專利名稱：制備L－甲硫氨酸γ－裂合酶晶體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備用作抗腫瘤劑的L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體的制備方法，包含以上制備方法在內(nèi)的純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法，以及通過以上制備方法可得到的重組L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體。
背景技術(shù)：
L-甲硫氨酸γ-裂合酶(EC4.4.1.11)為這樣的一種酶，其需要磷酸吡哆醛作為輔酶，并且催化L-甲硫氨酸或其衍生物的α，γ-脫離(elimination)和γ-置換，并且也催化S-置換的L-半胱氨酸或其衍生物的α，β-脫離和β-置換。已報導(dǎo)該酶從惡臭假單胞菌(Psendomonas putida)中得到分離和純化(Nakayama，T.等.，生化年鑒138，421-424(1984))。最近，已發(fā)現(xiàn)L-甲硫氨酸γ-裂合酶具有抗腫瘤活性(WO94/11535)。并且，隨著近年DNA重組技術(shù)的迅速發(fā)展，過去僅能從惡臭假單胞菌中獲得極微數(shù)量的L-甲硫氨酸γ-裂合酶已有可能大量生產(chǎn)。(Inoue，H.等.，生物化學(xué)雜志117，1120-1125(1995))。
勿庸置疑，用作藥物制品的藥物應(yīng)該是純品，在過去，L-甲硫氨酸γ-裂合酶從惡臭假單胞菌細(xì)胞中提取并結(jié)合離子交換柱層析加以純化(Nakayama，T等.，生物年鑒(Anal.Biochem)138，421-424(1984)，Lishko，VK等.，蛋白表達(dá)與純化4，529-533(1993))。然而用上述方法制備的酶存在作為藥品純度低，難以大量提純的問題。
作為制備蛋白晶體的方法，使用聚乙二醇的方法是眾所周知的。有關(guān)L-甲硫氨酸γ-裂合酶，其結(jié)晶的方法已有報導(dǎo)(Esaki，N等.，酶學(xué)方法143，459-465(1987))結(jié)晶通過將L-甲硫氨酸γ-裂合酶與含有聚乙二醇的磷酸鉀緩沖液混合并將混合物置于室溫而進(jìn)行(所謂的蒸氣擴(kuò)散法)。然而在該文中，將已預(yù)先通過柱層析純化的高純度L-甲硫氨酸γ-裂合酶用于結(jié)晶。而且，獲得的晶體量很小(1.6mg)。

發(fā)明內(nèi)容
從未經(jīng)提純、含有雜質(zhì)的蛋白中制備大量晶體是困難的。即使這種結(jié)晶成功，多數(shù)因?yàn)榫w中仍然含有雜質(zhì)，不能做為有效的提純方法。目前，幾乎還沒有嘗試過在該步驟的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)結(jié)晶。本發(fā)明旨在提供從未純化的L-甲硫氨酸γ-裂合酶制備大量純L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體的方法，以及包括該制備方法在內(nèi)的純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法。
基于對上述目的進(jìn)行深入研究的結(jié)果，本項(xiàng)發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)了用聚乙二醇制備L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體的方法。即是說，第一步為在向其中加入聚乙二醇之前或之后加熱含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液且第二步為加入無機(jī)鹽，可在短時間里制備高度純化的L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體。這樣，本發(fā)明才得以完成。
在本發(fā)明中，L-甲硫氨酸γ-裂合酶意為由微生物如惡臭假單胞菌產(chǎn)生的天然L-甲硫氨酸γ-裂合酶和由重組DNA技術(shù)制備的重組L-甲硫氨酸γ-裂合酶中的任意一種或其二者。從工業(yè)批量制備的角度來看，重組L-甲硫氨酸γ-裂合酶是優(yōu)選的。因此，雖然重組L-甲硫氨酸γ-裂合酶(之后也簡略稱為“rMETase”)用于本發(fā)明實(shí)施方案中的解釋說明，但是天然L-甲硫氨酸γ-裂合酶也同樣適用。
