局限于)蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿脂酶。采用酶的生色團(tuán)底物，利用比色方法就可以完成檢測。檢測還可以通過將酶與底物反應(yīng)的程度與類似制備的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行肉眼比較來實現(xiàn)。
檢測可用其他各種免疫試驗實現(xiàn)。例如，通過放射性標(biāo)記抗體或抗體片段，就可以通過采用放射免疫分析(RIA)來檢測R-PTP酶。關(guān)于RIA的清楚描述可在Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，T.S.等，NorthHolland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其參見Chard，T.所寫的標(biāo)題為“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques(放射免疫分析和相關(guān)技術(shù)的介紹)”的章節(jié)，該文獻(xiàn)納入本文作參考。放射性同位素可用g計數(shù)器或閃爍計數(shù)器等設(shè)備或通過放射性自顯影來進(jìn)行檢測。
還可以用熒光化合物來標(biāo)記本發(fā)明的抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體被暴露于適當(dāng)波長的光時，就能因熒光而檢測出它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白(pycocyanin)、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
抗體還可用發(fā)出熒光的金屬(如152E或其他鑭系金屬)進(jìn)行可檢測地標(biāo)記。這些金屬可通過這些金屬的螯合基團(tuán)(如二乙三胺五乙酸(ETPA))與抗體連接。
還可以將抗體偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光化合物，對抗體進(jìn)行可檢測標(biāo)記。然后，檢測在化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)光的存在來檢測帶有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是魯米諾、異魯米諾(isoluminol)、熱(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
同樣，還可以用生物發(fā)光化合物來標(biāo)記本發(fā)明抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在可通過檢測發(fā)光來確定。用于標(biāo)記目的的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。
本發(fā)明的抗體分子可用于免疫計量試驗，也稱為“雙位點(diǎn)”或“夾心”試驗。在典型的免疫計量試驗中，將一定量的未標(biāo)記抗體(或抗體片段)結(jié)合于固相支持物或載體上，加入一定量的帶可檢測標(biāo)記的可溶抗體，從而可以檢測和/或定量分析在固相抗體、抗原和標(biāo)記抗體之間形成的三元復(fù)合物。
典型的且較佳的免疫測量試驗包括“正向”試驗，在該試驗中與固相結(jié)合的抗體先與待測試樣品接觸，通過形成二元固相抗體-抗原復(fù)合物從而將抗原從樣品中抽提出。在培育合適的時間后，洗滌固相支持物或載體以去除液體樣品殘余物(包括未反應(yīng)的抗原，如果有的話)，然后再與含有未知量的標(biāo)記抗體(其功能為“報道分子”)的溶液接觸。在第二次培育使標(biāo)記抗體通過未標(biāo)記抗體與結(jié)合于固相支持物或載體上的抗原進(jìn)行復(fù)合之后，第二次洗滌固相支持物或載體，以除去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。
在另一種“夾心”測定(該試驗可與本發(fā)明的抗原一起使用)中，使用所謂的“同時”和“反向”測定。同時測定涉及一次培育步驟，因為和固相支持物或載體結(jié)合的抗體和標(biāo)記抗體被同時加入到測試樣品中。在培育結(jié)束后，洗滌固體支持物或載體以除去液體樣品殘余物和未復(fù)合的標(biāo)記抗體。然后象常規(guī)的“正向”夾心測定那樣，測定與固相支持物或載體結(jié)合的標(biāo)記抗體的存在。
在“反向”測定中，按步驟先將標(biāo)記抗體溶液加至液體樣品中，然后在培育適當(dāng)時間后，再加入固定于固相支持物或載體上的未標(biāo)記抗體。在第二次培育后，以常規(guī)方式洗滌固相載體，使其不含被測試樣品的殘余物和未反應(yīng)的標(biāo)記抗體溶液。然后再象“同時”或“正向”測定那樣，測定與固相支持物或載體結(jié)合的標(biāo)記抗體的存在。
本發(fā)明的G1蛋白可用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA程序來生產(chǎn)(例如參見，Sambrook等，1989和Ansabel等，1987-1995，同上)，其中用含有編碼該蛋白的序列的合適的真核或原核載體來轉(zhuǎn)化本領(lǐng)域熟知的合適的真核或原核宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明還涉及用來生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化宿主。如上所述，這些蛋白還包括它們的具有生物活性的類似物、片段和衍生物，因此，編碼這些物質(zhì)的載體也包括編碼這些蛋白的類似物和片段的載體，轉(zhuǎn)化宿主包括產(chǎn)生這些類似物和片段的那些轉(zhuǎn)化宿主。轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的這些蛋白的衍生物是通過對蛋白或其類似物或片段進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)修飾產(chǎn)生的衍生物。
本發(fā)明還涉及含有重組動物病毒載體的藥物組合物，該載體編碼G1蛋白，還編碼能結(jié)合特定靶細(xì)胞(如癌癥細(xì)胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，從而能引導(dǎo)G1蛋白序列插入到細(xì)胞中。本發(fā)明的其它藥物組合含有下列物質(zhì)作為活性成分(a)編碼G1蛋白序列的反義序列的寡核苷酸序列；或(b)阻斷G1蛋白或其同種型蛋白水解活性的藥物。
本發(fā)明的藥物組合物含有足量的活性成分以達(dá)到其所需目的。此外，藥物組合物還含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括賦形劑和輔助劑，它們可協(xié)助將活性化合物加工成可作為藥物使用的制劑，并且它們可使這種制劑更穩(wěn)定，以便給予所需對象，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
懷疑G1蛋白及其同種型在不同組織中表達(dá)的水平明顯不同，其同種型的方式也明顯不同，其方式與上述共同擁有的待批專利申請中所述的MACH蛋白及其各種同種型的表達(dá)方式類似。這些差別可能導(dǎo)致了其對Fas/APO1-配體和TNF應(yīng)答反應(yīng)的組織特異性特征。至于其它CED3/ICE同系物(Wang等，1994；Alnermri等，1995)，本發(fā)明者早先就在上述專利申請中表明，發(fā)現(xiàn)含有不完全CED3/ICE區(qū)域的MACH同種型(例如MACHα3)對共同表達(dá)的MACHα1或MACHα2分子的活性有抑制作用；還發(fā)現(xiàn)它們阻斷了Fas/APO1和p55-R的死亡誘導(dǎo)作用。這些抑制性同種型在細(xì)胞中的表達(dá)可能構(gòu)成了細(xì)胞自我保護(hù)抵抗Fas/APO1和TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的機(jī)制。因此，懷疑至少一些G1同種型有類似的抑制作用。MACH同種型具有廣泛的異質(zhì)性，該異質(zhì)性應(yīng)能特別精細(xì)地調(diào)節(jié)活性MACH同種型的功能，同樣懷疑G1同種型也有類似的異質(zhì)性(其大大超過了CED3/ICE家族其它蛋白酶所見的異質(zhì)性)，因此本發(fā)明的活性G1同種型也有類似能力。
還可能，一些可能的G1同種型具有其它功能。例如，以前發(fā)現(xiàn)(如本發(fā)明者上文所述)MACHβ1能與MORT-1和MACGα1二者結(jié)合，這暗示該同種型實際上增強(qiáng)了具有酶活性的同種型的活性。在轉(zhuǎn)染了該同種型的293-EBNA和MCF7培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性較弱，而該同種型在HeLa細(xì)胞中發(fā)揮了相當(dāng)顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)，這可能反映了內(nèi)源性表達(dá)的MACHα分子在結(jié)合轉(zhuǎn)染的MACHβ1分子時被激活?？梢韵胂蟮氖?，一些MACH同種型還可作為涉及Fas/APO1和TNF受體的其它非細(xì)胞毒性效應(yīng)的分子的停靠位點(diǎn)。因此，G1和/或其同種型可能也以類似的方式具有這種增強(qiáng)活性或作為其它此類分子的?？课稽c(diǎn)起作用。
由于Fas/APO1和TNF受體能獨(dú)特地引起細(xì)胞死亡，以及TNF受體能引發(fā)其它各種組織破壞性活性，因此這些受體的功能畸變對生物體特別有害。實際上，這些受體的功能過度和不足均已表明會導(dǎo)致各種疾病的病理表現(xiàn)(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鑒定參與受體信號傳導(dǎo)活性的分子，以及尋找方法來調(diào)節(jié)這些分子的活性，這些都能引出新的治療方法。由于懷疑G1在Fas/APO1和TNF介導(dǎo)的毒性中起關(guān)鍵作用，因此設(shè)計出能阻斷G1的可能的蛋白水解功能的藥物似乎尤其重要，而對CED3/ICE家族的其它一些成員已經(jīng)采用這種做法(Thornberry等，1994；Miller等，1995；Mashima等，1995；Milligan等，1995；Enari等，1995；Los等，1995)。G1分子中明顯存在CED3/ICE同系物的獨(dú)特序列特征，這樣就允許設(shè)計出能特異性地影響其活性的藥物。這些藥物能提供保護(hù)，防止過度免疫介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而對CED3/ICE家族其它成員涉及的生理性細(xì)胞死亡過程沒有干擾。
本發(fā)明的其它方面可從下列實施例明顯看出。
現(xiàn)在本發(fā)明將在下列非限制性實施例及其附圖中作更詳細(xì)地描述。
還應(yīng)注意，下列步驟同樣適用于本發(fā)明的G1及其可能的同種型的相應(yīng)分離、克隆和定性i)雙雜交篩選和雙雜交半乳糖苷酶表達(dá)測試；ii)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)、代謝性標(biāo)記和免疫沉淀；iii)體外結(jié)合；iv)細(xì)胞毒性的測定；和V)Northern分析和序列分析，它們分別表述在下文參考實施例1(另見Boldin等，1995b)、2和3(另見Boldin等，1996)關(guān)于MORT-1和MORT-1結(jié)合蛋白(例如MACH)部分內(nèi)。因此，這些步驟被認(rèn)為充分公開了用于分離、克隆和定性本發(fā)明的G1蛋白的相同步驟，如下文實施例1所述(下文參考實施例1-3也以相同或等價的形式出現(xiàn)在共同擁有的待批以色列申請No.114645、114986、115319、116588和117932，以及相應(yīng)的PCT申請No.PCT/US96/10521中)。而且，在上文標(biāo)題為“附圖簡述”章節(jié)中也包括了根據(jù)本發(fā)明所實施的試驗步驟的一些細(xì)節(jié)，在本發(fā)明充分公開方面來說，它們是下文實施例1的一部分，因此應(yīng)被理解成與實施例1一同公開。
參考實施例1與FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的MORT-1蛋白的克隆和分離(i)雙雜交篩選和雙雜交β半乳糖苷酶表達(dá)測試為了分離與FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白，采用了酵母雙雜交系統(tǒng)(Fields和Song，1989)。簡言之，這種雙雜交系統(tǒng)是一種以酵母為基礎(chǔ)的遺傳試驗，其通過真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白(如GAL4)的恢復(fù)來檢測體內(nèi)蛋白-蛋白特異性相互作用，該激活蛋白具有兩個分開的區(qū)域，一個DNA結(jié)合域和一個激活域，這些區(qū)域在被表達(dá)并結(jié)合在一起形成恢復(fù)的GAL4蛋白時能與上游的激活序列結(jié)合，而該上游序列再激活控制報道基因(如lacZ或HIS3)表達(dá)的啟動子，該表達(dá)很容易在培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。在該系統(tǒng)中，將相互作用的候選蛋白的基因克隆到分開的表達(dá)載體中。在一個表達(dá)載體中，克隆入一個候選蛋白的序列與GAL4 DNA結(jié)合域的序列同相，從而和GAL4 DNA結(jié)合域產(chǎn)生雜交蛋白，而在另一個載體中，克隆入第二候選蛋白的序列與GAL4激活域的序列同相，從而和GAL4-激活域產(chǎn)生雜交蛋白。然后將兩種雜交載體共轉(zhuǎn)化到具有l(wèi)acZ或HIS3受體基因(該基因在上游GAL4結(jié)合位點(diǎn)的控制之下)的酵母宿主菌株中。只有兩種雜交蛋白被表達(dá)并能相互作用的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(共轉(zhuǎn)化體)才能表達(dá)報道基因。至于lacZ報道基因，當(dāng)培養(yǎng)物中加入X-gal時，表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞會變成藍(lán)色。因此，藍(lán)色菌落表示的事實是兩種克隆的候選蛋白能夠相互作用。
采用該雙雜交系統(tǒng)，將胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(FAS-IC)分開克隆到pGBT9載體(攜帶GAL4 DNA-結(jié)合序列，由ClONTECH，USA提供，見下文)中，和GAL4 DNA結(jié)合域一起形成融合蛋白。為了將FAS-R克隆到pGBT-9中，采用編碼FAS-R全長cDNA的克隆(WO 9531544)，通過標(biāo)準(zhǔn)步驟用各種限制性酶從中切除胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(IC)，然后用標(biāo)準(zhǔn)步驟分離并插入pGBT9載體，該pGBT9載體的多個克隆位點(diǎn)區(qū)域(MCS)用相應(yīng)的合適的限制性酶打開。應(yīng)注意，F(xiàn)AS-IC為完整FAS-R的氨基酸殘基175-319的延伸，而含有殘基175-319的這一部分為插入pGBT9載體的FAS-IC。
然后，將上述雜交物(嵌合體)與克隆的人HeLa細(xì)胞的cDNA文庫(克隆到pGAD GH載體中，攜帶有GAL4激活域)共同轉(zhuǎn)染到HF7c酵母宿主菌株中(上述所有載體，pGBT9和攜帶HeLa細(xì)胞cDNA文庫的pGADGH、以及酵母菌株均購自Clontech Laboratories，Inc.，USA，是MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)#PT1265-1的一部分)。選擇能在缺少組氨酸的培養(yǎng)基(His培養(yǎng)基)中生長的共轉(zhuǎn)染酵母，生長的菌落表明為陽性轉(zhuǎn)化體。然后，測試所選酵母克隆表達(dá)lacZ基因的能力，即它們的LACZ活性，在培養(yǎng)基中加入X-gal來進(jìn)行測試，X-gal被lacZ基因編碼的酶β-半乳糖苷酶分解成藍(lán)色產(chǎn)物。藍(lán)色菌落表明有活性lacZ基因。為了使lacZ基因有活性，GAL4轉(zhuǎn)錄激活蛋白必須以活性形式存在于轉(zhuǎn)化的克隆內(nèi)，即上述雜交載體編碼的GAL4-結(jié)合域必須適當(dāng)?shù)嘏c另一雜交載體編碼的GAL4激活域結(jié)合。如果與GAL4兩區(qū)域融合的兩個蛋白能穩(wěn)定地相互作用，才可能有這樣的結(jié)合。因此，分離出的His+和藍(lán)色(LACZ+)菌落是已經(jīng)被編碼FAS-IC的載體以及編碼人HeLa細(xì)胞來源的蛋白產(chǎn)物(它能與FAS-IC穩(wěn)定結(jié)合)的載體共同轉(zhuǎn)染的菌落。
