專利名稱：：小球藻病毒啟動子的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分離自小球藻(Chlorella)病毒的新啟動子，所述新啟動子可用于在宿主細胞中表達異源基因?；蚬こ炭蓮囊粋€生物體中分離結構基因并在不同的生物體中表達該基因。基因的表達包括核酸轉錄為mRNA和mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。為了在新的生物體中表達結構基因，必須將基因與適當位置處的傳遞基因轉錄信號的調(diào)節(jié)序列連接。調(diào)節(jié)序列一般包括結構基因上游的啟動子序列。啟動子序列是指導結構基因轉錄的DNA序列。結構基因的核酸序列被轉錄成信使RNA(mRNA)，然后被翻譯成特定多肽或蛋白質(zhì)的特征性氨基酸序列。啟動子序列一般位于基因的5’區(qū)域，結構基因轉錄起始位點的上游。啟動子可以是誘導型的，也可以是組成型的。誘導型啟動子對誘導劑的反應是活性增加，從而使可操作相連的編碼序列的轉錄速率增加。與之形成對照的是，在組成型啟動子的控制下，基因的轉錄速率不受調(diào)節(jié)。然而，值得注意的是通過加入操縱基因序列可使組成型啟動子變?yōu)檎T導型啟動子。例如，在T7噬菌體啟動子中加入lac操縱基因，使其由組成型啟動子轉變?yōu)槟鼙籌PTG誘導的啟動子(Rosenberg等，美國專利4,952,496)。盡管不受誘導劑的控制，一些組成型啟動子可提供比其它啟動子水平更高的轉錄。提供高水平基因轉錄的高活性啟動子在基因產(chǎn)物的商業(yè)生產(chǎn)中具有顯著的優(yōu)點。通常，啟動子在其天然宿主體外指導轉錄的能力各不相同。另外，特定啟動子的轉錄速率也可隨啟動子所作用的特定宿主的不同而變化。因此，需要能在廣范圍宿主細胞中促進高水平轉錄的新啟動子。小球藻病毒是一組感染某些單細胞的，真核的，小球藻樣綠藻系的病毒(VanEtten，1995，Mol.Cells，599-106；VanEtten等，1991，微生物學評論，55586-620)。這些病毒是已知的最大的和最復雜的病毒，一般為直徑150-190nm的多角體，其中含有大于300kb的雙鏈DNA。小球藻病毒基因組具有編碼幾百個基因產(chǎn)物的潛力。已分離出小球藻病毒甲基轉移酶啟動子，該啟動子顯示出在原核和真核宿主細胞系統(tǒng)中都可起作用。這些甲基轉移酶啟動子在一些細菌和高等植物細胞中能很好地起作用。例見美國專利5,563,328和Mitra等，1994，植物分子生物學，2685-893(“Mitra”)。本發(fā)明提供了分離自小球藻病毒的新的啟動子序列，該啟動子可在寬溫度范圍，如約21℃至37℃，在原核或真核細胞中誘導高水平的基因表達。本發(fā)明提供了分離自小球藻病毒的新的啟動子序列(SEQIDNOS1-7)。本發(fā)明包括含有本發(fā)明啟動子序列的基因構建體，所述啟動子序列與結構基因的DNA序列可操作相連。本發(fā)明還提供了表達由本發(fā)明基因構建體的結構基因編碼的產(chǎn)物的載體和宿主細胞，以及被與啟動子可操作相連的異源基因轉化的細胞。本發(fā)明的啟動子包括誘導型小球藻啟動子，例如通過與操縱基因序列融合可使該啟動子變?yōu)檎T導型啟動子。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的小球藻啟動子與lac操縱基因融合。本發(fā)明的小球藻啟動子在寬溫度范圍內(nèi)，如約21℃至約37℃，顯示出很強的啟動子活性。在一個實施方案中，結構基因是編碼用于在宿主細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的非小球藻病毒DNA序列。根據(jù)此實施方案，非小球藻病毒DNA序列可以是編碼肽，蛋白質(zhì)，激素，酶等的任何適當?shù)慕Y構基因。適當結構基因的例子包括胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，生長激素釋放因子(GRF)，甲狀旁腺激素(PTH)，互連肽，酰胺化密碼子序列，碳酸酐酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉移酶(CAT)，谷胱甘肽乙酰轉移酶等。本發(fā)明的基因構建體被導入適當?shù)挠糜诒磉_基因產(chǎn)物的宿主細胞。直接轉化宿主細胞，或通過載體進行轉化。在一個實施方案中，用于例如大腸桿菌菌株HB101或JM109的原核細胞的適當載體是質(zhì)粒pKK232-8。本發(fā)明的啟動子可用于多種原核和真核宿主細胞。在一個實施方案中，在包括煙草，小麥和其它植物的植物中使用本發(fā)明的啟動子促進高水平的基因表達。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)組分的方法。根據(jù)此實施方案，在被本發(fā)明基因構建體轉化的宿主細胞中產(chǎn)生了蛋白質(zhì)產(chǎn)物。該基因構建體包括與編碼有待在宿主細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的結構基因可操作相連的本發(fā)明的啟動子序列。本發(fā)明也提供了篩選和分離具有強轉錄特性的啟動子序列(包括下文所示小球藻病毒啟動子的截短形式)的方法。圖1圖解說明了pKK232-8質(zhì)粒圖譜。圖2圖解說明了使用與編碼CAT蛋白的異源DNA序列相連的7個小球藻病毒啟動子的基因構建體。圖3是用與啟動子序列cvp-10，cvp-13，cvp-15和cvp-16可操作相連的CAT基因轉化的氯霉素抗性大腸桿菌的CAT活性比較。圖4是轉化至大腸桿菌HB101并在多種濃度氯霉素的存在下生長的小球藻病毒啟動子cvp-13和tac啟動子的啟動子活性比較。圖5圖解說明了pBN115-glp質(zhì)粒圖譜。圖6是顯示不同溫度下，由pBN115-glp和pBN115-glp/tac表達GLP-1的SDS-PAGE凝膠。圖7是含有3拷貝GLP-1和YX16啟動子或tac啟動子的表達盒所表達蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠照片，分別為經(jīng)誘導和未經(jīng)誘導，可溶和不可溶的蛋白質(zhì)，于27℃和37℃。圖8是由8拷貝GLP-1和YX15，YX16或tac啟動子形成的表達盒所表達蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠照片，分別為經(jīng)誘導和未經(jīng)誘導，可溶和不可溶的蛋白質(zhì)，于27℃和37℃。圖9圖解說明了pBN951nk2[GLP(7-36)AFAM]8HAE(tac)的質(zhì)粒圖譜。本發(fā)明涉及分離自幾個小球藻病毒基因組的新的核酸序列，所述分離的核酸序列作為轉錄啟動子起作用[SEQIDNOS1-7]。本發(fā)明的啟動子序列與結構基因可操作相連以指導結構基因在原核或真核細胞中的轉錄。相對于天然或其它非天然啟動子而言，本發(fā)明的啟動子序列提供了高水平的基因表達，這一點如下文實施例的細菌宿主細胞中所示。本發(fā)明的啟動子序列與結構基因序列可操作相連，形成“基因構建體”或“表達盒”。在典型的實施方案中，基因構建體的結構基因序列是異源序列。