專利名稱：用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物控制昆蟲的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲控制。
背景技術(shù)：
在第二次世界大戰(zhàn)之后推廣的合成有機(jī)殺蟲劑為人類帶來了不可估量的好處并產(chǎn)生了巨大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)利益。DDT的推廣應(yīng)用導(dǎo)致了諸如傳瘧蚊的嚴(yán)重公害害蟲被從所有國家清除。DDT、其它有機(jī)氯、以及隨后有機(jī)磷和氨基甲酸酯材料的使用被積極應(yīng)用于控制方案，盡管有時會對單一的害蟲控制方法提出警告。
新型殺蟲劑的開發(fā)和用于昆蟲控制的殺蟲劑數(shù)量的增加與害蟲對農(nóng)藥的耐藥性的形成相關(guān)。自從DDT在1948年應(yīng)用以來，抗殺蟲劑的物種的數(shù)量已大大增加了。其結(jié)果是，到了80年代有關(guān)節(jié)肢害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性的報導(dǎo)數(shù)量已達(dá)到281例，植物病原體67例，雜草病原體17例。因此，需要生物學(xué)控制劑，特別重要的是具有較寬基礎(chǔ)活性的控制劑。
本發(fā)明涉及克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在植物上控制昆蟲的方法。該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物或植物種子，處理條件為能有效控制所述植物或由所述植物種子產(chǎn)生的植物上的昆蟲。
為了控制所述植物或由所述植物種子產(chǎn)生的植物上的昆蟲，可以使用轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，以代替將一種過敏性反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加在植物或植物種子上的做法。在使用轉(zhuǎn)基因植物時，該方法包括提供一種用編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物，并在能由所述DNA分子控制昆蟲的條件下生長所述植物?；蛘?，提供一種用編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物種子并播種到土壤中，并在能有效控制昆蟲的條件下由所播種的種子繁殖植株。
本發(fā)明涉及在植物上實施任何形式的昆蟲控制。例如，本發(fā)明的昆蟲控制包括防止昆蟲接觸施加過過敏性反應(yīng)誘導(dǎo)物的植物，防止由進(jìn)食損傷對植株的直接昆蟲損害，導(dǎo)致昆蟲離開這些植株，殺死接近這些植株的昆蟲，干擾食用這些植株的昆蟲幼蟲，防止昆蟲在宿主植株上定居，防止定居的昆蟲釋放植物毒素等。本發(fā)明還能防止因昆蟲感染對植株造成的后繼病害。
結(jié)果，本發(fā)明為種植者提供了巨大的經(jīng)濟(jì)利益。
附圖簡述

圖1是例4的大田研究小區(qū)。
圖2表示由歐洲玉米鉆心蟲導(dǎo)致的細(xì)菌軟腐病使對照、Kocid、Kocid+Maneb、和過敏性反應(yīng)誘導(dǎo)物(“harpin”)處理損失的胡椒果實平均數(shù)。
圖3表示由歐洲玉米鉆心蟲導(dǎo)致的對照、Kocid、Kocid+Maneb、和過敏性反應(yīng)誘導(dǎo)物(“harpin”)處理損傷的胡椒果實(所有大小)平均數(shù)。
圖4表示由歐洲玉米鉆心蟲導(dǎo)致的對照、Kocid、Kocid+Maneb、和過敏性反應(yīng)誘導(dǎo)物(“harpin”)處理損傷的大型胡椒果實平均數(shù)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種植物昆蟲控制方法。該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物或植物種子的全部或部分，處理條件為能控制植物或由所述植物種子長成的植株上的昆蟲。另外，可將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或多肽施加在植物上，以便從這些植物上收獲的種子本身能有效控制昆蟲。
為了控制植物或由所述植物種子長成的植株上的昆蟲，可以使用轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，以代替將一種過敏性反應(yīng)多肽或蛋白施加在植物或植物種子上的做法。在使用轉(zhuǎn)基因植物時，該方法包括提供一種用編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物，并在使所述DNA分子能有效控制昆蟲的條件下生長所述植物?；蛘咛峁┮环N用編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物種子并將其播種到土壤中。然后在使所述DNA分子能有效控制昆蟲的條件下由播種的種子繁殖植株。
用于本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白可相當(dāng)于源于多種真菌或細(xì)菌病原體的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。這種多肽或蛋白能夠在接觸到所述誘導(dǎo)物的植物組織中誘導(dǎo)局部壞死。多肽或蛋白誘導(dǎo)物的合適的細(xì)菌來源的例子包括歐文氏菌、假單胞菌、和黃單胞菌(例如，下列細(xì)菌解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、青枯假單胞菌(Pseudomonassolancearum)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)，或其混合物)。
過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白或多肽的真菌來源的例子是疫霉屬。疫霉屬的合適的種包括腐霉疫霉(Phytophthora pythium)、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大雄疫霉(Phytophthoramegasperma)、和柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrothora)。
本發(fā)明的將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加植物種子上的實施方案可以多種方式實現(xiàn)，包括1)施加一種提取的誘導(dǎo)多肽或蛋白；2)施加不會導(dǎo)致發(fā)病的細(xì)菌，該細(xì)菌用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過；和3)施加能導(dǎo)致某些植物種發(fā)病(但不會使施加這種細(xì)菌的植物發(fā)病)的細(xì)菌，該細(xì)菌天然含有編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。另外，可以從用本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白處理過的植物上收獲本發(fā)明的種子。
在本發(fā)明的一種實施方案中，待使用的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白可以從其相關(guān)的生物中提取，并施加到植物或植物種子上。這種提取方法是眾所周知的，可以參見以下文獻(xiàn)Arlat，M.F.Van GijsegemJ.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“通過青枯假單胞菌的Hrp途徑分泌的PopA1，一種能在特定的矮牽牛基因型中誘導(dǎo)過敏-樣反應(yīng)的蛋白”，EMBO雜志13543-553(1994)；He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，“丁香假單胞菌丁香致病變種Harpinpss一種通過Hrp途徑分泌的蛋白，它能誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)”，細(xì)胞731255-1266(1993)和Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)Harpin誘導(dǎo)物”，科學(xué)25785-88(1992)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。另外，參見待批美國專利申請流水號08/200,024和08/062,024，以上專利被收作本文的參考文獻(xiàn)。不過，優(yōu)選地，本發(fā)明提取的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是通過重組方法生產(chǎn)的，并通過以下方法純化。
在本發(fā)明的其它實施方案中，可以通過施加含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因的細(xì)菌的方法將本發(fā)明的所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到植物或植物種子上。所述細(xì)菌必須能夠分泌或輸出所述多肽或蛋白，以使所述誘導(dǎo)物能夠接觸植物或植物種子細(xì)胞。在所述實施方案中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是由所述細(xì)菌在導(dǎo)入所述種子之前或在植物中或種子上產(chǎn)生的。
在本發(fā)明施加細(xì)菌方法的一種實施方案中，所述細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，而且用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過(例如，通過重組方法轉(zhuǎn)化)。例如，可以用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化不會在植物中引起過敏反應(yīng)的大腸桿菌(E.coli)，然后將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌施加到植物上。還可將除大腸桿菌以外的細(xì)菌種用于本發(fā)明的該實施方案中。