用于制備本發(fā)明晶體方法中的含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液意為含有未純化或純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶溶液中的任意一種。此溶液的實(shí)例包括在下面步驟1中制備的粗酶溶液、含有未純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液以及通過用聚乙二醇去除雜質(zhì)后而獲得的溶液。然而，本發(fā)明并不局限于以上這些例子。
此外，陽離子性高分子促凝劑通過結(jié)合陽離子基團(tuán)至核酸或內(nèi)毒素的陰離子基團(tuán)上，使核酸或內(nèi)毒素形成不溶性凝集物而被除去。促凝劑的實(shí)例包括聚乙烯亞胺或主要由脫乙酰殼多糖(優(yōu)選為KurimoverI(栗田工業(yè)生產(chǎn)))所組成的陽離子性高分子促凝劑。然而，本發(fā)明中所說的陽離子性高分子促凝劑并不局限于這些實(shí)例。
附圖簡述

圖1為顯示rMETase棱晶的照片。
圖2為顯示rMETase八面體晶體的照片。
圖3描述制備新的rMETase表達(dá)質(zhì)粒pMGLTrc03的策略。
實(shí)行本發(fā)明的最佳方式1.含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶(rMETase)溶液的制備
(1)rMETase表達(dá)菌株的培養(yǎng)根據(jù)Inoue，H.等在生物化學(xué)雜志117，1120-1125(1995)中所述的方法制備其中插入有L-甲硫氨酸γ-裂合酶結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)質(zhì)粒。更為具體地，通過以下方法制備表達(dá)質(zhì)粒，包括將含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶基因的DNA片段插入pKK223-3、pPL-λ或其它載體中，這些載體具有用于rMETase基因在大腸桿菌中有效表達(dá)的合適啟動子如lac、tac、trp、trc或λPL及Shine-Dalgarno(SD)序列，或?qū)⑵洳迦刖哂蟹g起始密碼子ATG的pKK233-2、pTrc99A或其它ATG載體中。將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌菌株HB101、JM103、JM105、JM109、C600、MV1184、DH1、DH5、DH5α、BL21等中。因此，得到并培養(yǎng)rMETase表達(dá)菌株。
(2)細(xì)胞殘渣的排除培養(yǎng)后，將濕菌體在20到55℃，優(yōu)選約42℃下用高壓勻漿器(APV-Gaulin)破碎細(xì)胞，向其中加入陽離子高分子促凝劑。這一步驟的陽離子高分子促凝劑，最好用聚乙烯亞胺或Kurimover I等。將陽離子高分子促凝劑調(diào)節(jié)至0.05-0.5％(w/v)，優(yōu)選0.1-0.2％(w/v)的終濃度后，用陽離子高分子促凝劑于5到25℃、1到20分鐘去除細(xì)胞殘渣從而獲得rMETase的粗酶液。除了用陽離子高分子促凝劑去除(殘渣)外，也可用高壓勻漿器打碎細(xì)胞，離心并將上清液在55到65℃下加熱處理1到10分鐘而去除細(xì)胞殘渣。將獲得的粗酶液通過硫酸銨鹽析并離心。將獲得的沉淀溶解于緩沖液，優(yōu)選為磷酸緩沖液中，既獲得含有未純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶(rMETase)的溶液。
(3)雜質(zhì)的去除隨后，將終濃度從5到25％(w/v)，優(yōu)選從約8到12％(w/v)的聚乙二醇加入含有未純化rMETase的溶液中。將混合物于大約2℃到15℃，優(yōu)選4℃攪拌約10分鐘至120分鐘，優(yōu)選約60分鐘并離心，以去除雜質(zhì)。所使用的聚乙二醇，優(yōu)選其平均分子量不低于7,200(如，PEG 6000等)。在此步驟，預(yù)先加入硫酸銨使其終濃度為8到10％，優(yōu)選為10％的飽和濃度，可使rMETase的溶解性變得更高，從而最大限度減少rMETase的丟失。2. rMETase晶體的制備(1)加熱含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液，優(yōu)選為按上述步驟1去除了其中雜質(zhì)的溶液，并加入聚乙二醇。加熱可在添加聚乙二醇之前或之后進(jìn)行。而且，聚乙二醇也可在加熱之前和之后分開加入。在加熱前后分開加入聚乙二醇的情況下，加溫前的聚乙二醇添加可與為了上述去除雜質(zhì)的目的而進(jìn)行的聚乙二醇添加合并進(jìn)行。