用標(biāo)準(zhǔn)程序分離出上述His+、LACZ+酵母菌落的質(zhì)粒DNA，電穿孔到大腸桿菌菌株HB101中，然后選擇Leu+和有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體，這些轉(zhuǎn)化體攜帶了帶AmpR和Leu2編碼序列的雜交pGAD GH載體。因此，這些轉(zhuǎn)化體是這樣一些克隆，它們所攜帶的序列可編碼最近鑒定出的能結(jié)合FAS-IC的蛋白。然后，從這些轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分離出質(zhì)粒DNA，并用下列方式重新進(jìn)行測試(a)使它們和原來的FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域雜交質(zhì)粒(攜帶FAS-IC的雜交體pGTB9)一起重新轉(zhuǎn)化到上述HF7酵母菌株內(nèi)。將攜帶不相關(guān)蛋白編碼序列的載體(例如pACT-核纖層蛋白或單單pGBT9)作為對照，用來和編碼FAS-IC-結(jié)合蛋白(即MORT-1)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。然后在單單His培養(yǎng)基或含有不同水平的3-氨基三唑的培養(yǎng)基上測試共轉(zhuǎn)化酵母的生長情況；和(b)將(a)中所述的質(zhì)粒DNA、原來的FAS-IC雜交質(zhì)粒和對照質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到菌株SFY526的酵母宿主細(xì)胞中，然后測定LACZ+活性(βgal形成即形成藍(lán)色菌落的效率)。
上述測試結(jié)果表明，根據(jù)菌落顏色來評價，His-培養(yǎng)基中的菌落生長模式與LACZ活性的模式相同，即His+菌落即為LACZ+。而且，在將GAL4 DNA結(jié)合域和激活域雜交體轉(zhuǎn)染到SFY256酵母宿主(其用GAL4轉(zhuǎn)錄激活蛋白的LACZ誘導(dǎo)性比HF7酵母宿主細(xì)胞更佳)中后，評價在液體培養(yǎng)(較佳的培養(yǎng)條件)中的LACZ活性。
采用上述程序鑒別、分離并鑒定出一種以前命名為HF1、現(xiàn)在稱為MORT-1(即“受體誘導(dǎo)毒性的介導(dǎo)劑”)的蛋白。
而且，還應(yīng)提到的是，在上述兩種雙雜交β-半乳糖苷酶表達(dá)的一些測試中，β-半乳糖苷酶的表達(dá)還可用較佳的過濾試驗來評價。在該篩選中，發(fā)現(xiàn)約3×106個cDNA中有5個含有MORT-1插入物。然后，用標(biāo)準(zhǔn)DNA測序程序?qū)@樣分離的克隆的MORT-1 cDNA插入物進(jìn)行測序。從該DNA序列推斷出MORT-1的氨基酸序列(關(guān)于MORT-1的DNA和氨基酸序列參見共同擁有的待批以色列申請No.112022，112692和114615及其相應(yīng)的PCT申請No.WO96/18641)。cDNA插入物編碼的蛋白中的殘基編號如Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中所述。用PCR產(chǎn)生缺失突變體，用寡核苷酸定點(diǎn)誘變產(chǎn)生點(diǎn)突變體(Current Protocol in Molec.Biol.，1994)。
(ii)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、代謝性標(biāo)記和免疫沉淀在HeLa細(xì)胞中表達(dá)N端與FLAG八肽連接的MORT-1(FLAG-MORT-1；Eastman Kodak，New Haven，Ct.USA)、Fas-IC、FAS-R、p55-R、含有p55-R胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-168)與FAS-R跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(氨基酸153-319)融合的嵌合體、以及作為對照的螢光素酶cDNA。在表達(dá)四環(huán)素控制的反式激活蛋白的HeLa細(xì)胞克隆(HtTA-1)中用四環(huán)素控制的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)(Gossen和Bujard，1992；另見Boldin等，1995)。在轉(zhuǎn)染18小時后，用[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(DUPONT，Wilmington，DE，USA和Amersham，Buckinghamshire，England)進(jìn)行代謝性標(biāo)記，再在缺少甲硫氨酸和半胱氨酸、但添加了2％透析的胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中37℃培育4小時。然后在RIPA緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1％ NP-40，1％脫氧膽酸鹽，o.1％SDS和1m MEDTA)中裂解該細(xì)胞，裂解液通過和不相關(guān)的家兔抗血清(3μl/ml)和蛋白G Sepharose玻珠(Pharmacia，Uppsala，Sweden；60μl/ml)一起培育來預(yù)澄清。免疫沉淀如下進(jìn)行，用抗FLAG八肽(M2；Eastman Kodak)、p55-R(#18和#20；Engelmann等，1990)、或FAS-R(ZB4；Kamiya Southand Oaks，Ca.，USA)的小鼠單克隆抗體(5μl/等份)4℃培育0.3ml等份裂解液1小時，或用同種型匹配的小鼠抗體作為對照，然后再和蛋白G Sepharose玻珠(30μl/等份)一起培育1小時。
(iii)體外結(jié)合使谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與野生型或突變型Fas-IC融合，然后吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖玻珠上；見Boldin等，1995；Current Protocols in Molecular Biology，1994；Frangioni和Neel，1993)。使玻珠與用[35S]甲硫氨酸(60μCi/ml)代謝性標(biāo)記過的、表達(dá)FLAG-MORT-1的HeLa細(xì)胞抽提物4℃培育2小時，評價有代謝性標(biāo)記的FLAG-MORT-1融合蛋白與GST-Fas-IC的結(jié)合。抽提物用含有50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.1％ NP-40，1mM二硫蘇糖醇，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氯，20μg/ml胰蛋白酶肽，20μg/ml亮抑酶肽，10mM氟化鈉和0.1mM釩酸鈉(每5×105細(xì)胞1毫升)的緩沖液配制。
(iv)評價誘導(dǎo)MORT-1表達(dá)引發(fā)的細(xì)胞毒性將MORT-1、FAS-IC、p55-IC和螢光素酶cDNA插入有四環(huán)素控制的表達(dá)載體中，并和置于SV40啟動子(pSBC-2載體，Dirks等，1993)控制之下的分泌的胎盤堿性磷酸酶cDNA一起轉(zhuǎn)染到HtTA-1細(xì)胞(一種HeLa細(xì)胞系)(Gossen和Bujard，1992)中。轉(zhuǎn)染40小時后通過中性紅攝取試驗(Wallach，1984)評價細(xì)胞死亡，或通過測定培育最后5小時內(nèi)分泌到生長培養(yǎng)基中的胎盤堿性磷酸酶(Berger等，1988)的量來具體評價表達(dá)轉(zhuǎn)染cDNA的那些細(xì)胞的死亡情況。
在分析MORT-1蛋白參與結(jié)合Fas-IC的區(qū)域的另一組試驗中，用有四環(huán)素控制的表達(dá)載體(pUHD10-3)在含有四環(huán)素控制的反式激活蛋白的HeLa細(xì)胞(HtTA-1)中表達(dá)下列蛋白單單人FAS-R；人FAS-R以及MORT-1的N端部分(氨基酸1-117，“MORT-1的頭部”)；人FAS-R以及MORT-1的C端部分(它含有MORT-1的“死亡域”同源區(qū)，氨基酸130-245，“MORT-1 DD”)；FLAG-55.11(蛋白55.11的氨基酸309-900，蛋白55.11的N端與FLAG八肽融合，蛋白55.11是p55-IC特異性結(jié)合蛋白)。轉(zhuǎn)染12小時后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并以30000細(xì)胞/孔的濃度重新接種。進(jìn)一步培育24小時后，用各種濃度(0.001-10μg/ml單克隆抗體)抗FAS-R胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體(單克隆抗體CH-11，Oncor，Gaithersburg，MD，USA)在10μg/ml環(huán)己酰亞胺存在下處理細(xì)胞6小時。然后通過中性紅攝取試驗測定細(xì)胞存活率，結(jié)果以與單用環(huán)己酰亞胺培育的細(xì)胞(沒有抗-FAS-R單克隆抗體CH-11存在)相比的活細(xì)胞百分率％表示。
(v)Nothern分析和序列分析從HeLa細(xì)胞的總RNA(Oligotex-dT mRNA試劑盒，QIAGEN，Hilden，Germany)中分離出Poly A+RNA。用MORT-1 cDNA作為探針，通過常規(guī)方法進(jìn)行Northern分析(見Boldin等，1995)。用雙脫氧鏈終止方法測定兩個方向的MORT-1的核苷酸序列。
對雙雜交程序克隆的MORT-1 cDNA進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明它編碼了一個新的蛋白。采用雙雜交測試進(jìn)一步評價該蛋白(MORT-1，即“受體誘導(dǎo)毒性的中介體”)與Fas-IC結(jié)合的特異性，并確定Fas-IC中與其結(jié)合的特定區(qū)域，發(fā)現(xiàn)下列結(jié)果(a)MORT-1蛋白與人和小鼠Fas-IC結(jié)合，但是不與其它一些測試蛋白(包括TNF/NGF受體家族的三個受體，p55和p75 TNF受體以及CD40)結(jié)合；(b)FAS-R“死亡域”中225位(Ile)的取代型突變顯示消除了體外和體內(nèi)的信號傳導(dǎo)(lprcg突變(Watanabe-Fukunaga等，1992；Itoh和Nagata，1993))，還阻止了MORT-1與Fas-IC結(jié)合；(c)FAS-R中的MORT-1結(jié)合位點(diǎn)在該受體的“死亡域”內(nèi)；和(d)MORT-1與其自身結(jié)合。該自身結(jié)合，以及MORT-1與FAS-R的結(jié)合涉及蛋白的不同區(qū)域?qū)?yīng)于殘基1-117的MORT-1片段與全長MORT-1結(jié)合，但是不與其自身或Fas-IC結(jié)合。相反，對應(yīng)于殘基130-245的片段與FAS-R結(jié)合，但是不和MORT-1結(jié)合。另外，從這些結(jié)果還可看出，F(xiàn)AS-R的“死亡域”區(qū)域?qū)τ贔as-IC自身締合來說是很關(guān)鍵的，正如p55-R的“死亡域”區(qū)域?qū)τ趐55-IC自身締合那樣。這些“死亡域”兩側(cè)的缺失不會影響其自身締合的能力，但是這些“死亡域”中的缺失卻會影響自身締合。至于MORT-1，MORT-1與Fas-IC的結(jié)合還取決于FAS-R的全部“死亡域”，但是不取決于與FAS-IC結(jié)合的FAS-R“死亡域”區(qū)域以外的區(qū)域。
用β-半乳糖苷酶表達(dá)過濾試驗評價轉(zhuǎn)染的SFT526酵母中Gal4 DNA結(jié)合域和激活域構(gòu)建物(pGBT9和pGAD-GH)編碼的蛋白的相互作用。DNA結(jié)合域構(gòu)建物包括四種人Fas-IC構(gòu)建物，四種小鼠Fas-IC構(gòu)建物(包括兩種全長構(gòu)建物，它們在225位有Ile到Leu或Ile到Ala的取代型突變(分別為I225N和I225A))，以及三種MORT-1構(gòu)建物。激活域構(gòu)建物包括三種MORT-1構(gòu)建物，與DNA結(jié)合域構(gòu)建物中一樣的MORT-1部分；以及全長人Fas-IC構(gòu)建物，該Fas-IC部分與上述DNA結(jié)合域構(gòu)建物中的一樣。人p55 TNF受體(p55-IC殘基206-426)、人CD40(CD40-IC，殘基216-277)和人p75 TNF受體(p75-IC，殘基287-461)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以及核纖層蛋白、細(xì)胞周期蛋白D和“空”的Gal4(pGBT9)載體以DNA結(jié)合域構(gòu)建物形式作為陰性對照。SNF-1和SNF4以DNA結(jié)合域(SNF1)和激活域(SNF4)構(gòu)建物的形式作為陽性對照?！翱铡钡腉al4載體(pGAD-GH)還以激活域構(gòu)建物形式作為陰性對照。上述分析結(jié)果表示中，所用的標(biāo)記“++”和“+”表示在試驗30和90分鐘內(nèi)分別產(chǎn)生深的顏色；“-”表示在24小時內(nèi)不產(chǎn)生顏色。
HeLa細(xì)胞蛋白中表達(dá)產(chǎn)生了N端與FLAG八肽融合的MORT-1分子(FLAG-MORT-1)，它們有四種不同的大小—約為27、28、32和34kD。通過免疫沉淀轉(zhuǎn)染了FLAG-MORT-1融合蛋白或螢光素酶cDNA(作為對照)的HeLa細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)MORT-1和Fas-IC在體外相互作用，免疫沉淀用抗FLAG抗體(aFLAG)來進(jìn)行。MORT-1和Fas-IC之間在體外有相互作用還可這樣來證明，從轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞抽提物獲得的MORT-1是[35S]甲硫氨酸代謝性標(biāo)記的FLAG-MORT-1融合蛋白，F(xiàn)AS-IC是人和小鼠GST-FAS-IC融合蛋白，包括FAS-IC的225位有取代型突變的一種融合蛋白，所有GST-FAS-IC融合蛋白均在大腸桿菌中產(chǎn)生。GST-融合蛋白在與含MORT-1-FLAG融合蛋白的抽提物相互作用前先與谷胱甘肽玻珠連接，在該相互作用后，進(jìn)行SDS-PAGE。因此，通過SDS-PAGE后放射自顯影來評價[35S]代謝性標(biāo)記的MORT-1(以FLAG八肽的融合體形式(FLAG-MORT-1)產(chǎn)生于轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中)和GST結(jié)合、和GST與人或小鼠Fas-IC的融合體(GST-huFas-IC，GST-mFas-IC)的結(jié)合或和GST與225位Ile被Ala取代突變的Fas-IC融合體的結(jié)合，從而評價體外相互作用。結(jié)果表明，所有四種FLAG-MORT-1蛋白均顯示出在和GST-Fas-IC融合蛋白一起培育時能結(jié)合Fas-IC。當(dāng)在酵母雙雜交測試，MORT-1不與lprcg突變位點(diǎn)有取代(I225A)的GST-Fas-IC融合蛋白結(jié)合。
FLAG-MORT-1 cDNA編碼的蛋白還顯示出，當(dāng)其和這些受體在HeLa細(xì)胞中共同表達(dá)時，它能與FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、以及胞外結(jié)構(gòu)域被p55-R的胞外結(jié)構(gòu)域(p55-FAS)取代的FAS-R嵌合體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在這種情況下，MORT-1和FAS-IC在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中(即體內(nèi))的相互作用(從各種轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的免疫沉淀觀察到)證實在共轉(zhuǎn)染了編碼這些蛋白的構(gòu)建物的細(xì)胞中MORT-1和FAS-IC之間在體內(nèi)有相互作用，且該相互作用有特異性。因此，在HeLa細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)FLAG-MORT-1融合蛋白，或和人FAS-R、FAS-R嵌合體(其中FAS-R的胞外結(jié)構(gòu)域被人p55-R的對應(yīng)區(qū)域(p55-FAS)所代替)、或人p55-R(作為陰性對照)一起表達(dá)，并用[35S]半胱氨酸(20μCi/ml)和[35S]甲硫氨酸(40μCi/ml)作代謝性標(biāo)記。用各種特異性抗體使MORT-1和共表達(dá)的受體一起進(jìn)行交叉免疫沉淀。結(jié)果表明，當(dāng)和這些受體在HeLa細(xì)胞中共表達(dá)時，F(xiàn)LAG-MORT-1能夠結(jié)合FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，以及FAS-R-p55-R嵌合體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該嵌合體具有p55-R的胞外結(jié)構(gòu)域和FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。另外，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抽提物中免疫沉淀出FLAG-MORT-1也導(dǎo)致共表達(dá)的FAS-R或共表達(dá)的p55-FAS嵌合體的沉淀。相反，這些受體的免疫沉淀導(dǎo)致FLAG-MORT-1的共同沉淀。