在本發(fā)明細(xì)菌施加方法的另一種實施方案中，所述細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，并且天然含有一個編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。這些細(xì)菌的例子在上文已經(jīng)給出。不過，在該實施方案中，這些細(xì)菌被施加到不會感染由該細(xì)菌所攜帶的病害的植物或植物種子上。例如，解淀粉歐文氏菌可導(dǎo)致蘋果或梨發(fā)病，但不會導(dǎo)致番茄發(fā)病。不過，這種細(xì)菌可在番茄中引起過敏反應(yīng)。因此，按照本發(fā)明的該實施方案，可將解淀粉歐文氏菌施加到番茄植物或種子上，以促進(jìn)其生長，而又不會導(dǎo)致該種植物發(fā)病。
源于菊歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列1的氨基酸序列，其序列如下Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala
這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的分子量為34kDa，它是熱穩(wěn)定性的，其甘氨酸含量大于16％，而且基本上不含半胱氨酸。所述菊歐文氏菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是由具有相當(dāng)于序列2的核苷酸序列的DNA分子編碼的，該核苷酸序列如下CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列3的氨基酸序列，該序列如下Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的分子量為大約39kDa，其pI大約為4.3，而且，在100℃下的熱穩(wěn)定性可維持至少10分鐘。這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白基本上不含半胱氨酸。源于解淀粉歐文氏菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白在以下文獻(xiàn)中有更全面的描述Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“Harpin，由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物”科學(xué)25783-88(1992)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。編碼該多肽或蛋白的DNA分子具有相當(dāng)于序列4的核苷酸序列，該核苷酸序列如下AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT 120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG 180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG 240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG 300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA 360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA 420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 460TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288源于丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列5的氨基酸序列，該序列如下Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340這種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的分子量為大約34-35kDa。它富含甘氨酸(大約13.5％)并缺少半胱氨酸和酪氨酸。有關(guān)源于丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的更多的信息可參見以下文獻(xiàn)He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，“丁香假單胞菌丁香致病變種Harpinpss一種通過Hrp途徑分泌的蛋白，它能誘導(dǎo)植物的過敏反應(yīng)”，細(xì)胞731255-1266(1993)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。編碼源于丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的DNA分子具有相當(dāng)于序列6的核苷酸序列，該核苷酸序列如下ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020GCCTGA1026源于青枯假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列7的氨基酸序列，該序列如下Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340它是由具有相當(dāng)于序列8的核苷酸序列的DNA分子編碼，該序列如下ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA 1035有關(guān)源于青枯假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的其它信息記載在以下文獻(xiàn)中Arlat，M.F.Van Gijsegem J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“通過青枯假單胞菌的Hrp途徑分泌的PopA1，一種能在特定的矮牽牛基因型中誘導(dǎo)過敏-樣反應(yīng)的蛋白”，EMBO雜志13543-533(1994)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
源于野油菜黃單胞菌大豆病原變種的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白具有相當(dāng)于序列9的氨基酸序列，該序列如下Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25該序列是僅有源于野油菜黃單胞菌大豆病原變種的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的26個殘基的氨基末端序列。該序列與在其它野油菜黃單胞菌致病變種中所確定的菌毛亞基蛋白吻合。
源于野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(Xanthomonas campestrispv.pelargonii)的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是熱穩(wěn)定性的，對蛋白酶敏感，而且其分子量為20kDa。它包括一個具有相當(dāng)于序列10的氨基酸，該序列如下Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20提取胡蘿卜軟腐歐文氏菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的方法披露于以下文獻(xiàn)中Cui等“胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種菌株Ecc71的RsmA變體，能過量表達(dá)hrpNECC并能在煙草葉片中引起過敏反應(yīng)樣反應(yīng)”，MPMI，9(7)65-73(1996)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。該過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白披露于以下文獻(xiàn)中Ahmad等，“斯氏歐文氏菌對玉米的致病性不需要Harpin”，第8屆國際分子植物微生物交流大會，1996年7月14-19日，和Ahmad等““斯氏歐文氏菌對玉米的致病性不需要Harpin”，美國植物病理學(xué)協(xié)會年會，1996年7月27-31日，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
源于寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、隱地疫霉、樟疫霉、辣椒疫霉、大雄疫霉、和柑桔褐腐疫霉的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白披露于以下文獻(xiàn)中Kaman等，“源于疫霉屬的細(xì)胞外蛋白誘導(dǎo)物宿主專一性和對細(xì)菌和真菌植物病原體抗性的誘導(dǎo)”，分子植物-微生物交流6(1)15-25(1993)，Ricci等，“在煙草中引起壞死和獲得性抗性、源于病原真菌疫霉屬的蛋白的結(jié)構(gòu)和活性”，歐洲生物化學(xué)雜志，183555-63(1989)，Ricci等，“一種壞死誘導(dǎo)物Parasiticein的差別產(chǎn)生，和通過分離寄生疫霉在煙草中產(chǎn)生的抗性”，植物病理學(xué)，41298-307(1992)，Baillreul等，“煙草中的一種新的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物一種能引起細(xì)胞死亡、防衛(wèi)基因表達(dá)、水楊酸產(chǎn)生的真菌糖蛋白，以及系統(tǒng)獲得性抗性的導(dǎo)入”，植物雜志8(4)551-60(1995)和Bonnet等，“由誘導(dǎo)蛋白在煙草和其它植物中引起的獲得性抗性”，歐洲植物病理學(xué)雜志，102181-92(1996)，以上文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。
上述誘導(dǎo)物是示例性的。通過在能表達(dá)編碼一種誘導(dǎo)物的基因的條件下生長能引起過敏反應(yīng)的真菌或細(xì)菌可以鑒定其它誘導(dǎo)物?？梢詸z測由培養(yǎng)上清液制成的無細(xì)胞制劑的誘導(dǎo)物活性(即局部壞死)，其做法是，將所述制劑用于侵入合適的植物組織。
在本發(fā)明的方法中還可以使用上述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的片段，以及源于其它病原體的全長誘導(dǎo)物。
合適的片段可以通過幾種方法產(chǎn)生。第一種方法是通過常規(guī)分子遺傳學(xué)操作，以亞克隆基因片段的方式產(chǎn)生編碼一種已知誘導(dǎo)蛋白的基因的亞克隆。然后讓所述亞克隆以體外或體內(nèi)方式在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，以產(chǎn)生較小的蛋白或肽，可以按下文所述的方法檢測所述蛋白或肽的誘導(dǎo)物活性。