加熱后的溫度約為25℃到40℃，優(yōu)選約30℃到32℃。一般地，通過降溫促進(jìn)結(jié)晶。在本發(fā)明，出人意料地通過在此階段加熱來促進(jìn)L-甲硫氨酸γ-裂合酶的結(jié)晶。這是本發(fā)明最重要的要點(diǎn)之一。
可根據(jù)蛋白結(jié)晶的常規(guī)方法進(jìn)行聚乙二醇的加入。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，加入具有不少于約7,200分子量的聚乙二醇，使其終濃度達(dá)到約5到25％(w/v)，然后攪拌，溶解。在加熱前后分別加入聚乙二醇時，聚乙二醇的總濃度應(yīng)調(diào)至上述的終濃度。而且，在使用步驟1中制備的含有rMETase溶液的情況下，因?yàn)槿芤褐猩泻袨槿コs質(zhì)而添加的聚乙二醇，應(yīng)算上這部分聚乙二醇的濃度，使添加入聚乙二醇后的濃度達(dá)到上述終濃度。
(2)然后，加入無機(jī)鹽以得到rMETase的棱晶。所用無機(jī)鹽，適宜的有堿性金屬鹽如氯化鈉和氯化鉀等，其中氯化鈉是尤其優(yōu)選的。無機(jī)鹽優(yōu)選以約20mM至500mM，更為優(yōu)選約100mM至200mM的終濃度使用。無機(jī)鹽在10分鐘至2小時，優(yōu)選在20分鐘加入。
盡管不攪拌也能形成晶體，但最好在操作上述的步驟(1)和(2)時，一邊攪拌一邊進(jìn)行。用于結(jié)晶的溶液，pH可維持在7到8，最好保持在7.2到7.5。
通過上述步驟析出的rMETase晶體，可通過離心分離出來。
獲得的rMETase晶體具有高純度，并且熱源物質(zhì)被減少。該晶體可在低溫下長期保存。
而且，通過重復(fù)步驟(1)和(2)，可獲得含有極少量污染蛋白的高度純化的rMETase。通過此結(jié)晶而獲得的rMETase與通過聯(lián)合數(shù)種柱層析而沒有經(jīng)過結(jié)晶獲得的rMETase具有相同或更高的純度。此外，通過包括本發(fā)明結(jié)晶制備法在內(nèi)的提純法(例如，本發(fā)明結(jié)晶化后再實(shí)行離子交換柱層析、分子篩柱層析等柱層析提純法)，不僅可得到高度純化，雜質(zhì)蛋白極少的rMETase晶體，還可使其中含有的熱源物質(zhì)，達(dá)到做為醫(yī)藥品許可的極低濃度。
在工業(yè)上，很顯然此結(jié)晶方法較層析方法具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。因此，包括本發(fā)明的晶體制備方法在內(nèi)的提純L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法在工業(yè)上是非常有用的提純法。
通過本發(fā)明制備方法而可制備的重組型L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體為新型的。本發(fā)明也提供這些新型的晶體。根據(jù)本發(fā)明制備的rMETase晶體，再溶解后，與天然蛋白晶體具有相同的酶促活性，并且相互間氨基末端氨基酸序列也是一致的。
通過列出下面的實(shí)施例和參考例，本發(fā)明得到更為詳細(xì)的解釋，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。參考例1rMETase表達(dá)菌株的培養(yǎng)將L-甲硫氨酸γ-裂合酶結(jié)構(gòu)基因插入市售的表達(dá)載體(Amersham Pharmacia Biotech)，構(gòu)建出rMETase表達(dá)質(zhì)粒pYH301(Inoue，H等，生物化學(xué)雜志117，1120-1125(1995))。將此質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109，以用作rMETase表達(dá)菌株。