采用MORT-1 cDNA作為探針的Northern分析揭示了在HeLa細(xì)胞中有單個雜交轉(zhuǎn)錄物。在Northern印跡中，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的poly A+RNA(0.3μg)與MORT-1cDNA雜交，發(fā)現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄物的大小(約1.8kb)與MORT-1 cDNA的大小(約1702核苷酸)非常接近。
在序列分析中，發(fā)現(xiàn)cDNA含有約250個氨基酸的開放讀框。在上述共同擁有的待批申請中，示出了MORT-1 DNA和氨基酸序列(見WO 96/18641)。在這些序列中，“死亡域”基序用下劃線表示，還示出了可能的起始Met殘基(49位；粗體有下劃線的M)以及翻譯終止密碼子(密碼子在769-771位有星號)。該“死亡域”基序與已知的p55-R和FAS-R“死亡域”基序(p55DD和FAS-DD)同源。為了精確地確定MORT-1的C端，并獲得關(guān)于MORT-1的精確N端(起始Met殘基)的證據(jù)，還進(jìn)行下列試驗。
采用上述方法，構(gòu)建出多個編碼N端與FLAG八肽融合的MORT-1分子(FLAG-MORT-1)構(gòu)建物，并在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，用35S-半胱氨酸和35S-甲硫氨酸對表達(dá)的蛋白質(zhì)作代謝性標(biāo)記。MORT-1-FLAG分子用下列含有MORT-1編碼序列不同部分的cDNA來編碼i)FLAG八肽cDNA與MORT-1 cDNA的5′端連接，該MORT-1 cDNA的核苷酸1-45缺失；ii)FLAG八肽cDNA與MORT-1全長cDNA的5′端連接；iii)FLAG八肽cDNA與MORT-1 cDNA的5′端連接，該MORT-1 cDNA的核苷酸1-145以及核苷酸832-1701缺失，并且142-144位的密碼子GCC被突變成TCC，以防止從該位點(diǎn)開始翻譯。
在上述FLAG-MORT-1融合產(chǎn)物表達(dá)后，如上所述采用抗FLAG單克隆抗體或抗p75-TNF-R抗體(作為對照)進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)和放射自顯影。上述FLAG-MORT-1融合產(chǎn)物的分析結(jié)果確認(rèn)了MORT-1的C末端，并提供了MORT-1的N末端可能在序列第49位的證據(jù)。
實際上，5′端沒有融合FLAG八肽的MORT-1的其它表達(dá)實驗已經(jīng)表明，Met49是有效的翻譯起始位點(diǎn)。
在“基因庫”和“蛋白質(zhì)庫”數(shù)據(jù)庫中的檢索顯示，迄今沒有序列與上述分離的MORT-1序列對應(yīng)。因此，MORT-1代表了一種新的FAS-IC-特異性結(jié)合蛋白。
p55-IC的高度表達(dá)導(dǎo)致引發(fā)殺細(xì)胞效應(yīng)(Boldin等，1995)。Fas-IC在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)也有此效應(yīng)，雖然程度較低，只能用靈敏的測定才能檢測到。因此，分析轉(zhuǎn)染了MORT-1，以及人p55-IC和FAS-IC的細(xì)胞中殺細(xì)胞效應(yīng)的配體非依賴型引發(fā)。用四環(huán)素控制的表達(dá)載體評價MORT-1、人Fas-IC、人p55-IC或螢光素酶(作為對照)的瞬時表達(dá)對HeLa細(xì)胞存活率的效應(yīng)。在四環(huán)素(1μg/ml，以阻斷表達(dá))存在或不存在下，用這些cDNA以及編碼分泌的胎盤堿性磷酸酶的cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染40分鐘后，評價細(xì)胞存活率。通過中性紅攝取試驗測定細(xì)胞存活率，或者為了特異性測定表達(dá)轉(zhuǎn)染DNA的那些特定細(xì)胞的存活率，可通過測定分泌到生長培養(yǎng)基中的胎盤堿性磷酸酶的量來測定細(xì)胞存活率。
上述分析揭示MORT-1在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞顯著死亡，其程度大于FAS-IC表達(dá)所引起的程度。p55-IC、FAS-IC和MORT-1的細(xì)胞毒性效應(yīng)看來均與所有這些蛋白中的“死亡域”區(qū)域有關(guān)，該“死亡域”具有自身締合的趨勢，從而可能促進(jìn)了細(xì)胞毒性效應(yīng)。
鑒于MORT-1的上述特性，即MORT-1與參與細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用的FAS-R的特定區(qū)域特異性締合，并且該區(qū)域結(jié)構(gòu)即使微小的變化(會防止信號傳導(dǎo)，lprcg突變)也會消除MORT-1的結(jié)合這一事實，這表明該蛋白在細(xì)胞死亡的信號傳導(dǎo)或引發(fā)中起作用。這一觀點(diǎn)進(jìn)一步得到以下觀察結(jié)果的支持，即MORT-1能通過其自身來引發(fā)殺細(xì)胞效應(yīng)。因此，MORT-1能夠(i)通過其自身和FAS-R和本身結(jié)合的能力來作為FAS-R的自身締合調(diào)節(jié)劑，或(ii)作為參與FAS-R信號傳導(dǎo)作用的其它蛋白的?？课稽c(diǎn)，即，MORT-1可能是“?？俊钡鞍?，因而能結(jié)合FAS-R以外的其它受體，或(iii)構(gòu)成了與FAS-R信號傳導(dǎo)相互作用的不同信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分。
為了進(jìn)一步分析涉及FAS-IC結(jié)合和調(diào)節(jié)FAS-R-介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)(細(xì)胞毒性)的MORT-1區(qū)域，進(jìn)行上述試驗，試驗采用編碼部分MORT-1(“MORT-1頭部”，氨基酸1-117和“MORT-1 DD”，氨基酸130-245)(分開)的載體，以及編碼人FAS-R的載體，共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。在這些試驗中，將編碼蛋白的序列插入四環(huán)素控制的表達(dá)載體pUHD10-3中，從而在含有四環(huán)素控制的反式激活蛋白的HeLa細(xì)胞(HtTA-1)中瞬時表達(dá)各種蛋白和蛋白的組合。對照轉(zhuǎn)染采用僅編碼FAS-R的載體以及編碼FLAG-55.11融合蛋白(55.11蛋白是一種p55-IC特異性結(jié)合蛋白，它的一部分含有氨基酸309-900在其N端與FLAG八肽融合)的載體。
在轉(zhuǎn)染和培育后，用各種濃度的抗FAS-R單克隆抗體(CH-11)處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該單克隆抗體能特異性地結(jié)合細(xì)胞表達(dá)的FAS-R的胞外結(jié)構(gòu)域。與該抗FAS-R抗體的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞表面的FAS-R聚集(與FAS-R配體非常相似)，并且誘導(dǎo)了由FAS-IC介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡(FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)?？笷AS-R單克隆抗體(CH-11)所用的濃度在0.01-10μg/ml范圍內(nèi)，通常用的濃度例如是0.005；0.05；0.5和5μg/ml。在10μg/ml環(huán)己酰亞胺存在下，用該抗-FAS抗體處理細(xì)胞。
上述分析的結(jié)果表明，F(xiàn)AS-R在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)增加了細(xì)胞對抗FAS-R抗體對殺細(xì)胞效應(yīng)的敏感度。另外，如同從MORT-1“死亡域”(DD)區(qū)域結(jié)合FAS-R“死亡域”(FAS-DD)的能力所預(yù)計的那樣，MORT-1中含有“死亡域”同源區(qū)的區(qū)域以及FAS-R的共表達(dá)強(qiáng)烈干擾了FAS誘導(dǎo)(即FAS-R介導(dǎo))的細(xì)胞死亡。而且，MORT-1的N端部分和FAS-R的共表達(dá)不干擾FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而且還一定程度地增強(qiáng)了細(xì)胞毒性(即稍稍增加細(xì)胞死亡)。
因此，上述結(jié)果清楚地表明，就結(jié)合FAS-IC和介導(dǎo)FAS-IC的細(xì)胞毒性活性而言，MORT-1蛋白有兩個不同的區(qū)域。
因此，這些結(jié)果也為使用MORT-1蛋白不同部分(即活性片段或類似物)來作為不同的藥物用途提供了基礎(chǔ)。例如，基本上只含MORT-1 C端部分包括其“死亡域”區(qū)域的MORT-1蛋白的類似物、片段或衍生物可用來抑制含有FAS-R的細(xì)胞或組織中FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)，從而保護(hù)這些細(xì)胞或組織免受FAS-R配體的有害作用(例如在急性肝炎情況下)。或者，基本上只含有MORT-1 N端部分的MORT-1蛋白的類似物或片段或衍生物，可用來在含有FAS-R的細(xì)胞和組織中增強(qiáng)FAS-R介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)，從而在需要時增強(qiáng)對這些細(xì)胞或組織的破壞(例如在腫瘤細(xì)胞和自身反應(yīng)T和B細(xì)胞情況下)。如上文所詳細(xì)描述的，通過用各種重組病毒(如牛痘)來將MORT-1區(qū)域的編碼序列插入需要治療的特定細(xì)胞或組織中，就可實現(xiàn)MORT-1不同區(qū)域的上述用途。
另外，還可制得和使用其它各種分子，例如抗體、肽和有機(jī)分子，它們具有對應(yīng)于上述MORT-1區(qū)域的序列或分子結(jié)構(gòu)，以便實現(xiàn)這些MORT-1區(qū)域介導(dǎo)的所需的相同效應(yīng)。
而且，MORT-1可用來特異性地鑒別、分離和分析能與MORT-1結(jié)合的其它蛋白(即MORT-1結(jié)合蛋白)；參見參考實施例2和3。
參考實施例2MORT-1結(jié)合蛋白的分離(i)雙雜交篩選和雙雜交β-半乳糖苷酶表達(dá)試驗以類似于參考實施例1所述的步驟，用p55 TNF-R(p55IC)和MORT-1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域作為誘餌，篩選人B-細(xì)胞文庫，獲得兩個cDNA克隆，這兩個克隆編碼了能與MORT-1和p55-IC結(jié)合的蛋白。兩個克隆在5′端表現(xiàn)出相同的核苷酸序列(參見共同擁有的待批申請WO96/18641和PCT/US96/10521)。
(ii)新克隆的cDNA在雙雜交篩選中的結(jié)合性質(zhì)采用上述酵母雙雜交程序，用含有新的MORT-1結(jié)合蛋白cDNA的構(gòu)建物作為“捕獲物”，該“捕獲物”構(gòu)建物在各反應(yīng)中加入了多個“誘餌”，以測定該cDNA編碼的MORT-1結(jié)合蛋白的結(jié)合特異性。這些“誘餌”所包括構(gòu)建物能編碼MORT-1、MORT-1的一部分(MORT“頭部”，氨基酸1-117，MORT“尾部”，氨基酸130-245)、p55 IC(206-426p55)或其部分(“死亡域”，326-426p55；以及“死亡域”的其它上游，即206-326)。結(jié)果顯示在表2中。
表2
克隆與一大組誘餌的結(jié)合的雙雜交β-半乳糖苷酶表達(dá)測試的上述結(jié)果證實了該克隆編碼的蛋白特異性地結(jié)合p55 TNF-R和MORT-1的死亡域。
總之，MORT-1結(jié)合蛋白可用來直接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)MORT-1相關(guān)的細(xì)胞效應(yīng)，或間接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)FAS-R配體對于細(xì)胞的效應(yīng)(當(dāng)該效應(yīng)由MORT-1介導(dǎo)或調(diào)節(jié)時)。對于其它胞內(nèi)蛋白或跨膜蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來說也是如此，具體可用本文的p55 TNF-R來加以證實。
MORT-1結(jié)合蛋白包括與整個MORT-1蛋白特異性結(jié)合的那些蛋白，或是與MORT-1蛋白的不同區(qū)域(例如上述的MORT-1的N端和C端區(qū)域)結(jié)合的那些蛋白。與這些區(qū)域特異性結(jié)合的MORT-1結(jié)合蛋白可用來調(diào)節(jié)這些區(qū)域的活性，因此可以調(diào)節(jié)這些區(qū)域決定的MORT-1的特異性活性。
參考實施例3另一種MORT-1結(jié)合蛋白-MACH蛋白的分離和鑒定(i)雙雜交篩選、雙雜交β-半乳糖苷酶試驗，測序和序列分析用上述參考實施例1和2提出的步驟，在酵母雙雜交系統(tǒng)中用編碼人MORT-1蛋白的全長構(gòu)建物作為“誘餌”，分離出編碼另一新的MORT-1結(jié)合蛋白的cDNA克隆。該新的蛋白最初命名為MORT-2，現(xiàn)在根據(jù)如下文所述的其特征被重新命名并稱為MACH(與MORT-1相關(guān)的CED3同系物)。
用上述參考實施例1和2中提到的標(biāo)準(zhǔn)步驟對該cDNA進(jìn)行測序。標(biāo)準(zhǔn)步驟的序列分析和計算機(jī)程序(參見參考實施例1和2)揭示，該cDNA具有新的序列并編碼一個新的蛋白(其DNA和氨基酸序列均未在GENBANK和PROTEINBANK序列數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn))。另外，編碼MACH的cDNA揭示ORF-B開放讀框與MORT-1蛋白“死亡域”基序前面(5′上游)的區(qū)域(參見參考實施例1)的同源性非常高。在共同擁有的待批以色列申請No.114615，114986，115319，116588和117932及其對應(yīng)的PCT申請No.PCT/US96/10521中顯示了含有ORF-B(235氨基酸殘基)的MACH cDNA克隆的該部分結(jié)構(gòu)；MACH ORF-B據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列；以及MACH cDNA分子的核苷酸序列。ORB-F區(qū)享有和MORT-1“死亡域”基序上游MORT-1區(qū)域非常高的同源性。
進(jìn)一步用酵母雙雜交試驗來評價MACH和MORT-1結(jié)合的特異性，特別是用來確定MORT-1中與MACH結(jié)合的區(qū)域，并確定那些MACH ORF與MORT-1相互作用，這些步驟如上文參考實施例1和2中所述。簡言之，制得各種MORT-1和MZCH構(gòu)建物，用來測試由轉(zhuǎn)染的SFY526酵母細(xì)胞中Gal4 DNA結(jié)合域和激活域構(gòu)建物編碼的蛋白的相互作用，通過β-半乳糖苷酶表達(dá)過濾試驗來評價。DNA結(jié)合域構(gòu)建物制備在pGBT9載體中，激活域構(gòu)建物制備在pGAD-GM載體中。對于激活域構(gòu)建物，采用全長MACH cDNA(MACH)和僅僅編碼ORF-B區(qū)(MACH B)的構(gòu)建物。作為對照的激活域構(gòu)建物是那些含有全長MORT-1編碼序列(MORT 1，陽性對照)的構(gòu)建物和不含插入物(即“空”載體)(pGAD-GM)的構(gòu)建物。對于DNA結(jié)合域構(gòu)建物，采用全長MORT-1 cDNA(MORT 1)，以及僅僅編碼MORT-1上游區(qū)域(MORT-1 DD，氨基酸130-245)的構(gòu)建物。作為對照的DNA結(jié)合域構(gòu)建物(也構(gòu)建用來測定MACG結(jié)合的特異性)包括編碼核纖層蛋白(Lamin)、人p75 TNF-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的殘基287-461的構(gòu)建物(人p75 IC)、細(xì)胞周期蛋白D(cycD)、SNF1、人p55 TNF-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域殘基206-426(人p55 IC)、人Fas-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的“死亡域”區(qū)域(人Fas DD)、人CD40胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的殘基216-277(人CD40 IC)、沒有插入物的載體或“空”的pGBT9載體(pGBT9，陰性對照)的構(gòu)建物，以及編碼MACH ORF-B區(qū)域(MACH B)的構(gòu)建物。在試驗中，測定顏色的產(chǎn)生，顏色產(chǎn)生的越深，則DNA結(jié)合域和激活域編碼的構(gòu)建物之間的相互作用就越強(qiáng)。顏色的產(chǎn)生用以下標(biāo)記表示，＂+++＂和＂+＂分別表示在測定30和90分鐘內(nèi)產(chǎn)生了較深的顏色，而＂---＂表示在測定的24小時內(nèi)不產(chǎn)生顏色。沒有測試相互作用則無表示標(biāo)記。上述情況下的各種相互作用結(jié)果顯示在下表3中，而MACH同種型的各種相互作用的結(jié)果則顯示在上述共同擁有的待批PCT/US96/10521及其IL對應(yīng)申請中。