本文所用的“異源序列”是不同于小球藻病毒中與啟動子序列可操作相連之序列的DNA序列?；驑嫿w也優(yōu)選包括增強子，標記物，聚腺苷酸化序列或其它調(diào)節(jié)核酸序列。當欲產(chǎn)生分泌蛋白質(zhì)時，結構基因的編碼序列優(yōu)選包括編碼信號肽的核酸序列。本發(fā)明的基因構建體被用于在宿主細胞中表達由結構基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。使用已知方法將基因構建體直接地，或經(jīng)由載體摻入宿主細胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物保持細胞內(nèi)后-表達或者當基因構建體中含有編碼信號肽的核酸序列時，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物被分泌到細胞外。小球藻病毒啟動子序列下列核酸序列分離自小球藻病毒，并包括指導結構基因轉錄的啟動子序列。cvp-1[SEQIDNO1]CCCGGGGATCGCAGGGCATGGGCATTAAAAGAACTTTATGGAATCAAAAATCTTAGTGAATTTCCACCACAGGTATATAGTCTTCAGGACGCTAACGATGATATCAACGATTGTATCAAAGGTTATCGTTTGAGGCACTCATATCAGGTAGTTTCTACACAGAAACTTGAACAACGCCTGGGAAAAGATCCTGAGCATAGTAACTTATATACTAGCAGATGTTGTAACGATGCTTTATATGAATATGAATTAGCACAACGACAACTACAAAAACAACTTGATGAATTTGACGAAGATGGGTATGATTTTTTTCAGGCACGTATAAATACATTAGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-3[SEQIDNO2]CCCGGGGATCTAATTCAGGGTGCGAATTTCTTGAACATCAAAGGTCTGTTGGACGTTTTGTGTGCAGCGGTTGCTGATCGCATTGAATCCATCAATAAACAGATTGGGGTAAATATCAAACCCAGTTAGTCGGACATTAGAAGGATTTGTGAGACCACCACATCCAACGACACCTAATGGTGTTGTGAATGATATATTAGAAATGTTACTTATCATTGATATTTGCATAACACCATTTCCCTTTGCTTGATTTCTACCTATACTAATTGATTGTATTGTAGTGCACGCGGCGTACTTACTTGTATTTGCCGTCTCAGACGTGCTTGATAATAGTGTGGAACTCGAGTATGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-6[SEQIDNO3]CCCGGGGATCATCGAAAGCAACTGCCGCATTCGAAACTTCGACTGCCTCGTTATAAAGGTTAGTGAAAGCCATTGTATGTTATTACTGAGTTATTTAATTTAGCTTGCTTAAATGCTTATCGTGTTGATATGATAAATGACAAATGATACGCTGTATCAACATCTCAAAAGATTAATACGAAGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-10[SEQIDNO4]CCCGGGGATCGTTTCTCAGGGCGTCCGGGAGCATATTTCAGACTTGTCCAGCCGTATGAGCATCACGTGCGCGTTCCTAGCAAGAGCGTGTACGTATATTCTTTCGCTCTAGAAGATGCAGATTCGAGACAACCGAATGGATCGAATCTATTTGTACCCCGATATATATAGAATCTAGTCTAAACAAAACGACCGCGGCTCTTGCCAATAAATGTGACGCAATTAACGCATTCGTGAATGATGACTTGTCCGCCCCGGTTCTTGACATTCTAAAAAAATGTGGAGTATCCTCGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-13[SEQIDNO5]CCCGGGGATCTGCGTATTGCGGGACTTTTGAGCATTTTCCAGAACGGATTGCCGGGACGTATACTGAACCTCCAGTCCCTTTGCTCGTCGTATTTCCCATAATATACATATACACTATTTTAATTATTTACACCGGTTGTTGCTGAGTGATACAATGCAAATTCCCTCCACCGAGGAGGATCGCGAACTGTCCAAATGTCTTCTTTCTGCAGCTCCATACGGAGTCGTTAGGAAACATTCACTTAATTATAGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-15[SEQIDNO6]CCCGGGGATCAGGCCTCGCTTATAAATATGGTATTGATGTACTTGCCGGTGTGATTGACTCAGATTACAGAGGAGAGTTGAAAGCAATCCTTTACAATACTACAGAACGTGACTATATTATCAAAAAAGGCGATCAGCCAAGCTTCGTCGACCTGCGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTcvp-16[SEQIDNO7]CCCGGGGATCGCAAAACTCACAGTCAACAAACCAAAACACGGAATGAAGAAAGGAGAAACTGTGATCATGTGGCAACAAGATGGAGGTGTCATAGACTACATTTACCCTCCCTCTGATCATCGAAAGCAACTGCCGCATTCGAAACTTCGACTGCCTCGTTATAAAGGTTAGTGAAAGCCATTGTATGTTATTACTGAGTTATTTAATTTAGCTTGCTTAAATGCTTATCGTGTTGATATGATAAATGACAAATGATACGCTGTATCAACATCTCAAAAGATTAATACGAAGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTT下文實施例中更全面地描述了發(fā)現(xiàn)這些新啟動子序列的方法。簡而言之，由5株小球藻病毒，CA-4B，A1-1A，PBCV-1，SC-1A和NC-1A的病毒基因組產(chǎn)生限制性DNA片段(VanEtten，1991，微生物學評論，55586-620)。使用已知方法，通過鳥槍克隆法將限制性片段插入質(zhì)粒pKK232-8(Sambrook等，1989，分子克隆)。質(zhì)粒載體pKK232-8含有無啟動子的氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因，在其上游含有多克隆位點以插入DNA限制性片段。然后，用克隆的pKK232-8轉化大腸桿菌，用氯霉素抗性篩選攜有啟動子序列的轉化子。為了得到高活性的啟動子，使用生長培養(yǎng)基中增加濃度的氯霉素進一步篩選氯霉素抗性轉化子。