另一種方法是通過用諸如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶的蛋白酶消化全長誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生該誘導(dǎo)蛋白的片段。不同的蛋白酶可能裂解誘導(dǎo)蛋白的不同位點，這些位點是基于該誘導(dǎo)蛋白的氨基酸序列。由蛋白酶解所產(chǎn)生的某些片段可能是抗性的活性誘導(dǎo)物。
在另一種方法中，根據(jù)對所述蛋白的一級結(jié)構(gòu)的了解，可以使用PCR技術(shù)合成該誘導(dǎo)蛋白基因的片段，同時使用選擇的特殊引物組，以體現(xiàn)該蛋白的特定部分。然后將這些合成的基因克隆到合適的載體中，以便增量表達(dá)一種截短的肽或蛋白。
化學(xué)合成法也可用于制備合適的片段。所述合成方法是利用待生產(chǎn)的誘導(dǎo)物的已知氨基酸序列進(jìn)行的。另外，對全長誘導(dǎo)物進(jìn)行高溫和高壓處理可產(chǎn)生片段。然后，可以通過常規(guī)方法(例如，層析，SDS-PAGE)分離這些片段。
一種有用片段的例子是源于青枯假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的PopA1片段。參見Arlat，M.F.Van Gijsegem J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“通過青枯假單胞菌的Hrp途徑分泌的PopA1，一種能在特定的矮牽?；蛐椭姓T導(dǎo)過敏-樣反應(yīng)的蛋白”，EMBO雜志13543-53(1994)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)。就解淀粉歐文氏菌而言，舉例來說，合適的片段可以是介于并包括序列3的1號氨基酸和98號氨基酸之間的多肽和介于并包括序列3的137號氨基酸和204號氨基酸之間的多肽中的任一個或兩個。
例如，可以通過缺失或增加對該多肽的性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和疏水性有較小影響的氨基酸修飾變體。例如，可以在一種多肽的N-末端綴合一個信號(或前導(dǎo))序列，該信號序列可以在翻譯的同時或在翻譯之后指導(dǎo)該蛋白的轉(zhuǎn)移。還可以將該多肽與一個接頭序列或其它序列綴合，以方便該多肽的合成、純化或鑒定。
本發(fā)明的所述蛋白或多肽優(yōu)選通過常規(guī)技術(shù)以純化形式生產(chǎn)(其純度優(yōu)選為至少大約60％，更優(yōu)選80％)，一般，本發(fā)明的蛋白或多肽是在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的，而不是分泌到該培養(yǎng)基中的。或者，本發(fā)明的所述蛋白或多肽是分泌到該培養(yǎng)基中的。就非分泌性蛋白而言，為了提取該蛋白，繁殖帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌等宿主細(xì)胞，通過超聲、加熱、或化學(xué)處理進(jìn)行裂解，并對勻漿物進(jìn)行離心，以除去細(xì)菌碎片。然后對其上清液進(jìn)行加熱處理，并通過離心分離所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白。對含有本發(fā)明多肽或蛋白的上清液級分進(jìn)行凝膠過濾，以分離所述蛋白，所述過濾是在合適尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中進(jìn)行的。如果必要，可以通過離子交換或HPLC對該蛋白級分作進(jìn)一步的純化。
可以用常規(guī)重組DNA技術(shù)將編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子整合到細(xì)胞中。一般，該方法包括將所述DNA分子插入一種表達(dá)系統(tǒng)中，該DNA分子對該系統(tǒng)而言是異源的(即正常情況下不存在的)。所述異源DNA分子是以正確的有義取向和正確的讀框插入所述表達(dá)系統(tǒng)或載體中。該載體具有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入的蛋白編碼序列所必需的因子。
美國專利US4,237,224(該專利被授予Cohen和Doyer，被收作本文的參考文獻(xiàn))披露了重組質(zhì)粒形式的所述表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)方法，該方法使用了限制酶裂解和用DNA連接酶進(jìn)行的連接。然后通過轉(zhuǎn)化的方法將這些重組質(zhì)粒導(dǎo)入單細(xì)胞培養(yǎng)物并進(jìn)行復(fù)制，所述單細(xì)胞培養(yǎng)物包括生長于組織培養(yǎng)物中的原核生物和真核細(xì)胞。
還可將重組基因?qū)胫T如痘苗病毒的病毒中?？梢酝ㄟ^將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到感染了病毒的細(xì)胞之中以制備重組病毒。
合適的載體包括，但不限于以下病毒載體，如λ載體系統(tǒng)gt11、gt WES.tB、Charon4，和質(zhì)粒載體，如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(參見由Stratagene提供的“Stratagene克隆系統(tǒng)”產(chǎn)品目錄(1993)，La Jolla，Calif，該資料被收作本文的參考文獻(xiàn))、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見F.W.Studier等，“用T7RNA聚合酶指導(dǎo)克隆基因的表達(dá)”，基因表達(dá)技術(shù)185卷(1990)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn))，以及它們的一切衍生物?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化，特別是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)移或電穿孔將重組分子導(dǎo)入細(xì)胞。用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法將DNA序列克隆到所述載體中，如由Sambrook所披露的方法，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)，該書被收作本文的參考文獻(xiàn)。
可以利用多種宿主-載體系統(tǒng)來表達(dá)所述蛋白編碼序列。首先，所述載體系統(tǒng)必需與所使用的宿主細(xì)胞相容。宿主-載體系統(tǒng)包括，但不限于以下系統(tǒng)用細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌；微生物，如含有酵母載體的酵母；感染過病毒(例如，痘苗病毒，腺病毒等)的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；感染過病毒(例如桿狀病毒)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；以及由細(xì)菌感染的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá)因子在其強(qiáng)度和專一性方面有所不同。根據(jù)所使用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯因子中的任一種。
由不同的遺傳信號和加工過程控制著多種水平的基因表達(dá)(例如，DNA轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)翻譯)。
DNA的轉(zhuǎn)錄取決于一個啟動子的存在，啟動子是一種DNA序列，由它引導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合，因此能促進(jìn)mRNA的合成。真核啟動子的DNA序列有別于原核啟動子的DNA序列。并且，在原核系統(tǒng)中，真核啟動子及相關(guān)的遺傳信號不能被識別或不能起作用，而且，在真核細(xì)胞中，原核啟動子也不能被識別和不能起作用。
類似地，mRNA在原核細(xì)胞中的翻譯取決于正確原核信號的出現(xiàn)，該信號有別于真核細(xì)胞中的信號。mRNA在原核細(xì)胞中的有效翻譯需要mRNA上的一個核糖體結(jié)合位點，該位點被稱作Shine-Dalgarno(“DS”)序列。該序列是一個短的mRNA核甘酸序列，它位于起始密碼子(通常為AUG，由它編碼該蛋白的氨基末端甲硫氨酸)之前。所述SD序列互補(bǔ)于16S rRNA(核糖體RNA)的3’-末端，并有可能與所述rRNA形成雙鏈體的形式促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合，使該核糖體能正確定位。為了了解增大基因表達(dá)的方法，可以參見Roderts和Lauer的著述，酶學(xué)方法，68473(1979)，該文獻(xiàn)收作本文的參考文獻(xiàn)。
啟動子在其“強(qiáng)度”(即其促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力)方面不同。為了表達(dá)一個克隆的基因，需要使用強(qiáng)啟動子，以便獲得高水平的轉(zhuǎn)錄，并因此獲得該基因的高水平表達(dá)。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用多種合適啟動子中的任一種。例如，當(dāng)克隆到大腸桿菌、其細(xì)菌噬菌體或質(zhì)粒中時可以使用諸如T7噬菌體啟動子、lac啟動子、trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、大腸桿菌噬菌體λ的PR和PL啟動子和其它啟動子，包括，但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等用于指導(dǎo)相鄰DNA片段的高水平轉(zhuǎn)錄。另外，可以用雜合trp-1acUV5(tac)啟動子或通過重組DNA或其它合成DNA技術(shù)生產(chǎn)的其它大腸桿菌啟動子進(jìn)行插入基因的轉(zhuǎn)錄。
可以選擇細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株和表達(dá)載體，使其能抑制所述啟動子的作用，除非受到特別地誘導(dǎo)。在某些操作中，為了有效轉(zhuǎn)錄所插入的DNA，必需添加特殊的誘導(dǎo)物。例如，lac操縱子是通過添加乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)的。諸如trp、pro等的多種其它操縱子受到不同的控制。