表3域雜交
因此，從上述表3的結(jié)果可以明顯看出，(a)MACH以非常強(qiáng)的特異性方式與MORT-1結(jié)合；(b)MORT-1中的MACH結(jié)合位點(diǎn)在MORT-1中的“死亡域”基序之前(上游)，即在MORT-1的氨基酸1-117所確定的MORT-1區(qū)域內(nèi)；(c)MACH的ORF-B區(qū)域是MACH蛋白中與MORT-1相互作用的區(qū)域；和(d)MACH ORF-B區(qū)域能自身締合。
(ii)MACH蛋白的自身締合能力介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)MACH能自身締合、尤其是MACH的ORF-B區(qū)域能自身締合的觀察結(jié)果，和以前觀察到的p55 TNF-R和FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的自身締合和細(xì)胞毒性之間的關(guān)系，以及MORT-1的觀察(見參考實施例1)，這些都暗示MACH自身締合也可能參與細(xì)胞毒性效應(yīng)。
為了測試這一可能性，用四環(huán)素控制的表達(dá)載體制得編碼MACH的構(gòu)建物(細(xì)節(jié)參見參考實施例1)。用這些構(gòu)建物來轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，載體在該細(xì)胞中瞬時表達(dá)。除了MACH構(gòu)建物外，還采用其它構(gòu)建物來評價瞬時表達(dá)對HeLa細(xì)胞存活率的影響，并將其與MACH構(gòu)建物的影響相比較。這些其它構(gòu)建物包括MORT-1、人FAS-IC和螢光素酶(Luc)。另外，還用MORT-1和MACH構(gòu)建物來共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以確定這些蛋白之間的相互作用會引起何種效應(yīng)。轉(zhuǎn)染后，培育HeLa細(xì)胞，并在四環(huán)素(用來抑制表達(dá))(1μg./ml)存在或不存在下，在轉(zhuǎn)染48小時后評價細(xì)胞存活率。用中性紅攝取試驗測定細(xì)胞存活率。
從上述分析的結(jié)果可明顯看出，MACH在HeLa細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)出顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)，即HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)的MACH cDNA過度表達(dá)導(dǎo)致了顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)。該細(xì)胞毒性效應(yīng)可能與MACH的自身締合性能相關(guān)。
(iii)Northern分析用熟知的步驟(見參考實施例1)，以MACH cDNA作為探針，對幾種細(xì)胞系進(jìn)行Northern分析。該分析結(jié)果表明，在許多細(xì)胞系中(特別是CEM，Raji，Daudi，HeLA，Alexander，Jurkat和A673細(xì)胞系中)，存在大小約為3.2kb的兩種雜交轉(zhuǎn)錄物。
鑒于上述結(jié)果，MACH蛋白、尤其是MACHβ1蛋白(MACH的ORF-B)可用來直接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)MORT-1相關(guān)的細(xì)胞效應(yīng)，或間接調(diào)節(jié)或介導(dǎo)FAS-R配體對于細(xì)胞的效應(yīng)(當(dāng)該效應(yīng)由MORT-1來調(diào)節(jié)或介導(dǎo)時)。MACH與MORT-1上游區(qū)域特異性結(jié)合且與MORT-1同源的這些事實提供了一種特殊的方式，此方式可用MACH或MACH ORF-B來調(diào)節(jié)MORT-1的該特異性區(qū)域，因而調(diào)節(jié)由該上游區(qū)域確定的MORT-1的特異性活性。另外，MACH或MACH ORF-B還可以類似于MORT-1(見上文)的方式憑借MACH能自身締合并誘導(dǎo)對自己的細(xì)胞毒性的能力用作胞內(nèi)效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑或中介體。
如下文所述，進(jìn)一步分析MACH蛋白及其編碼的DNA序列。結(jié)果進(jìn)一步揭示了MACH的ORF-B只是多種MACH同種型中的一種。因此，現(xiàn)在已經(jīng)對MACH蛋白及其DNA編碼序列重新命名，這從下文中可明顯看出。
(a)雙雜交篩選結(jié)合MORT-1的蛋白揭示了一個享有MORT-1序列基序的新蛋白如上所述，為了鑒別出參與MORT-1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程的蛋白，用雙雜交技術(shù)來篩選cDNA文庫，以便選出與MORT-1結(jié)合的蛋白。用MORT-1 cDNA作為誘餌，對人B細(xì)胞文庫進(jìn)行雙雜交篩選(Dufee等，1993)，產(chǎn)生了MORT-1本身的cDNA克隆，這反映了該蛋白能如同MORT-1有效結(jié)合的TRADD克隆一樣好地自身締合(見參考實施例2)。篩選還產(chǎn)生了新序列的cDNA克隆，其產(chǎn)物能特異性地結(jié)合MORT-1。該蛋白最初被稱為MACH，后來，在發(fā)現(xiàn)它存在于多種同種型(見下文)后，就重新命名為MACHβ1，其在雙雜交測試中也顯示出能與其自身結(jié)合，但是不能和FAS-R結(jié)合(見上述共同擁有的待批申請PCR/US96/10521，此申請還包括所有下述分析和分析所獲得的結(jié)果)。
在轉(zhuǎn)染了Gal4 DNA結(jié)合域和激活域構(gòu)建物(pGBT9和pGAD-GH)的SFY526酵母中表達(dá)MORT-1和MACHβ1及其缺失的構(gòu)建物，以及MACHα1(一種MACHα1突變體，此突變體有催化性的半胱氨酸Cys360被Ser代替(MACHα1(C360S)))，和人FAS-R胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Fas-IC)。用Boldin等(1995b)所述的β-半乳糖苷酶表達(dá)過濾試驗評價它們的相互作用。結(jié)果用產(chǎn)生較深顏色所需的時間表示。受檢測的插入物沒有一種和大量測試陰性對照相互作用，包括人p55TNF受體、p75 TNF受體和CD40的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，以及核纖層蛋白、細(xì)胞周期蛋白D和“空”的Gal4載體。用HF7c酵母報道菌株，通過雙雜交篩選Gal4 AD-標(biāo)記的人B細(xì)胞文庫(Durfee等，1993)中與MORT-1結(jié)合蛋白，克隆獲得MACHβ1。除非另有特指，該發(fā)現(xiàn)的所有步驟如上所述(另見Boldin等，1995)。缺失分析表明，MACHβ1與參與細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用的MORT-1的N端部分結(jié)合(Chinnaiyan等，1995)。MACHβ1還在轉(zhuǎn)染的酵母中自身締合。然而，它不與幾種對照蛋白結(jié)合，并且與MORT-1不同，不能與FAS-R結(jié)合。MACHβ1分子在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生了34kDa的蛋白，它能與和其共表達(dá)的MORT-1分子結(jié)合。它還能在體外和GST-MORT-1融合蛋白結(jié)合。
比較MACHβ1和MORT-1的氨基酸序列，結(jié)果表明這兩種蛋白中有一個共同的序列基序(命名為“Mort組件”)，其與死亡基序(MORT-1通過該基序與FAS-R結(jié)合)不同。該基序在MORT-1中有一個，在MACHβ1中有兩個。另外，在PEA-15(一種功能未知的星形細(xì)胞磷蛋白)中也發(fā)現(xiàn)了該基序。初步數(shù)據(jù)暗示，MORT基序參與了MACHβ1(及其它MACH同種型)與MORT-1的結(jié)合。
推導(dǎo)的MACHβ1的氨基酸序列在上述PCT/US96/10521及其對應(yīng)的以色列申請(尤其是IL117932)中有所描述。其中顯示了兩種MORT組件以及采用的兩種MACHβ1缺失突變體的C端。上述共同擁有的待批申請中還描述了MACHβ1、MORT-1和PEA-15基因(登錄號為X86809)中的組件序列同源性，其中相同和相似的殘基分別用方框和陰影區(qū)域表示。
在上述共同擁有的申請中，還示出了死亡域和MORT組件，以及Fas/APO1，MACHβ1和MACHα1中的CED3/ICE同源區(qū)。
現(xiàn)已表明，含有該“MORT組件”的MORT-1中的區(qū)域參與了該蛋白的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用(見上文參考實施例1)。還表明，它導(dǎo)致MORT-1自身締合(盡管不充分)(見參考實施例1)。對轉(zhuǎn)染酵母中MACHβ1的缺失構(gòu)建物的結(jié)合性能進(jìn)行分析，結(jié)果也揭示了MORT組件以類似方式參與了MACHβ1的自身締合以及其與MORT-1的結(jié)合缺失構(gòu)建物中MORT組件以下(下游)的區(qū)域缺失，使它不能相互結(jié)合，但是仍保留了與全長MORT-1和全長MACHβ1結(jié)合的能力。進(jìn)一步截短使MORT組件序列的一部分缺失，結(jié)果導(dǎo)致該蛋白喪失結(jié)合能力。為了進(jìn)一步評價MORT組件參與這些相互作用，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)與FLAG八肽融合的MACHβ1缺失突變體(FLAG-MACHβ1)，并評價其與細(xì)菌產(chǎn)生的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-MORT-1融合蛋白(GST-MORT-1)的體外結(jié)合。與酵母雙雜交測試中所觀察到的結(jié)合類似，發(fā)現(xiàn)這種體外結(jié)合也取決于MACHβ1組件內(nèi)區(qū)域的相互作用。在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生MACHβ1、N端融合了FLAG八肽的MACHβ1(FLAG-MACHβ1)、FLAG-MACHβ1的C端截短突變體以及對照螢光素酶。表達(dá)采用四環(huán)素控制的表達(dá)載體，在表達(dá)四環(huán)素控制的反式激活蛋白的HeLa細(xì)胞克隆(HtTA-1)中進(jìn)行。
用抗FLAG抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀來評價上述蛋白的表達(dá)及其分子大小。所用抗體如下針對GST-MACHβ1和GST-MORT1融合蛋白產(chǎn)生的家兔抗MACHβ1和抗MORT1抗血清。針對FLAG八肽的小鼠單克隆抗體(M2)以及針對FAS/APO1的單克隆抗體(CH11，Yonehara等，1989)分別購自Eastman Kodak和Oncor(Gaithersburg，MD)。小鼠單克隆抗-HA表位抗體(12C.A5，F(xiàn)ield等，1988)和抗TNF抗體由我們實驗室根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常用方法產(chǎn)生。結(jié)果顯示了這些蛋白與吸附在谷胱甘肽-瓊脂糖玻珠上的GST-MORT-1親和結(jié)合(或作為對照，這些蛋白與GST或和Fas-APO1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的GST結(jié)合)；且采用各種特異性抗體時，各種MORT-1和MACH融合構(gòu)建物發(fā)生免疫沉淀，這些結(jié)果在上述共同擁有的待批申請中，尤其是在PCT/US96/10521和IL 117932中有所描述。
(b)以多種同種型形式存在的MACH用MACHβ1 cDNA作為探針的Northern分析結(jié)果表明，在幾種不同細(xì)胞系中，大小約為3kb的轉(zhuǎn)錄物的豐度很低。簡言之，用MACHβ1 cDNA作為探針，對幾種細(xì)胞系的總RNA(14μg/泳道)或poly A+RNA(2μg)進(jìn)行Northern印跡分析。受檢的T47D、CEM、Raji、Daudi、HeLa、Alexander、Jurkat、和A673細(xì)胞系均為人源，分別來自乳房導(dǎo)管癌、急性淋巴母細(xì)胞T細(xì)胞白血病、Burkitt淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、上皮樣(epitheloid)癌、人肝瘤、急性T細(xì)胞白血病和橫紋肌肉瘤。Northern印跡上雜交條帶相當(dāng)擴(kuò)散的形狀表明，這些轉(zhuǎn)錄物是異質(zhì)性的，大小在2.85-3.5Kb范圍內(nèi)。不同人組織的轉(zhuǎn)錄物的量和大小均不相同，且與MORT1或FAS/APO1的表達(dá)無關(guān)(Watanabe等，1992)。例如在睪丸和骨骼肌中，MACH轉(zhuǎn)錄物幾乎檢測不到，盡管這些組織表達(dá)了顯著量的MORT1。相反在靜止的外周血單核白細(xì)胞中，MOAT1的表達(dá)非常低，而發(fā)現(xiàn)MACH的表達(dá)水平非常高。用外源凝集素激活白細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致MACH轉(zhuǎn)錄物的大小模式顯著改變，同時還誘導(dǎo)了MORT-1。
為了研究該大小非均一性的特性，篩選cDNA文庫，尋求與MACHβ1 cDNA探針雜交的轉(zhuǎn)錄物。MACHα1和MACHα2從人胸腺mRNA獲得的Charon BScDNA文庫中克隆出。用MACHβ1 cDNA探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下篩選該文庫，該探針用隨機(jī)引導(dǎo)試劑盒(Boehringer Mannheim)作標(biāo)記。其它MACH同種型通過在Raji(MACHα1，α2，α3，β3和β4)和Daudi(MACHα2，β2，β3，β4和β5)的總RNA上進(jìn)行RT-PCR來克隆獲得。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)用寡-dT銜接引物(5′-GACTCG AGTCTAGAGTC GAC(T)17-3′)和SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO-BRL)根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行。PCR的第一輪采用Expand Long Template PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)進(jìn)行，分別用下列有義和反義引物5′-AAGTGA GCAGA TCAGA ATTGAG-3′(對應(yīng)于MACHβ1 cDNA的核苷酸530-551)和5′-GACT CGAGT CTAGA GTCGAC-3′。第二輪用Vent聚合酶(NEB)來進(jìn)行，分別采用下列有義和反義嵌套引物5′GAGGA TCCCC AAATGC AAACTG GATGA TGAC-3′和5′GCCA CCAGCTAAAAA CATTC TCAA-3′(從MACHβ1 cDNA的序列獲得)。為了確認(rèn)MACHβ3和MCAHβ4具有啟動密碼子，還從Raji細(xì)胞的RNA克隆獲得這些同種型的其它5′序列。用上述寡-dT銜接引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，然后是兩輪PCR(用Vent聚合酶(NEB))，采用下列有義和反義寡核苷酸5′-TTGGA TCCAG ATGGA CTTCAGCAGA AATCTT-3′和5′-ATTCTC AAACCC TGCAT CCAA GTG-3′(從MACHβ1的序列獲得)。后一寡核苷酸對β-同種型有特異性。在以該方式獲得的克隆中，對發(fā)現(xiàn)含有編碼＂區(qū)段2＂氨基酸的核苷酸(它的存在區(qū)分MACHβ3和MACHβ4與MACHβ1和MACHβ2)的那些克隆進(jìn)行全部測序。用雙脫氧鏈終止方法在兩個方向上測定所有克隆的同種型中的核苷酸序列。只獲得了MACHa3和MACHβ2的部分cDNA克隆。該篩選揭示了MACH的多種同種型的存在。詳細(xì)研究這些同種型中的7種的氨基酸序列。在上述共同擁有的待批申請、尤其是PCT/US96/10521和IL 117932中列舉性地圖示了該結(jié)果，其中將同種型中的3種的氨基酸序列與已知同系物作了比較。