本文所用的啟動子“強度”指的是由啟動子指導的轉錄水平。“強”啟動子提供了比弱啟動子更高水平的轉錄。因此，術語“強啟動子”可以與“高活性啟動子”互換使用。強啟動子對于基因產(chǎn)物的商業(yè)生產(chǎn)特別有用。應理解啟動子功能可能不需要SEQIDNOS1-7中每一個所述的完整核酸序列。使用上文和下文實施例中所述的方法，可進一步地限制，如截短或修飾本發(fā)明的啟動子序列，并進行篩選以提煉出有活性的啟動子區(qū)域。制備基因構建體根據(jù)本發(fā)明，基因構建體包括至少一種與轉錄控制區(qū)可操作相連的結構基因編碼序列。轉錄控制區(qū)包括啟動子和其它調(diào)節(jié)元件，如增強子，調(diào)節(jié)元件，聚腺苷酸化序列，轉錄起始區(qū)和轉錄終止序列。SEQIDNOS1-7各包括啟動子序列，也可包括其它調(diào)節(jié)元件。將啟動子序列與結構基因序列可操作相連的方法是已知的，例見Itakuri等，1977，科學，1981056-1063。本發(fā)明基因構建體的結構基因一般編碼蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物。使用已知方法可將任何已知的或后來發(fā)現(xiàn)的編碼所需產(chǎn)物的結構基因與本發(fā)明的啟動子序列可操作相連。適用于與本發(fā)明啟動子一起使用的已知結構基因的例子包括編碼下列物質(zhì)的那些核酸序列胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，生長激素釋放因子(GRF)，甲狀旁腺激素(PTH)，碳酸酐酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉移酶(CAT)，谷胱甘肽乙酰轉移酶，互連肽，酰胺化序列，以及其它結構基因。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子序列與編碼碳酸酐酶，如人碳酸酐酶的DNA序列可操作相連。在另一個實施方案中，本發(fā)明的啟動子序列與編碼多拷貝所需蛋白質(zhì)的DNA序列相連。美國專利5,595,887中公開了胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的適當多拷貝結構基因的例子?；蜣D化方法一旦形成基因構建體，直接將它導入宿主細胞，或亞克隆至適當載體中以轉化宿主細胞。轉化細胞的方法是已知的，優(yōu)選的方法隨被轉化宿主細胞的類型而變化。本文所用的“宿主細胞”指的是最終表達基因構建體的結構基因的細胞。對于包括細菌，酵母和動物宿主細胞的原核和真核宿主細胞而言，優(yōu)選的轉化方法包括凍融法，氯化鈣沉淀法，磷酸鈣沉淀法，質(zhì)粒，原生質(zhì)體轉化，脂質(zhì)體指導的轉化，電穿孔和其它已知的轉化方法。對于植物細胞而言，優(yōu)選的轉化方法包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)指導的轉化，電穿孔，微粒轟擊，原生質(zhì)體融合，這些方法和其它已知轉化方法的結合。宿主細胞本發(fā)明的啟動子可用于多種宿主細胞，包括原核和真核宿主細胞。用于表達本發(fā)明基因構建體的適當細菌宿主細胞包括大腸桿菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。本發(fā)明的啟動子也可用于植物和動物細胞，包括酵母細胞，如煙草，小麥和其它植物細胞，胚胎，腫瘤和其它動物細胞等。將基因構建體攜至宿主細胞的適當載體系統(tǒng)包括例如質(zhì)粒，病毒，噬菌體和酵母人工染色體(YAC)。如下文實施例中所述，適于用本發(fā)明基因構建體轉化細菌宿主細胞的適當質(zhì)粒包括pKK232-8或pB0304。將外源基因導入植物的方法是已知的，可使用該方法將本發(fā)明的基因構建體插入植物宿主，所述方法包括生物和物理植物轉化法，例見Miki等，1993，“將外源DNA導入植物的方法”，植物分子生物學和生物技術方法，Glick和Thompson編，CRC出版公司，BocaRaton，p67-88。選定的方法隨宿主植物的不同而不同，包括化學轉染法如磷酸鈣，微生物指導的基因轉移如農(nóng)桿菌(Horsch等，科學，2271229-31，1985)，電穿孔，顯微注射，和biolistic轟擊。植物細胞的表達載體和體外培養(yǎng)方法或植物的組織轉化和再生是已知的，可以獲得的，例見Gruber等，1993，“植物轉化載體”，植物分子生物學和生物技術方法，Glick和Thompson編，CRC出版公司，BocaRaton，p89-119。實施例參照下列實施例更全面地描述本發(fā)明，但實施例不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1產(chǎn)生病毒DNA片斷提取自5株小球藻病毒CA-4B；A1-1A；PBCV-1；SC-1A和NC-1A的病毒DNA由Nebraska大學的VanEtten博士提供。合并提取的病毒DNA(各1.5μg)，通過在(100μl體積的)100mMNaCl，10mMBisTrisPropane-HCl，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇和100μg/mlBSA中用Sau3A1(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)消化產(chǎn)生了病毒DNA片斷。將混合物于37℃保溫120分鐘，通過10mMEDTA終止反應。用乙醇從消化混合物中沉淀出Sau3A1片斷，并用乙醇洗滌。實施例2將片斷克隆至DKK232-8通過Sambrook等在1989，分子克隆中所述的鳥槍克隆法將按實施例1所述產(chǎn)生的Sau3A1病毒片斷克隆至質(zhì)粒pKK232-8中。質(zhì)粒pKK232-8購自Pharmacia(Piscataway，NJ)。pKK232-8的圖譜示于圖1。按Sambrook等(文獻同上)所述或根據(jù)廠商的指導進行DNA的制備，補平反應和連接。將小球藻病毒DNA片斷與1μg預先經(jīng)BamHI和牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理過的pKK232-8連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pCVP-1；pCVP-3；pCVP-6；pCVP-10；pCVP-13；pCVP-15；和pCVP-16。這7個與異源CAT基因可操作相連的小球藻病毒啟動子示于圖2。(縮寫Sm，SmaI；Sa，SalIH，HindIII；CAT，氯霉素乙酰轉移酶基因)，牛小腸堿性磷酸酶購自Promega(Madison，WI)。T4DNA連接酶購自BRL(Rockville，MD)。pKK232-8是pBR322的衍生物，它含有無啟動子的氯霉素?；D移酶(CAT)基因，在其上游含有多克隆位點以插入DNA限制性片段。被pKK232-8轉化的大腸桿菌細胞對氨芐青霉素具有抗性，但對氯霉素敏感，除非含有啟動子的DNA片斷被插入CAT基因的上游以誘導CAT的表達。如果插入這種啟動子，攜有重組質(zhì)粒的細胞即表達CAT，從而獲得氯霉素抗性。