為了在原核細(xì)胞中進(jìn)行有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，還需要特殊的起始信號。這些轉(zhuǎn)錄和翻譯起始信號在“強(qiáng)度”方面有所不同，這種不同分別體現(xiàn)在基因特異性mRNA和合成的蛋白的量的不同上。含有一個啟動子的DNA表達(dá)載體，還可以含有各種“強(qiáng)的”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號的任意組合。例如，在大腸桿菌中進(jìn)行的有效翻譯，需要位于起始密碼子(ATG)5’末端大約7-9堿基的SD序列，以提供一個核糖體結(jié)合位點。因此，能被宿主細(xì)胞核糖體利用的一切SD-ATG組合均可以使用。所述組合包括但不限于源于大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因，或源于大腸桿菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG組合。另外，通過重組DNA或其它技術(shù)生產(chǎn)的任何SD-ATG組合均可以使用，所述技術(shù)包括整合合成的核甘酸。
一旦將提取到的編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子克隆到一種表達(dá)系統(tǒng)中，即可將其整合到宿主細(xì)胞中。這種整合可以通過上述各種形式的轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)，所采用的轉(zhuǎn)化方法取決于載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)。合適的宿主細(xì)胞包括，但不限于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲、和植物等。
可將本發(fā)明的方法用于處理多種植物或其種子，以控制昆蟲。合適的植物包括雙子葉和單子葉植物。更具體地講，有用的作物類植物可以包括苜蓿、稻、小麥、大麥、黑麥、棉、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。合適的觀賞植物的例子有擬南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
本發(fā)明能有效地抗多種昆蟲。為了實現(xiàn)本發(fā)明，昆蟲(節(jié)肢門、昆蟲綱)還包括軟體動物門(蝸牛和蛞蝓，其代表為大蛞蝓、帶狀蛞蝓、沼澤蛞蝓、和庭院灰蛞蝓)，蛛形綱(螨)，和線蟲門(蛔蟲或線蟲)。所述害蟲中某一些的宿主范圍是很廣的。例如，歐洲玉米鉆心蟲是玉米(馬齒玉米和甜玉米)的主要害蟲，但它還可以食用超過200種以上的植物種，包括綠莢菜豆、黃莢菜豆、和利馬菜豆，并且食用大豆、胡椒、馬鈴薯、和番茄，加上許多雜草物種。其他昆蟲幼蟲和成年進(jìn)食害蟲可以食用并破壞多種蔬菜以及小型水果，包括以下物種蔬菜--玉米種蠅、稻粘蟲、苜蓿葉蟬、翠菊葉蟬、甜菜粘蟲、甘藍(lán)尺蠖、甘藍(lán)根蛆、科羅拉多馬鈴薯甲蟲、棉鈴蟲、棉花或甜瓜蚜蟲、菜蛾、草地夜蛾、跳甲(各種成年物種食用甘藍(lán)、芥菜、及其他十字花科植物、黃瓜、茄子、煙草、馬鈴薯、甜瓜、和菠菜)，綠色桃蚜、洋蔥蠅、洋蔥薊馬、胡椒蠅、泡菜蟲(甜瓜野螟)、馬鈴薯葉蟬、馬鈴薯莖鉆心蟲、馬鈴薯和玉米莖桿鉆心蟲、南美食葉殼蟲、斑點黃瓜甲蟲、北方和西方玉米根蟲、薊馬、牧草盲蝽、煙草蚜蟲、番茄蟯蟲、番茄螻蛄、和根部蟲癭線蟲；小型水果--牧場沫蟬、草莓象甲、草莓食根象甲、牧草盲蝽、和草莓螨；葡萄--葡萄小卷蛾、葡萄癭象甲、climbing cutworms、葡萄斑葉蟬(三個種)、grape cancgirdler。這一類型的所有昆蟲以及同類物種代表了蔬菜、小型水果、和世界范圍內(nèi)的葡萄生產(chǎn)上的大部分在經(jīng)濟(jì)上有重要意義的害蟲類型。
本發(fā)明的方法包括施加所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白，這一目的可以通過多種方法實現(xiàn)，對植物的全部或部分進(jìn)行處理，包括葉、莖、根等。所述方法可以包括但(不限于)將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白滲入所述植物。合適的施加方法包括高壓或低壓噴霧、注射、噴粉、和在臨近施加誘導(dǎo)物時進(jìn)行葉片摩擦。在根據(jù)本發(fā)明的施加實施方案處理植物種子時，可以通過高壓或低壓噴霧、浸泡、噴粉、包衣、和注射施加所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以設(shè)計出其它合適的施加方法，只要這些方法能夠?qū)崿F(xiàn)所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白與植物或植物種子的接觸即可。一旦用本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物作過處理，即可將所述種子種植到天然或人工土壤中并用常規(guī)方法載培以產(chǎn)生植株。在由本發(fā)明處理過的種子繁殖出植株之后，可以通過一次或幾次施加所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白對該植株進(jìn)行處理，以控制該植株上的昆蟲。這些繁殖的植株，反過來又可用于生產(chǎn)種子或繁殖體(例如插穗)，由這些種子或繁殖體生產(chǎn)的植株能控制昆蟲。
根據(jù)本發(fā)明，可將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白單獨(dú)或以與其它材料混合的形式施加到植物或植物種子上?；蛘咚鲞^敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白與其它材料可在不同時間分別施加到植物或植物種子上根據(jù)本發(fā)明的一種實施方案，本發(fā)明的一種適于處理植物或植物種子的組合物含有一種包含在一種載體中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。合適的載體包括水、水溶液、糊劑、或干粉。在該實施方案中，所述組合物含有高于500nM的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
盡管不是必需，該組合物可以含有其它添加劑，包括肥料、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、除草劑、及其混合物。合適的肥料包括硝酸銨。合適的殺昆蟲劑的一個例子是馬拉硫磷。有用的殺真菌劑包括克菌丹。
其它合適的添加劑包括緩沖劑、濕潤劑、包衣劑、和摩擦劑?？梢杂眠@些材料協(xié)助本發(fā)明的方法。另外，可以與包括粘土和多糖在內(nèi)的其它常見種子制備和處理材料一起將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到植物種子上。
在涉及使用轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子的本發(fā)明的其它實施方案中，無須將過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到所述植物和種子表面上。相反，用編碼一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物，是用本領(lǐng)域眾所周知的方法生產(chǎn)的，如biolistics或農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在上文中披露了合適過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白及其編碼DNA的核甘酸序列的例子。一旦生產(chǎn)出這種類型的轉(zhuǎn)基因植物，即可用常規(guī)方法載培所述植物本身，這種植物具有編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的基因，從而導(dǎo)致對該植物上昆蟲的控制。另外，可以從所述轉(zhuǎn)基因植物上回收到轉(zhuǎn)基因種子。然后可以用常規(guī)方法將這些種子播種到土壤中并進(jìn)行培育，以生成植株。在能有效控制昆蟲的條件下，由所播種的轉(zhuǎn)基因種子繁殖所述轉(zhuǎn)基因植物。盡管不希望受任何理論的約束，這種生長加強(qiáng)作用可能是由RNA介導(dǎo)的或者由所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的表達(dá)而產(chǎn)生。
當(dāng)把轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物種子用于本發(fā)明時，可以用相同的材料(如上文所述)同處理上述植物和種子一樣對其進(jìn)行進(jìn)一步處理，以便將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到所述植物和種子上?？梢酝ㄟ^上述包括高壓或低壓噴霧、注射、包衣、噴粉和浸泡在內(nèi)的方法將所述包括過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物在內(nèi)的其它材料施加到所述轉(zhuǎn)基因植物和植物種子上。類似地，在由所述轉(zhuǎn)基因植物種子繁殖出植物之后，可以通過一次或幾次施加所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物，以便控制昆蟲。還可以用常見的植物處理劑(例如，殺昆蟲劑、肥料等)處理所述植物?？蓪⒈景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物用于生產(chǎn)種子或繁殖體(例如，插穗)，由所述種子或繁殖體能生長出昆蟲控制植株。
實施例例1-控制蚜蟲由定居或受害煙草上的傳播用濃度為20μM/ml的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物浸潤煙草植株的2-3個下部葉片(在第4位)。將用5mM磷酸鉀緩沖液浸潤的另一個煙草植株用作對照。然后將這兩個植株上的所有可見的蚜蟲殺死。將以上兩個植株放置在實驗室工作臺上，在夜間給予光照。在用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物浸潤5天之后，將一個嚴(yán)重感染蚜蟲的煙草植株由溫室轉(zhuǎn)移到所述實驗室工作臺。將該蚜蟲感染過的植株放置在所述用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株和用緩沖液浸潤的植株之間并使其接近這兩個植株，讓許多未感染過的植株的葉片與感染過的植株的葉片重疊，以方便蚜蟲由感染過的植株上遷移。每天一次統(tǒng)計過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物和緩沖液處理過的植株上的蚜蟲數(shù)量，共統(tǒng)計大約10天。結(jié)果如表1所示。