MACHα1中編碼“區(qū)段2”的65個核苷酸的缺失導(dǎo)致MACHβ1和MACHβ2中編碼“區(qū)段3”的核苷酸讀框改變。因此，在那些同種型中，這些核苷酸編碼的其它氨基酸共同組成了其獨(dú)特的C端區(qū)域。另一方面，在MACHβ3和MACHβ4中保留了區(qū)段3的讀框，但是編碼CED3/ICE區(qū)域和部分3′非編碼區(qū)核苷酸的缺乏導(dǎo)致更下游的核苷酸讀框發(fā)生改變。由于這一變化，該非編碼下游區(qū)的大多數(shù)5′部分編碼了10個氨基酸，它們組成了這兩種同種型特有的C端區(qū)。
從人B細(xì)胞cDNA文庫(MACHβ1)、人胸腺cDNA文庫(MACHα1和α2)和人淋巴母細(xì)胞瘤(lymphoblastoid)細(xì)胞Raji(MACHα1，α2，α3，β3，β4和β5)和Daudi(MACHα2，β2，β3，β4和β5)的mRNA克隆獲得同種型。從Raji和Daudi細(xì)胞的mRNA克隆用RT-PCR來進(jìn)行，采用對應(yīng)于3′非編碼區(qū)和MACHβ1中第二MORT組件中一個序列的寡核苷酸。因此，以該種方式分離出的克隆的起始密碼子位于第二MORT組件內(nèi)。
不同同種型中的序列的相互關(guān)系如下(a)所有MACH同種型均具有一個共同的182氨基酸的N端區(qū)，該區(qū)域包括MORT組件，但是這些組件羧基端(3′下游)以及其非編碼區(qū)不同。(b)根據(jù)C端序列，同種型分為兩個亞類四種同種型稱為亞類β，由于讀框的改變，它們具有不同的C端。兩種同種型(MACHβ1和β2)均具有雙雜交篩選中最初克隆獲得的同種型中所見的C端，另兩種(MACHβ3和MACHβ4)則具有不同的C端；三種同種型被稱為亞類α，它們具有長得多的C端區(qū)，該C端區(qū)與CED3/ICE家族的蛋白酶(見下文)非常類似；在MORT組件區(qū)和確定亞類的C端區(qū)之間的延伸區(qū)各同種型相互不同。然而仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn)，這些中間區(qū)由相同的三個氨基酸序列區(qū)段(區(qū)段1、2和3)的不同組合組成。不同克隆之間的氨基酸序列的變化反映了核苷酸序列的兩類變化，它們很可能是由可變剪接產(chǎn)生的(a)在編碼Lys184的核苷酸后面，插入或缺失了兩種核苷酸序列之一或兩者，一個有45個核苷酸，另一個有65個核苷酸；(b)在MACHβ1中組成3′非編碼部分的區(qū)域中有附加插入物的存在。這些變化對讀框以及蛋白長度均有影響。
部分MACH同種型包括CED3/ICE同系物。數(shù)據(jù)庫檢索表明，包括區(qū)段3及其下游延伸序列的MACHα同種型的C端區(qū)，與CED3/ICE家族的蛋白酶非常相似。將MACH中的該區(qū)域與該家族的各種已知人成員和Caenorhabditis elegansced3蛋白作序列比較(Ellis和Horvitz，1986；Yuan等，1993)，CED3/ICE蛋白酶家族的已知人蛋白酶是CPP32(Fernandes-Alnemri等，1994)(也稱為apopain(Nicholson等，1995)和Yama(Tewari等，1995b))、Mch2α(Fernandes-Alnemri等，1995)、Ich-l(Wang等，1994；小鼠Nedd2蛋白的人同系物，Kumar等，1994)、ICErelII(＜umday等，1995)、ICErelII(Munday等，1995)(也稱為TX和Ich2(Faucheu等，1995；Kamens等，1995))、和ICE(Thomberry等，1992；Cerretti等，1992)。
上述MACH的C端區(qū)最近似于CPP32(相同性41％，同源性62％)和CED3(相同性34％，同源性56％)。它表現(xiàn)出與ICE及其密切相關(guān)的同系物ICErelII(也稱為TX和Ich2)和ICErelIII的相似性明顯較低(相同性28％，同源性50％)。在區(qū)段3內(nèi)從Tyr226起至MACHα同種型的C端為止的幾乎全部區(qū)域內(nèi)觀察到該相似性。
有兩點(diǎn)相似性特別值得注意(a)CED3/ICE家族的所有已知蛋白酶切割蛋白的位點(diǎn)定位于P1位置有Asp，以及P1′處有小疏水性氨基酸殘基。但是對于底物的其它結(jié)構(gòu)特征(包括位置P2-P4的殘基的特征)，它們的特異性不同。因此，在這些蛋白酶中，參與催化的活性位點(diǎn)殘基(對應(yīng)于ICE中的His237，Gly238和Cys285)以及涉及針對P1 Asp羧酸側(cè)鏈的結(jié)合袋的活性位點(diǎn)殘基(Arg179，Gln283，Arg341，可能還有Ser347)是保守的。這些殘基在MACHα1中也是保守的。但是有一個例外，在對應(yīng)于ICE的Ser347位點(diǎn)處Ser保守性地變?yōu)門hr。MACHa同種型和該蛋白酶家族其它成員之間的另一個輕微的但可能很重要的序列差別是，對應(yīng)于ICE的Arg286殘基，Arg被Gln取代。該殘基與推導(dǎo)的催化性半胱氨酸殘基毗鄰，它在其它所有CED3/ICE家族成員中是完全保守的。另外，MACHα同種型中位于底物P2-P4殘基附近的部分殘基也與CED3/ICE家族其它成員中所見的不同。
(b)CED3/ICE家族的蛋白酶含有自身斷裂的位點(diǎn)。已知幾種蛋白酶確實能自我加工，并且依靠這種加工來表現(xiàn)出最大的催化活性。它們?nèi)康纳锘钚孕问接纱笮〔煌膬蓚€非共價聯(lián)合的斷裂產(chǎn)物組成(ICE中的p20和p17；CPP32中的p17和p12)。該家族其它成員中存在自身斷裂的潛在位點(diǎn)，暗示它們也可受類似的加工，并且也能類似地依靠該加工來表現(xiàn)出最大的活性。MACHα1中的這些潛在的自身斷裂位點(diǎn)和CPP32中的幾乎處于相同的位置處。對應(yīng)于CPP32的p17亞基N端的位點(diǎn)在氨基酸的第二保守區(qū)段內(nèi)，正好是CED3/ICE-同源區(qū)N端上游的幾個氨基酸(在Asp216之后)。和已知能被斷裂的CED3/ICE家族的其它所有成員中的一樣，對應(yīng)于CPP32兩個亞基間斷裂點(diǎn)的位點(diǎn)是在催化性半胱氨酸殘基下游(在Asp347之后)的幾個氨基酸。這種保守提示了MACHα1中的CED3/ICE同源區(qū)易受蛋白水解加工。該斷裂的兩個預(yù)計產(chǎn)物的大小與CPP32分子加工后的兩個亞基非常相似。
(c)MACH中的CED3/ICE同源區(qū)具有蛋白水解活性。
為了確認(rèn)MACHa中的CED3/ICE同源區(qū)是否具有蛋白水解活性，申請人在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)了從該區(qū)域上游潛在斷裂位點(diǎn)(在Asp216和Ser217之間)延伸到蛋白C端的區(qū)域，作為GST融合蛋白。檢測細(xì)菌裂解液斷裂熒光肽底物的能力，前已表明該底物可被其它CED3/ICE同系物斷裂。采用以下兩個底物肽第一個是乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰-7-酰胺)(AC-DEVD-AMC)，它對應(yīng)于FAS-R刺激后不久(Tewari等，1995b)和其他凋亡過程(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)中在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)被切割的一種核蛋白聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列。該熒光底物可被CPP32有效地切割。第二種熒光底物是乙酰-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC(Ac-YVAD-AMC)，它對應(yīng)于IL-1β前體中針對ICE的底物位點(diǎn)。該熒光底物可被ICE斷裂。表達(dá)MACHα1中的CED3/ICE同源區(qū)的細(xì)菌裂解液有效地切割了PARP序列衍生的熒光底物。雖然，它們針對IL-1β前體序列衍生的熒光底物(對照)Ac-YVAD-AMC(它是IL-1β前體中的ICE切割位點(diǎn)(Thornberry等，1992))，卻沒有可檢測的蛋白水解活性。蛋白水解活性被碘代乙酸(5mM)阻斷，這確證了它是由硫醇蛋白酶介導(dǎo)的。用含有融合GST的MACHCED3/ICE同源區(qū)(其中催化性半胱氨酸殘基Cys360被Ser取代)的裂解液沒有發(fā)現(xiàn)斷裂。另外，將全長MACHα1蛋白表達(dá)成GST-融合蛋白的細(xì)菌的裂解液不切割A(yù)c-DEVD-AMC，這可能是因為沒有能加工該全長分子的細(xì)菌酶存在。用含有CED3/ICE同源區(qū)的兩種潛在斷裂產(chǎn)物之一的裂解液也沒有發(fā)生斷裂。
與表達(dá)全長MACHα1分子或CED3/ICE同源區(qū)的兩個潛在蛋白水解產(chǎn)物之一(Ser217至Asp374，和Asp374至蛋白C端)的GST-融合蛋白的細(xì)菌抽提物沒有斷裂相比，表達(dá)MACHα1中CED3/ICE同源區(qū)(Ser217至蛋白C端)的GST融合蛋白的大腸桿菌抽提物，顯示出斷裂PARP序列衍生的熒光底物(Ac-DEVD-AMC，50mM)的動力學(xué)(性能)。
另外，還顯示了Ac-DEVD-AMC的斷裂對底物濃度的依賴性，該底物和表達(dá)與GST融合的MACHα1 CED3/ICE同源區(qū)的細(xì)菌抽提物一起培育180分鐘。在碘代乙酸(5mM)存在下沒有發(fā)現(xiàn)斷裂。此抽提物對于Ac-YVAD-AMC(一種對應(yīng)于IL-1β前體中ICE底物位點(diǎn)的熒光底物)沒有活性。
簡言之，用pGEX3表達(dá)載體在XL1-藍(lán)色細(xì)菌中產(chǎn)生GST-融合蛋白。細(xì)菌在含25mM HEPES(pH7.5)，0.1％3-[3-乙醇胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸，5mMEDTA和2mM DDT的緩沖液中超聲破碎裂解，然后16000Xg離心10分鐘。SDS-PAGE分析證實了裂解液中存在相似水平的各種融合蛋白。使50μl等份的抽提物(4mg/ml總蛋白)在總體積為500μl的反應(yīng)中和指定濃度的熒光底物在室溫下培育指定長的時間。用光譜熒光術(shù)在380nm的激發(fā)波長和460nm的發(fā)射波長下測定AMC釋放值。AMC的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。兩種熒光底物肽均購自Peptide Institute Inc.(Osaka，Japan)。其它CED3/ICE蛋白酶只有在蛋白水解加工后才表現(xiàn)出全部的活性，該加工可通過自身斷裂或由其它蛋白酶斷裂(回顧見Kumar，1995；Henkart，1996)來產(chǎn)生。申請人觀察到，表達(dá)GST-MACHα1分子的細(xì)菌裂解液不具有酶活性，這與表達(dá)CED3/ICE同源區(qū)的細(xì)菌裂解液所見的活性相反，這暗示了加工也是MACHα活性所需的。關(guān)于MACHα加工在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的方式，以及該加工怎樣由FAS-R或p55-R引發(fā)卻不知道。已經(jīng)表明，MORT-1在細(xì)胞中結(jié)合激活的FAS-R以及其它一些蛋白(Kischkel等，1995)。這些蛋白可能包括MACHα1和其它MACH同種型。和MACHα連接的MORT-1與FAS-R的結(jié)合，將幾個MACH分子聚在一起，或誘導(dǎo)它們構(gòu)象發(fā)生改變，這些變化或是引發(fā)MACHα的自身裂解加工，或是使得MACHα易受其它蛋白酶的斷裂，這看來似乎是合理的。p55-R的刺激可能以類似的但更間接的方式來引發(fā)MACHα的自身加工，它將幾個TRADD分子聚在一起，或誘導(dǎo)它們發(fā)生構(gòu)象變化，從而誘導(dǎo)MORT-1及其相連的MACH分子的形成、狀態(tài)或聚集發(fā)生改變。
MACHα的底物特異性似乎是“有點(diǎn)死亡取向性的”。盡管它能斷裂對應(yīng)于死亡底物PARP(Ac-DEVD-AMC)中的斷裂位點(diǎn)的底物肽，但是MACHα對對應(yīng)于IL-1β前體中的ICE加工位點(diǎn)(Ac-YVAD-AMC)的肽卻沒有表現(xiàn)出蛋白水解活性。鑒別出作為MACHα斷裂底物的細(xì)胞蛋白將闡述該蛋白酶誘導(dǎo)死亡過程中更下游的行為。MACHα斷裂的可能的底物是CED3/ICE家族的其它成員，如CPP32和ICE。這些蛋白酶中有一些實際上是在FAS-R或TNF受體引發(fā)后被加工的(Miura等，1995；Schlegel等，1996；Chinnaiyan等，1996)。不屬于CED3/ICE家族的蛋白酶可能也由MACHα直接激活或通過和其它CED3/ICE蛋白酶作用來激活。多種蛋白酶參與細(xì)胞死亡過程與各種蛋白酶抑制劑(包括絲氨酸蛋白酶抑制劑和ICE斷裂抑制劑以及反義ICE cDNA)所報道的保護(hù)細(xì)胞免受遭FAS-R和TNF受體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力相符(Weitzen和Granger，1980；Ruggiero等，1987；Enari等，1995；Los等，1995)。
其它各種酶，包括磷酸酯酶、鞘磷脂酶和蛋白激酶可能參與了TNF受體和FAS-R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(見Eischen等，1994；Vandenabeele等，1995；Cifone等，1995及其參考文獻(xiàn))。這些酶中有一些可能通過MACHα引發(fā)的蛋白水解斷裂而激活。然而，看來也有可能其它這些與死亡相關(guān)的活性至少一部分由不依賴于MACHα刺激的不同信號傳導(dǎo)途徑所激發(fā)。多種信號級聯(lián)涉及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，一些是p55-R和FAS/APO1共有的，一些只由其中的一種來誘導(dǎo)，這與兩種受體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程的共同和不同特征的報道相符(Grell等，1994；Schulze-Osthoff等，1994；Wong和Goeddel，1994；Clement和Stamenkovic，1994)。
(d)MACHα和MORT1以及MACHβ1結(jié)合為了確定MACHα1是否象MACHβ1那樣與MORT1結(jié)合，首先在轉(zhuǎn)染的酵母中檢測這些蛋白的相互作用。MACHα1表現(xiàn)出對酵母有顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)。該效應(yīng)通過表達(dá)激活域(AD)載體(其表達(dá)水平高于DNA結(jié)合域(DBD)載體)中的蛋白質(zhì)的酵母菌落產(chǎn)生率顯著降低得以證實。另一方面，催化性半胱氨酸殘基Cys360被Ser取代(MACHα1(C360S))的MACHβ1對哺乳動物細(xì)胞(見下文)或酵母均沒有細(xì)胞毒性。MACHα1(C360S)在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中與MORT-1結(jié)合，還可與自身結(jié)合。它還與MACHβ1結(jié)合。另外，表達(dá)野生型MACHα1以及MORT-1或MACHβ1的酵母顯現(xiàn)了轉(zhuǎn)染的蛋白之間有相互作用。然而，在酵母菌落中l(wèi)acZ-產(chǎn)物顏色的強(qiáng)度不同；在用AD和DBD兩載體中的MACHα1轉(zhuǎn)染的酵母中，沒有觀察到有顏色的產(chǎn)物，這可能是由于野生型MACHα1的細(xì)胞毒性效應(yīng)而致。然而，盡管有此不同，與MORT1組合或和MACHβ1組合表達(dá)MACHα1的酵母卻清晰呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)染蛋白相互作用的明確證據(jù)。與MACHβ1不同，MACHα1在雙雜交測試中沒有表現(xiàn)出自身反應(yīng)。
MACHα1(C360S)和MACHβ1均能與人胚腎293-EBNA細(xì)胞裂解液的MORT-1共同免疫沉淀，這說明它們在哺乳動物細(xì)胞中也與MORT-1結(jié)合。為了進(jìn)一步測試MACHα1是否在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)也結(jié)合MORT1，使與FLAG八肽融合的MACHα1或MACHβ1與HA表位標(biāo)記的MORT1分子一起表達(dá)。在HeLa細(xì)胞中表達(dá)35[S]代謝性標(biāo)記的N端與FLAG八肽融合的MACHα1和MACHβ1(FLAG-MACHα1和β1)，以及N端與HA表位融合的MORT1(Field等，1988)。用針對FLAG八肽(M2；Eastman Kodak)、HA表位(12CA5，F(xiàn)ield等，1988)或作為對照的p75 TNF受體(#9，Bigda等，1994)的單克隆抗體使細(xì)胞裂解液中的蛋白免疫沉淀。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(12％丙烯酰胺)分析蛋白，然后進(jìn)行放射自顯影。MACHα1和MACHβ1均與細(xì)胞裂解液中的MORT1發(fā)生共免疫沉淀，這說明它們均與MORT1結(jié)合。MACHα1與MORT1相互作用的效率看來比MACHβ1要低。
