專利名稱：植物的延遲衰老和逆境耐力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景技術(shù)許多高等植物在它們生命周期的某些階段會(huì)遭受至少暫時(shí)的相對(duì)水分缺失，因此，進(jìn)化了一些干燥保護(hù)機(jī)能。然而，如果水分缺失的變化狀態(tài)延長(zhǎng)，對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的影響就會(huì)很大。由于干旱，寒冷或鹽度逆境造成的水分缺失會(huì)不可恢復(fù)地?fù)p失植物細(xì)胞，限制植物生長(zhǎng)及農(nóng)業(yè)作物產(chǎn)量。
對(duì)干旱，鹽度及寒冷不利條件反應(yīng)，植物會(huì)有一些形態(tài)上和生理上的變化。盡管我們對(duì)植物對(duì)于這些逆境耐力機(jī)能了解是不完整的，但植物激素落葉酸(ABA)已被提議為環(huán)境刺激與植物反應(yīng)間的重要介質(zhì)。對(duì)水分缺失反應(yīng)，ABA含量增加，外源使用的ABA模擬許多種通常由水分缺失誘發(fā)的反應(yīng)。一旦ABA合成，它會(huì)引起葉子氣孔關(guān)閉，從而減少蒸發(fā)造成的水分損失。
對(duì)將ABA傳導(dǎo)到細(xì)胞反應(yīng)的基因的確定，開拓了利用這些調(diào)節(jié)基因增強(qiáng)農(nóng)作物物種干旱耐力的可能。一般地，這些ABA信號(hào)基因可與適當(dāng)?shù)目刂埔蜃优悸?lián)以最優(yōu)化植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。這樣，這些基因不僅僅使農(nóng)作物遺傳改性(tailoring)可抵擋暫時(shí)的環(huán)境侵害，它們還可拓寬傳統(tǒng)農(nóng)作物可生長(zhǎng)的環(huán)境。
此外，有關(guān)控制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的遺傳機(jī)理幾乎不被了解。進(jìn)一步影響其他代謝過程如植物的衰老和生長(zhǎng)習(xí)性的基因可應(yīng)用在多種農(nóng)作物和園藝植物中。
本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及編碼包括SEQ ID NO:1的法呢基轉(zhuǎn)移酶(Farnesyl Transferase)的分離的核酸。本發(fā)明包括的核酸還有編碼SEQ ID NO:1的功能等同物的雜交序列。本發(fā)明還涉及使用由這些核酸編碼的產(chǎn)品的抑制劑來(lái)增強(qiáng)植物的干旱耐力的方法。另外，本發(fā)明涉及控制光合成有機(jī)體內(nèi)的調(diào)節(jié)功能；如控制這樣有機(jī)體的生長(zhǎng)習(xí)性，開花，種子制備，種子發(fā)芽，和衰老。
本發(fā)明還涉及通過改變編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)蛋白質(zhì)或其功能等同物的分離或重組核酸來(lái)增強(qiáng)植物干旱耐力的方法。當(dāng)這樣的雜交序列編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的功能等同物時(shí)，與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶基因(ERA1)雜交的核酸也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還涉及通過對(duì)ERA1基因和其功能等同物的基因處理改進(jìn)農(nóng)作植物的逆境耐力，來(lái)增強(qiáng)植物的干旱耐力的方法。失去ERA1基因功能，就給成熟植物帶來(lái)了增強(qiáng)的干旱耐力。失去法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的ERA1突變基因的特性顯示，抑制法呢基作用增強(qiáng)了植物的ABA反應(yīng)。
進(jìn)一步，本發(fā)明涉及通過抑制法呢基轉(zhuǎn)移酶活性，抑制光合成有機(jī)體的衰老。產(chǎn)物光合有機(jī)體可保持綠色，組織生存能力維持更長(zhǎng)的時(shí)間。這樣，提供常綠植物及延緩衰老的方法也是本發(fā)明的一部分。
在另一個(gè)具體實(shí)施中，提供了改變植物生長(zhǎng)習(xí)性和促進(jìn)開花的方法。在特殊環(huán)境條件下失去ERA1基因功能會(huì)使植物生長(zhǎng)的側(cè)枝數(shù)量減少，每個(gè)開花期花朵數(shù)量增加。
本發(fā)明還涉及用于植物細(xì)胞基因工程的調(diào)節(jié)序列，以提供控制與這種新型調(diào)節(jié)序列聯(lián)接的DNA序列表達(dá)的組織模式的方法。
圖2是ERA1蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖3A-3B表示ERA1啟動(dòng)子的核酸序列(SEQ ID NO:3)。
圖4是擬南芥[Arabidopsis(Arab.)](SEQ ID NO:2)β-亞單元法呢基作用域和豌豆(SEQ ID NO:4)，酵母(SEQ ID NO:5)和鼠(SEQ ID NO:6)β-亞單元法呢基作用域的氨基酸序列。與擬南芥序列相同的殘基用點(diǎn)標(biāo)出。破折號(hào)表示空白。擬南芥基因的氨基酸位置標(biāo)在右手邊。
圖5是eral-轉(zhuǎn)化的擬南芥植物(右)與野生型(對(duì)照物，如自然生長(zhǎng)的)植物(左)在非常干燥的條件下的對(duì)比照片。
圖6是失活的或突變法呢基轉(zhuǎn)移酶活性(M.Columbia,eral-2)的擬南芥植物與對(duì)照物(M.C.對(duì)照物，era 1-2對(duì)照物)的水含量對(duì)比圖。
圖7是失活的或突變法呢基轉(zhuǎn)移酶活性(M.Columbia,eral-2)的擬南芥植物與對(duì)照物(M.C.對(duì)照物，era 1-2對(duì)照物)的水失去速率對(duì)比圖。
圖8是對(duì)照物(野生型)和era-2突變植物的老葉對(duì)比。
圖9是對(duì)照物(野生型)和era-2突變植物老葉的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)比。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及改變植物生長(zhǎng)、繁殖和衰老的分離核酸和由這些核酸編碼的蛋白質(zhì)。具體地，本發(fā)明的構(gòu)建物包括編碼含SEQ IDNO:1的法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)多肽或其功能等同物的分離的核酸，和由這些核酸編碼的法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽或蛋白質(zhì)。特別是，本發(fā)明涉及其中序列是SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中還包括核酸構(gòu)建物，其中包括與含SEQ ID NO:1分離核酸、或其功能等同物、或兩者中任何一個(gè)的互補(bǔ)體可工作地聯(lián)接的啟動(dòng)子(ERA1啟動(dòng)子)。當(dāng)摻入到植物中時(shí)，ERA1啟動(dòng)子在植物保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)被調(diào)節(jié)，可影響通過氣孔的水分失去。這種啟動(dòng)子由含SEQ ID NO:3(圖3)的核酸構(gòu)成。
摻入這些構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物、種子、植物細(xì)胞和組織也是本發(fā)明的一部分。因此，本發(fā)明的一方面是，提供一種制備基因產(chǎn)品方法，在主要于保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)工作的啟動(dòng)子的控制下，通過在植物細(xì)胞內(nèi)對(duì)編碼基因產(chǎn)品的基因進(jìn)行表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該方法包括步驟用包括含SEQ ID NO:3或其功能部分的調(diào)節(jié)區(qū)域，含編碼基因產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)基因的DNA，和含多腺苷化區(qū)域的3’非翻譯區(qū)域的DNA構(gòu)建物來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；從細(xì)胞再生植物、光合成有機(jī)體或組織培養(yǎng)物；將植物、光合成有機(jī)體或組織培養(yǎng)物置于使啟動(dòng)子誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄及基因產(chǎn)品表達(dá)的條件下。
在本篇公開的上下文中，“調(diào)節(jié)區(qū)域”和“啟動(dòng)子”是指DNA的序列，通常處于結(jié)構(gòu)基因編碼序列的上游(5’)，其通過為RNA聚合酶提供識(shí)別和結(jié)合位置，和/或?yàn)樵谡_位置開始轉(zhuǎn)錄提供所需要的因素，來(lái)控制編碼區(qū)域的表達(dá)?！肮δ懿糠帧被颉肮δ芷巍笔侵副景l(fā)明的啟動(dòng)子的截?cái)嘈蛄?，其在描述的法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)活性條件下，維持誘導(dǎo)ERA結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的能力。
本文所描述的構(gòu)建物和方法可適用于所有類型的植物和其他光合成有機(jī)體，包括但不限于被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)，裸子植物，帶孢子的或營(yíng)養(yǎng)性再生的植物和藻類，包括藍(lán)(藍(lán)-綠藻類)。特別推薦的植物是那些提供商業(yè)價(jià)值的農(nóng)作物，如玉米，小麥，棉花，稻米，canola，甘蔗，甜菜，向日葵，土豆，番茄，椰菜，胡蘿卜，萵筍，蘋果，棕櫚，橙子，檸檬，玫瑰等等。
進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建物和方法還適用于植物的任何植物部分、原生質(zhì)體、或組織培養(yǎng)物，其中組織是從光合成有機(jī)體獲得的?！爸参锊糠帧币庵赴墚a(chǎn)生再生植物的部分植物。較好的植物部分包括根和椏枝和它們的分生部分。本發(fā)明包括的其他植物部分有葉子，花，種子，上胚軸，子葉下軸，子葉，子葉節(jié)點(diǎn)，移植體，花粉，胚珠，分生或胚胎組織，原生質(zhì)體，等等。轉(zhuǎn)基因植物可從任何這些植物部分包括組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體再生，并且也可從移植體再生。具體方法根據(jù)植物物種的不同而變化。