表1-Harpin誘導(dǎo)的煙草對蚜蟲感染的抗性<
HHarpin誘導(dǎo)過的植株C對照植株從以上結(jié)果可以看出，用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于用緩沖液處理過的植株的蚜蟲，這表明蚜蟲不愿意定居在用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株上。即使是在用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株上，在其下部的三個葉片上也存在大量的蚜蟲。因為過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的浸潤始于第四葉片，這表明由過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物產(chǎn)生的昆蟲抗性信號僅能夠有效地向上傳送到煙草植株的頂部。
還觀察到蚜蟲在遷移到過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株上之后兩天死亡。例2-蚜蟲在過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的煙草植株上的定居通過例1發(fā)現(xiàn)，在用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的煙草葉片上有許多死去的蚜蟲。為了進(jìn)一步證實這一發(fā)現(xiàn)，將蚜蟲人工接種到用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的煙草植株上。每天一次統(tǒng)計存活和死去蚜蟲的數(shù)量，共進(jìn)行四天。
過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理和蚜蟲接種用濃度為20μM/ml的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物浸潤煙草植株的2個下部葉片。24小時之后觀察組織壞死。在用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物浸潤7天之后將蚜蟲由受到侵害(或定居)的植株轉(zhuǎn)移到所述用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株的三個上部葉片上。
表2歸納了該實施例的結(jié)果。該表表明，兩天之后，大多數(shù)接種的蚜蟲死亡，而某些蚜蟲離開所述用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的植株；不過，在對照植株上的接種蚜蟲的數(shù)量大體上保持不變。表2-對照植株和Harpin處理過的煙草植株上的定居蚜蟲的數(shù)量
表中數(shù)字是活蚜蟲數(shù)HHarpin誘導(dǎo)過的植株C對照植株例3-由Harpin-浸泡過的種子產(chǎn)生的煙草幼苗抗蚜蟲感染將大約80粒煙草種子(Nicotiana tabacum L.‘Xanthi’)放在Harpin溶液中(大約25μg/ml的5mM磷酸鉀緩沖液，pH6.5)浸泡大約16小時。然后將Harpin浸泡過的種子播種到裝有人工土壤的6英寸花盆中。將用不含Harpin的5mM磷酸鉀緩沖液進(jìn)行相同處理用作對照。將所述花盆放在生長箱中在25℃的溫度下培養(yǎng)，日照時間為14小時。在播種之后20天，用Harpin處理過的煙草幼苗的大小，明顯大于對照植株的大小。在播種之后28天，將每一種處理的20個幼苗移植到8英寸的花盆中。將所述幼苗放在生長室中在大約23℃的溫度下培養(yǎng)，采用14小時的日照。在移植所述幼苗時，在對照煙草幼苗上觀察到了蚜蟲的感染，但在Harpin處理過的幼苗上未發(fā)現(xiàn)蚜蟲感染。蚜蟲感染的來源是處于相同生長箱中的預(yù)先感染過的成體煙草植株。在所述生長室中，將7個預(yù)先定居過的成體煙草植株放置在待測試的幼苗周圍，起到蚜蟲的天然來源的作用。在所述幼苗移植7天后，統(tǒng)計每一個煙草幼苗上的蚜蟲數(shù)量。如表3所示，20個對照植株中有17個受到了蚜蟲的感染，蚜蟲的數(shù)量在1-13個之間變化。然而，在20個Harpin處理過的植株中僅有2個受到蚜蟲的感染。這表明由Harpin處理過的種子產(chǎn)生的煙草植株對蚜蟲感染的抵抗力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照植株的。表3-由Harpin浸泡過的種子產(chǎn)生的煙草植株抗蚜蟲感染對照Harpin處理植株編號 蚜蟲數(shù) 植株編號 蚜蟲數(shù)1 4 1 02 2 210311 3 0411 4 05 4 5 0613 6 07 3 7 08 5 8 0911 9 010 110 011 311 012 412 013 413 014 014 015 1215 016 216 017 017 018 218 019 019 020 220 0總計 9410例4-有關(guān)過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物應(yīng)用對昆蟲控制的影響的大田研究在位于紐約州Freeville的Homer C.Thompson蔬菜研究場進(jìn)行試驗。試驗設(shè)計為具有4次重復(fù)的隨機(jī)完全區(qū)組，每一個重復(fù)有8個植株，在塑料上單行種植，植株之間的間距為22英寸。一個接種過的胡椒傳播行貫穿小區(qū)的整個長度，位于兩個處理行之間，以便提供胡椒的細(xì)菌性葉斑目標(biāo)病害的接種物(野油菜黃單胞菌起泡亞種，胡椒小種)。參見圖1，在所述胡椒試驗田的上風(fēng)，并垂直于該胡椒試驗田的過道是馬齒玉米的商業(yè)化生產(chǎn)大田，該大田能在相應(yīng)季節(jié)提供歐洲玉米鉆心蟲的天然來源。之所以選擇胡椒品種“Jupiter”，是因為它很容易感染細(xì)菌性葉斑病。在第0天將胡椒幼苗移植到所述大田中。通過兩種方式將細(xì)菌接種物導(dǎo)入所述小區(qū)。在第26天將預(yù)先感染過的Jupiter幼苗移植到傳播行中，并在第38天用野油菜黃單胞菌起泡亞種胡椒小種再次接種該傳播行，以便對每一側(cè)的胡椒行產(chǎn)生更大的發(fā)病壓力。
第1次施加過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物或Harpin是在第23天進(jìn)行的，先于將任何接種物引入或擴(kuò)散之前。總共試驗了4種處理(1)噴水對照；(2)3lb/A的Kocide；(3)1lb的Kocide+1.2qt/A的Manex殺真菌劑；和(4)Harpin。銅殺真菌劑Kocide和Kocide+Manex(maneb)殺真菌劑是被推薦用于胡椒的細(xì)菌性葉斑病控制的標(biāo)準(zhǔn)材料。Kocide是由Griffin公司(Valdosta，GA)生產(chǎn)的，而Manex是由Crystal Chemical Inter-Americal(Houston，TX)生產(chǎn)的。所有處理都是用以二氧化碳加壓的寬幅噴霧機(jī)以大約40psi的壓力噴施的，通過4個TeeJet XR11003扇形霧錐噴嘴以21.5gal/A的用量噴施，噴嘴間距20英寸。這樣能產(chǎn)生良好的葉面覆蓋。在最初的Harpin處理之后，所有處理都是每周施加1次，直到試驗結(jié)束。不施加其他的殺蟲劑，包括殺昆蟲劑。試驗植株上首次出現(xiàn)病害是在第54天。在第61天和第97天兩次收獲胡椒。數(shù)據(jù)采集包括每個處理的發(fā)病率(即感染細(xì)菌性葉斑病的植株數(shù)量)，分類(大、中、小、和不明顯)采收的果實的總數(shù)和重量，以蟲糞形式體現(xiàn)的表現(xiàn)歐洲玉米鉆心蟲損害的果實的總數(shù)或由于細(xì)菌性軟腐病胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種造成的果實破壞而導(dǎo)致的不能收獲的果實的總數(shù)。在大約第50天的時候，歐洲玉米鉆心蟲的作用開始顯現(xiàn)。因此，在第57天和第97天的收獲物中記錄所有處理的軟腐病的數(shù)量。類似地，很明顯，在第57天的收獲物上，還可以通過胡椒果實上的幼蟲進(jìn)食(即蟲糞)評價歐洲玉米鉆心蟲的破壞作用。歐洲玉米鉆心蟲以最后的幼蟲齡期越冬，而在春天幼蟲化蛹。在五月底至六月初由多代品系產(chǎn)生成蟲，并在八月再次產(chǎn)生成蟲。如果存在單一世代品系，則成蟲的出現(xiàn)將在七月達(dá)到高峰。不過，在東北部的某些大田中，可同時出現(xiàn)單一和多代品系。雌性蛾飛到易感作物中產(chǎn)卵，每一只雌蟲在其生命周期中可以產(chǎn)下高達(dá)500枚的卵。在孵化以后，小的鉆心蟲爬到保護(hù)區(qū)的植株上，當(dāng)所述植株是胡椒時，其采食部位是將莢果連接在莖桿上的花萼。然后這些鉆心蟲鉆入莢果，使細(xì)菌進(jìn)入莢果并在莢果里的潮濕環(huán)境中迅速繁殖。細(xì)菌性軟腐病可以用幾天的時間破壞莢果。在第2次收獲時記錄處理之間的歐洲玉米鉆心蟲破壞和感染的差別。對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并通過方差的單向分析確定顯著性。
在整個小區(qū)中出現(xiàn)了細(xì)菌性葉斑病葉面感染，但發(fā)病程度沒有顯著的差別。在第97天進(jìn)行最后的發(fā)病評級。Harpin處理所產(chǎn)生的控制相當(dāng)于Kocide或Kocide+Manex商業(yè)化處理的控制效果，而且，所有的控制效果均好于噴水對照。記錄第97天所述植株上腐爛的、歐洲玉米鉆心蟲(ECB)損傷的果實的數(shù)量；這些果實因為縮水而無法采收。Harpin處理過的小區(qū)具有較少的腐爛胡椒莢果，盡管與其他處理相比沒有顯著差別(P＝0.229)，但由噴灑Harpin所產(chǎn)生的保護(hù)程度是顯著的(參見圖2)，由歐洲玉米鉆心蟲采食導(dǎo)致的損害程度的另一個表現(xiàn)是，出現(xiàn)采食損傷或蟲糞的果實的數(shù)量，與所有其他處理相比(參見圖3)，用Harpin處理過的果實在所有果實大小中具有明顯較低的果實損傷(P＝0.076)。在噴灑Harpin時(參見圖4)受到鉆心蟲損害的大型果實的數(shù)量明顯減少(P＝0.048)。