(e)含有CED3/ICE同源區(qū)的MACH分子可介導(dǎo)細(xì)胞死亡為了研究MACH參與細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用，檢測各種MACH同種型過度表達(dá)對細(xì)胞存活率的影響。測試這樣進(jìn)行，將MACH表達(dá)載體以及作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記的β-半乳糖苷酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人胚腎293-EBNA細(xì)胞和乳房癌MCF7細(xì)胞中。
簡言之，使293-EBNA細(xì)胞、MCF7人乳房癌細(xì)胞和HeLa HtTA-1細(xì)胞在Dulbecco改進(jìn)的Eagle最小必需培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清、非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。用磷酸鈣沉淀方法，用指定蛋白的cDNA和β-半乳糖苷酶表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞組織培養(yǎng)碟(6cm碟中有5×105293-EBNA細(xì)胞，3×105MCF7細(xì)胞或3×105HeLa細(xì)胞)。在一組試驗中，每個碟用3.5μgMACH構(gòu)建物和1.5μg pSV-β-gal轉(zhuǎn)染；在另一組試驗中，每個碟用2.5μg指定的MACH或MORT1構(gòu)建物(或作為對照的空載體)和1.5μg pSV-β-gal來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6-10小時清洗細(xì)胞。使293-EBNA和MCF7細(xì)胞再培育18小時而不作任何處理。HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后培育26小時，然后在抗Fas.APO1抗體(CH11，0.5μg/ml)或TNF(100ng/ml)之一以及環(huán)己酰亞胺(10μg/ml)存在下再培育5小時。在培育期最后如Kumar等，1994所述，測定β-半乳糖苷酶的表達(dá)來評價細(xì)胞死亡程度。
用MACHα1或MACHα2的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物顯現(xiàn)出有大量細(xì)胞死亡，其表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、起泡、收縮并最終細(xì)胞和碟分離。轉(zhuǎn)染20小時后，經(jīng)β-半乳糖苷酶染色(X-Gal)鑒定，大部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出凋亡的典型的固縮形態(tài)。相反，表達(dá)空載體的細(xì)胞仍保持存活。
為了測定MACHα同種型中的CED3/ICE同源區(qū)參與它們的凋亡效應(yīng)，用下列表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞缺少CED3/ICE同源區(qū)的MACHβ1同種型表達(dá)載體；缺少CED3/ICE同源區(qū)N端部分的MACHα3的表達(dá)載體；以及MACHα1(C360S)和MACHα1 C端截短突變體(MACHal(1-415))的表達(dá)載體，它缺少一個據(jù)信對于CED3/ICE蛋白酶功能來說關(guān)鍵的殘基(對應(yīng)于ICE中的Ser347)。在用MACHα3、MACHα1(1-415)或MACHα1(C360S)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的293-EBNA或MCF7細(xì)胞中沒有發(fā)生死亡(除了用空表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中所觀察到的少量死亡外)。而且，轉(zhuǎn)染了MACHα1以及這些載體的細(xì)胞還表現(xiàn)出非常少的細(xì)胞死亡，這說明含有不完全的CED3/ICE區(qū)域的MACH分子對于野生型分子的活性具有陰性顯性效應(yīng)。表達(dá)不含CED3/ICE區(qū)的MACHβ1的培養(yǎng)物不呈現(xiàn)有少量細(xì)胞死亡。出于某些原因，MACHβ1的這種效應(yīng)(最可能是由于內(nèi)源MACHα1分子激活)在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中更為顯著。而且，在HeLa細(xì)胞中，MACHα3、MACHα1(1-415)和MACHα1(C360S)也具有一定程度的細(xì)胞毒性。
MACHα活性看來構(gòu)成了FAS/APO1和p55-R殺細(xì)胞效應(yīng)的信號傳導(dǎo)級聯(lián)中最上游的酶促步驟。MACHβ1與MORT-1和MORTα1結(jié)合的能力暗示了該同種型能增強(qiáng)酶促活性同種型的活性?？赡芤恍㎝ACH同種型還有其它功能。MACHβ1與MORT-1和MACHα1結(jié)合的能力暗示了該同種型可能增強(qiáng)了酶促活性同種型的活性。用該同種型轉(zhuǎn)染的293-EBNA和MCF7培養(yǎng)物中觀察到的細(xì)胞毒性較為輕微，而其在HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞毒性效應(yīng)卻相當(dāng)顯著，這可能反映了內(nèi)源表達(dá)的MACHα分子在結(jié)合轉(zhuǎn)染的MACHβ1分子時被激活。可以想象的是，一些MACH同種型還可作為涉及FAS/APO1和TNF受體的其它非細(xì)胞毒性效應(yīng)分子的?？课稽c(diǎn)而起作用。
(f)MACHα功能的阻斷干擾了Fas/APO1和p55-R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
為了評價MACHα對Fas/APO1和p55-R細(xì)胞毒性的作用的貢獻(xiàn)，在誘導(dǎo)后能表現(xiàn)其細(xì)胞毒性的細(xì)胞中表達(dá)MACHα3、以及無功能的MACHα1突變體、MACHα1(1-415)和MACHα(C360S)。293-EBNA細(xì)胞中p55-R誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性由該受體的瞬時過度表達(dá)而引發(fā)(Boldin等，1995b)，而Fas/APo1細(xì)胞毒性由嵌合分子的過度表達(dá)來引發(fā)，該嵌合分子不含p55-R的胞外結(jié)構(gòu)域和正常Fas/APO1的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。該嵌合體的細(xì)胞毒作用比正常的Fas/APO1高得多。在蛋白合成阻斷劑環(huán)己酰亞胺的存在下，用TNF或抗-Fas/APO1抗體處理HeLa細(xì)胞也會在HeLa細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)出細(xì)胞毒性活性。HeLa細(xì)胞通過瞬時表達(dá)該受體對Fas/APO1作出應(yīng)答。在檢測的所有系統(tǒng)中，MACHα3和無功能的MACHα1突變體提供了有效的保護(hù)力抵抗了Fas/APO1或p55-R引發(fā)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。如以前所報道的(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，發(fā)現(xiàn)在用缺乏MACH結(jié)合區(qū)的MORT-1 N端缺失突變體(MORT1(92-208))轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中也有這種保護(hù)作用。這些保護(hù)效應(yīng)表明MACHα是Fas/APO1和p55-R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)級聯(lián)的必需組件。
MACH在不同組織中的表達(dá)水平顯著不同，并且明顯有不同的同種型方式。這些差別可能導(dǎo)致了對FAS/APO1配體和TNF應(yīng)答反應(yīng)時的組織特異性特征。在其它CED3/ICE同系物的情況下(Wang等，1994；Alnemri等，1995)，發(fā)現(xiàn)含有不完全CED3/ICE區(qū)域的MACH同種型(例如MACHα3)抑制了共表達(dá)的MACHα1或MACHα2分子的活性；還發(fā)現(xiàn)它們阻斷了FAS/APO1和p55-R誘導(dǎo)的死亡。這種抑制性同種型在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可能構(gòu)成了細(xì)胞自我保護(hù)抵抗FAS/APO1和TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的機(jī)制。MACH同種型的廣泛的異質(zhì)性大大超過了CED3/ICE家族任何其它蛋白酶所見，這就能特別細(xì)微地調(diào)節(jié)活性MACH同種型的功能。
實施例1與MORT-1結(jié)合蛋白Mch4結(jié)合的G1蛋白的克隆和分離(i)雙雜交篩選和雙雜交β-半乳糖苷酶表達(dá)試驗用上述參考實施例1-3中所述的步驟分離出一種新的蛋白，命名為G1，它明顯與ICE-樣蛋白酶家族同源，因此可能是該家族的一個成員。G1蛋白含有兩個組件與MORT組件同源，即與MORT-1 N端部分、MACH蛋白的MORT組件(見上文參考實施例1-3和Boldin等，1996)以及另一相關(guān)的MORT-1結(jié)合蛋白Mch4的MORT組件(見Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)同源。而且，G1蛋白具有與CED3/ICE家族蛋白酶的酶(蛋白酶)活性區(qū)域(例如，MACH蛋白和Mch4及其它蛋白的蛋白酶區(qū))同源的酶(蛋白酶樣)活性區(qū)域。
簡言之，用蛋白Mch4作為“誘餌”，通過雙雜交篩選從人Jurkat T細(xì)胞cDNA文庫中獲得一個蛋白G1的克隆(＂克隆G1＂)。采用Gal4激活域標(biāo)記的人Jurkat T細(xì)胞cDNA文庫，按照MatchmakerTM雙雜交系統(tǒng)程序(Clontech)，在缺少3-氨基三唑下用HF7c酵母報道菌株(Clontech，Palo Alto，Ca.)進(jìn)行篩選。Mch4序列從EMBL數(shù)據(jù)庫獲得。利用獲得的此序列，用OLIGOTM軟件設(shè)計PCR-引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)從總RNA中獲得對應(yīng)于Mch4編碼部分的DNA片段，該總RNA通過標(biāo)準(zhǔn)方法從原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞獲得。然后將Mch4的該編碼部分克隆到pGADGH載體(Clontech)中，并如上所述用作雙雜交篩選程序中的誘餌。在此雙雜交篩選中，獲得11個克隆，它們編碼的蛋白均顯然是含有與MORT-1同源的兩個基序的蛋白的剪接變體。分析G1的基本部分序列以及＂dbest＂數(shù)據(jù)庫和人基因組數(shù)據(jù)庫(Human Genome Database)一級水平中的序列，就能獲得許多含有克隆G1部分序列的表達(dá)序列標(biāo)記(est)。對這些表達(dá)序列標(biāo)記(est)進(jìn)行序列分析，結(jié)果揭示了可能有許多蛋白G1的剪接變體含有編碼與ICE樣蛋白酶同源的蛋白基序的序列段，且該序列段位于雙雜交篩選獲得的G1序列的3′端。
為了獲得含有蛋白酶樣酶活性區(qū)域的G1同種型的全部序列，用含有15dt序列段和銜接子序列的寡核苷酸作為引物對從各種細(xì)胞系獲得的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)以產(chǎn)生cDNA分子。然后將這些cDNA分子用作PCR反應(yīng)中的模板，其中設(shè)計和合成的PCR引物具有從G15′非編碼部分獲得的序列和銜接子序列的寡核苷酸形式，這些引物用于第一輪PCR反應(yīng)。隨后，在上述PCR反應(yīng)第二輪中，采用另一寡核苷酸引物，該引物具有包括起始密碼子ATG在內(nèi)的G15′編碼部分的序列以及銜接子序列。這樣，就可以獲得含有酶(蛋白酶樣)活性區(qū)域的G1蛋白的明顯剪接變體的全部序列。這只代表了一種懷疑的G1同種型。
圖1示出了這樣一種G1同種型(G1剪接變體)的基本序列，其中上方的序列為核苷酸序列，下方的序列為推導(dǎo)的從ATG(核苷酸編號482)起至TAA(核苷酸1921)為止的ORF的氨基酸序列，這些起始和終止密碼子核苷酸在核苷酸序列中用星號(*)表示。圖1的G1剪接變體也假定稱為“G1α”。
圖2中示出了另一種G1同種型的基本序列，該同種型是一種短的G1剪接變體，具有兩個MORT組件，假定稱為“G1β”，圖中上方的序列是核苷酸序列，下方的序列是從核苷酸No.482(ATG)起至核苷酸No.1145(TGA)為止的ORF的氨基酸序列，起始和終止密碼子在核苷酸序列中用星號(*)表示。
另外應(yīng)注意，用Mch4序列作為“誘餌”最初分離獲得的G1克隆是短的G1剪接變體的至少一部分，稱為“G1β”(見圖2)。該最初分離獲得的G1克隆是新的cDNA的部分克隆，它象MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)一樣，在緊靠其N端下游處有兩個“死亡域基序/MORT組件(或“死亡效應(yīng)域”-DED)”。利用該原始的克隆，然后就可以分離和鑒定分析較大的G1α剪接變體和較小的G1β剪接變體的cDNA克隆。較大的剪接變體的C端與卡斯酶的蛋白酶區(qū)域同源，因此它可能是卡斯酶家族的新成員。因此，G1也因為是“卡斯酶同系物”而被稱為CASH。比較G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)序列和其它卡斯酶序列(更詳細(xì)的內(nèi)容，尤其是小鼠G1序列的分離見下文以及上文“附圖簡述”關(guān)于圖3的描述)。圖3示出了這一比較的詳細(xì)結(jié)果，關(guān)于附圖的全部詳細(xì)內(nèi)容、尤其是該附圖中對于指定序列最為關(guān)鍵的內(nèi)容在上文“附圖簡述”中有所描述。
在上述初始克隆和對G1(尤其是G1α和G1β同種型)測序后，進(jìn)一步分析這些蛋白(ii)Northern分析和其它序列分析Northern印跡分析揭示了G1蛋白至少以三個不同轉(zhuǎn)錄物大小(2，2.4和4.4kb)形式存在，它們的比例在不同組織中有很大的不同(圖4)。為了獲得G1(CASH)的全長cDNA，用對應(yīng)于G1序列的cDNA探針篩選人皮膚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(Clontech)。獲得兩個cDNA物質(zhì)，它們顯然對應(yīng)于G1的兩個剪接變體(見上文)。這兩個cDNA編碼的蛋白均有含死亡效應(yīng)域的N端區(qū)，但是它們的C端不同。一個(G1β＝CASHβ)具有短的C端，對應(yīng)于最初克隆獲得的cDNA。另一個(G1α＝CASHα)具有較長的C端。
G1α的這個較長的C端區(qū)中的氨基酸序列顯示出與MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)中蛋白酶前體區(qū)的那些氨基酸序列有相當(dāng)高的同源性(另見圖3)。然而，G1α缺少據(jù)認(rèn)為對于蛋白酶活性來說是關(guān)鍵的幾個殘基，這提示該蛋白可能沒有半胱氨酸蛋白酶活性。令人感興趣的是，G1α在對應(yīng)于MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)的蛋白酶區(qū)域中的蛋白水解加工位點(diǎn)上含有卡斯酶底物序列(圖3中用陰影表示)?；緮?shù)據(jù)暗示了G1α確實能在該位點(diǎn)被MACH斷裂(數(shù)據(jù)未示出)。
根據(jù)EST克隆的核苷酸序列對應(yīng)于G1中“死亡域”(DED)部分的小鼠同源物這一發(fā)現(xiàn)，用RT-PCR從小鼠肝mRNA中克隆出小鼠CASHα和CASHβ剪接變體的cDNA。鑒別出一種EST克隆(GenBank登錄號AA198928)是G1中DED區(qū)域部分的小鼠同源物。根據(jù)該序列，用RT-PCR從小鼠肝mRNA中克隆出小鼠G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)剪接變體。按照生產(chǎn)商說明書采用寡-dT銜接子引物(5′-GACTC GAGTC TAGAG TCGAC(T)17-3)和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。第一輪PCR采用Expand Long Template PCR System(BoehringerMannheim)，并分別用下列有義和反義引物5′-GGCTT CTCGTG GTTCCCAGAGC-3′和5′-GACTC GAGTC TAGAG TCGAC-3′(銜接子)。第二輪用Vent聚合酶(NEB)，采用嵌套有義引物5′-TGCT CTTCC TGTGT AGAGA TG-3′和銜接子。