本發(fā)明涉及包括編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的分離核酸(DNA和RNA)和其光合成有機(jī)體部分的組合物和構(gòu)建物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子的分離的核酸的組合物和構(gòu)建物。具體地，編碼擬南芥法呢基轉(zhuǎn)移酶β亞單元的ERA1基因，和調(diào)節(jié)ERA1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列已被分離和測(cè)序。編碼光合成有機(jī)體法呢基轉(zhuǎn)移酶的核酸，和這些核酸的同源物和同類物也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用分離的和/或重組的核酸(DNA和RNA)的方法，核酸的特點(diǎn)在于它們與(a)編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)或多肽，如含序列SEQ ID NO:1的核酸雜交，或與(b)部分前述物，如含編碼功能法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)所需的最小核苷酸的部分雜交的能力；或其編碼含法呢基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的多肽(如SEQ ID NO:2，或編碼其功能等同物；如含與SEQ IDNO:2至少80％相同序列的多肽，當(dāng)摻入到植物細(xì)胞內(nèi)時(shí)，可用如SEQ ID NO:1相同的方式促進(jìn)光合成有機(jī)體的生長(zhǎng)習(xí)性，種子發(fā)芽，和新陳代謝)的能力。因此，法呢基轉(zhuǎn)移酶的功能等同物，應(yīng)含與由SEQ ID NO；2編碼的多肽至少80％相同的氨基酸序列，具有與由SEQ ID NO；2編碼的多肽相同特點(diǎn)，或用與由SEQ ID NO；2編碼的多肽基本上相同的方法工作。與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽如SEQ ID NO:2的核酸雜交的核酸可以是雙鏈的，或是單鏈的。與DNA如含序列SEQ ID NO:1的DNA的雜交作用，包括與所顯示出的鏈的雜交，以及與其互補(bǔ)鏈的雜交。
在一個(gè)具體實(shí)施中，法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽如SEQ ID NO:2，和其功能等同物之間氨基酸序列的相同率為至少約60％。在一個(gè)較好的具體實(shí)施中，法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽和其功能等同物之間氨基酸序列的相同率為至少約75％(≥75％)。更好地，法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽和其功能等同物之間氨基酸序列的相同率為至少約80％，還要好地是，當(dāng)比較連續(xù)的氨基酸序列時(shí)，相同率為至少約90％。
符合這些標(biāo)準(zhǔn)的分離的和/或重組的核酸包括，與天然的ERA1基因或其部分基因、或天然的基因的變異體含相同序列的核酸。這樣的變異體包括通過添加、刪除或替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不同的突變體，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被修飾的修飾核酸(如DNA,RNA的類似物)的突變體，及包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸的突變體。
這樣的核酸，包括DNA和RNA，可通過在高度嚴(yán)緊條件或中度嚴(yán)緊條件下的雜交進(jìn)行檢測(cè)和分離，如選出不允許含非互補(bǔ)序列的核酸進(jìn)行雜交的核酸。雜交的“嚴(yán)緊條件”是本領(lǐng)域的術(shù)語(yǔ)，是指溫度和緩沖液濃度條件允許一種特定的核酸與另一種核酸雜交，其中第一種核酸可能與第二種核酸完全互補(bǔ)，或第一種和第二種核酸可能共有比完全互補(bǔ)少的一定程度的互補(bǔ)。如，某些高度嚴(yán)緊條件可以用來(lái)從互補(bǔ)性小的核酸中將完全互補(bǔ)核酸區(qū)分出來(lái)。核酸雜交的“高度嚴(yán)緊條件”和“中度嚴(yán)緊條件”在《現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊(cè)》(Ausubel,F.M.et al.,eds.,Vol.1，包括補(bǔ)充部分至補(bǔ)充29,1995)6.3.1-6頁(yè)和2.10.1-2.10.16頁(yè)上作了解釋。決定嚴(yán)緊雜交的確切條件不僅僅取決于離子濃度，溫度和脫穩(wěn)定劑如甲酰胺濃度，還取決于其他因素如核酸序列長(zhǎng)度，堿基組合，雜交序列之間的誤配率，和在其他非一致序列內(nèi)那種序列小分子團(tuán)的出現(xiàn)頻率。這樣，高度或中度嚴(yán)緊條件可以經(jīng)驗(yàn)確定。
高度嚴(yán)緊雜交過程可以(1)使用低離子濃度和高溫進(jìn)行淋洗，如0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉，pH7.0(0.1xSSC)和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS),50℃；(2)雜交期間使用50％(體積/體積)甲酰胺和5xDenhardt溶液(0.1％重量/體積高度提純的牛血清清蛋白/0.1％重量/體積Ficoll/0.1％重量/體積聚乙烯基吡咯烷酮),50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5和5xSSC,42℃；或(3)雜交使用50％甲酰胺，5xSSC,50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt溶液，超聲波降解的鮭魚精液DNA(50μg/ml),0.1％SDS，和10％右旋糖苷硫酸鹽，42℃，在42℃用0.2xSSC和0.1％SDS淋洗。除了雜交使用25％甲酰胺替換50％甲酰胺，中度嚴(yán)緊條件的其它方面是相同的。
通過改變雜交條件，從沒有雜交發(fā)生的嚴(yán)緊程度到第一次觀察到雜交發(fā)生的程度，使給定序列能與樣品中最相似序列雜交的條件可以被確定。
示例條件在Krause,M.H.和S.A.Aaronson的(1991)《酶學(xué)中的方法》,200∶546-556中作了描述。同樣，參閱《當(dāng)代分子生物學(xué)手冊(cè)》(咄處同上)中2.10.11頁(yè)，其中描述了如何確定中度或低度嚴(yán)緊條件的淋洗條件。淋洗是這樣一種步驟，其中通常設(shè)定的條件是為了確定雜交體之間的最小程度的互補(bǔ)性。一般，對(duì)于任何選取的SSC濃度，從僅有同源雜交發(fā)生的最低溫度，雜交核酸間的1％誤配會(huì)導(dǎo)致解鏈溫度Tm降低1℃。通常，加倍SSC濃度會(huì)使Tm增加約17℃。利用這些準(zhǔn)則，根據(jù)查尋的誤配程度，可經(jīng)驗(yàn)性地確定中度或低度嚴(yán)緊雜交的淋洗溫度。
以(a)與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸，如SEQ ID NO:1描述的核酸雜交，(b)與SEQ ID NO:1的互補(bǔ)序列雜交，(c)與部分(a)和(b)(如在高度和中度嚴(yán)緊條件下)雜交的能力為特征的分離的和/或重組的核酸，還可進(jìn)一步編碼含有至少一種法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽功能特性的蛋白質(zhì)或多肽，如晝夜光照循環(huán)下調(diào)節(jié)側(cè)分枝，或調(diào)節(jié)對(duì)ABA的反應(yīng)，或調(diào)節(jié)衰老。
在確定和/或分離編碼多肽如含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽或這種多肽的功能等同物的核酸的過程中，還可以使用酶學(xué)檢測(cè)，互補(bǔ)檢測(cè)，或其他適當(dāng)?shù)姆椒āＳ呻s交核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽的抗原屬性可以通過免疫法使用與法呢基多肽結(jié)合的抗體來(lái)確定，如免疫印跡法，免疫沉淀法，放射免疫測(cè)定法。PCR方法，包括RAGE(基因組DNA末端快速擴(kuò)增法)，也可用來(lái)篩查和探測(cè)編碼類-法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)和多肽的核酸的存在，并協(xié)助從基因組DNA中克隆出這樣的核酸。適用于此的PCR方法可在Innis,M.A.，等人的《PCR手冊(cè)》(Innis,M.A.,et al.,(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,CA)中找到。
本文所描述的核酸使用在本發(fā)明的方法中，以制備摻入細(xì)胞、組織、植物部分、植物和其他光合成有機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)和多肽。在一個(gè)具體實(shí)施中，含有全部或部分法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽編碼序列的DNA，或與含序列SEQ ID NO:2的DNA雜交的DNA，被引入到在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)對(duì)被編碼的多肽進(jìn)行表達(dá)的載體中。包含法呢基轉(zhuǎn)移酶亞單元或其功能等同物的被編碼的多肽具有法呢基轉(zhuǎn)移酶活性。本文中所用的“載體”指一種核酸分子，能轉(zhuǎn)運(yùn)與其已聯(lián)接的其他核酸。
包含20個(gè)或更多個(gè)上述核酸的鄰接核苷酸的引物和探針也是本發(fā)明所包括的一部分。這樣，本發(fā)明的一種核酸包括約20個(gè)到約200個(gè)或更多個(gè)核苷酸的特殊序列，其與編碼法呢基蛋白質(zhì)DNA或轉(zhuǎn)錄的mRNA的核苷酸特異序列相同或互補(bǔ)。這些引物和探針可用來(lái)在其他光合成有機(jī)體中識(shí)別和分離編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
本文所稱為“分離的”核酸是從它們的原始來(lái)源(如當(dāng)存在于細(xì)胞中或核酸混合物中如文庫(kù)中)的基因組DNA或細(xì)胞RNA的核酸中分離出來(lái)的核酸，并可能進(jìn)行進(jìn)一步的加工。“分離的”核酸包括用本文描述的方法、類似的方法、以及其它的適宜的方法所獲得的核酸，包括幾乎純的核酸，化學(xué)合成制備的核酸，通過生物和化學(xué)方法制備的核酸，分離的重組體核酸。本文所稱為“重組體”核酸是用重組DNA方法制備的核酸，包括那些用人工重組方法制備的核酸，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和/或使用限制酶克隆到載體內(nèi)?！爸亟M體”核酸還有那些通過細(xì)胞天然機(jī)能發(fā)生的重組事件中產(chǎn)生的核酸，但在為所需重組事件發(fā)生或可能發(fā)生而設(shè)計(jì)的核酸被引入細(xì)胞中后進(jìn)行選取。編碼具有某種功能的多肽的部分分離核酸可用如Jasin,M.等人的美國(guó)專利第4,952,501號(hào)中的方法進(jìn)行識(shí)別和分離。
本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施是全部或部分與含有義鏈的靶分子互補(bǔ)，并能與靶分子雜交的反義核酸或寡聚核苷酸。靶分子可以是DNA，或其相對(duì)的RNA(如其中DNA的T殘基相對(duì)RNA的U殘基)。當(dāng)引入細(xì)胞時(shí)，反義核酸和寡聚核苷酸可抑制有義鏈編碼基因的表達(dá)或從有義鏈轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達(dá)。反義核酸可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。參閱，如Shewmaker等人的美國(guó)專利第5,107,065號(hào)。