pKK232-8被設計成降低氯霉素抗性背景并增加篩選強啟動子的能力。為了降低背景，CAT基因的側翼為有效的轉錄終止子，該轉錄終止子阻斷質(zhì)粒上存在的其它啟動子轉錄CAT基因。在多克隆位點和CAT基因起始密碼子之間的所有3個閱讀框中導入翻譯終止密碼子以防止從克隆的啟動子片斷可能導入的任何ATG起始密碼子開始翻譯讀。CAT基因也含有其自身的核糖體-結合信號和ATG起始密碼子，能有效地翻譯CATmRNA。實施例3轉化大腸桿菌和選擇轉化子按Sambrook等，1989(文獻同上)所述進行大腸桿菌HB101和JM109的轉化。所述大腸桿菌菌株購自Promega(Madison，WI)。篩選經(jīng)轉化的大腸桿菌的可顯示被pKK232-8轉化的氨芐青霉素抗性和顯示啟動子插入的氯霉素抗性。通過在遞增量的氯霉素存在下測定細胞生長來估計插入的啟動子的強度。在含有30μg/ml氨芐青霉素和多種濃度氯霉素(5，10，20，30，100μg/ml)的Luria肉湯(LB)平板上分離陽性菌落。選擇抗100μg/ml氯霉素的大腸桿菌菌落，接種于含200，400，600，700，900μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中。通過測定培養(yǎng)物的O.D.600來監(jiān)測細胞生長。得到幾千個抗30μg/ml氯霉素的轉化子?？孤让顾氐霓D化子數(shù)目隨抗生素濃度的增加而顯著降低。僅有約500個轉化子抗100μg/ml氯霉素，僅有36個轉化子顯示出對500μg/ml氯霉素的抗性。被未插入啟動子的對照pKK232-8轉化的細胞對濃度大于5μg/ml的氯霉素沒有抗性。將顯示出對500μg/ml氯霉素具有抗性的36個轉化子進一步暴露于500，700和900μg/ml氯霉素中。7個轉化子在含有700μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中顯示出正常生長，在900μg/ml氯霉素存在下顯示出較緩慢的生長(圖2)。實施例4比較由小球藻病毒啟動子誘導的CAT活性比較由實施例3氯霉素抗性小球藻病毒啟動子轉化子表達的CAT活性。在600μg/ml氯霉素存在下，使7個氯霉素抗性大腸桿菌轉化子中的4個生長(CVP-10；CVP-13；CVP-15和CVP-16)。通過測定不同時間的細胞密度(O.D.600)來監(jiān)測細胞生長。如圖3所示，4個轉化子顯示出類似的細胞生長，這表明各個培養(yǎng)物中表達了類似水平的CAT活性。實施例5純化質(zhì)粒DNA使用Wizard微量制備質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Promega公司，Madison，WI)或QiagenDNA純化試劑盒(Qiagen公司，Chatsworth，CA)從顯示出最高水平氯霉素抗性(700至900μg/ml)的那些菌落中純化質(zhì)粒DNA。通過限制性核酸內(nèi)切酶消化對質(zhì)粒進行分析，結果表明所有質(zhì)粒都攜有DNA插入片段。用SmaI和HindIII消化質(zhì)粒，并在7.5％聚丙烯酰胺凝膠或0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。如圖2所示，電泳凝膠顯示出大小為100至400bp的7個病毒啟動子片段。實施例6測定啟動平片段的序列用SmaI和HindIII從pKK232-8載體上切下7個含啟動子的病毒DNA片段(cvp-1，cvp-3，cvp-6，cvp-10，cvp-13，cvp-15和cvp-16)并亞克隆至pUC19或pBluescriptSK(+)II以供測序。由NebraskaLincoln大學(UNL)測序實驗室使用自動LICOR測序儀進行DNA測序。使用Sanger雙脫氧鏈終止法在兩個方向測定序列。所有7個小球藻病毒片段的序列分析揭示出Sau3A1位點位于小球藻病毒插入物的每個末端，并側翼于pKK232-8載體的多克隆位點。7個啟動子片段DNA序列的大小與通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的限制性片段的大小相符。</tables>已知的大腸桿菌啟動子序列含有3個必需的元件兩個六聚體序列(-35區(qū)域和-10區(qū)域)和這兩個區(qū)域之間的16-18bp間隔區(qū)。使用lac，lacUV5，trp，tac和PL啟動子共有序列作為參照，將-35和-10區(qū)域推定序列對7個病毒啟動子中的每一個進行排布。如下表I所示，這些六聚體序列與已知大腸桿菌啟動子的共有序列或者相同，或者僅稍有不同。例如，cvp-10(TTGACA)或cvp-15(TTTACA)的-35序列區(qū)域與trp(TTGACA)或lac(TATGTT)中的相同。本發(fā)明7個分離的病毒啟動子中的6個在推定的-35和-10區(qū)域之間具有16-18bp間隔區(qū)。cvp-13病毒啟動子和lac啟動子都具有相同的-35六聚體序列(TTTACA)，-35和-10區(qū)域之間完全相同的間隔區(qū)(18bp)，非常相似的-10六聚體序列(cvp-13為TACAAT，lac為TATAAT)。黑體“A”表示轉錄起始位點?？s寫lac，lac啟動子；lacUV5，lacUV5啟動子；trp，trp啟動子；tac，tac啟動子；PL，噬菌體λPL啟動子。實施例7比較cvp-13和tac的啟動子活性tac啟動子是很強的大腸桿菌啟動子(deBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.8021-25)，已在研究和工業(yè)中被廣泛用于基因表達。為了在相同檢測系統(tǒng)中將病毒啟動子cvp-13的啟動子活性和tac的啟動子活性進行比較，使用pKK232-8構建tac的啟動子質(zhì)粒。將含有tac序列的兩個互補寡聚體，5′-GGGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATGGCTCGTATAATGTGTGGAAGCTT-3′[SEQIDNO8]和5′-CCCTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACCTTCG-3′[SEQIDNO9]退火并插入pKK232-8中CAT基因上游，SmaI和HindIII之間。將所得質(zhì)粒pTAC-cat轉化至大腸桿菌HB101中。在100，300或600μg/m1氯霉素存在下培養(yǎng)含有pTAC-cat或pCVP-13的細胞。通過測定不同時間的細胞生長密度來監(jiān)測抗生素抗性。如圖4所示，在所有3個氯霉素濃度水平下，cvp-啟動子顯示出比tac啟動子更高的啟動子活性。實施例8構建受調(diào)節(jié)的病毒啟動子分離自小球藻病毒基因組的7個病毒啟動子片段在大腸桿菌中顯示出強啟動子活性。然而，它們的啟動子活性不受調(diào)節(jié)，因此，只能組成型指導蛋白質(zhì)表達。已為幾個啟動子開發(fā)了通過融合啟動子與lac操縱基因將組成型啟動子轉變?yōu)檎T導型啟動子的方法，所述啟動子如核糖體RNA基因啟動子(Brosius和Holy，1984，PNASUSA816929-6933)和脂蛋白基因啟動子(Nakamura等，1982，EMBOJ.1771-775)。