序列比較揭示，整個G1α(CASHα)分子有高保守性(相同性在DED區(qū)中為71％，蛋白酶同源區(qū)中為59％)，這暗示了該蛋白中的DED和蛋白酶同源區(qū)對其功能均有貢獻(xiàn)(見圖3)。
(iii)雙雜交分析G1同種型的結(jié)合特異性G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)相互作用性能的雙雜交測試(圖5)揭示了這兩種變體均與MORT1/FADD和MACH(CASP8)相互作用，最有可能是通過它們共同擁有的DED區(qū)。值得注意的是，雖然通過雙雜交篩選初步克隆了結(jié)合Mch4(CASP-10)的蛋白，但是在此試驗中發(fā)現(xiàn)G1β(CASHβ)與Mch4(CASP-10)的結(jié)合弱，以及G1α(CASHα)看來只弱結(jié)合Mch4。然而應(yīng)注意，克隆G1蛋白的最初雙雜交篩選與測定結(jié)合特異性的本次雙雜交篩選不同，因此實際上看來，G1α和G1β會象最初克隆結(jié)果所顯示的那樣與MACH和Mch4結(jié)合。這兩種G1變體還能自身締合并相互結(jié)合，但是不能結(jié)合RIP或TRADD(銜接蛋白，它象MORT1/FADD一樣含有死亡域但是缺少DED)，它們也不與用作特異性對照的一些無關(guān)蛋白(如核纖層蛋白)結(jié)合。
為了進(jìn)一步測定G1的功能，在HeLa和293-T細(xì)胞中瞬時表達(dá)其兩個變體，并評價轉(zhuǎn)染的蛋白對于下列信號傳導(dǎo)的影響p55-R(CD120a)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號傳導(dǎo)，該細(xì)胞毒性由TNF或受體過度表達(dá)所引發(fā)；以及FAS-R(CD95)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號傳導(dǎo)，而這種細(xì)胞毒性由FAS-R的抗體交聯(lián)或嵌合受體的過度表達(dá)所引發(fā)，該嵌合受體包含p55-R(CD120a)的胞外結(jié)構(gòu)域和FAS-R(CD95)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(見圖6)。在兩個細(xì)胞系中，G1β(CASHβ)的表達(dá)本身對細(xì)胞活力沒有影響，但是它會強(qiáng)烈抑制p55-R(CD120a)和FAS-R(CD95)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。G1α(CASHα)變體的表達(dá)對兩個細(xì)胞系的影響有很大不同。在HeLa細(xì)胞中，它抑制了p55-R(CD120a)和FAS-R(CD95)的細(xì)胞毒性，這與G1β(CASHβ)相似。然而，在293-T細(xì)胞中，它卻導(dǎo)致了顯著的細(xì)胞毒性。當(dāng)G1α蛋白在293-EBNA細(xì)胞中表達(dá)時發(fā)現(xiàn)有類似的細(xì)胞毒性(未示出)。該細(xì)胞毒性效應(yīng)可被p35(一種從桿狀病毒衍生的卡斯酶抑制劑)的共表達(dá)完全阻斷(關(guān)于p35另見Clem等，1991；Xue和Horvitz，1995)。
為了評價G1α(CASHα)中同源的蛋白酶區(qū)對其殺細(xì)胞效應(yīng)的貢獻(xiàn)，檢測此蛋白的兩個突變體。這些突變體是G1/CASHα(1-385)和G1/GASHα(1-408)，帶有對應(yīng)于從成熟蛋白酶的小亞基獲得的蛋白酶域部分區(qū)域的C端缺失。兩種突變體均沒有任何細(xì)胞毒性效應(yīng)。而且，象G1β(CASHβ)一樣，它們可保護(hù)293細(xì)胞免受p55-R(CD120a)和FAS-R(cd95)的死亡誘導(dǎo)作用(圖6C和D)。
應(yīng)當(dāng)注意的是，上述步驟采用了下列方法和材料(i)G1α(CASHα)缺失突變體和p55-R/FAS-R(CD120a/CD95)嵌合體用PCR和/或常規(guī)克隆技術(shù)產(chǎn)生。用pcDNA3表達(dá)載體(Invitrogen)，在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)G1(CASH)剪接變體、FAS-R(CD95)或p55-R(CD120a)信號傳導(dǎo)級聯(lián)蛋白(均為人源)和桿狀病毒p35蛋白。β-半乳糖苷酶用pCMV-β-gal載體(Promega)來表達(dá)。
(ii)使穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染的人FAS-R(CD95)(由本發(fā)明者實驗室建立)的人胚腎293-T細(xì)胞、293 EBNA細(xì)胞和人宮頸癌HeLa細(xì)胞(HeLa-Fas；HtTA-1克隆)在Dulbecco改進(jìn)的Eagle最小必需培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基中添加了10％胎牛血清、非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。
上述發(fā)現(xiàn)表明G1能與p55-R和FAS-R的信號傳導(dǎo)復(fù)合物的組分相互作用，它影響死亡誘導(dǎo)的方式可能不同，這取決于G1剪接變體的特性和表達(dá)該變體的細(xì)胞類型。
G1β具有抑制細(xì)胞毒性誘導(dǎo)作用，對HeLa細(xì)胞Gla也有此抑制作用，這顯然是由該蛋白中的“死亡域”(DED)區(qū)域介導(dǎo)的。它可能反映了G1的DED與MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)中的相應(yīng)區(qū)域競爭結(jié)合MORT1/FADD。
關(guān)于CASHα引起293細(xì)胞死亡的方式，p35蛋白阻斷該細(xì)胞毒性效應(yīng)的能力暗示了該細(xì)胞毒性是由卡斯酶的活性介導(dǎo)的。然而，即使G1α表現(xiàn)出與卡斯酶有顯著的序列同源性，但實際上它可能缺乏半胱氨酸蛋白酶活性，因為它不含幾個保守的卡斯酶活性位點(diǎn)殘基。因此，G1α可能通過激活具有卡斯酶活性的其它分子來起作用。
另一種可能性是，盡管G1α不能單獨(dú)作為蛋白酶起作用，但是它仍能構(gòu)成部分活性蛋白酶分子。CASP-1和CASP-3結(jié)構(gòu)的晶體圖學(xué)研究表明每個加工過的酶的小的和大的蛋白酶亞基從不同酶原分子獲得(Walker等，1994；Wilson等，1994；Mittl等，1997；Rotonda等，1996)。由于觀察到的G1α細(xì)胞毒性活性取決于對應(yīng)于蛋白酶小亞基的區(qū)域的完整性(圖6C)，可能G1α(CASHα)中的該區(qū)域能與某些卡斯酶的大亞基區(qū)締合，從而導(dǎo)致重新構(gòu)成具有酶活性的分子。然后，獲得的活性異質(zhì)四聚體能激活其它卡斯酶，從而引發(fā)細(xì)胞死亡。
另外，還得出的結(jié)論(結(jié)果未示出)是G1與參與IL-1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路的另一蛋白(稱為MYD88)至少有一些同源性。因此，G1還能參與其它細(xì)胞因子引發(fā)/介導(dǎo)的其它途徑。
鑒于上述關(guān)于G1蛋白(它的至少兩種同種型)的克隆和分離，G1有下列特征和用途(i)通過雙雜交篩選克隆獲得G1，它是結(jié)合MORT-1結(jié)合蛋白Mch4的一種分子，因此它可能參與調(diào)節(jié)Mch4和MORT-1的活性，因此，通過上述機(jī)制，G1可能參與調(diào)節(jié)FAS-R和p55-R引發(fā)的細(xì)胞行為。由于Mch4能結(jié)合MORT-1，并直接涉及細(xì)胞毒性和最終的細(xì)胞死亡，而且還能與已知抑制細(xì)胞死亡的一些Mch4同種型結(jié)合，因此結(jié)果是G1(包括其各種同種型)可直接或間接參與細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡，并能抑制細(xì)胞死亡。
(ii)G1含有的N端區(qū)域顯然含有與MACH(見上文參考實施例1-3)和Mch4的兩個MORT組件同源的兩個MORT組件。因此，G1中這些MORT組件的存在似乎解釋了G1能結(jié)合Mch4的原因，可能也使G1(或它的至少一些同種型)和MACH(或其一些同種型)結(jié)合以及直接結(jié)合MORT-1。因此，G1可能通過直接結(jié)合MORT-1、或結(jié)合已知與MORT-1結(jié)合的Mch4和/或MACH，來直接或間接地調(diào)節(jié)MORT-1的活性(從而調(diào)節(jié)FAS-R和p55-R的活性)。
(iii)在上述數(shù)據(jù)庫和篩選中分析G1序列，結(jié)果還揭示了G1顯然位于第2條人染色體上的Mch4和MACH基因座附近，這暗示了編碼所有這些蛋白的基因之間的關(guān)系在染色體水平上也很密切。
(iv)至少一些G1同種型(例如圖1的G1α同種型)在MORT組件區(qū)的下游具有一個表現(xiàn)出與MACH和Mch4的酶(即蛋白酶)活性區(qū)類似的區(qū)域，因此，G1可能是CED3/ICE蛋白酶家族的一個成員。
(v)至少一些G1同種型(例如G1α)中存在著蛋白酶樣區(qū)，這表明G1或它的這些同種型可直接參與由各種刺激引起的細(xì)胞毒性和發(fā)炎，這些刺激包括TNF/NGF受體家族的受體(例如FAS-R和p55-R)以及直接或間接通過胞內(nèi)蛋白酶活性引起細(xì)胞毒性和發(fā)炎而起作用的其它受體。
(vi)在由TNF/NGF受體家族的受體和具有共同胞內(nèi)效應(yīng)物的其它蛋白介導(dǎo)的導(dǎo)致細(xì)胞毒性、發(fā)炎和其它有關(guān)作用的胞內(nèi)機(jī)制中，G1可作為其它蛋白(例如MACH和Mch4蛋白(包括它們的各種同種型))活性的增強(qiáng)物或強(qiáng)化物。G1(或至少它的一些同種型)的增強(qiáng)或強(qiáng)化效應(yīng)可通過G1與這些其它蛋白(如上所述G1與Mch4結(jié)合，還可能和MACH以及MORT-1結(jié)合)結(jié)合來實現(xiàn)，從而增加它們和MORT-1的結(jié)合(包括MORT-1自身締合)，或不依賴MORT-1的作用。
(vii)G1還可作為其它蛋白活性的抑制劑，其作用方式是通過G1作為其結(jié)合其它蛋白(例如Mch4，可能還有MACH和MORT-1)而形成的復(fù)合體的一部分，從而影響它們的細(xì)胞毒性直至抑制該活性。另外，以上述一些MACH同種型以及Mch4的一些同種型的類似方式，G1同種型可能也特異性地具有抑制活性。G1的這樣一種同種型可能是圖2所示的G1β同種型，它具有兩個MORT組件，但是沒有與其它已知蛋白酶類似的明顯的蛋白酶樣區(qū)。
在全部描述了本發(fā)明后，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的思路和范圍下，無需過多的實驗就可在等同的參數(shù)、濃度和條件的廣泛范圍內(nèi)進(jìn)行同樣的工作。
盡管本發(fā)明已經(jīng)聯(lián)系其具體實例作了描述，但是應(yīng)當(dāng)知道它還能作進(jìn)一步的改進(jìn)。本申請應(yīng)當(dāng)覆蓋大致上根據(jù)本發(fā)明原理、本文公開的內(nèi)容、利用本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)技術(shù)以及如下文所附權(quán)利要求范圍內(nèi)提出的必要特征所作的任何變化、用途或改進(jìn)。
本文中引用的所有文獻(xiàn)，包括期刊雜志或摘要、出版的或?qū)?yīng)的美國或外國專利申請、授權(quán)的美國或外國專利、或任何其它文獻(xiàn)，包括引用文獻(xiàn)中列舉的所有數(shù)據(jù)、圖表和文本，均全部納入本文作參考。另外，本文引用的文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也全部納入本文作參考。
參考已知的步驟、常規(guī)的步驟、已知的方法或常規(guī)方法并不以任何方式表示承認(rèn)本發(fā)明的各個方面、描述或?qū)嵗言谙嚓P(guān)技術(shù)領(lǐng)域予以公開、指導(dǎo)或提示。
前述具體實例的描述將完全揭示本發(fā)明的總特征，在不脫離本發(fā)明的總思路下，其它人可運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的知識(包括本文引用的內(nèi)容和參考文獻(xiàn))無需過多實驗就很容易對這些具體的實例作變化和/或改進(jìn)用于各種用途。因此，基于本文的理論和指導(dǎo)，這些變化和改進(jìn)均應(yīng)在本文所公開的實例的等價意義和范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，本文的措詞或術(shù)語均只是為了便于描述，而非限制性，因此本說明書的措詞或術(shù)語可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的理論和指導(dǎo)結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識來作解釋。
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權(quán)利要求
1.一種DNA序列，它編碼G1蛋白至少一種同種型、或其片段和類似物，所述至少一種G1同種型或其片段和類似物能夠直接或間接與MORT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白、或其它胞內(nèi)中介體/調(diào)節(jié)劑蛋白結(jié)合或相互作用，并能介導(dǎo)由FAS-R或p55-TNF-R或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的胞內(nèi)效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，它選自下列序列(a)衍生自G1蛋白天然同種型編碼區(qū)的cDNA序列；(b)能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)序列雜交并編碼有生物活性的G1蛋白同種型的DNA序列；和(c)與(a)和(b)所確定的DNA序列的遺傳密碼簡并、且編碼有生物活性的G1蛋白同種型的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA序列，它包含圖1所示序列的至少一部分，并編碼G1蛋白的至少一種同種型G1α同種型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA序列，它包含圖2所示序列的至少一部分，并編碼G1蛋白的至少一種同種型G1β同種型。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA序列，它編碼了具有圖1所示氨基酸序列的G1同種型、其片段和類似物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA序列，它編碼了具有圖2所示氨基酸序列的G1同種型、其片段和類似物。
7.一種載體，它包含權(quán)利要求1-6任一所述的DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，它能被真核宿主細(xì)胞表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，它能被原核宿主細(xì)胞表達(dá)。
10.轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞，它們含有權(quán)利要求7-9任一所述的載體。
11.一種G1蛋白、其片段、或功能類似物或衍生物，它由權(quán)利要求1-6任一所述的DNA序列編碼，所述蛋白及其片段、類似物和衍生物能直接或間接與MORT-1、和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白、或其它胞內(nèi)中介體/調(diào)節(jié)劑蛋白結(jié)合或相互作用，并能介導(dǎo)由FAS-R或p55-TNF-R或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的胞內(nèi)效應(yīng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的G1同種型及其片段、類似物和衍生物，其中所述蛋白、類似物、片段和衍生物具有圖1所示氨基酸序列的至少一部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的G1同種型及其片段、類似物和衍生物，其中所述蛋白、類似物、片段和衍生物具有圖2所示氨基酸序列的至少一部分。
14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白的至少一種同種型、其片段、類似物或衍生物的方法，該方法包括使權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適合所述蛋白、類似物或衍生物表達(dá)的條件下生長，按需進(jìn)行翻譯后修飾，以獲得所述蛋白、片段、類似物或衍生物，并分離所述表達(dá)的蛋白、片段、類似物或衍生物。
15.抗體或其活性片段或衍生物，它對權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白、片段、類似物或衍生物有特異性。