在一個(gè)具體實(shí)施中，反義核酸或寡聚核苷酸全部或部分與靶核酸(DNA或RNA)互補(bǔ)，并能雜交，其中靶核酸能與含SEQ IDNO:1鏈互補(bǔ)序列的核酸雜交。如反義核酸或寡聚核苷酸可以與含如SEQ ID NO:1的開放讀框鏈所示序列的靶核酸互補(bǔ)，或與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶功能等同物的核酸互補(bǔ)，或與足夠允許雜交的部分這些核酸互補(bǔ)。部分核酸，如16個(gè)核苷酸的序列足夠抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。含與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的25個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的片段也可被使用?；蛘?，與ERA1基因的5’或3’非翻譯區(qū)域，或重疊翻譯起始密碼子(5’未翻譯的和翻譯的區(qū)域)，或編碼功能等同物的基因互補(bǔ)的核酸或寡聚核苷酸也是有效的。在另一個(gè)具體實(shí)施中，反義核酸與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽的靶核酸全部或部分互補(bǔ)并與之雜交。
除了本發(fā)明的反義核酸，還可構(gòu)建寡聚核苷酸，其與基因中或轉(zhuǎn)錄DNA∶RNA復(fù)合體中的復(fù)式核酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的含三重螺旋體或三聯(lián)核酸，抑制編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽或其等同物的基因的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄。參見Frank-Kamenetskii,M.D.和Mirkin,S.M在《生物化學(xué)回顧年刊》的文獻(xiàn)[Frank-Kamenetskii,M.D.andMirkin,S.M.(1995)Ann.Rev.Biochem.64∶65-95]。本發(fā)明的這種寡聚核苷酸的構(gòu)建是采用三重螺旋形成的堿基配對(duì)原則和法呢基轉(zhuǎn)移酶mRNA或基因的核苷酸序列。這些寡聚核苷酸可以用一些方式阻礙法呢基轉(zhuǎn)移酶類的活性，如預(yù)防ERA1基因轉(zhuǎn)錄，或當(dāng)它被基因轉(zhuǎn)錄時(shí)與mRNA結(jié)合。
本發(fā)明還涉及如本文所描述的新型核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是分離的和/或是重組體。本文稱作“分離的”蛋白質(zhì)或多肽是指提純到超過它們?cè)诩?xì)胞中存在的程度的蛋白質(zhì)或多肽。在一個(gè)較好的具體實(shí)施中，它們至少是10％純度；如充分提純的。“分離的”蛋白質(zhì)或多肽包括用下文描述的方法，相似的方法，或其他適當(dāng)方法獲得的蛋白質(zhì)或多肽，包括基本上純的蛋白質(zhì)和多肽，用化學(xué)方法或用生物及化學(xué)結(jié)合的方法合成的蛋白質(zhì)或多肽，和分離的重組體蛋白質(zhì)或多肽。本文稱作“重組體”蛋白質(zhì)或多肽是指由重組體核酸表達(dá)制備的蛋白質(zhì)或多肽。
在一個(gè)較好的具體實(shí)施中，蛋白質(zhì)或其部分至少具有一種法呢基轉(zhuǎn)移酶功能特性；如，影響正常例分枝，花/花序，種子發(fā)芽，或氣孔張開，結(jié)合功能，和/或抗原功能(如，結(jié)合的抗體也與自然產(chǎn)生的法呢基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合)的催化活性。因此，這些蛋白質(zhì)被稱作植物來(lái)源法呢基轉(zhuǎn)移酶，包括如天然的法呢基轉(zhuǎn)移酶，這些蛋白質(zhì)和/或其部分的變異體(如突變體)。這樣的變異體包括由于添加、刪除或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而不同的突變體，或其中一個(gè)或多個(gè)殘基被修飾的修飾多肽，含一個(gè)或多個(gè)修飾殘基的突變體。
本發(fā)明還涉及如上所述的法呢基轉(zhuǎn)移酶的分離和/或重組體部分，特別是法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的β-亞單元?？芍苽浔旧砭哂腥炕虿糠止δ艿牟糠置福虍?dāng)部分酶混合時(shí)(全部地，部分地，或僅為非功能地)，自然與一個(gè)或多個(gè)其他多肽裝配，重新組成含至少一種本發(fā)明法呢基轉(zhuǎn)移酶功能特性的功能蛋白質(zhì)。
被ABA誘導(dǎo)的一些基因已確定。這說(shuō)明不利環(huán)境條件的ABA-誘導(dǎo)的耐力是復(fù)雜的多基因事件。這樣，識(shí)別及轉(zhuǎn)移信號(hào)基因進(jìn)入農(nóng)作植物中，由于對(duì)ABA反應(yīng)的增加，以改進(jìn)植物在不同環(huán)境條件下的生存能力，這是很新潁的并且非常有用。
為了識(shí)別可能是ABA-調(diào)節(jié)植物過程的全局控制物的基因，在一些植物物種中使用基因篩查，以分離改變植物對(duì)激素反應(yīng)的突變。
增強(qiáng)擬南芥種子對(duì)ABA(era)反應(yīng)的突變，可通過它們?cè)谕ǔＪ挂吧椭参?對(duì)照物，如自然生長(zhǎng)的)種子發(fā)芽的低濃度ABA下能預(yù)防種子發(fā)芽來(lái)確定。其中，era1突變類型，其包括一種轉(zhuǎn)運(yùn)DNA(T-DNA)系(era1-1，生態(tài)型Wassilewskija)和兩種中子-產(chǎn)生的突變(era1-2,era1-3，生態(tài)型Columbia)，因?yàn)檫@種era1突變類型在正常吸收后作用下顯示降低的發(fā)芽率，所以引起更多的關(guān)注。一般來(lái)講，增強(qiáng)ABA反應(yīng)的突變應(yīng)是休眠更深的。通過4天的冷凍處理，era等位基因的休眠減弱；隨著種子冷凍時(shí)間增長(zhǎng)，era1發(fā)芽率增加。在許多植物物種中，打破休眠發(fā)芽需要進(jìn)行春化處理并曝露在濕潤(rùn)低溫環(huán)境下一段時(shí)間(Baskin和Baskin,1971)。Era突變的發(fā)芽情況可反映出ABA-誘導(dǎo)休眠的增加狀況。因此，這些種子發(fā)芽需要較長(zhǎng)時(shí)間的春化處理。對(duì)這種論點(diǎn)的支持來(lái)自era的ABA生物合成突變體(abi1-1)和不敏感突變體(abi1-1和abi3-6)的雙突變體構(gòu)建物。在所有情況中，與era1相比，雙突變體減緩了休眠程度，說(shuō)明在era1種子中觀察到的增強(qiáng)的休眠取決與ABA的合成或敏感性。
除了拓寬新ABA反應(yīng)突變體的型譜，超敏感性篩查也用來(lái)識(shí)別ABA敏感性的負(fù)調(diào)節(jié)基因。也就是，對(duì)這些基因功能抑制增強(qiáng)了ABA反應(yīng)。這些基因中的一種(ERA1)已被克隆并顯示編碼異源二聚蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)的β-亞單元(Cutler等人，1996)。T-DNA插入產(chǎn)生的era1-1突變，使得插入點(diǎn)側(cè)翼植物基因組區(qū)域可被分離。使用側(cè)翼區(qū)域作為探針，野生型cDNA和基因組克隆體被分離。對(duì)這些進(jìn)行序列分析顯示了含3.5kb基因組DNA的基因。這種基因含13個(gè)內(nèi)含子，在

圖1A-1C中以下劃線標(biāo)出，T-DNA在era1-1中的插入位置在內(nèi)含子8中。對(duì)用EralcDNA探測(cè)的野生型DNA,era1-2，和era1-3進(jìn)行Southern(DNA)分析顯示，兩個(gè)快速-中子等位基因含有跨越ERA1位點(diǎn)的刪除。快速-中子突變形成誘導(dǎo)擬南芥中的小型刪除(Shirley等人，1992)，隨后用14-kb探針進(jìn)行跨越ERA1位點(diǎn)的基因組分析，確定era1-2的刪除大小約為7.5 kb,era1-3的刪除稍大些。這樣，全部三個(gè)era1等位基因在相同位點(diǎn)含有DNA中斷，證實(shí)了ERA位點(diǎn)的同一性。
在ERA基因中最長(zhǎng)的開放讀框(404氨基酸)的概念上的翻譯，產(chǎn)生與酵母，豌豆，和哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶β-亞單元基因序列高度相似性的蛋白質(zhì)(圖2和圖4)(Goodman等人，1988；Chen等人，1991；Yang等人，1993)。法呢基轉(zhuǎn)移酶由α和β亞單元構(gòu)成，二元聚合形成酶，催化法呢基焦磷酸酯(15個(gè)碳)與含COOH-終端CaaX基元序列的蛋白質(zhì)裝配(Schafer和Rine,1992)，其中C指的是半胱氨酸殘基，aa一般為脂族氨基酸，X可指的是半胱氨酸，絲氨酸，蛋氨酸，谷氨酸殘基。植物β亞單元的兩種基因在鄰近COOH終端都含有約50個(gè)氨基酸的區(qū)域，在酵母和動(dòng)物β亞單元基因中不含。
在酵母和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，法呢基轉(zhuǎn)移酶修飾幾種膜定位信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)。這是通過法呢基轉(zhuǎn)移酶將親脂性法呢基側(cè)鏈裝配到蛋白質(zhì)靶標(biāo)上完成的。裝配法呢基基團(tuán)使靶標(biāo)的整體疏水性發(fā)生變化，使得蛋白質(zhì)錨定在通常它與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用的膜中。在era1突變體中失去法呢基活性，導(dǎo)致種子對(duì)ABA反應(yīng)增強(qiáng)，這說(shuō)明在擬南芥中的靶蛋白質(zhì)一定位于膜內(nèi)以削弱ABA信號(hào)。這樣，在擬南芥中的法呢基化可被認(rèn)為是ABA敏感性的負(fù)調(diào)節(jié)基因的正常功能所必需的。
隨后的研究顯示在擬南芥中ERA1基因功能的失去，增強(qiáng)了成熟植物對(duì)環(huán)境逆境的耐力。如，在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，比較在土壤中成長(zhǎng)的野生型植物和era1突變體植物(24小時(shí)光照，150μE m-2sec-1,30％濕度)顯示，突變體不象野生型植物一樣為了維持生存頻繁需要澆水(圖5)。當(dāng)突變體和野生型植物成長(zhǎng)到開花時(shí)，停止?jié)菜?，觀察植物隨后每天的逆境跡象。與野生型植物相比，突變體植物中的水分失去顯著降低(圖6和圖7)。
為了確定所觀察的era突變體增加的干旱耐力是否與ERA1基因功能有關(guān)，構(gòu)建含融合到報(bào)告基因GUS基因的ERA1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物(通過將5kb ERA1啟動(dòng)子片段插入到無(wú)啟動(dòng)子的GUS T-DNA質(zhì)粒中制備)。分析轉(zhuǎn)基因植物顯示ERA1轉(zhuǎn)錄表達(dá)在擬南芥的表皮組織中，這種表達(dá)是保衛(wèi)細(xì)胞特異性的。ERA1表達(dá)也在植物分生組織和根須中記錄到。ERA1的保衛(wèi)細(xì)胞表達(dá)與突變體的干旱耐力相一致，因?yàn)檫@些細(xì)胞是植物水分蒸發(fā)的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞。可以認(rèn)為ERA1-調(diào)節(jié)的氣孔傳導(dǎo)率需要ERA1基因在保衛(wèi)細(xì)胞中的表達(dá)。因此ERA1基因功能的失去產(chǎn)生對(duì)ABA有更強(qiáng)反應(yīng)的保衛(wèi)細(xì)胞，這樣，就產(chǎn)生更強(qiáng)的對(duì)干旱反應(yīng)的保衛(wèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。因此，在高等植物中修飾法呢基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)或活性，特別是農(nóng)作植物，會(huì)對(duì)植物中的氣孔傳導(dǎo)率和蒸發(fā)速率有很大的影響。