用Harpin減弱由歐洲玉米鉆心蟲造成的損害的優(yōu)點體現(xiàn)在兩個方面。首先，當(dāng)每周一次噴灑Harpin時，會導(dǎo)致大田中果實損失的細(xì)菌性軟腐病明顯減少。其次，在Harpin處理過的小區(qū)中與鉆心蟲采食(即蟲糞)有關(guān)的果實的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于所有其他處理中的數(shù)量。Harpin處理對經(jīng)濟(jì)因素的最大影響在于，在所有大小類型的果實中都具有較大的未受損害的果實的產(chǎn)量，以及較高產(chǎn)量的健康大型果實，這種果實能賣出好價錢。例5-通過在棉花上葉面噴施HP-1000TM過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物控制蚜蟲。
棉蚜蟲(Aphis gossypii)會留下“蜜露”沉積物，該沉積物會污染皮棉，并降低作物價值。用一個田間試驗測定源于解淀粉歐文氏菌的HP-1000TM過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物(Eden Bioscience公司，Bothell，Wash)對棉花(品種Acala)的影響，所述棉花播種在以隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計的重復(fù)(4X)的小區(qū)(3.2×25英尺)中，處理為20、60、和80μg/ml(a.i.)的HP-1000TM和8oz./ac.的化學(xué)殺昆蟲劑Asana XL(杜邦農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，Wilmington，DE)。在子葉至3片真葉期開始用背負(fù)式噴霧器進(jìn)行葉面噴施處理，然后以14天的間隔進(jìn)行處理。在所述第1次處理(DAT1)之后，第14、28、35、和42天即將噴施之前統(tǒng)計蚜蟲數(shù)量。在前3個采樣日中從每個小區(qū)中采集隨機(jī)選擇的25個葉片，在最后一個采樣日中每個小區(qū)采集10個葉片。
在14DAT1(即第14天)，所有處理的蚜蟲數(shù)量都比較低，但是，在28DAT1(進(jìn)行了兩次噴霧)(即第28天)，在Asana XL處理的小區(qū)中每個葉片上的蚜蟲數(shù)量明顯高于HP-1000TM處理過的小區(qū)中的數(shù)量(表4)。在35DAT1(進(jìn)行了三次噴霧)(即第35天)，所有處理類型的蚜蟲數(shù)量都增加，但HP-1000TM處理的棉花的每一個葉片上的蚜蟲數(shù)量仍然顯著低于Asana XL處理的。最后，在42 DAT1(進(jìn)行了四次噴霧)(即第42天)，每一個葉片上的蚜蟲數(shù)量增加到有可能破壞包括化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)殺昆蟲劑處理在內(nèi)的所有處理的程度，此時，對所有的小區(qū)噴施Pravado殺蚜蟲劑(Bayer公司，農(nóng)業(yè)分部，堪薩斯市，MO)，以便從所有處理中根除蚜蟲，并將試驗繼續(xù)到作物收獲期。
以上數(shù)據(jù)表明，用HP-1000TM處理過的棉花可阻止輕度至中度蚜蟲壓力，而且這一效果明顯好于標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)殺昆蟲劑Asana XL效果。表4-在用Asana XL或HP-1000TM處理之后棉花上每個葉片上的蚜蟲數(shù)量
1帶有不同字母的平均數(shù)按照Duncan’s MRT是顯著不同的，P＝0.05。2Asana XL用量是指制備的產(chǎn)品量，HP-1000TM用量是指活性成分量(a.i.)。例6-通過對棉花葉面噴施HP-1000TM控制土格斯坦紅葉螨。
螨能引起棉花的葉片損傷，因而降低潛在的作物產(chǎn)量。為了評價HP-1000TM對螨的潛在控制作用，將棉花播種到隨機(jī)完全區(qū)組大田試驗中的重復(fù)的(4X)田間小區(qū)(3.2×25英尺)中。處理包括20、60、和80μg/ml的HP-1000TM，和6oz./ac.的用于殺螨的化學(xué)殺昆蟲劑Zephyr(Novartis，Greensboro，NC)。HP-1000TM處理用背負(fù)式噴霧器以14天為間隔噴施，噴施始于作物的3片真葉期。在第1次噴施HP-1000TM的同一天噴施一次Zephyr。在即將進(jìn)行第1次噴施之前對土格斯坦紅葉螨(Tetranychus turkestani)進(jìn)行處理前評價，并在第1次處理(DAT1)之后，在第4、7、14、和28天再次評價。
通過從每一個小區(qū)中采集25個隨機(jī)挑選的棉花葉片確定螨蟲群體。用刷螨機(jī)刷所有的葉片，并將刷下來的螨蟲均勻分布在旋轉(zhuǎn)的玻璃板上，所述玻璃板用濕潤劑預(yù)處理過，使螨蟲粘著在濕潤劑上。在30倍雙目顯微鏡下統(tǒng)計活動成體螨蟲的數(shù)量。然后將該數(shù)字換算成每一個葉片單位。
在五個評價時間點上，每個葉片上的活的或活動成體螨蟲的數(shù)量在任何評價時間都未表現(xiàn)出顯著的處理效果(表5)。表5-在用Zephyr或HP-1000TM處理之后每個葉片上的成年活動螨蟲數(shù)
>1Zephyr用量是指制備的產(chǎn)品量，HP-1000TM用量是指活性成分量(a.i.)。
不過，使用Henderson等的方法(“用殺螨劑抗褐色小麥螨蟲的試驗”，J.Econ.Ent.48(2)卷157-61(1955)，該文獻(xiàn)被收作本文的參考文獻(xiàn)(“Henderson”))計算百分致死率，揭示了不同處理之間對螨蟲控制的差別(表6)。Henderson的方法被定義如下
其中Ta＝在處理之后統(tǒng)計的活動螨蟲的數(shù)量，Tb＝在處理之前統(tǒng)計的活動螨蟲的數(shù)量，Ca＝在對試驗小區(qū)進(jìn)行處理之后對照中的螨蟲數(shù)量，和Cb＝在對試驗小區(qū)進(jìn)行處理之前對照中的螨蟲數(shù)量。
當(dāng)在4DAT1計算百分致死率時，由HP-1000TM處理產(chǎn)生的螨蟲控制超過Zephyr處理的兩倍(表6)。在7DAT1，由HP-1000TM處理產(chǎn)生的螨蟲控制仍然顯著好于Zephyr處理的螨蟲控制。在14DAT1，由80μg/ml的HP-1000TM處理實現(xiàn)的螨蟲控制達(dá)到其最大值，略低于84％，大體上與Zephyr處理的控制效果相當(dāng)。在其余的14天里，由HP-1000TM處理實現(xiàn)的螨蟲控制傾向于相對Zephyr而言有所下降。在28DAT1，用Zephyr處理達(dá)到100％的螨蟲控制(表6)。表6-通過Henderson的方法測定的由HP-1000TM處理對棉花上活動成年螨蟲的控制。
1用Henderson的方法(1955)計算的控制百分比。2Zephyr用量是指制備的產(chǎn)品量，HP-1000TM用量是指活性成分量(a.i.)。
以上數(shù)據(jù)表明，HP-1000TM和Zephyr之間的螨蟲控制作用模式是不同的。通過用Zephyr處理進(jìn)行的完全控制直到28DAT仍未實現(xiàn)。每周用HP-1000TM進(jìn)行處理在為期28天的評價時期內(nèi)能產(chǎn)生比較“穩(wěn)定的”螨蟲控制。這表明HP-1000TM可以引起內(nèi)在的抗蟲過程，該過程從根本上不同于化學(xué)殺昆蟲劑的活性。例7-通過葉面噴施HP-1000TM減弱螻蛄在番茄上的采食活動將新購買的番茄(品種Agri-set)以12英寸的間隔種植在25英尺長的行中，所述種植行以隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計大田試驗重復(fù)5次，該病害控制試驗并非專門為評價由HP-1000TM處理產(chǎn)生的抗蟲性而設(shè)計的。在第1片真葉期開始葉面噴施20和40μg/ml的HP-1000TM，并以7天為間隔重復(fù)噴施8次。其他處理包括用標(biāo)準(zhǔn)市售殺真菌混合物(Bravo(Zeneca Ag制品，Wilmington，DE)+ManexTM+Kocide)控制細(xì)菌性枯萎病。在進(jìn)行前4次噴施之后，進(jìn)行1次大田評價，以確定由于螻蛄(Scapteriscus vicinus，scudder)采食而造成的植株損壞(環(huán)切)的數(shù)量。在表7中給出的數(shù)據(jù)表明，HP-1000TM處理的植株由螻蛄采食形成的環(huán)切明顯較少。由于病毒感染而完全喪失了作物，不可能對該試驗繼續(xù)進(jìn)行評價。表7-通過噴施HP-1000TM減弱螻蛄對番茄莖桿的環(huán)切作用。
1Bravo，Manex和Kocide用量是指制備的產(chǎn)品量，HP-1000TM用量是指活性成分量。2植株平均數(shù)是每一個重復(fù)的50個植株的平均數(shù)例8-通過葉面噴施HP-1000TM減弱粘蟲在稻上的采食活動在濃度為20μg/ml(a.i.)的HP-1000TM溶液中預(yù)浸泡稻種(品種M-202)24小時。然后將處理過的稻種播種到10×15英尺的隨機(jī)化(5X)田間小區(qū)中。還包括一個未處理的對照處理；該試驗不進(jìn)行葉面噴施。在播種后第41天所做的觀察發(fā)現(xiàn)了由于粘蟲(Spodopterapraefica)幼蟲采食而對葉片造成的顯著損害。為了對這種損害進(jìn)行定量，從HP-1000TM處理過的小區(qū)和未處理過的小區(qū)中采集100個隨機(jī)挑選的分蘗。按照以下等級對樣品進(jìn)行損害分析1＝無分蘗葉損傷2＝1個分蘗葉片具有采食損傷3＝2個分蘗葉片具有采食損傷4＝3個分蘗葉片具有采食損傷5＝4個或所有分蘗葉片具有采食損傷然后用以上分級結(jié)果分析處理的差別。在表8中給出的數(shù)據(jù)表明，用HP-1000TM處理過的稻株與UTC植株相比具有明顯較低的采食損傷。用HP-1000TM處理過的稻基本上未受到粘蟲采食的損害。表8-在用HP-1000TM進(jìn)行種子浸泡處理之后減弱了粘蟲對稻的采食。
1用量是指施加的活性成分量(a.i.)。2兩組之間中間值的差別是按照Mann-Whitney Rank Sum測驗的統(tǒng)計學(xué)差別，P＝0.0001。例9-通過葉面噴施HP-1000TM減弱了蚜蟲在煙草上的采食活動通過兩次葉面噴施HP-1000TM處理煙草幼苗，噴施濃度為15、30、和60μg/ml(a.i.)。第一次噴施是對幼苗進(jìn)行，第二次大約是在移植到重復(fù)的(3X)田間小區(qū)中42天之后進(jìn)行的。在第二次噴施之后兩天，統(tǒng)計煙草蠕蟲和蚜蟲的數(shù)量。在表9中給出的數(shù)據(jù)表明，HP-1000TM處理能顯著降低煙草蠕蟲和蚜蟲的采食活動量。表9-通過HP-1000TM處理煙草可減弱煙草蠕蟲和蚜蟲的采食活動