將本菌接種于LB培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)后，將細(xì)胞于市售的Terrific培養(yǎng)基(Funakoshi，東京，日本)中，在37℃下培養(yǎng)24小時。參考例2粗酶溶液的制備離心300ml參考例1中獲得的重組體培養(yǎng)液，收集約20g濕細(xì)胞，并懸浮于140ml的細(xì)胞破碎用緩沖液(1.3mM磷酸吡哆醛(以下簡略為PLP)、0.01％二硫蘇糖醇(以下簡略為DTT)、100mM磷酸鈉緩沖液(以下簡略為Na-PB)，pH7.2)，然后破碎細(xì)胞。離心破碎細(xì)胞后的懸液，獲得146ml的上清液(rMETase比活性20U/mg)。將上清液于60℃下加熱5分鐘，冷卻后，再次離心，得到136ml上清液，作為粗酶溶液(rMETase比活性30U/mg)?；蛘撸镁垡蚁﹣啺酚?0℃下處理破碎細(xì)胞后的155ml懸液5分鐘后離心，得到136ml上清液，作為粗酶溶液(rMETase比活性20U/mg)。參考例3rMETase酶活性測定法按如下測定rMETase的酶活性。用稀釋緩沖液(10μM PLP，1mM EDTA·2Na·2H2O，0.1g/l(±)-二硫蘇糖醇，0.5g/l吐溫80，100mM磷酸鉀緩沖液(以下簡稱K-PB，pH8.0))稀釋在上面參考例中獲得的rMETase溶液，以制備稀釋酶溶液。將作為底物的L-甲硫氨酸溶液預(yù)先于37℃下保溫5分鐘(25mM L-甲硫氨酸，10μM PLP，100mM K-PB(pH 8.0))，向其中加入50μl稀釋酶溶液，并將混合物于37℃下反應(yīng)10分鐘。加入100μl三氯乙酸(500g/L)溶液(以下稱為TCA液)以終止酶的反應(yīng)。將獲得的0.8ml酶反應(yīng)液、1.6ml乙酸緩沖液(1M乙酸鈉/乙酸，pH5.0)和0.6mlMBTH液(1g/L的3-甲基-2-苯并噻唑腙(benzothiazolinonehydrazone)HCl·H2O)的混合物于50℃下反應(yīng)30分鐘，然后冷卻至室溫。通過測定320nm處的吸光度(E320樣品)測定產(chǎn)生的α丁酮酸鹽的量。另外，將上述加入稀釋酶液和TCA溶液的順序顛倒過來，進(jìn)行類似地測定，作為空白(E320空白)。1個酶單位(U)定義為1分鐘產(chǎn)生1μmol α丁酮酸鹽的酶量。用下式計算酶活性(U/ml)＝(1.15·3.00/15.74/0.05/0.80/10)·(ΔE+2(ΔE)2)＝0.5480·(ΔE+2(ΔE)2)(其中，ΔEE320樣品-E320空白，1.15酶反應(yīng)液的量(ml)，3.00MBTH反應(yīng)液的量(ml)，15.74吖嗪(azine)衍生物的分子消光系數(shù)(mM)，0.05酶反應(yīng)樣品液的量(ml)，0.80MBTH反應(yīng)樣品液的量(ml)，10反應(yīng)時間(分鐘))。參考例4通過柱層析提純rMETase根據(jù)參考例2的方法，破碎細(xì)胞并加熱處理，獲取粗酶液。將270ml含有10μM PLP和0.01％2-巰基乙醇(2-ME)的去離子水加入136ml粗酶溶液中，將該液調(diào)至pH7.2，然后應(yīng)用至已用10mMNa-PB(pH7.2)平衡的100ml DEAE-TOYOPEARL 650C柱上(Tosoh公司，東京，日本)。用含有50mM NaCl，10μM PLP及0.01％2-ME的10mM Na-PB(pH7.2)洗柱。然后用含有10mMNaCl，10μM PLP和0.01％2-ME的10mM Na-PB(pH7.2)洗脫酶。rMETase的比活性大約為46U/mg，將100ml含有10μM PLP和0.01％2-ME的10mM Na-PB(pH8.0)加入到約100ml獲得的活性級份中，并將混合物調(diào)至pH8.0，然后應(yīng)用至50ml用50mMNa-PB(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(AmershamPharmacia Biotech)上。用含有80mM NaCl，10μM PLP及0.01％2-ME的50mM Na-PB(pH8.0)洗柱。然后用含有120mMNaCl，10μM PLP及0.01％2-ME的50mM Na-PB(pH8.0)洗脫酶。rMETase的比活性約50U/mg。用具有100kDa分子量截斷大小(cutting size)的濾膜(Millipore)將得到的活性餾份濃縮到10ml。將10ml濃縮液應(yīng)用至400ml以10mM Na-PB(pH7.2)(含10μMPLP)平衡的Sephacryl S-200HR柱(Pharmacia Biotech)上。得到的rMETase有效活性級份的比活性為52U/mg。在每個純化步驟后得到的rMETase比活性和產(chǎn)率列于表1中。表1