在擬南芥中的era1突變特性說(shuō)明，抑制法呢基作用會(huì)增強(qiáng)植物中的ABA反應(yīng)及農(nóng)作物物種中這種酶活性的改變。對(duì)農(nóng)作植物中法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制可通過一些方法完成。如，不同農(nóng)作物物種的同類ERA1基因的反義技術(shù)可用來(lái)減弱法呢基轉(zhuǎn)移酶活性，這樣增強(qiáng)干旱耐力。通過特異制備保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的ERA1的反義RNA，可將合成的法呢基轉(zhuǎn)移酶的量減到可模擬era突變體顯型的程度。ERA1啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，發(fā)生在從椏枝分生組織到根須的一些不同組織內(nèi)。通過確定使ERA1啟動(dòng)子在特異組織表達(dá)的要素，使制作僅適合一種組織或細(xì)胞類型，如保衛(wèi)細(xì)胞的反義ERA1表達(dá)成為可能。
在植物中抑制法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的另一種方法是，在轉(zhuǎn)基因植物中制備法呢基作用的特異肽抑制劑。在哺乳動(dòng)物和酵母系統(tǒng)中，使法呢基基團(tuán)裝配到特異蛋白質(zhì)上的羧基終端靶序列(CaaX，其中C=半胱氨酸，x=脂族，X=任何氨基酸)已清楚確定。模擬這些靶序列的肽已被制備，并顯示在這些系統(tǒng)中抑制內(nèi)源靶蛋白質(zhì)的法呢基作用。并且，CAIM在擬南芥活體內(nèi)是法呢基化的。這樣，類似的抑制劑可于高等植物以競(jìng)爭(zhēng)抑制活體內(nèi)法呢基轉(zhuǎn)移酶。此外，這也可通過在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)抑制劑肽完成，通過合成CaaX肽的DNA序列并將其融合到保衛(wèi)細(xì)胞特異啟動(dòng)子內(nèi)。在這兩種方法中，使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，可特異性地靶中和控制反義法呢基轉(zhuǎn)移酶或肽抑制劑。
這樣，本發(fā)明提供了一種制備耐干旱植物的方法，其包括制備包括可與含有或編碼SEQ ID NO:1反義序列的核酸，或與含有反義序列功能等同物的核酸可工作聯(lián)接的啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建物；將核酸構(gòu)建物插入到載體中；用載體轉(zhuǎn)化植物，組織培養(yǎng)物，或植物細(xì)胞；培養(yǎng)植物或從組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞再生植物；其中，制備了耐干旱植物。可使用這種方法的情況是，其中核酸是從下列基團(tuán)中選取的，含25-100個(gè)或更多個(gè)與SEQID NO:1互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸基團(tuán)，含25個(gè)或更多個(gè)SEQ ID NO:1的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)體的寡聚核苷酸，或編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑肽的核酸。
除了對(duì)ABA非常敏感的氣孔調(diào)節(jié)外，era植物還表現(xiàn)出在干旱條件下延遲衰老現(xiàn)象，說(shuō)明法呢基作用負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥內(nèi)的一些干旱誘導(dǎo)反應(yīng)。在正常實(shí)驗(yàn)室條件下生長(zhǎng)的era植物用更長(zhǎng)的時(shí)間變黃。在野生型植物衰老死亡后，突變體植物長(zhǎng)時(shí)間保持綠色并存活。Era突變體植物的離體葉子不象野生型植物的離體葉子一樣快速變黃(圖8)。將發(fā)育相同的大小相似的野生型植物和era植物葉子取下，并置于含瓊脂的陪替氏培養(yǎng)皿上(參閱實(shí)例7)。通常，野生型葉子在約5天后失去葉綠素并最終脫色。突變體植物葉子保持綠色兩倍長(zhǎng)的時(shí)間。因?yàn)槿~子持續(xù)與瓊脂接觸，它們不是在干旱逆境中，說(shuō)明era1突變體的減緩衰老不是干旱誘導(dǎo)現(xiàn)象。
另外，在10小時(shí)白天/16小時(shí)夜晚循環(huán)下，植物生命周期可以是野生型植物的兩倍(3個(gè)月)。因此，看來(lái)era突變體中葉綠素?fù)Q新率和衰老信號(hào)被改變了。如，野生型植物和突變體植物在充分水分條件下在罐中培養(yǎng)到發(fā)育階段，野生型植物葉子開始衰老(約在花發(fā)育階段)。在這個(gè)時(shí)候，通過Northnern印跡分析對(duì)發(fā)育相同的葉子進(jìn)行衰老誘導(dǎo)標(biāo)記基因檢測(cè)(實(shí)例8)。兩種基因，SAG12和SAG13，它們通常在野生型植物衰老期間基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo)，但在era1突變體中不被誘導(dǎo)(圖9)。并且，保持CAB轉(zhuǎn)錄(圖9)。綜合起來(lái)，這些結(jié)果說(shuō)明在era1突變體中的衰老誘導(dǎo)程序與野生型植物相比被延遲了，表示即使在水分逆境不是環(huán)境因素的條件下，法呢基作用活性的降低也會(huì)遲滯植物的衰老誘導(dǎo)。
除了對(duì)衰老和水分失去的影響，當(dāng)在晝夜光照循環(huán)下培養(yǎng)時(shí)，era1突變體顯示出在分枝和開花習(xí)性上的不同。在連續(xù)光照下(24小時(shí)光照/天)，突變體的分枝模式與野生型植物沒有不同。然而，當(dāng)給予一定的黑暗時(shí)間時(shí)，突變體不象野生型植物一樣產(chǎn)生許多側(cè)枝。測(cè)量的結(jié)果是，與每株野生型植物產(chǎn)生3.6個(gè)側(cè)枝相比，每株法呢基作用活性失去的植物僅產(chǎn)生2.4個(gè)側(cè)枝。這表示每株植物減少30％的側(cè)枝。
開花也受法呢基轉(zhuǎn)移酶活性失去的影響。每株缺少法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的植物(25-30個(gè)花蕾/花序)比每株野生型植物(10-15個(gè)花蕾/花序)產(chǎn)生更多的花。這樣，突變體上的花蕾平均是野生型植物上的兩倍。
缺失一定功能的era1突變體對(duì)整體植物發(fā)育的這些多效影響說(shuō)明，ERA1基因可以是一些植物發(fā)育功能的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)基因。
直到現(xiàn)在，在高等植物中還沒有法呢基作用的功能已被了解，包括ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。法呢基轉(zhuǎn)移酶已在許多高等植物如番茄和豌豆中發(fā)現(xiàn)，所以這種酶具有跨越物種界限的功能這一點(diǎn)很清楚。并且，法呢基轉(zhuǎn)移酶靶肽的過量產(chǎn)生或使用法呢基作用抑制劑可完全抑制哺乳動(dòng)物和酵母系統(tǒng)中的法呢基轉(zhuǎn)移酶。這樣，同樣的抑制劑可使用在高等植物上以抑制活體內(nèi)法呢基轉(zhuǎn)移酶。在兩種情況中使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，可特異地靶中及控制反義法呢基轉(zhuǎn)移酶或肽抑制劑。
法呢基作用缺失突變體對(duì)外源植物生長(zhǎng)素也是超敏感的。這些突變體表現(xiàn)出分枝減少及在分裂組織中較小的變化，可用改變植物生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)作用來(lái)解釋。這樣，其他激素功能在這種突變體中受到影響，這說(shuō)明除了ABA途徑，其他激素調(diào)節(jié)途徑也受法呢基轉(zhuǎn)移酶活性控制。這些結(jié)果顯示ERA1基因提供分子機(jī)能以協(xié)調(diào)不同激素信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用。
根據(jù)本發(fā)明，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的植物有植物界中的高等植物和低等植物。成熟植物、秧苗和種子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。成熟植物包括秧苗后發(fā)育的任何階段的植物。秧苗是非常年幼，在發(fā)育早期的未成熟植物。本發(fā)明也提供植物部分，原生質(zhì)體和組織培養(yǎng)物。
具有era1突變的表型特征的轉(zhuǎn)基因植物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明也提供轉(zhuǎn)基因植物的種子，這些種子可用來(lái)繁殖更多含本發(fā)明的構(gòu)建物的植物。
在一些農(nóng)作植物中ERA1功能可以被抑制，以增強(qiáng)植物對(duì)需要ABA調(diào)節(jié)信號(hào)的不利環(huán)境條件的反應(yīng)?？刂聘叩戎参锏姆鼗饔谜{(diào)節(jié)了胚胎和植物性組織對(duì)這種激素的反應(yīng)(Cutler等人，1996)。增加的敏感性轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織對(duì)逆境條件的快速反應(yīng)，從而給環(huán)境逆境中的植物帶來(lái)增加的保護(hù)性。因?yàn)檫@僅需要對(duì)單一基因，即ERA1的控制，所以通過控制這種酶的合成或活性來(lái)控制各種植物中法呢基作用應(yīng)是可能的。并且，本文所描述的研究清楚地表明，通過改變控制ABA反應(yīng)的基因來(lái)改變ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使改進(jìn)植物對(duì)不利水分逆境條件的反應(yīng)成為可能。
為了制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知或已使用的方法，將包括編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的基因構(gòu)建物，或編碼其功能等同物的核酸，和啟動(dòng)子整合到載體中。啟動(dòng)子可以包括全部或部分的SEQ ID NO:3。構(gòu)建物也可包括任何其他必要的與編碼序列可工作地聯(lián)接的調(diào)節(jié)因子，如終止子或類似因子。在該構(gòu)建物中包括5’前導(dǎo)序列，如從紫花苜蓿嵌合病毒的外被蛋白mRNA獲取的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling,S.A.和Gehrke,L.1987自然325∶622-625)或玉米萎黃病色斑病毒(MCMV)前導(dǎo)序列(Lommel,S.A.等人，1991濾過性微生物學(xué)81∶382-385)等，將是有益的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到用作不同目的其他前導(dǎo)序列的適用性。