例10-用HP-1000TM處理過的番茄幼苗表現(xiàn)出對線蟲的抗性在平皿中萌發(fā)番茄幼苗(品種Rutgers)，并生長4周，然后移植到花盆中，每盆兩個植株，重復(fù)8次。在移植時，通過用濃度為25μg/ml的HP-1000TM浸泡根部處理幼苗。在移植之后一周，用大約10,000根部蟲癭線蟲，RKN，(Meloidogyne hapla)卵接種每一個花盆。然后，每周為根部澆灌HP-1000TM，一直持續(xù)4周。4周之后，評價每一個花盆中的一個植株的根重和蟲癭數(shù)(即線蟲寄生物在根部的感染部位)。然后通過每周葉面噴施HP-1000TM(25μg/ml a.i.)處理其余的植株4次。在所有處理都進(jìn)行過之后，評價這些植株的根重、苗重和每個植株的果實數(shù)量。在接種之后4周，HP-1000TM處理過的植株的蟲癭數(shù)略高于對照植株的，而HP-1000TM處理過的植株的苗重則明顯較高(表10)。表10-用HP-1000TM處理之后RKN-接種過的番茄的蟲癭數(shù)和苗重。
1用量是指活性成分量，a.i.。2帶有不同字母的平均數(shù)按照Duncan’s MRT是顯著不同的，P＝0.05。
這表明，盡管線蟲感染HP-1000TM處理過的植株，但通過HP-1000TM處理仍然能加強(qiáng)植株生長。在接種8周之后(再進(jìn)行4次葉面噴施HP-1000TM)HP-1000TM處理過的植株的苗重仍然顯著高于同樣接種RKN的對照植株的苗重，而HP-1000TM處理過的植株的每一個植株的平均結(jié)果數(shù)量從數(shù)字上看較高(表11)。表11-用HP-1000TM處理之后每一個RKN-接種過的番茄植株的平均苗重和平均結(jié)果數(shù)。
1用量是指活性成分量，a.i.。2帶有不同字母的平均數(shù)按照Duncan’sMRT是顯著不同的，P＝0.05。
以上結(jié)果表明，用HP-1000TM處理似乎能使番茄植株“承受”線蟲的不利影響。例11-解淀粉歐文氏菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物對黃瓜排斥南美食葉殼蟲的影響。
通過在大腸桿菌中發(fā)酵克隆在高表達(dá)載體上的基因生產(chǎn)由解淀粉歐文氏菌hrpN基因編碼的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白(“Harpin”)。將無細(xì)胞誘導(dǎo)物制劑的高壓液相層析分析用于測定其Harpin含量。用水制備處理溶液。將Harpin葉面噴施到種植在生長箱中的黃瓜植株Marketmore76，lot#1089上，評價其排斥南美食葉殼蟲(Acalymmavittatum)(Fabricius)的能力。在種子播種到溫室中21天之后(植株具有2片子葉，并且每個植株具有6-8片完全展開的葉片)，將以0、5、和10mg/l的濃度溶解在水中的源于解淀粉歐文氏菌的Harpin噴施到黃瓜植株上。將每一種濃度噴施到每一區(qū)組的三個植株上，將以上處理重復(fù)三次。在處理之后7天，用人工方法以每株4.6個成年甲蟲的密度引入甲蟲。讓昆蟲采食7天，然后評價對植株的采食損害。測定子葉數(shù)和表現(xiàn)出任何甲蟲采食損傷的葉片數(shù)。使用0-6級的分級標(biāo)準(zhǔn)(其中0＝無明顯采食；1＝＜15％的損傷；2＝＜25％的損傷；3＝＜50％的損傷；4＝＞50％的損傷；5＝＞75％的損傷；而6＝由于采食而使得葉片脫水或死亡)評價由于甲蟲采食而對子葉和葉片造成的損傷程度。
表12歸納了過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白濃度對昆蟲損害的影響。受損傷的子葉的平均百分比與Harpin的濃度呈正比，而對葉片的損傷與Harpin的濃度呈反比。表12-用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理黃瓜葉面對隨后由南美食葉殼蟲(Acalymma vittatum)[Fabricius]引起的采食損傷的影響。
1在三個區(qū)組中的每一個中的每一個處理有9個植株。用0-6級的分級標(biāo)準(zhǔn)評價損傷程度，其中0＝無采食損傷，而6＝由于食葉殼蟲過度采食而使得子葉和葉片死亡。
更多的損傷可能出現(xiàn)在下部子葉上，因為葉面噴施的大部分Harpin是針對上部葉片的，據(jù)推測，更多的Harpin活性出現(xiàn)在上部葉片上(向上的或系統(tǒng)性Harpin影響)。子葉對食葉殼蟲極具誘惑力。在用較高濃度的Harpin處理過的植株的葉片上出現(xiàn)較少的損傷。因此，處理葉片的效果隨著Harpin濃度的提高而加強(qiáng)。
Harpin的效果由于兩個原因而重要1)減弱了由于食葉殼蟲采食葫蘆科植物，特別是黃瓜、甜瓜、南瓜、和西葫蘆以及筍瓜而造成的損害，因為用Harpin處理黃瓜會使得植株變得對昆蟲采食有較小的吸引力(排他性或排斥性)和2)可能減弱由于細(xì)菌性萎蔫病造成的損害，因為這些食葉殼蟲攜帶決定所述病害的細(xì)菌。通過防止采食，可以減弱或消除決定所述病害的細(xì)菌傳播。該研究證實，Harpin可被用于減弱由食葉殼蟲采食導(dǎo)致的昆蟲損傷。因此，通過Harpin可以減少或消除使用殺昆蟲劑的次數(shù)，特別是在對昆蟲敏感的葫蘆科植物上使用的次數(shù)。
盡管出于說明的目的已對本發(fā)明作過詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解的是，這些細(xì)節(jié)僅僅是用于說明目的的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不超出本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下可對這些細(xì)節(jié)加以改變，本發(fā)明的范圍是由以下權(quán)利要求限定的。
序列表(1)一般資料(i)申請人Cornell Research Foundation，Inc.(ii)發(fā)明名稱用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物控制昆蟲(iii)序列數(shù)10(iv)聯(lián)系地址(A)收件人Nixon，Hargrave，Devans &amp; Doyle LLP(B)街道P.O.Box 1051，Clinton Square(C)城市Rochester(D)州紐約(E)國家美國(F)郵編14603(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S60/039,226(B)申請日1997年2月28日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)注冊號30,727(C)資料/文件號19603/1522(ix)電信資料(A)電話(716)263-1304(B)傳真(716)263-1600(2)序列1資料(i)序列特征(A)長度338個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列1Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala(2)序列2資料(i)序列特征(A)長度2141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列2CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T2141(2)序列3資料(i)序列特征(A)長度403個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列3Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser MetGlu Gln Phe Asn340 345350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala(2)序列4資料(i)序列特征(A)長度1288個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列4AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA 60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720CTCCTTGGCA ACGGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA 1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288(2)序列5資料(i)序列特征(A)長度341個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列5Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile ALa Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340(2)序列6資料(i)序列特征(A)長度1026個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列6ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC 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(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列7Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340(2)序列8資料(i)序列特征(A)長度1035個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列8ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA 1035(2)序列9資料(i)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列9Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25(2)序列10資料(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列10Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20
權(quán)利要求
1.一種對植物進(jìn)行昆蟲控制的方法，該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物或植物種子，處理條件為能有效控制所述植物或由所述植物種子產(chǎn)生的植物上的昆蟲。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于選自下列一組的病原體的多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬、及其混合物。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的多肽或蛋白。
4.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于解淀粉歐文氏菌(Erwinia amyloaora)的多肽或蛋白。
5.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的多肽或蛋白。
6.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于青枯假單胞菌(Pseudomonas solancearum)的多肽或蛋白。
7.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的多肽或蛋白。
8.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于一種疫霉菌。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述植物選自雙子葉和單子葉植物。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述植物選自下列一組苜蓿、稻、小麥、大麥、黑麥、棉、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
11.如權(quán)利要求9的方法，其中，所述植物選自下列一組薔薇、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
12.如權(quán)利要求1的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物，所述施加是在將要進(jìn)行所述施加時通過噴霧、注射、或葉片摩擦而實現(xiàn)的。
13.如權(quán)利要求1的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物種子，所述施加是通過噴霧、注射、包衣、噴粉或浸泡實現(xiàn)的。
14.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是以還含有一種載體的組合物形式施加到植物或植物種子上。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述載體選自下列一組水、水溶液、糊劑和干粉。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述組合物含有大于0.5nM的所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述組合物還含有選自下列一組的添加劑肥料、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、及其混合物。
18.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是提取形式的。
19.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是以細(xì)菌形式使用的，該細(xì)菌不會導(dǎo)致發(fā)病，而且是用編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化過的。
20.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白是以細(xì)菌形式使用的，該細(xì)菌會導(dǎo)致某些植物種發(fā)病，但不會使進(jìn)行所述施加的植物發(fā)病，其中含有編碼所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的基因。
21.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述施加會導(dǎo)致所述多肽或蛋白浸入所述植物。
22.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述施加能有效防止昆蟲接觸施加過所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的植物。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物。
24.如權(quán)利要求22的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物種子，所述方法還包括將用所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的種子播種到天然或人工土壤中，和由播種到土壤中的種子繁殖植株。
25.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述施加能有效導(dǎo)致昆蟲離開施加過所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的植物。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物。
27.如權(quán)利要求25的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物種子，所述方法還包括將用所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的種子播種到天然或人工土壤中，和由播種到土壤中的種子繁殖植株。
28.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述施加能有效殺死接近施加過所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的植物的昆蟲。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物。
30.如權(quán)利要求28的方法，其中，是在所述施加期間處理所述植物種子，所述方法還包括將用所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物處理過的種子播種到天然或人工土壤中，和由播種到土壤中的種子繁殖植株。
31.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述施加能有效干擾食用施加過所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的植物的昆蟲幼蟲。
32.一種對植物進(jìn)行昆蟲控制的方法，包括提供用一種編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，和在能有效控制昆蟲的條件下生長所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子產(chǎn)生的植物。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于選自下列一組的病原體的多肽或蛋白歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬、及其混合物。
34.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于菊歐文氏菌的多肽或蛋白。
35.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于解淀粉歐文氏菌的多肽或蛋白。
36.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于丁香假單胞菌的多肽或蛋白。
37.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于青枯假單胞菌的多肽或蛋白。
38.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于野油菜黃單胞菌的多肽或蛋白。
39.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白相當(dāng)于源于一種疫霉菌的多肽或蛋白。
40.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述植物選自雙子葉和單子葉植物。
41.如權(quán)利要求40的方法，其中，所述植物選自下列一組苜蓿、稻、小麥、大麥、黑麥、棉、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苦苣、甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、樹莓、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
42.如權(quán)利要求40的方法，其中，所述植物選自下列一組薔薇、非洲紫苣苔屬、矮牽牛、天竺葵屬、一品紅、菊、香石竹和百日草。
43.如權(quán)利要求32的方法，其中，提供了一種轉(zhuǎn)基因植物。
44.如權(quán)利要求32的方法，其中，提供了一種轉(zhuǎn)基因植物種子。
45.如權(quán)利要求32的方法，還包括將所述過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白施加到繁殖的植物上，以實現(xiàn)昆蟲控制。
46.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述昆蟲控制能防止昆蟲接觸植物。
47.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述昆蟲控制能導(dǎo)致昆蟲離開轉(zhuǎn)基因植物。
48.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述昆蟲控制能殺死昆蟲。
49.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述昆蟲控制能干擾食用植物的昆蟲幼蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及在植物上控制昆蟲的方法。該方法包括將一種過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以非感染形式施加于植物或植物種子,處理條件為能有效控制所述植物或由所述植物種子產(chǎn)生的植物上的昆蟲。另外,可以提供用一種編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白的DNA分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子,并在能有效控制昆蟲的條件下生長所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子產(chǎn)生的植物。
文檔編號C12N15/82GK1253471SQ98804563
公開日2000年5月17日 申請日期1998年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月28日
發(fā)明者T·A·茲特爾, Z·M·韋 申請人:康乃爾研究基金會有限公司, 伊登生物科學(xué)有限公司