實(shí)施例1rMETase晶體的制備-(1)將58g固體硫酸銨(65％飽和度)逐漸加入136ml根據(jù)參考例2制備的粗酶溶液中。在加入硫酸銨的過程中用氨水將溶液調(diào)至pH7.2，使其溶解后，從該溶液中將酶鹽析出。離心收集沉淀并貯存于冰箱中。將此沉淀溶解于40ml溶解緩沖液(500μM PLP，0.05％2-ME和100mM Na-PB pH7.2)中，并逐漸加入4g PEG 6,000(10％(w/v))，然后將此混合物于4℃攪拌60分鐘。離心去除不溶性物質(zhì)后，將溶液于4℃下再攪拌16小時。將得到的溶液加熱至30℃并向其中加入0.8g PEG 6,000(2％(w/v))同時攪拌以溶解PEG 6,000。將2ml 4M的NaCl溶液加入該溶液中并攪拌。將此混合物進(jìn)一步于30℃下攪拌60分鐘以制備棱晶。進(jìn)一步于4℃下攪拌20小時后，離心得到rMETase的棱晶(圖1)。實(shí)施例2rMETase晶體的制備-(2)將上面實(shí)施例1中得到的棱晶溶解于40ml溶解緩沖液中。將該溶液于30℃下加熱并逐漸向此溶液中加入4g的PEG 6,000(10％(w/v))，同時攪拌以溶解。將2ml 4M的NaCl溶液加入該溶液中，并將混合物于4℃攪拌20小時。離心收集出現(xiàn)的八面體晶體。將這些晶體再次溶解于35ml溶解緩沖液中。將該溶液加熱至30℃后，向其中加入3.5g的PEG 6,000(10％(w/v))，同時攪拌以溶解。然后，邊攪拌邊加入1.75ml 4M NaCl溶液，并于4℃下進(jìn)一步攪拌該混合物20小時。離心收集析出的八面體晶體(圖2)。
在上面實(shí)施例1和2中得到的這些rMETase晶體，被高度純化，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時表現(xiàn)為單一條帶。這證明了本發(fā)明的結(jié)晶方法具有很高的提純效果。此外，這樣獲得的rMETase的比活性、純度和產(chǎn)率與通過聯(lián)合上述參考例4中提及的離子-交換柱層析的純化方法而獲得rMETase的比活性、純度和產(chǎn)率相同或比其更高。實(shí)施例3rMETase晶體的柱層析將實(shí)施例2中得到的晶體溶解于60ml溶解緩沖液中。將此溶液應(yīng)用至50ml用20mM Na-PB(pH7.2)平衡的DEAE-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech)柱層析中。用含有50mM NaCl，10μM PLP和0.01％ 2-ME的20mM Na-PB(pH7.2)洗柱。然后用含有100mM NaCl，10μM PLP及0.01％ 2-ME的20mMNa-PB(pH7.2)洗脫酶。rMETase的比活性為約52U/mg。用具有10kDa截斷大小的濾膜(Millipore)將此得到的活性餾份濃縮為10ml。將10ml此濃縮液應(yīng)用至400ml的用10mM含有10μM PLP的Na-PB(pH7.2)平衡的Sephacryl S-200HR(Pharmacia Biotech)柱層析中。得到rMETase有效活性級份的比活性為52U/mg。
在實(shí)施例1到3中每次操作后得到的rMETase比活性與產(chǎn)率列于表2中。
表2<

Sp.act.比活性實(shí)施例4新表達(dá)質(zhì)粒的制備用含有rMETase基因的pYH301作為模板，通過PCR方法克隆去除起始密碼子的rMETase基因(rMETase(-ATG))。將1μl 10pmol的有義引物(序列號15′-CCCGGTACCA CGGCTCCAACAAGCTCCCAG-3′)，1μl 10pmol的反義引物(序列號25′-CTCGAGACGG GTTCAGGCAC TCGCCTT-3′)和8μl的dNTP混合溶液(每種2.5mM)及一片Ampli WaxTM(Perkin-Elmer公司制，CT，美國)混合并將此得到的混合物于77℃加熱7分鐘，然后于20℃冷卻3分鐘。然后，加入0.5μl 5U/μl Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo公司制，Kyoto，日本)及大約1μl 1μg/μl的pYH301，且用蒸餾水將此溶液的量補(bǔ)充至90μl，然后加入10μl由聚合酶試劑盒附帶的PCR擴(kuò)增緩沖液。