靶標(biāo)序列也是有用的，也可整合到本發(fā)明的構(gòu)建物中。靶標(biāo)序列通常被翻譯成肽，指導(dǎo)編碼核酸序列的多肽產(chǎn)物到細(xì)胞內(nèi)所需的位置上，如到質(zhì)粒上，并在肽轉(zhuǎn)換完成后從肽分離出來(lái)或隨轉(zhuǎn)換同時(shí)存在。用于本發(fā)明中的靶標(biāo)序列實(shí)例包括但不限于，酵母線粒體RNA前序列(Schmitz等人，1989，植物細(xì)胞，1:783-791)，從煙草致病原因有關(guān)基因(PR-1)中獲取的靶標(biāo)序列(Cornellisen等人，1986,EMBO J.5:37-40)，液泡靶信號(hào)(Chrispeels,M.J.和Raikhel,N.V 1992細(xì)胞68:613-616),分泌途徑序列如ER或Golgi(Chrispeels,M.J.1991，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年刊，42:21-53)。內(nèi)細(xì)胞器序列對(duì)內(nèi)部位點(diǎn)，如葉綠體內(nèi)的類囊體也是有用的(Theg,S.M.和Scott,S.V1993細(xì)胞生物學(xué)趨勢(shì)，3:186-190)。
除了5’前導(dǎo)序列，終止序列通常也包括在構(gòu)建物中。在植物構(gòu)建物中，3’非翻譯區(qū)域(3’UTR)一般是表達(dá)質(zhì)粒的一部分，并含polyA終止序列。使用的終止區(qū)域通常是一種方便區(qū)域，因?yàn)榻K止區(qū)域呈現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目苫Q性。從根瘤農(nóng)桿菌(A.Tumefaciens)的Ti質(zhì)粒獲得的章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)域，在本發(fā)明的構(gòu)建物中用作這種用途是適合的。
任何適用的技術(shù)可用來(lái)引入本發(fā)明的核酸和構(gòu)建物，以制備帶有改變基因組的轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)于禾本植物如玉米，可使用微型射彈轟擊法(參閱如，Sanford J.C.等人的美國(guó)專利第5,100,792號(hào)，1992)。在這個(gè)具體實(shí)施中，核苷酸構(gòu)建物或含這種構(gòu)建物的載體涂在小顆粒的表面，小顆粒用高速?gòu)椬哟舳氲桨薪M織(細(xì)胞)內(nèi)。載體可以是任何允許外源DNA在引入該載體的植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的載體。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞在適合植物再生的條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
使用多種方法對(duì)帶有構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行所需要的表型的檢測(cè)，這些方法包括但不限于，適當(dāng)?shù)谋硇蜆?biāo)記，如對(duì)抗生素或除草劑的抵抗性，或與自然生長(zhǎng)植物相比，對(duì)花誘導(dǎo)時(shí)間的視覺觀察。
其他已知的將核酸構(gòu)建物插入到植物中的方法包括農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化法(參閱如Smith,R.H.，等人的美國(guó)專利第5,164,310號(hào),1992)，電穿孔法(參閱如Calvin,N.等人的美國(guó)專利第5,098,843號(hào)，1992)，使用激光束引入法(參閱如Kasuya,T.等人的美國(guó)專利第5,013,660號(hào)，1991)，或使用試劑如聚乙烯乙二醇引入法(參閱如Golds,T.等人，1991,生物技術(shù)，11∶95-97)，等等。通常，根據(jù)已熟知的技術(shù)，植物細(xì)胞可用多種載體轉(zhuǎn)化，如病毒，游離基因載體，Ti質(zhì)粒載體等等。對(duì)于本發(fā)明，將核酸引入植物細(xì)胞的方法不是至關(guān)重要的。
本發(fā)明的方法可與不需要培養(yǎng)或再生的in planta或種子轉(zhuǎn)化技術(shù)一起使用。這些技術(shù)的實(shí)例在下列文獻(xiàn)中公開了，Bechtold,N.等人，1993 CR.Acad.Sci.巴黎/生命科學(xué)316∶118-93；Chang,S.S.等人，1990，關(guān)于擬南芥研究第四次國(guó)際會(huì)議摘要，維也納，P.28；Feldmann,K.A.和Marks,D.M.1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9；Ledoux,L.等人，1985,Arabidopsis Inf.Serv.22:1-11；Feldmann,K.A.1992,In擬南芥研究方法(Eds.Koncz,C.,Chua,N-H,Schell,J.)pp.274-289；Chee，等人美國(guó)專利序第5,376,543號(hào)。
轉(zhuǎn)錄開始區(qū)域可提供組成表達(dá)和調(diào)節(jié)表達(dá)。除了ERA1啟動(dòng)子，在植物中起作用的許多啟動(dòng)子可以使用。
植物基因表達(dá)的組成啟動(dòng)子包括但不限于，章魚堿合成酶，胭脂堿合成酶，或從農(nóng)桿菌屬獲取的甘露堿合成酶啟動(dòng)子，花椰菜嵌合病毒(35S)啟動(dòng)子，玄參嵌合病毒(FMV)啟動(dòng)子，及煙草嵌合病毒(TMV)啟動(dòng)子。植物基因組成表達(dá)也可由谷酰胺合成酶啟動(dòng)子(Edwards等人，1990 PNAS 87:3459-3463)，玉米蔗糖合成酶1啟動(dòng)子(Yang等人，1990 PNAS 87:4144-4148)，從Ri質(zhì)粒TLDNA的Rol-C基因獲取的啟動(dòng)子(Sagaya等人，1989，植物細(xì)胞生理，30:649-654)，和pRVC-S-3A啟動(dòng)子的韌皮-特異區(qū)域(Aoyagi等人，1988,Mol.Gen.Genet.213:179-185)提供。
熱擊啟動(dòng)子，核酮糖-1,6-雙磷酸鹽(RUBP)羧基酶小亞單元(ssu)啟動(dòng)子，組織特異啟動(dòng)子等等也可用來(lái)調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)。也可使用發(fā)育調(diào)節(jié)，逆境誘導(dǎo)，傷害誘導(dǎo)或致病誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
調(diào)節(jié)區(qū)域可對(duì)物理刺激反應(yīng)，如光照，如用RUBP羧基酶ssu啟動(dòng)子，分化信號(hào)，或代謝物刺激。有義和反義取向表達(dá)水平和時(shí)間對(duì)所產(chǎn)生的表型有一定的影響。因此，啟動(dòng)子的選擇，與外源DNA取向的偶聯(lián)，在基因組中載體整合位置，將決定引入基因的效果。
調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的具體實(shí)例包括但不限于，低溫Kin1和cor6.6啟動(dòng)子(Wang，等人，1995植物分子生物學(xué)28:605；Wang，等人，1995植物分子生物學(xué)28:619-634),ABA可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(Marcotte Jr.等人，1989植物細(xì)胞1:969-976)，熱擊啟動(dòng)子，如從Drosphilia melanogaster獲取的可誘導(dǎo)hsp70熱擊啟動(dòng)子(Freeling,M.等人，1985，年刊修訂本，基因?qū)W19:297-323),從B.napus獲取的可冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子(White,T.C等人，1994,植物生理學(xué)，106:917)，由乙醇誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶啟動(dòng)子(Nagao,R.T.等人，Miflin,B.J.，植物分子和細(xì)胞生物學(xué)牛津概觀Vol.3,p384-438，牛津大學(xué)出版社，牛津1986)，從擬南芥獲取的韌皮特異蔗糖合成酶ASUS1啟動(dòng)子(Martin，等人，1993植物J.4:367-377),ACS1啟動(dòng)子(Rodrigues-Pousada等人，1993植物細(xì)胞5:897-911)，從玉米獲取的22kDa玉米蛋白啟動(dòng)子(Unger等人，1993植物細(xì)胞5:831-841)。豌豆ps1植物凝集素啟動(dòng)子(de Pater等人，1993植物細(xì)胞5:877-886)，從Phaseolusvulgaris獲取的phas啟動(dòng)子(Frisch等人，1995植物J.7:503-512),lea啟動(dòng)子(Thomas,T.L.1993植物細(xì)胞5:1401-1410),從番茄獲取的E8基因啟動(dòng)子(Cordes等人，1989植物細(xì)胞1:1025-1034),PCNA啟動(dòng)子(Kosugi等人，1995植物J.7:877-886),NTP303啟動(dòng)子(Weterings等人，1995植物J.8:55-63),OSEM啟動(dòng)子(Hattori等人，1995植物J.7:913-925)，從土豆獲取的ADP GP啟動(dòng)子(Muller-Rober等人，1994植物細(xì)胞6:601-604)，從大麥獲取的Myb啟動(dòng)子(Wisenbach等人，1993植物J.4:411-422)，和從擬南芥獲取的質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(Vorst等人，1993植物J.4:933-945)。
載體可用適合宿主細(xì)胞類型的方法引入細(xì)胞(如轉(zhuǎn)化法，電穿孔法，轉(zhuǎn)染法)。對(duì)本文來(lái)說(shuō)，“用…轉(zhuǎn)化的”,“轉(zhuǎn)化體”,“轉(zhuǎn)化”“用…轉(zhuǎn)染”，和“轉(zhuǎn)染”都是指通過一種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將核酸引入細(xì)胞內(nèi)的過程。如，原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化一般通過用氯化鈣處理細(xì)胞以使它們有能力接納外源DNA，然后混合這樣的DNA和“有能力”細(xì)胞而實(shí)施的。原核細(xì)胞也可用重組體噬菌載體感染。
取決于具體細(xì)胞類型，也可采用病毒感染法，細(xì)菌調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移法(如Agrobacterium T-DNA運(yùn)送系統(tǒng))，電穿孔法，磷酸鈣共沉淀法，微注射法，脂轉(zhuǎn)染法，用核酸覆蓋顆粒轟擊法或其他技術(shù)，將核酸引入高等有機(jī)體的細(xì)胞內(nèi)。對(duì)于禾本植物如農(nóng)作物和高梁屬植物，可使用如在Sanford,J.C.等人的美國(guó)專利第5,100,792號(hào)(1992)中所描述的微粒轟擊法。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的其他有用方案在Gelvin等人1992的文獻(xiàn)中提供。轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染細(xì)胞的適用方案也可在Sambrook等人1989的文獻(xiàn)中找到。通過本文所描述的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染技術(shù)，本發(fā)明的核酸構(gòu)建物也可被引入到如前面所描述的那些具體的植物部分中。