這些經(jīng)修飾的雜合啟動子受lacI基因產(chǎn)物，lac阻遏物的阻遏，所述阻遏物與lac操縱基因特異性的結合抑制轉錄的起始并且通過如異丙基b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)這樣的誘導物而解除阻遏，從而防止阻遏蛋白與lac操縱基因結合。將lac操縱基因與小球藻病毒啟動子cvp-1，cvp-15和cvp-16融合以評估小球藻病毒啟動子是否可變?yōu)檎T導型啟動子。由OperonTechnology公司(Alameda，CA)化學合成了含有l(wèi)ac操縱基因序列和適當限制性克隆位點的兩個互補寡核苷酸。這些寡核苷酸的序列如下5’-TCGACCGGGTACCTCGCGAGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCTCTAGA-3’[SEQIDNO22]5′-AGCTTCTAGAGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCTCGCGAGGTACCCGG-3’[SEQIDNO23]變性和退火之后，將所得寡核苷酸雙鏈體插入pKK232-8上SalI和HindIII位點處的病毒啟動子下游。將在CAT基因上游含有病毒啟動子/操縱基因雜合體的pKK232-8克隆轉化至缺乏lacI功能的大腸桿菌HB101。通過測定經(jīng)轉化細胞對氯霉素的抗性而檢測到與缺乏lac操縱基因的病毒啟動子類似水平的啟動子活性。這表明通過與lac操縱基因融合而操作病毒啟動子不會導致啟動子強度的降低。與lac操縱基因融合的啟動子cvp-1，cvp-15和cvp-16分別被稱為YX-1，YX-15和YX-16。實施例9由YX-15表達載體表達胰高血糖素樣肽(GLP-1)A.構建YX-15表達載體，pBN115-glp為了將病毒啟動子(YX-1，YX-15和YX-16)亞克隆至表達載體(需要限制性位點BglII和XbaI以供克隆)，使用由OperonTechnology公司合成的下列寡核苷酸進行聚合酶鏈反應(PCR)以修飾啟動子片段5’-GGGTTCGAAGATCTAATTCCCGGGGATC-3’[SEQIDNO24]和5’-TGCATTTCTAGAATTGTGAATTGTTATCCGCTCA-3’[SEQIDNO25]質(zhì)粒pGEX-2T購自PharmaciaBiotech公司(piscataway，NJ)，該質(zhì)粒攜有pBR322復制起點，lacIq基因，氨芐青霉素抗性基因，和tac啟動子/谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合基因表達盒。首先通過用FspI和SmaI消化除去1.2kb的FspI-SmaI片段以缺失pGEX-2T上的tac/GST表達盒，然后用含有BglII/XbaI/NheI/XhoI位點，可用作克隆位點的DNA片段取而代之。所得質(zhì)粒被稱為pBN115。GLP-1是29個殘基的激素肽。構建合成的8拷貝GLP-1基因并在大腸桿菌中表達之。為了檢測在YX-15控制下的GLP-1表達，通過將含有YX-15的BglII-XbaI片段與含有核糖體結合位點和8拷貝GLP-1基因的XbaI-XhoI片段融合，構建YX-15/GLP-1表達盒。然后，將YX-15/GLP-1表達盒插入pBN115唯一的BglII和XhoI位點處，產(chǎn)生pBN115-glp(圖5)。通過用含有l(wèi)ac操縱基因的tac啟動子替代pBN115-glp上BglII和XbaI位點處的YX-15，構建pBN115-glp/tac以用作對照表達載體。tac啟動子也可被IPTG嚴格調(diào)節(jié)。B.表達GLP-1在氨芐青霉素的存在下，將p’BN115-glp和pBN115-glp/tac轉化至大腸桿菌宿主菌株HMS174(Novagen公司，Milwaukee，WI)。在37℃至21℃下，用0.1至2mMIPTG誘導GLP-1的表達。誘導15小時之后收獲細胞。制備總細胞蛋白供SDS-PAGE分析(圖6)。使用PersonalColorScanner和Adobephotoshop和NIHImageAnalysis計算機程序，通過凝膠掃描來評價GLP-1的產(chǎn)生。如表1所示，凝膠掃描揭示出37℃下，pBN115-glp表達GLP-1的水平大于總細胞蛋白的46％，而pBN115-glp/tac表達GLP-1的水平大于總細胞蛋白的35％。1O.D.600細胞中，pBN115-glp產(chǎn)生的GLP-1比pBN115-glp/tac產(chǎn)生的多40％。此結果清楚地表明YX-15作為很強的啟動子在大腸桿菌中產(chǎn)生高水平重組蛋白的潛在應用。表1大腸桿菌中YX-15指導的GLP-1表達<p>每次處理時從0.25O.D.600細胞中提取總蛋白并在16％PAGE凝膠上分析(圖6)。用考馬斯藍染色后，使用PersonalColorScanner和Adobephotoshop和NIHImageAnalysis計算機程序掃描蛋白質(zhì)帶的強度。圓括號中的百分數(shù)表示相對于37℃下由tac啟動子驅動的GLP-1表達水平的GLP-1表達水平。C.通過IPTG誘導盡管在沒有IPTG的情況下可檢測到攜有pBN115-glp的HMS174中GLP-1的基本表達水平，但加入IPTG后，GLP-1表達水平增加了4倍。與之形成對照的是，IPTG誘導pBN115-glp/tac產(chǎn)生的GLP-1增加了13倍。這表明pBN115-glp的GLP-1表達確實對IPTG誘導作出反應。然而，對pBN115-glp的GLP-1表達所作的調(diào)節(jié)不如對pBN115-glp/tac的嚴格。37℃下，檢測多種濃度(0，0.25，0.5，1.0和2.0mM)的IPTG對GLP-1表達的誘導能力。在IPTG濃度范圍為2mM至0.1mM時，pBN115-glp產(chǎn)生了類似高水平的GLP-1。這表明低至0.1mM的IPTG濃度足以誘導GLP-1超量表達。在所有受試的IPTG濃度下，pBN115-glp產(chǎn)生的GLP-1比pBN115-glp/tac產(chǎn)生的GLP-1始終要高，這說明YX-15的啟動子活性比tac高。D.溫度的影響培養(yǎng)溫度對微生物的行為有很大的影響。通常使用37℃作為誘導溫度以在大腸桿菌中產(chǎn)生所需的重組蛋白，而在某些情況下，較低的溫度在產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)和避免形成無活性的蛋白質(zhì)聚集體方面顯示出優(yōu)點。然而，在較低的溫度下，作為生物化學反應的轉錄和翻譯的速率大大降低，因此，目的蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量降低。因此，使用在較低溫度下具有高活性的啟動子對于產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)是必需的。在本發(fā)明之前，這種大腸桿菌啟動子還不能得到。如tac啟動子和T7啟動子這樣的常用啟動子在37℃下活性很高，但在較低的溫度下活性弱得多，下文中有關tac啟動子的數(shù)據(jù)可以說明此現(xiàn)象。