其后，用DNA熱循環(huán)儀(PJ2000型Perkin-Elmer公司制)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)設(shè)定為每個循環(huán)94℃下1分鐘，55℃下1.5分鐘及72℃下2分鐘，進(jìn)行20輪循環(huán)。將得到的混合物于72℃下加熱7分鐘，然后置于室溫中。將凝固石蠟層下面的全部水相于瓊脂糖凝膠上電泳。用DNA回收系統(tǒng)SpinBindTM(Takara Shuzo公司制)回收擴(kuò)增的DNA片段。
將2μl收集到的DNA片段，1μl pMOSBlue T-載體(Amersham Pharmacia Biotech)及17μl蒸餾水加入到Ready-To-GoTMT4 DNA連接試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)，并將混合物于16℃下孵育45分鐘，然后連結(jié)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5菌株，將轉(zhuǎn)化子孵育于含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基中。從轉(zhuǎn)化子中篩選含有以相反方向插入rMETase基因和氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒并命名為LMGL/T-載體。
下面，將LMGL/T-載體的rMETase(-ATG)插入質(zhì)粒pATG3131起始密碼子的下游，該質(zhì)粒含有trc啟動子、SD序列、起始密碼子(ATG)、5SrrnBT1T2終止子及四環(huán)素抗性基因。首先，用限制酶EcoRI消化5μg的pATG3131，用綠豆核酸酶平滑化并用限制酶XbaI消化，然后于瓊脂糖凝膠上電泳，從而用SpinBind回收3.3kbp的片段。另一方面，用限制酶KpnI消化10μg LMGL/T-載體，用DNA補(bǔ)平試劑盒(Takara Shuzo公司制)平滑化并用限制酶XbaI消化，然后于瓊脂糖凝膠上電泳以回收1.2kbp的片段。將這兩種片段加入Ready-To-GoTMT4 DNA連接試劑盒并于16℃下孵育45分鐘，且連結(jié)然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將此轉(zhuǎn)化子孵育于含有四環(huán)素的瓊脂培養(yǎng)基上，從中篩選含有目的基因的質(zhì)粒并命名為pMGLTrc03(圖3)。實(shí)施例5rMETase晶體的制備-(3)將rMETase表達(dá)質(zhì)粒pMGLTrc03導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，制備了rMETase表達(dá)菌株。將得到的菌株培養(yǎng)于作為前種子培養(yǎng)基(preseedmedium)的LB培養(yǎng)基中，并進(jìn)一步培養(yǎng)于作為種子培養(yǎng)基的含有5％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，然后通過三個30-l的發(fā)酵罐于28℃下，將這些細(xì)胞培養(yǎng)于含有4％甘油的Terrific培養(yǎng)基(Funakoshi)中24小時。離心(Alfa Laval公司制)得到的重組體培養(yǎng)液57kg，收集到19kg濃縮的菌體細(xì)胞，向其中加入17.4kg含有24.57g EDTA、10.34gPLP和3.3g DTT的100mM Na-PB液(pH7.5)。將得到的細(xì)胞懸液于28℃下加熱，然后用高壓勻漿器(APV-Gaulin公司制)進(jìn)行破碎。破碎后的溫度為42℃。在大約5分鐘內(nèi)將2.18L 5％的Kurimover I溶液加入36.6kg得到的破碎后溶液中，攪拌混合物20分鐘。離心38.8kg得到的Kurimover I處理溶液，得到37.4kg粗酶溶液。這種粗酶液含有160g rMETase，其比活性為30U/mg。