為了幫助確定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，可對(duì)本發(fā)明的構(gòu)建物進(jìn)行進(jìn)一步的加工以包括編碼植物可選擇性標(biāo)記的基因。有用的可選擇性標(biāo)記包括提供對(duì)抗生素如慶大霉素、勻霉素、卡那霉素等有抗性的酶。同樣地，提供產(chǎn)生通過顏色改變可識(shí)別的化合物如GUS(β-葡萄糖苷酸酶)，或通過發(fā)光可識(shí)別的化合物如熒光素酶的酶也可使用。
如，反義法呢基轉(zhuǎn)移酶可通過將與含SEQ ID NO:3 DNA聯(lián)接的ERA1基因的互補(bǔ)體，整合到進(jìn)入宿主細(xì)胞的病毒基因組內(nèi)來(lái)制備。通過感染宿主細(xì)胞，允許反義基因的轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)的組成就存在于宿主細(xì)胞中。
當(dāng)獲得被本發(fā)明的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含反義基因的細(xì)胞和原生質(zhì)體時(shí)，細(xì)胞或原生質(zhì)體再生成整體植物。然后在適合植物再生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。選擇再生步驟的方法不是至關(guān)重要的，已經(jīng)存在著眾多的適用于植物，組織和其他光合有機(jī)體的適當(dāng)方案。參閱如Gelvin S.B.和Schilperoort R.A.eds.植物分子生物學(xué)手冊(cè)，第二版，增刊1,1995 Kluwer學(xué)院出版社，波士頓，馬薩諸塞州，美國(guó)。
可使用多種方法對(duì)帶有構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行所需要的表型的檢測(cè)，這些方法包括但不限于，適當(dāng)?shù)谋硇蜆?biāo)記，如對(duì)抗生素或除草劑的抗性，如前所述，或視覺觀察生長(zhǎng)狀況，與在相同的條件下自然生長(zhǎng)植物的生長(zhǎng)狀況相比較。
在本文所使用的術(shù)語(yǔ)，轉(zhuǎn)基因植物，包括，含在野生型植物(天然的)或已知變異體中不是自然產(chǎn)生的DNA或RNA的植物，或含如本文所描述的方法引入的自然產(chǎn)生的DNA另外的或反向復(fù)制體的植物。轉(zhuǎn)基因植物包括其中分離核酸已被引入的植物，和由種子，營(yíng)養(yǎng)性繁殖，細(xì)胞，組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)物等產(chǎn)生的其中維持著這種改變的它們的后代。
在一個(gè)具體實(shí)施中，這樣的轉(zhuǎn)基因植物包括，轉(zhuǎn)基因植物是被子植物，單子葉植物和雙子葉植物。轉(zhuǎn)基因植物包括DNA已被引入的植物，和由種子，營(yíng)養(yǎng)性繁殖，細(xì)胞，組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)物等產(chǎn)生的它們的后代。
種子可從再生植物獲得，或從再生植物和適當(dāng)?shù)耐锓N植物雜交獲得。另外，植物也可通過在適合這種植物部分再生的條件下，培養(yǎng)植物部分進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)性繁殖而獲得。
另一方面，本發(fā)明提供了植物組織培養(yǎng)物和原生質(zhì)體，其中含有包括反義基因或可與REA1啟動(dòng)子可工作地聯(lián)接的改變的ERA1核酸的DNA，這改變了植物組織或原生質(zhì)體對(duì)不同環(huán)境條件的反應(yīng)。
本發(fā)明的方法還與不需要培養(yǎng)或再生的in planta或種子轉(zhuǎn)化技術(shù)一起使用。這些技術(shù)的實(shí)例在Bechtold,N.等人，1993 CR.Acad.Sci.巴黎/生命科學(xué)316:118-93；Chang,S.S.等人，1990,關(guān)于擬南芥研究第四次國(guó)際會(huì)議摘要，維也納，P.28；Feldmann,K.A.和Marks,D.M.1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9；Ledoux,L.等人，1985,Arabidopsis Inf.Serv.22:1-11；Feldmann,K.A.1992,In:Arabidopsis研究方法(Eds.Koncz,C.,Chua,N-H,Schell,J.)pp.274-289；Chee，等人美國(guó)專利第5,376,543號(hào)中作了描述。
具體實(shí)施本發(fā)明的方法和構(gòu)建物有許多具有商業(yè)價(jià)值的應(yīng)用，特別是在水分逆境期間預(yù)防植物組織干燥方面。摻入法呢基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑或抑制編碼外源植物法呢基轉(zhuǎn)移酶的基因，對(duì)農(nóng)作植物的基因加工會(huì)使這樣的植物能忍耐暫時(shí)的環(huán)境逆境，并能拓寬這些植物可以生長(zhǎng)的環(huán)境。這樣改進(jìn)農(nóng)作植物對(duì)寒冷，鹽度和干旱逆境的耐力，可提高植物在這樣的不利條件下的產(chǎn)量。
本文所描述的技術(shù)也可用來(lái)改變植物的收獲時(shí)間和收獲質(zhì)量。如，過度表達(dá)法呢基轉(zhuǎn)移酶會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物快速干燥，如谷物和其他禾本植物。干燥谷物包括使用大量的丙烷氣體。農(nóng)作物如干草的干燥時(shí)間，在田地里自然干燥會(huì)被縮短，使雨水對(duì)農(nóng)作物毀壞的可能減小。
此外，對(duì)植物法呢基作用的抑制也可用來(lái)控制植物的衰老程序，這樣葉子可以保持在綠色狀態(tài)更長(zhǎng)些，果實(shí)可以保持不成熟。例如，如果將ERA1的反義構(gòu)建物或CaaX框抑制劑蛋白質(zhì)構(gòu)建物置于衰老誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，那么當(dāng)衰老程序被啟動(dòng)，植物會(huì)誘導(dǎo)法呢基作用的抑制劑，這樣聚抑制了衰老。結(jié)果是植物保持綠色或果實(shí)保持不成熟。這樣，植物會(huì)堅(jiān)持更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)生產(chǎn)產(chǎn)物，如營(yíng)養(yǎng)性部分，花或果實(shí)。這樣，園藝師可以制備出保持綠色并持續(xù)生長(zhǎng)的植物，在相同的條件下，相同種類的野生型植物甚至開始衰老了。切花可被保持更長(zhǎng)的時(shí)間?；蚬麑?shí)可保持不成熟，對(duì)蔬菜工業(yè)是重要成果，產(chǎn)物壽命對(duì)市場(chǎng)是非常重要的。
并且，抑制果實(shí)和蔬菜中的法呢基轉(zhuǎn)移酶可減緩枯萎。這樣，在運(yùn)送和運(yùn)輸期間產(chǎn)物的枯萎能被減緩。果實(shí)和蔬菜在商店貨架上也會(huì)需要較少水霧以保持它們的新鮮和味道，這樣就較少需要給產(chǎn)物如黃瓜，蘋果和橙子涂蠟以防止它們變干。
較少澆水也意味著真菌和細(xì)菌對(duì)農(nóng)作物，或果實(shí)和蔬菜的襲擊會(huì)減小。如，由于植物病原體從土壤飛濺到植物葉子和果實(shí)而產(chǎn)生的田地中的植物疾病會(huì)被抑制。
在園藝領(lǐng)域中，可制備許多抗干旱植物品種用來(lái)美化風(fēng)景及用作裝飾房屋的植物。特別有價(jià)值的是用作盆栽的各種植物，如用作辦公室和家居內(nèi)外的裝飾，并且不常澆水也能存活。這對(duì)園藝師來(lái)說(shuō)是相當(dāng)實(shí)惠的，特別在干旱夏季的幾個(gè)月期間，忘記照顧的植物在太陽(yáng)下很快變干。并且，生長(zhǎng)在樹下和其他陰暗區(qū)域內(nèi)的植物常常遭受干旱條件和有限的光照。本文所提供的技術(shù)可提供在這些條件下能較好生存的植物品種。
在另一個(gè)具體實(shí)施中，園藝師會(huì)發(fā)現(xiàn)其側(cè)分枝和/或花的數(shù)目可用光照/黑暗循環(huán)來(lái)調(diào)節(jié)的植物的許多用途。莖干較長(zhǎng)且無(wú)分枝會(huì)帶來(lái)市場(chǎng)利益的植物實(shí)例包括玫瑰，康耐馨，百合等。能增加植物上的花或菊科小花的數(shù)目也具有很高的價(jià)值。這些特性對(duì)于許多農(nóng)作物也是有用的，使用更容易收獲的方式使產(chǎn)量增加。
本文提供的方法和構(gòu)建的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，ERA1啟動(dòng)子在葉子的保衛(wèi)細(xì)胞中是活性的。部分ERA1基因啟動(dòng)子可融合到ERA1基因的反義核酸中，這樣法呢基轉(zhuǎn)移酶的活性只在保衛(wèi)細(xì)胞中被減小。
另一個(gè)具體實(shí)施是使用抗干旱特性作為植物，植物細(xì)胞，植物組織轉(zhuǎn)化作用的可選擇標(biāo)記。檢測(cè)植物轉(zhuǎn)化作用的一種方法包括(a)摻入含可與含SEQ ID NO:1反義基因核酸，或含反義基因功能等同物的核酸可工作地聯(lián)接的啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建物；(b)將核酸構(gòu)建物插入到植物，植物細(xì)胞，或植物組織中；(c)培育植物，或從植物細(xì)胞或植物組織再生植物直到氣孔形成；(d)將植物或再生植物置于植物處于干旱逆境條件下，其中在干旱條件下存活植物與未轉(zhuǎn)化植物相比較說(shuō)明轉(zhuǎn)化。這樣這種技術(shù)可用作可選擇的基因標(biāo)記，如特別當(dāng)與植物選擇和轉(zhuǎn)化設(shè)計(jì)結(jié)合時(shí)可用作視標(biāo)記。
此外，在沒有采取措施處理基因植物的情況下，失去法呢基轉(zhuǎn)移酶功能的植物的分枝和或開花習(xí)性與野生型植物顯著不同，這可用作轉(zhuǎn)化成功的標(biāo)記。在采用植物中(in planta)轉(zhuǎn)化技術(shù)的領(lǐng)域中，這種方法非常有用。在晝夜光照條件下，轉(zhuǎn)基因植物的椏枝顯示比未轉(zhuǎn)化的椏枝較少分枝，這樣在沒有使用選擇性抗生素標(biāo)記的情況下，有效顯示出法呢基轉(zhuǎn)移酶活失去。實(shí)例實(shí)例1突變發(fā)生條件本研究所使用的擬南芥(Arabidopsis)植物在連續(xù)光照在土壤或含瓊脂的陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，如在其他文獻(xiàn)中所描述的(Haughn和Somerville)使用兩種不同的野生型擬南芥Meyerowitz的Colombia(Col)(Lelhe種子，Dripping Springs,TX)和Wassilewskija(Ws)(ABRC，俄亥俄州立大學(xué))。將用篩查T-DNA基因突變種子分離出的突變體置于Wssailewkija背景中。這些從俄亥俄州擬南芥種子儲(chǔ)備站(ABRC儲(chǔ)備號(hào)CS2606-2654)獲得。T-DNA種子站包括從100個(gè)基因突變親體獲取的49組1200個(gè)第四代(T4)后代?；蛲蛔冇H體是通過在充滿農(nóng)桿菌屬的含T-DNA質(zhì)粒的培養(yǎng)物中培育野生型種子(T1)獲得的。種子用水沖洗并種在罐中。T2代種子從每株植物獲得并作抗卡那霉素試驗(yàn)(在T-DNA上實(shí)施)。抗卡那霉素植物培育到T3代。T4代種子交給儲(chǔ)備中心。每組獨(dú)立篩查。