在37℃至21℃的溫度范圍內(nèi)，比較YX-15控制GLP-1產(chǎn)生的啟動子活性。表1所示的結果(上文)證明YX-15啟動子在37℃至21℃的溫度范圍能驅動高水平GLP-1的表達。27℃下，使用YX-15啟動子的表達水平甚至比37℃時使用tac啟動子的表達水平稍高。27℃和21℃時，YX-15驅動的GLP-1表達水平降低，與37℃時相比，分別降低20％和50％。與之形成對照的是，使用tac時，27℃與37℃相比，表達降低了95％。21℃時未檢測到tac啟動子的蛋白質(zhì)表達。實施例10病毒啟動子在植物中的功能為了檢測分離的病毒啟動子是否能在植物中起作用，將7個啟動子片段插入β-葡糖醛酸酶(GUS)表達載體pBI221(ClotechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的GUS基因上游以替代CaMV35S啟動子。通過微粒轟擊法將所得質(zhì)粒導入煙草葉和小麥不成熟的胚中。然后通過計數(shù)受試外植體上藍色GUS焦點的形成，組化檢測經(jīng)轉化外植體的GUS表達情況。用含有CaMV35S啟動子的pBI221轉化陽性對照外植體。如表2所示，用啟動子cvp-15觀察到GUS瞬時測定的陽性結果，但用另外6個啟動子未觀察到陽性結果。表2*n＝3次實驗實施例11用pYX16低溫表達GLP構建體上文實施例9中所述的表達質(zhì)粒pBN115-glp(8拷貝GLP-1)使用YX15啟動子(cvp-15加上lac操縱基因)驅動8拷貝GLP-1(7-36)表達盒的表達。通過用YX-16啟動子的片段替代pBN115載體中BglII/XbaI啟動子片段，構建含有YX16啟動子(cvp-16加上lac操縱基因)和3拷貝GLP-1(7-36)的第二個質(zhì)粒。通過XbaI-XhoI片段的取代用3拷貝GLP-1盒取代8拷貝GLP-1盒。此構建體pGEXlnk2(3拷貝GLP)YX16含有與pBN115相同的質(zhì)粒骨架，不同之處是啟動子是YX16而不是YX15。使用pBN53表達質(zhì)粒制備驅動8拷貝GLP-1(7-36)表達的YX16啟動子構建體。YX16啟動子作為BglII/XbaI片段被克隆至此構建體。所得質(zhì)粒pBN53lnk28拷貝GLPYX16為四環(huán)素抗性，并含有l(wèi)acIq基因以阻遏未誘導的表達。pBN95質(zhì)粒與pBN53質(zhì)粒相同，不同的是它含有l(wèi)acI基因而不是lacIq基因。這一變化導致pBN95中l(wèi)acI基因產(chǎn)物較低水平的表達，因此，使用此載體可較低水平地阻遏未誘導的蛋白質(zhì)水平。使用上文實施例9中所述的方法和材料將表達載體轉化至大腸桿菌細胞。按實施例9中所述，在27℃和37℃下用IPTG誘導GLP-1的表達。把誘導受tac或YX16啟動子控制的3拷貝GLP-1(7-36)和8拷貝GLP-1(7-36)之后從細胞培養(yǎng)物中取出的蛋白質(zhì)樣品在16％TrisTricineSDS-PAGE凝膠上分離，并用考馬斯藍染色。圖7所示的數(shù)據(jù)闡明YX16啟動子在27℃下能較好地發(fā)揮作用，而tac啟動子在此溫度下無活性。GLP前體肽于27℃是可溶性的，而于37℃是不可溶的。圖8所示的數(shù)據(jù)闡明YX15和YX16啟動子在27℃下都能發(fā)揮作用，而tac啟動子在此溫度下無活性。數(shù)據(jù)表明YX16啟動子在低溫(27℃)下發(fā)揮作用，具有兩個獨立的靶肽。上述說明書，實施例和數(shù)據(jù)提供了制備和使用本發(fā)明組分的完整描述。由于在不違背本發(fā)明精神和范圍的前提下可想出很多本發(fā)明的實施方案，本發(fā)明包含在下文所附的權利要求書中。序列表(1)一般資料(i)申請人BIONEBRASKA，InC.(ii)發(fā)明題目小球藻病毒啟動子(iii)序列數(shù)25(iv)通訊地址(A)收件人Merchant，Gould，Smith，Edell，Welter&amp;Schmidt(B)街道3100NorwestCenter，90South7thStreet(C)城市Minneapolis(D)州MN(E)國家美國(F)郵政編碼55402(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQforWindowsVersion2.0(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)?新提交)(B)申請日19-MAR-1998(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/821,559(B)申請日21-MAR-1997(viii)代理人/律師資料(A)姓名Kettelberger，DeniseM(B)登記號33,924(C)資料/文檔號8648.63WOI1(ix)通訊資料(A)電話612-332-5300(B)傳真612-332-9081(C)電報(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長度358個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO1CCCGGGGATCGCAGGGCATGGGCATTAAAAGAACTTTATGGAATCAAAAATCTTAGTGAA60TTTCCACCACAGGTATATAGTCTTCAGGACGCTAACGATGATATCAACGATTGTATCAAA120GGTTATCGTTTGAGGCACTCATATCAGGTAGTTTCTACACAGAAACTTGAACAACGCCTG180GGAAAAGATCCTGAGCATAGTAACTTATATACTAGCAGATGTTGTAACGATGCTTTATAT240GAATATGAATTAGCACAACGACAACTACAAAAACAACTTGATGAATTTGACGAAGATGGG300TATGATTTTTTTCAGGCACGTATAAATACATTAGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTT358(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長度374個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO2CCCGGGGATCTAATTCAGGGTGCGAATTTCTTGAACATCAAAGGTCTGTTGGACGTTTTG60TGTGCAGCGGTTGCTGATCGCATTGAATCCATCAATAAACAGATTGGGGTAAATATCAAA120CCCAGTTAGTCGGACATTAGAAGGATTTGTGAGACCACCACATCCAACGACACCTAATGG180TGTTGTGAATGATATATTAGAAATGTTACTTATCATTGATATTTGCATAACACCATTTCC240CTTTGCTTGATTTCTACCTATACTAATTGATTGTATTGTAGTGCACGCGGCGTACTTACT300TGTATTTGCCGTCTCAGACGTGCTTGATAATAGTGTGGAACTCGAGTATGATCCGTCGAC360