將8.86kg的硫酸銨逐漸加入粗酶溶液(40％飽和度)，用氨水將溶液調(diào)至pH7.2，用于溶解硫酸銨。通過鹽析沉淀酶并保存于冰箱中。通過離心分離器(Sharples公司制)收集沉淀，將沉淀物溶解于3.6L溶解緩沖液(0.5mM PLP，0.05％2-ME，20mM Na-PB，pH7.2)中，向其中加入0.2L的溶解了150g硫酸銨的溶解緩沖液。用氨水將此溶液調(diào)至pH7.2，并冷卻至4℃，向其中逐漸加入1.6L含有540g PEG6,000的溶解緩沖液，并于4℃下攪拌該混合液60分鐘。離心去除不溶性物質(zhì)后，攪拌并逐漸加入5.4L含有650g PEG 6,000的溶解緩沖液。然后將得到的混合物加熱至32℃，接著用20分鐘時間邊攪拌邊加入540ml 4M的NaCl溶液。進(jìn)一步于32℃攪拌60分鐘產(chǎn)生rMETase的棱晶。進(jìn)一步于4℃下攪拌20小時以充分產(chǎn)生晶體，最后離心收集得到rMETase的棱晶。實(shí)施例6rMETase晶體的制備-(4)將上面獲得的棱晶溶解于6L溶解緩沖液中，離心去除其中的不溶性物質(zhì)，然后逐漸向其中加入2.4L含有760g PEG 6,000的溶解緩沖液，并將得到的混合物加熱至32℃。然后，用20分鐘時間邊攪拌邊加入420ml 4M的NaCl溶液，接著將此混合物于32℃下攪拌60分鐘。進(jìn)一步于4℃攪拌20小時產(chǎn)生rMETase的八面體晶體。離心將晶體收集并溶解于6L溶解緩沖液中。6.3L的晶體再溶解液中含有125g的rMETase，比活性為50U/mg。實(shí)施例7結(jié)晶后用柱層析對rMETase的純化-(2)將實(shí)施例6中得到的晶體再溶解液用于以20mM Na-PB(pH7.2)平衡的DEAE-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech)柱層析中。用含有0.1mM PLP和0.01％2-ME的20mM Na-PB(pH7.2)洗柱。用含有120mM NaCl，0.1mM PLP和0.01％2-ME的20mM Na-PB(pH7.2)洗脫酶。其比活性為52U/mg。用具有10kDa分子量截斷大小的濾膜(Millipore)將得到的15L活性級份濃縮至2.7L。濃縮液含有101g rMETase。將900ml的濃縮液用于18L以含有0.01mM PLP的10mM Na-PB(pH7.2)平衡的Sephacryl S-200 HR(Amersham Pharmacia Biotech)柱層析。此操作進(jìn)行三次。獲得的有效活性級份含有80g rMETase其比活性為52U/mg。
實(shí)施例5到7中每次操作后rMETase的比活性及產(chǎn)率列于表3中。表3

Sp.act.比活性序列表序列號1長度30個核苷酸類型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性種類DNA(有義引物)序列CCCGGTACCA CGGCTCCAAC AAGCTCCCAG序列號2長度27個核苷酸類型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性種類DNA(反義引物)序列CTCGAGACGG GTTCAGGCAC TCGCCTT工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的用于制備L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體的方法，可純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶至由柱層析得到該產(chǎn)品相同水平或比其更高的水平。與層析相比，用結(jié)晶的純化方法可經(jīng)濟(jì)而大規(guī)模地提純目的化合物。因此，本發(fā)明的制備晶體的方法作為L-甲硫氨酸γ-裂合酶的工業(yè)提純法是有用的。
權(quán)利要求
1.利用聚乙二醇制備L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體的方法，其特征在于包括在向其中加入聚乙二醇之前或之后加熱含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶溶液的第一步和加入無機(jī)鹽的第二步。
2.權(quán)利要求1的方法，其中加熱前的溫度約2℃到15℃，加熱后的溫度約25℃到40℃。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的無機(jī)鹽為氯化鈉或氯化鉀。