將通過篩查快速中子照射過的種子分離的突變體置于Meyerowitz的Columbia背景中?；蛲蛔兊囊吧头N子(N1)用60Gy的快速中子照射并培育到下一代。獲得從1387個(gè)N1親體產(chǎn)出的約11,000個(gè)種子的N2種子庫(kù)。十個(gè)種子庫(kù)獨(dú)立進(jìn)行ABA超敏感突變篩查。在初始篩查時(shí)種子保存在4℃不吸脹置于板上。所有后面重篩查的種子在4℃0.3μM ABA下吸脹一周，并評(píng)定在22℃光照下5-7天后的子葉突出體。
實(shí)例2基因分析突變體組與野生型植物反交三次。T-DNA突變與Ws反交，快速中子突變與Mcol反交。Era表型隔離后，將F2種子覆在0.3μM ABA板上并吸脹4天。吸脹后，將板轉(zhuǎn)移到室溫光照下。在吸脹后一周當(dāng)秧苗上存在或不存在張開的子葉時(shí)測(cè)定發(fā)芽。通過雜交隔離后每種突變的純合子組，及識(shí)別帶有一種突變體顯型的組構(gòu)建雙突變體。使用在本研究中的abi3等位基因是abi3-6(Nambara等人，1994)和abi1-1(Koornneef等人，1982)。Era1-2等位基因用作era親體。隔離分析顯示era1部分地抑制abi1的不敏感性，這樣，F(xiàn)2植物首先被篩查到對(duì)3mM ABA不敏感性，對(duì)從這些植物獲取的F3種子評(píng)定對(duì)0.3μM ABA敏感性。推定雙突變體是在F4代中測(cè)試的后代，并通過Abi1和Era1的DNA多態(tài)性證實(shí)。對(duì)于era1和abi1雙突變體，對(duì)F2種子篩查不敏感性(對(duì)3μMABA)，對(duì)突變體植物進(jìn)行突出心皮和不成熟綠色種子評(píng)定(Nambara等人，1994)。推定的雙突變體組被Abi1和Era1的DNA多態(tài)性證實(shí)。
實(shí)例3:DNA和RNA分析用已描述的方法提取DNA(Dellaporta等人，1983)和RNA(Verwoerd等人，1989)。如所描述在65C實(shí)施高度嚴(yán)緊Southerns(Sambrook等人，1989)。依據(jù)制造商(Gelman Sciences)建議在Gelman BioTrace NT膜上實(shí)施基因組和cDNA文庫(kù)篩查?？寺12W突變體(era1-1)內(nèi)的T-DNA和基因組DNA之間插入結(jié)合點(diǎn)，T12W DNA文庫(kù)在γ-ZAPⅡ(Stratagene)中制備。用EcoRI消化及用T-DNA右邊探測(cè)的T12W DNA的基因組Southern印跡產(chǎn)生三條帶(13kb,7.0kb，和8.0kb)。隨后用其他限制酶證實(shí)7和8kb的帶含T-DNA的插入點(diǎn)，并是側(cè)翼植物DNA。通過用EcoRI消化基因組DNA克隆這些片段，使用Prep細(xì)胞(Pharmacia)分級(jí)分離DNA。使用PB作探針，通過對(duì)匯集分級(jí)進(jìn)行Southern分析確定分級(jí)含7和8kb片段。依據(jù)制造商建議(Stratagene)將這些匯集體結(jié)合在γ-ZAPⅡ臂上。對(duì)40,000重組體文庫(kù)進(jìn)行篩查。確定5個(gè)陽(yáng)性噬菌斑，并依據(jù)制造商建議(Stratagene)分離克隆插入的切除質(zhì)粒形式。選定pL4B和pL7的兩個(gè)質(zhì)粒，與PB探針雜交進(jìn)一步定性。使用pBluescript，從pL4B獲取的2.3kb的EcoRI BamHⅠ片段亞克隆，選定pSC10，從pL7獲取的1.3kb的HindⅢ BamHⅠ片段亞克隆，選定pSC11。這兩個(gè)質(zhì)粒含約1.2kb T-DNA與側(cè)翼植物DNA相連。將pSC10用作探針篩查擬南芥cDNA文庫(kù)，PRL21-ZipLox(ABRC,StockCD4-7)。確定5個(gè)cDNA和最長(zhǎng)的cDNA插入，pZL23，用來(lái)篩查其他200,00 PRL2噬菌體。從這次篩查，較長(zhǎng)cDNA插入，pZL51,(1.35kb)被分離。測(cè)序這些克隆體，并用來(lái)篩查從部分消化的EcoEI野生型Columbia基因組DNA制備的30.000γ-ZAPⅡ噬菌斑。如上所述除了不分級(jí)分離消化的DNA構(gòu)建這種文庫(kù)。確定4個(gè)陽(yáng)性克隆體。插入被切除，對(duì)含pZL51克隆的6kb區(qū)域進(jìn)行徹底測(cè)序。用同樣的方法(ABRC,Stock CD4-7)?？蓪?-FIX Lansberg erecta基因文庫(kù)中分離的這種基因組插入和14kb基因組插入用作探針,以篩查在快速中子突變體(era1-2,era1-3)中的刪除部分。
實(shí)例4蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試使用從野生型植物和突變體植物中提取的游離細(xì)胞作為法呢基轉(zhuǎn)移酶源，合成七肽作為反應(yīng)底物，實(shí)施法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)測(cè)試。肽從Genemed生物技術(shù)公司購(gòu)得。肽的適當(dāng)序列以Randall等人的1993年資料為根據(jù)；它們是GGCCAIM(-CAIM)和GGCCALL(-CALL)。肽溶液制備在含10mM的二硫蘇糖醇(DTT)的100％二甲基亞砜(DMSO)中，并用無(wú)DNSO的10mM DTT稀釋。作轉(zhuǎn)移酶測(cè)試的法呢基轉(zhuǎn)移酶源是取自三周大的植物萌芽的可溶蛋白質(zhì)。收集1g野生型植物和突變體植物的萌芽(鮮重)，并均勻分布在(含50mM Hepes pH7.5,1mMMgCl2,1mM EGTA,5mM DTT,2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑肽素，和1mM PMSF)緩沖液中。在4℃,10,000g 10分鐘和100,000g,30分鐘離心分離細(xì)胞碎片和膜。保留留在表面的物質(zhì),依據(jù)Bradford(1976)測(cè)定可溶蛋白質(zhì)的總量?？扇芴崛∥镉秒牡孜锖?H-法呢基焦磷酸酯(Amershem)在30℃溫育40分鐘。每種總體積25μl的反應(yīng)混合物含有下列組分50mMHepes pH7.5,5mM MgCl2,5mM DTT,50μM肽，0.5μM[3H]FPP,100μg可溶蛋白質(zhì)提取物。作為對(duì)照一個(gè)含可溶提取物的反應(yīng)煮沸5分鐘。加入EDTA到最終濃度為50mM反應(yīng)終止，然后點(diǎn)在薄層硅膠60色譜板上(Millipore)。用n-丙醇-水(7∶3v/v)將板顯影4-5小時(shí)。干燥板，用En3Hance(新英格蘭Nuclear)噴灑，在-70℃，對(duì)柯達(dá)X-OMAT AR膠片曝光4天。
實(shí)例5:ERA1-GUS基因構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植物ERA1-GUS融合構(gòu)建是通過將ERA1啟動(dòng)子的5kb EcoEⅠ-HindⅢ基因組片段插入到無(wú)啟動(dòng)子的GUS T-DNA質(zhì)粒(pBI121)中制備的。將這種構(gòu)建轉(zhuǎn)化成農(nóng)桿菌屬菌株LB4404。將農(nóng)桿菌屬培育到(0.8O.D.單位，595nm)，然后用水徹底沖洗，將細(xì)胞重新懸浮在10％甘油中，在電穿孔器中在200 Ohms,25μF,2.5伏特下脈沖處理。然后將細(xì)胞鋪在有LB介質(zhì)和氨比西林(100μg/ml)板上，并在28℃培育2天?？拱北任髁洲D(zhuǎn)化株使用在隨后的植物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，用充滿農(nóng)桿菌屬的培養(yǎng)物(0.8O.D.單位，595nm)真空滲透植物制備轉(zhuǎn)基因植物。野生型植物在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件(25℃,150μEm-2sec-1，濕潤(rùn)，連續(xù)光照)下培育，直到約5周它們產(chǎn)生它們的最初抽苔。移出莖干，并將植物浸沒在農(nóng)桿菌屬溶液中，置于真空(20mBar)下5分鐘。真空中斷后將植物轉(zhuǎn)移到土壤中，并在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下恢復(fù)。植物產(chǎn)生2個(gè)月后收獲的新的花和種子，并干燥2周。從個(gè)體植物獲取的種子種在最小限度介質(zhì)MS的培養(yǎng)皿(含50μg/ml卡那霉素)上。確定綠色抗卡那霉素植物小芽，并將其2周后移到土壤中，使其培育到接種。將這些種子發(fā)芽，使用熒光GUS底物Imagene綠(分子探針，Eugene,Oregon)檢測(cè)秧苗的GUS活性。在室溫下黑暗中，通過將秧苗懸浮在GUS-緩沖液(50mM磷酸鈉，pH7.0,10mM EDTA,0.1％Triton X-100,0.1％sarcosyl鈉，4mM Imagene綠)中2-4小時(shí)來(lái)實(shí)施檢測(cè)。將秧苗直接在顯微鏡(25X)下觀察，對(duì)正熒光信號(hào)使用藍(lán)色激發(fā)光，其在紅色葉綠素自熒光背景上呈黃色。
實(shí)例6干旱試驗(yàn)六株野生型秧苗和六株era1-2秧苗在連續(xù)光照(25℃,150 μEm-2 sec-1,70％濕度，連續(xù)光照)下培育4周。然后用錫紙將罐蓋住以減緩?fù)寥勒舭l(fā)，植物和罐稱重。這時(shí)，不再給植物澆水，每天稱重罐。在試驗(yàn)的最后將植物移出，將罐再干燥兩周，然后稱重以確定干燥土壤和罐的重量。將這個(gè)重量從每個(gè)樣品中減去。
實(shí)例7離體葉子中與年齡有關(guān)的變化當(dāng)擬南芥植物成年葉子離體后，將野生型Columbia和era1-2突變體成年葉子中的葉綠素含量作比較。植物在連續(xù)光照(150μE m-2sec-1)和22℃溫度下培育到相同的發(fā)育年齡(發(fā)芽后3周)。這時(shí)，摘掉發(fā)芽后已長(zhǎng)出葉子的幾株植物的第五片葉子，并將其置于陪替氏培養(yǎng)皿中含最小限度鹽的0.8％瓊脂上。將植物密封并置于連續(xù)光照(50μE m-2sec-1)環(huán)境中12天。拍攝并比較0,3,6,9,12天的顏色。
實(shí)例8在衰老葉子中選擇基因的轉(zhuǎn)錄水平確定植物在連續(xù)光照(150μEm-2sec-1)和22℃溫度下培育到相同的發(fā)育年齡(發(fā)芽后4周)，這時(shí)，摘掉突變體(era1-2)植物和野生型植物發(fā)芽后長(zhǎng)出的第五片葉子。用Northern分析對(duì)這些葉子作三種基因(CAB,SAG12,SAG13)表達(dá)的檢測(cè)。CAB基因編碼涉及光合作用中捕獲光的擬南芥葉綠素結(jié)合蛋白質(zhì)。CBA對(duì)于葉子綠色是必需的，并且它也是植物中葉綠素?fù)Q新率很好的標(biāo)記。一旦衰老被誘導(dǎo)，野生型植物中CBA顯示轉(zhuǎn)錄水平降低。在era1-2突變體的衰老葉子中沒有觀察到轉(zhuǎn)錄水平降低。SAG12和SAG13是衰老期間由差異表達(dá)克隆的擬南芥基因(SAG表示衰老激活基因)。在野生型擬南芥植物中衰老開始期間兩種基因的轉(zhuǎn)錄都被誘導(dǎo)。可以確定這些基因在相同的發(fā)育條件下在era-2突變體中沒有被誘導(dǎo)。