CTGCAGCCAAGCTT374(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特征(A)長度207個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO3CCCGGGGATCATCGAAAGCAACTGCCGCATTCGAAACTTCGACTGCCTCGTTATAAAGGT60TAGTGAAAGCCATTGTATGTTATTACTGAGTTATTTAATTTAGCTTGCTTAAATGCTTAT120CGTGTTGATATGATAAATGACAAATGATACGCTGTATCAACATCTCAAAAGATTAATACG180AAGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTT207(2)SEQIDNO4的資料(i)序列特征(A)長度317個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO4CCCGGGGATCGTTTCTCAGGGCGTCCGGGAGCATATTTCAGACTTGTCCAGCCGTATGAG60CATCACGTGCGCGTTCCTAGCAAGAGCGTGTACGTATATTCTTTCGCTCTAGAAGATGCA120GATTCGAGACAACCGAATGGATCGAATCTATTTGTACCCCGATATATATAGAATCTAGTC180TAAACAAAACGACCGCGGCTCTTGCCAATAAATGTGACGCAATTAACGCATTCGTGAATG240ATGACTTGTCCGCCCCGGTTCTTGACATTCTAAAAAAATGTGGAGTATCCTCGATCCGTC300GACCTGCAGCCAAGCTT317(2)SEQIDNO5的資料(i)序列特征(A)長度277個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO5CCCGGGGATCTGCGTATTGCGGGACTTTTGAGCATTTTCCAGAACGGATTGCCGGGACGT60ATACTGAACCTCCAGTCCCTTTGCTCGTCGTATTTCCCATAATATACATATACACTATTT120TAATTATTTACACCGGTTGTTGCTGAGTGATACAATGCAAATTCCCTCCACCGAGGAGGA180TCGCGAACTGTCCAAATGTCTTCTTTCTGCAGCTCCATACGGAGTCGTTAGGAAACATTC240ACTTAATTATAGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTT277(2)SEQIDNO6的資料(i)序列特征(A)長度181個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO6CCCGGGGATCAGGCCTCGCTTATAAATATGGTATTGATGTACTTGCCGGTGTGATTGACT60CAGATTACAGAGGAGAGTTGAAAGCAATCCTTTACAATACTACAGAACGTGACTATATTA120TCAAAAAAGGCGATCAGCCAAGCTTCGTCGACCTGCGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCT180T181(2)SEQIDNO7的資料(i)序列特征(A)長度316個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO7CCCGGGGATCGCAAAACTCACAGTCAACAAACCAAAACACGGAATGAAGAAAGGAGAAAC60TGTGATCATGTGGCAACAAGATGGAGGTGTCATAGACTACATTTACCCTCCCTCTGATCA120TCGAAAGCAACTGCCGCATTCGAAACTTCGACTGCCTCGTTATAAAGGTTAGTGAAAGCC180ATTGTATGTTATTACTGAGTTATTTAATTTAGCTTGCTTAAATGCTTATCGTGTTGATAT240GATAAATGACAAATGATACGCTGTATCAACATCTCAAAAGATTAATACGAAGATCCGTCG300ACCTGCAGCCAAGCTT316(2)SEQIDNO8的資料(i)序列特征(A)長度52個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO8GGGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATGGCTCGTATAATGTGTGGAAGCTT52(2)SEQIDNO9的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO9CCCTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACCTTCG51(2)SEQIDNO10的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO10CAAAAACAACTTGATGATTTGACGAAGATGGGTATGATTTTTTTCAGGC49(2)SEQIDNO11的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO11TCAGACGTGCTTGATAATAGTGTGGAACTCGAGTATGATCCGTCGACCT49(2)SEQIDNO12的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO12GCTTATCGTGTTGATATGATAAATGACAAATGATACGCTGTATCAACA48(2)SEQIDNO13的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO13GCCCCGGTTCTTGACATTCTAAAAAAATGTGGAGTATCCTCGATCCGTCGA51(2)SEQIDNO14的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO14ATTTTAATTATTTACACCGGTTGTTGCTGAGTGATACAATGCAAATTCCCT51(2)SEQIDNO15的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO15AAAGCAATCCTTTACAATACTACAGAACGTGACTATATTATCAAAAAAGG50(2)SEQIDNO16的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO16ACTGCCTCGTTATAAAGGTTAGTGAAAGCCATTGTATGTTATTACTGAGTT51(2)SEQIDNO17的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO17CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATT50(2)SEQIDNO18的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO18CACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATT50(2)SEQIDNO19的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO19AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGT50(2)SEQIDNO20的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO20AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATT48(2)SEQIDNO21的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO21TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGGGGTGATACTGAGCACATCA49(2)SEQIDNO22的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO22TCGACCGGGTACCTCGCGAGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCTCTAGA50(2)SEQIDNO23的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO23AGCTTCTAGAGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCTCGCGAGGTACCCGG50(2)SEQIDNO24的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO24GGGTTCGAAGATCTAATTCCCGGGGATC28(2)SEQIDNO25的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO25TGCATTTCTAGAATTGTGAATTGTTATCCGCTCA3權利要求1.根據(jù)SEQIDNo.1的分離的核酸序列。2.根據(jù)SEQIDNo.2的分離的核酸序列。3.根據(jù)SEQIDNo.3的分離的核酸序列。4.根據(jù)SEQIDNo.4的分離的核酸序列。5.根據(jù)SEQIDNo.5的分離的核酸序列。6.根據(jù)SEQIDNo.6的分離的核酸序列。7.根據(jù)SEQIDNo.7的分離的核酸序列。8.含有SEQIDNos.1，2，3，4，5，6或7的核酸序列的啟動子。9.含有與結構基因可操作相連的啟動子的基因構建體，所述啟動子含有SEQIDNos.1，2，3，4，5，6或7的核酸序列。10.權利要求9的基因構建體，其中所述結構基因編碼碳酸酐酶。11.權利要求9的基因構建體，其中所述碳酸酐酶是人碳酸酐酶。12.權利要求9的基因構建體，其中所述結構基因編碼胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，生長激素釋放因子(GRF)或甲狀旁腺激素(PTH)。13.含有基因構建體的宿主細胞，所述基因構建體含有與結構基因可操作相連的啟動子，所述啟動子含有SEQIDNos.1，2，3，4，5，6或7的核苷酸序列。14.權利要求13的宿主細胞，其中所述宿主細胞是原核細胞。15.權利要求14的宿主細胞，其中所述原核細胞是大腸桿菌。16.權利要求14的宿主細胞，其中所述大腸桿菌包括HB101，JM109，BL21或HMS174。17.生產(chǎn)蛋白質(zhì)組分的方法，所述方法包括用核酸序列轉化宿主細胞，所述基因構建體含有與異源DNA序列可操作相連的啟動子，所述啟動子含有SEQIDNos.1，2，3，4，5，6或7的核苷酸序列；和在宿主細胞中表達異源DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)組分。18.生產(chǎn)蛋白質(zhì)組分的方法，所述方法包括在宿主細胞中表達核酸序列，其中所述表達受與異源核酸序列可操作相連的啟動子驅動，所述啟動子含有SEQIDNos.1，2，3，4，5，6或7的核苷酸序列。19.核酸序列，它含有含有SEQIDNo.1，2，3，4，5，6或7所示核酸序列的啟動子；lac操縱基因；和結構基因；其中啟動子，操縱基因和結構基因可操作地相連。20.權利要求1的核酸序列，其中啟動子含有SEQIDNo.15所示的核酸序列。21.含有SEQIDNo.1，2，3，4，5，6或7所示核酸序列的誘導型啟動子。22.含有與lac操縱基因可操作相連的SEQIDNo.1，2，3，4，5，6或7所示核酸序列的誘導型啟動子。23.權利要求22的誘導型啟動子，它含有SEQIDNo.15所示的核酸序列和lac操縱基因。24.含有權利要求22的誘導型啟動子的宿主細胞。25.權利要求24的宿主細胞，其中宿主細胞是植物細胞。26.權利要求24的宿主細胞，其中宿主細胞是原核細胞。27.權利要求24的宿主細胞，其中宿主細胞是大腸桿菌細胞。28.核酸序列，它含有小球藻啟動子；lac操縱子；和結構基因，其中啟動子，操縱子和結構基因可操作地相連。29.權利要求28的核酸序列，其中結構基因含有編碼胰高血糖素樣肽1，生長激素釋放因子，甲狀旁腺激素，碳酸酐酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉移酶或谷胱甘肽乙酰轉移酶的核酸序列。30.在其基因組中攜有權利要求28的核酸序列的植物。31.在其基因組中攜有權利要求22的誘導型啟動子的植物。32.在宿主細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括下列步驟用含有小球藻啟動子、lac操縱基因和編碼蛋白質(zhì)的結構基因的核酸序列轉化宿主細胞；和在足以使結構基因表達為蛋白質(zhì)的條件下保溫經(jīng)轉化的細胞。33.權利要求32的方法，其中所述經(jīng)轉化的細胞在21至37℃的溫度范圍內(nèi)保溫。34.權利要求33的方法，其中所述經(jīng)轉化的細胞在低于37℃的溫度下保溫。35.權利要求32的方法，其中所述經(jīng)轉化的細胞在21至30℃的溫度范圍內(nèi)保溫。36.權利要求28的啟動子，該啟動子在21至37℃的溫度范圍內(nèi)起作用。37.權利要求36的啟動子，該啟動子在低于37℃的溫度下起作用。全文摘要本發(fā)明提供了得自小球藻病毒的新的啟動子序列。本發(fā)明包括含有本發(fā)明啟動子序列的基因構建體,所述啟動子序列與編碼結構基因的DNA序列可操作地相連。本發(fā)明還提供了表達由本發(fā)明基因構建體中的結構基因編碼的產(chǎn)物的載體和宿主細胞以及被與啟動子可操作相連的異源基因轉化的細胞。文檔編號C12N5/10GK1260831SQ98803491公開日2000年7月19日申請日期1998年3月21日優(yōu)先權日1997年3月21日發(fā)明者夏遠南申請人:柏內(nèi)布拉斯加公司