4.權(quán)利要求1的方法，其中無機(jī)鹽的終濃度約20mM到500mM。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的聚乙二醇具有不少于約7,200的平均分子量。
6.權(quán)利要求1的方法，其中的聚乙二醇終濃度約5％(w/v)到25％(w/v)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的加熱在所述加入聚乙二醇之前進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中的加熱在所述加入聚乙二醇之后進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的加入聚乙二醇在所述的加熱之前和之后進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1、8或9的方法，其進(jìn)一步包括在所述的加入聚乙二醇之后且其所述的加熱之前去除雜質(zhì)的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的去除雜質(zhì)通過在硫酸銨存在下加入聚乙二醇進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1的方法，其中的含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液中L-甲硫氨酸γ-裂合酶的濃度約4g/l到30g/l。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液用陽離子高分子促凝劑處理。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的陽離子高分子促凝劑為聚乙烯亞胺。
15.權(quán)利要求13的方法，其中的陽離子高分子促凝劑的主要成分為脫乙酰殼多糖。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述的陽離子高分子促凝劑為KurimoverI。
17.權(quán)利要求1的方法，其中重復(fù)一次或更多次一系列以下步驟，包括重新溶解L-甲硫氨酸γ-裂合酶，在加入聚乙二醇之前或之后加熱溶液及加入無機(jī)鹽。
18.包括權(quán)利要求1到17中任一項(xiàng)的方法的純化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法。
19.權(quán)利要求18的純化方法，其中的柱層析在權(quán)利要求1到17中任一項(xiàng)的方法之后進(jìn)行。
20.包括權(quán)利要求18或19純化方法的制備L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法。
21.通過權(quán)利要求1到17中任一項(xiàng)的方法而制備的重組L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶體。
22.示于圖3中的L-甲硫氨酸γ-裂合酶表達(dá)質(zhì)粒pMGLTrc03。
23.權(quán)利要求22的質(zhì)粒，其宿主為大腸桿菌。
24.含有重組L-甲硫氨酸γ-裂合酶溶液的制備方法，包括以下步驟將所述的權(quán)利要求22的L-甲硫氨酸γ-裂合酶表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主中；培養(yǎng)該宿主；以及破碎該宿主。
25.權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞破碎的溫度約20℃到55℃。
全文摘要
一種利用聚乙二醇制備L－甲硫氨酸γ－裂合酶晶體的方法,特征在于包括向其中加入聚乙二醇之前或之后加熱含有L－甲硫氨酸γ－裂合酶溶液的第一步和加入無機(jī)鹽的第二步。
文檔編號C12N9/88GK1250476SQ9880331
公開日2000年4月12日 申請日期1998年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月13日
發(fā)明者秋田憲作, 高倉知朗, 瀧本明生, 伊藤孝臣 申請人:鹽野義制藥株式會社