16.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的方法，該方法包括用權(quán)利要求11-13任一所述的一種或多種G1蛋白、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，其中所述細(xì)胞的所述處理包括，將所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物的核苷酸序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)。
17.一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對攜帶FAS-R或p55-R細(xì)胞的效應(yīng)的方法，該方法包括用權(quán)利要求11-13任一所述的一種或多種G1蛋白、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述蛋白、類似物、片段或衍生物能直接或間接結(jié)合MORT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白，MORT-1則與FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，或能直接或間接與結(jié)合TRADD的MORT-1結(jié)合，TRADD則與p55-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)所述FAS-R或p55 TNF-R的活性，其中所述細(xì)胞的所述處理包括將所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對細(xì)胞的效應(yīng)的方法，其中所述細(xì)胞的所述處理包括將所述G1蛋白、類似物、片段或衍生物、編碼所述G1蛋白、類似物、片段或衍生物的DNA序列，以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述處理是用重組動物病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，它包含下列步驟(a)構(gòu)建一個重組動物病毒載體，該載體攜帶的一個序列編碼的病毒表面蛋白即配體能結(jié)合攜帶FAS-R或p55-R的細(xì)胞表面上的特異性細(xì)胞表面受體，該載體攜帶的第二個序列編碼了選自權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白、類似物、片段和衍生物的蛋白，當(dāng)它們在所述細(xì)胞中表達(dá)時，能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)所述FAS-R或p55-R的活性；和(b)用(a)所述的載體感染所述細(xì)胞。
20.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的方法，該方法包括用介導(dǎo)所述細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的一種或多種蛋白/酶的一種或多種抑制劑處理所述細(xì)胞，所述抑制劑選自以下(i)權(quán)利要求11-13任一所述的能抑制所述細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程的一種或多種G1蛋白、類似物、片段或衍生物；和(ii)在所述一種或多種G1蛋白增強(qiáng)/強(qiáng)化或介導(dǎo)所述細(xì)胞死亡或發(fā)炎過程時，權(quán)利要求11-13任一所述的一種或多種G1蛋白的抑制劑。
21.一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對攜帶FAS-R或p55-R細(xì)胞的效應(yīng)的方法，該方法包括用權(quán)利要求15所述的抗體或其活性片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述處理是將含有所述抗體、其活性片段或衍生物的合適組合物施加到所述細(xì)胞上，其中當(dāng)所述細(xì)胞的G1蛋白或其部分顯露在胞外表面上時，將所述組合物配制成用于胞外用途；當(dāng)所述G1蛋白在細(xì)胞內(nèi)時，將所述組合物配制成用于胞內(nèi)用途。
22.一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對攜帶FAS-R或p55-R細(xì)胞的效應(yīng)的方法，該方法包括用一寡核苷酸序列處理所述細(xì)胞，該寡核苷酸序列編碼了權(quán)利要求1-6任一所述的編碼G1蛋白的DNA序列至少一部分的反義序列，所述寡核苷酸序列能阻斷G1蛋白的表達(dá)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述寡核苷酸通過權(quán)利要求19所述的病毒導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，其中所述病毒的所述第二序列編碼了所述寡核苷酸序列。
24.一種處理腫瘤細(xì)胞或HIV感染細(xì)胞或其它患病細(xì)胞的方法，該方法包括(a)構(gòu)建一個重組動物病毒載體，該載體攜帶的一個序列所編碼的病毒表面蛋白能結(jié)合特異性的腫瘤細(xì)胞表面受體、或HIV感染的細(xì)胞的表面受體、或其它患病細(xì)胞攜帶的受體，該載體還攜帶了一個序列編碼選自權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白、類似物、片段和衍生物的蛋白，當(dāng)它們在所述腫瘤、HIV感染的或其它患病細(xì)胞中表達(dá)時，能殺死所述細(xì)胞；和(b)用(a)所述的載體感染所述腫瘤、HIV感染的或其它患病細(xì)胞。
25.一種調(diào)節(jié)FAS-R配體或TNF對細(xì)胞的效應(yīng)的方法，該方法包括采用核酶步驟，其中將編碼核酶序列的載體以允許所述核酶序列在所述細(xì)胞中表達(dá)的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，該核酶序列能與編碼權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白的細(xì)胞mRNA序列相互作用，且其中當(dāng)所述核酶序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，它與所述細(xì)胞mRNA序列相互作用，并切割所述mRNA序列，導(dǎo)致所述G1蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受到抑制。
26.一種選自權(quán)利要求16-25任一所述方法的方法，其中所述G1蛋白及其任何類似物、片段和衍生物能直接或間接地結(jié)合MORT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白，而MORT-1再特異性地結(jié)合FAS-IC；或能直接或間接地結(jié)合MORT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白，而MORT-1再與TRADD結(jié)合，TRADD再與p55-IC結(jié)合。
27.一種分離和鑒定權(quán)利要求11-13任一所述的蛋白的方法，該蛋白能直接或間接地結(jié)合MORT-1蛋白和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白，該方法包括采用酵母雙雜交程序，其中一個雜交載體攜帶了編碼所述MORT-1蛋白和/或MORT-1結(jié)合蛋白的序列，第二個雜交載體攜帶了源自cDNA或基因組DNA文庫的序列，然后用此載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離出陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后抽提所述第二雜交載體，獲得編碼與所述MORT-1蛋白和/或MORT-1結(jié)合蛋白結(jié)合的蛋白的序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求16-27任一所述的方法，其中所述蛋白是G1同種型、其類似物、片段和衍生物中的至少一種。
29.一種調(diào)節(jié)FAS-配體、或TNF或其它蛋白對細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白的至少一種同種型、其具有生物活性的片段、類似物、衍生物或混合物作為活性組分。
30.一種調(diào)節(jié)FAS-R配體、或TNF或其它蛋白對細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，該組合物包含一種重組病毒載體作為活性組分，該載體編碼了能結(jié)合細(xì)胞表面受體的蛋白，并編碼了權(quán)利要求11-13任一所述的G1蛋白或其生物活性片段或類似物的至少一種同種型。
31.一種調(diào)節(jié)FAS-R配體、TNF或其它蛋白對細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，該組合物包含一種寡核苷酸序列作為活性組分，該寡核苷酸編碼了權(quán)利要求1-6任一所述的G1蛋白mRNA序列的反義序列。
32.一種調(diào)節(jié)MORT-1誘導(dǎo)的或MORT-1結(jié)合蛋白或其它蛋白誘導(dǎo)的對細(xì)胞的效應(yīng)的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求16-28任一所述的方法，用G1蛋白、其類似物、片段或衍生物或用編碼G1蛋白、其類似物或片段的序列處理所述細(xì)胞，所述處理導(dǎo)致所述MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白或其它蛋白介導(dǎo)的效應(yīng)得到增強(qiáng)或抑制，從而使FAS-R或p55-R或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的效應(yīng)得到增強(qiáng)或抑制。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述G1蛋白、其類似物、片段或衍生物是特異性地涉及與MORT-1、MORT-1結(jié)合蛋白或其它蛋白結(jié)合的那部分G1蛋白。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述方法，其中所述G1蛋白是能夠增強(qiáng)MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白或其它蛋白相關(guān)的細(xì)胞效應(yīng)從而也能增強(qiáng)FAS-R或p55-R或其它細(xì)胞毒性中介體或誘導(dǎo)劑相關(guān)的細(xì)胞效應(yīng)的G1同種型的任何一種。
35.一種調(diào)節(jié)凋亡過程或編程性細(xì)胞死亡過程的方法，該方法包括用權(quán)利要求11-13任一所述的一種或多種G1蛋白、類似物、片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述G1蛋白、類似物、片段或衍生物能直接或間接地結(jié)合MROT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白，而MORT-1結(jié)合FAS-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，或能直接或間接結(jié)合MORT-1和/或任何MORT-1結(jié)合蛋白，而MORT-1結(jié)合TRADD，TRADD再結(jié)合p55-R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，從而能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)所述FAS-R或p55-R的活性，其中所述細(xì)胞的所述處理包括，將所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，或?qū)⒕幋a所述一種或多種蛋白、類似物、片段或衍生物的DNA序列以攜帶所述序列的合適載體形式導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)，所述載體能以使所述序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式將所述序列插入所述細(xì)胞內(nèi)。
36.根據(jù)權(quán)利要求11所述的片段，它是肽。
37.一種篩選能與權(quán)利要求11-13任一所述的蛋白結(jié)合的配體的方法，該方法包括使連接了所述蛋白的親和層析基質(zhì)與細(xì)胞抽提物接觸，從而使配體與所述基質(zhì)結(jié)合，并洗脫、分離和分析所述配體。
38.一種篩選DNA序列的方法，該DNA序列編碼了能結(jié)合權(quán)利要求11-13任一所述的蛋白的配體，該方法包括采用酵母雙雜交程序，其中一個雜交載體攜帶了編碼所述蛋白的序列，第二雜交載體攜帶了源自cDNA或基因組DAN文庫的序列，用所述載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離出陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并抽提出所述第二雜交載體，以獲得編碼所述配體的序列。
39.一種鑒定和生產(chǎn)配體的方法，該配體能調(diào)節(jié)由MORT-1或MORT-1結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選能與多肽結(jié)合的配體，該多肽包含MORT-1或選自MACH蛋白、Mch4蛋白和其它MORT-1結(jié)合蛋白的MORT-1結(jié)合蛋白的至少一部分；b)對于所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合、但非MORT-1或非所述MORT-1結(jié)合蛋白或非TNF/NGF受體家族受體一部分的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
40.一種鑒定和生產(chǎn)配體的方法，該配體能調(diào)節(jié)由權(quán)利要求11-13任一所述的蛋白調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選能與多肽結(jié)合的配體，該多肽包括圖1所示G1α序列的至少一部分或圖2所示G1β序列的至少一部分；b)對于經(jīng)所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合、但非MORT-1或非MORT-1結(jié)合蛋白或非TNF/NGF受體家族受體一部分的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
41.一種鑒定和生產(chǎn)配體的方法，該配體能調(diào)節(jié)由G1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選能與圖1所示G1α序列或圖2所示G1β序列的至少一部分結(jié)合的配體；b)對于經(jīng)所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的、能進(jìn)行所述結(jié)合、但非MORT-1或非MORT-1結(jié)合蛋白或非TNF/NGF受體家族受體一部分的配體，進(jìn)行鑒定和特性分析；c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
42.一種鑒定和生產(chǎn)能直接或間接調(diào)節(jié)G1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)G1調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)對所述分子進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
43.一種鑒定和生產(chǎn)分子的方法，該分子能直接或間接調(diào)節(jié)由權(quán)利要求11-13任一所述的蛋白所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)由權(quán)利要求11-13任一所述的蛋白所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)對所述分子進(jìn)行鑒定和特性分析；和c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了能調(diào)節(jié)或介導(dǎo)MORT－1功能的蛋白質(zhì)。還公開了編碼這些蛋白質(zhì)的DNA序列,重組產(chǎn)生這些蛋白的方法以及它們的用途。
文檔編號C12N1/19GK1249780SQ98803074
公開日2000年4月5日 申請日期1998年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月3日
發(fā)明者D·沃勒克, Y·戈爾采夫, A·科瓦連科, E·瓦爾福洛梅耶夫, V·布羅迪安斯基 申請人:依達(dá)研究發(fā)展有限公司