參考文獻(xiàn)Baskin,JM和Baskin,CC(1971)在Can J Bot 50:277的文獻(xiàn)。Chandler,PM和Robertson,M(1994)由落葉酸調(diào)節(jié)的基因表達(dá)及其與逆境耐力的關(guān)系。Ann Rev植物生理和植物分子生物學(xué)45:113-141。Chen,W-J,Anders,DA,Goldstein,JL,Russell,DW, Brown,MS(1991)細(xì)胞66:327。Cutler,S,Ghassemian,M,Bonetta,D,Cooney,S,McCourt,P(1996)在擬南芥中涉及落葉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶?？茖W(xué)273:1239-1241。Dellaporta,S.L.Wood,J.和Hicks,J.B.(1983)。植物DNA的微量制備譯本Ⅱ，植物分子生物學(xué)，Rep.1:19-21。Eisenmann,D.M.和Kim,S.K.(1994)。Caenorhabditis elegans陰門發(fā)育期間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞fate特異性。Curr.Opin.Genet.Dev.4:508-516。Ellington,A.(1987),DNA的制備和分析。分子生物學(xué)最新方案，F(xiàn).Ausubel等人，eds.(Boston,Greene).pp.2.0.1-2.12.5。Goodman,LE,Perou,CM,Fujiyama,A,Tamanoi,F(1988)酵母4:271。Haughn,G和Somerville,C.R.(1986),Arabidopsis thaliana的抗磺脲突變體，Mol.Gen.Genet,204:430-434。Koornneef,M,Reuling,G和Karssen,CM(1984),Arabidopsisthaliana的落葉酸不敏感突變體的分離和特性，植物生理學(xué)，61:377-383。Leung,J,Bouvier-Durand,M,Morris,P-C,Guerrier,D,Chefdor,F,和Giraudat,J(1994)擬南芥落葉酸反應(yīng)基因ABI1鈣調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸酯酶的特性，科學(xué)264:1448-1455。Meyer,K,Leube,MP，和Grill,E(1994)Arabidopsis thaliana中涉及落葉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)磷酸酯酶2C，科學(xué)264:1452-1455。Randall,SK,Marshall,MS,Crowell,DN(1993)，懸浮培養(yǎng)煙草細(xì)胞的蛋白質(zhì)異戊二烯基化作用，植物細(xì)胞5:433-442。Reid,JB，和Howell,SH(1995)，植物生長(zhǎng)及發(fā)育中激素的功能，植物激素生理學(xué)，生物化學(xué)及分子生物學(xué)，2nd ed.P.Davies ed.(Dortrencht Kluwer)PP.448-485。Sambrook,J.,E.F.Fritsch和Maniatis,T.(1989).分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(寒春碼頭，紐約寒春碼頭實(shí)驗(yàn)出版社)。Schafer,WR，和Rine,J(1992)，蛋白質(zhì)異戊二烯基化作用基因，酶，靶和功能，Ann Rev Genet 30:209-237。Shirley,BW,Hanley,S,Goodman,HM(1992)植物細(xì)胞4:333。Verwoerd,T.C.,Deeker,B.M.M和Hoekema,A.(1989)，植物RNA快速分離小規(guī)模技術(shù)，核酸研究17:2362。Yang,Z,Cramer,CL，和Watson,JC(1993)植物蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶，植物生理學(xué)101:667-674。
權(quán)利要求
1．一種分離的核酸，其包括SEQ ID NO:1或其功能等同物。
2．一種分離的核酸，其包括20-200個(gè)SEQ ID NO:1的連續(xù)核苷。
3．一種分離的核酸，其(a)在高度嚴(yán)緊條件下與權(quán)利要求2的DNA雜交；(b)與權(quán)利要求1的DNA有80％的相同序列；(c)含有權(quán)利要求2的DNA的互補(bǔ)序列。
4．一種分離的蛋白質(zhì)，其包括SEQ ID NO:2或其功能等同物。
5．一種多肽，其與權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)有80％的相同序列。
6．一種分離的核酸構(gòu)建物，其包括(a)啟動(dòng)子；以及(b)編碼植物法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的核酸。
7．一種轉(zhuǎn)基因植物，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
9．一種植物部分，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物。
10．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是單子葉植物。
11．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是雙子葉植物。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是Brassica sp。
13．一種細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物。
14．從權(quán)利要求13的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物再生的植物。
15．一種含權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物的植物，與在相同環(huán)境條件下自然生長(zhǎng)的相同種類植物相比具有改進(jìn)的抗干旱，鹽度，寒冷逆境的耐力。
16．一種含編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶基因突變的植物，導(dǎo)致法呢基轉(zhuǎn)移酶活性失去。
17．轉(zhuǎn)基因植物種子，其中由于植物轉(zhuǎn)化，或再生制備轉(zhuǎn)基因植物的植物部分轉(zhuǎn)化造成種子內(nèi)法呢基轉(zhuǎn)移酶活性被抑制，其中所說(shuō)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致法呢基轉(zhuǎn)移酶活性失去。
18．一種改變植物中法呢基轉(zhuǎn)移酶水平的方法，該方法包括(a)轉(zhuǎn)移核酸到植物從中再生的植物細(xì)胞中，其中核酸包括在高度嚴(yán)緊條件下與含SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA雜交的分離核酸，其中所說(shuō)的核酸編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶活性必需的產(chǎn)物；(b)從植物細(xì)胞再生植物，這樣植物表達(dá)核酸。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中的核酸包括擬南芥(Arabidopsis)法呢基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
20．一種制備抗干旱植物的方法，該方法包括(a)制備核酸構(gòu)建物，其含可與含SEQ ID NO:1反義序列的核酸或與含反義序列功能等同物的核酸可工作地聯(lián)接的啟動(dòng)子；(b)將核酸構(gòu)建物插入到載體中；(c)用載體轉(zhuǎn)化植物，組織培養(yǎng)物，或植物細(xì)胞；(d)從組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞培育植物或再生植物；其中抗干旱植物被制備。
21．一種檢測(cè)植物轉(zhuǎn)化的方法，該方法包括(a)摻入核酸構(gòu)建物，其含可與含SEQ ID NO:1反義序列的核酸或與含反義序列功能等同物的核酸可工作地聯(lián)接的啟動(dòng)子；(b)將核酸構(gòu)建物插入到植物，植物細(xì)胞或植物組織中；(c)從組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞培育植物或再生植物直到氣孔形成；(d)將植物或再生植物置于其中植物處于干旱逆境條件下，其中在干旱條件下存活的植物與未轉(zhuǎn)化植物相比較說(shuō)明轉(zhuǎn)化。
22．一種減少側(cè)分枝的方法，其中包括將編碼抑制內(nèi)源法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)物的核酸引入到植物或植物細(xì)胞內(nèi)。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中核酸是從含25-200個(gè)或更多個(gè)與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸，或含25個(gè)或更多個(gè)SEQ ID NO:1連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)體的寡聚核苷酸；編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑肽的核酸中選取的。
24．根據(jù)權(quán)利要求22的方法制備的植物。
25．根據(jù)權(quán)利要求22的方法制備的植物的種子。
26．一種延遲衰老的方法，其包括將編碼抑制內(nèi)源法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)物的核酸引入植物或植物細(xì)胞中。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中核酸是從含25-200個(gè)或更多個(gè)與SEQ ID NO:1互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸，或含25個(gè)或更多個(gè)SEQ ID NO:1連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)體的寡聚核苷酸；編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑肽的核酸中選取的。
28．根據(jù)權(quán)利要求26的方法制備的植物。
29．根據(jù)權(quán)利要求26的方法制備的植物的種子。
30．一種在相同環(huán)境條件下與自然生長(zhǎng)植物相比，通過抑制植物中法呢基轉(zhuǎn)移酶活性在植物中延遲衰老，維持葉綠素含量，減少側(cè)分枝，增加每個(gè)花序的花朵數(shù)量的方法。
全文摘要
本發(fā)明的新型構(gòu)建物和方法改進(jìn)了植物對(duì)環(huán)境逆境和衰老的耐力。描述了編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的核酸,也描述了摻入這些核酸和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物和種子。還提供了天然法呢基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑,當(dāng)表達(dá)時(shí),會(huì)增強(qiáng)植物對(duì)干旱的耐力,提高抗衰老能力,改變生長(zhǎng)習(xí)性。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1314944SQ98808770
公開日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1998年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月1日
發(fā)明者彼得·麥克康特, 馬奇德·戈斯梅恩, 肖恩·卡特勒, 達(dá)里奧·伯尼塔 申請(qǐng)人:波夫曼斯種植公司