專利名稱：冷凍食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗凍蛋白(AFP)和含AFP的冷凍食品。
背景技術(shù)：
已經(jīng)提出抗凍蛋白(AFP)用于改善食料的耐凍性。
對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)AFP的含義是本領(lǐng)域眾所周知的，即這些蛋白顯示抑制冰晶生長(zhǎng)的活性。參見例如US5，118，792。
WO90/13571公開了化學(xué)生產(chǎn)或用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗凍肽。所述AFP適用于食品。
WO92/22581公開了可用于控制冰淇淋中的冰晶形狀的得自植物的AFP。該文獻(xiàn)也描述了通過用提取介質(zhì)浸潤(rùn)葉子而不需要破裂所述植物從植物細(xì)胞外間隙提取多肽組合物的方法。
WO94/03617公開了從酵母生產(chǎn)AFP及其在冰淇淋方面的可能應(yīng)用。WO96/11586描述了微生物生產(chǎn)的魚AFP。
數(shù)個(gè)文獻(xiàn)也講述了分離和/或應(yīng)用植物蛋白用于冷凍保護(hù)。冷凍保護(hù)蛋白的功能是保護(hù)植物膜抵抗霜害。然而，這些蛋白不具有重結(jié)晶抑制特性，因此不包含在所述術(shù)語(yǔ)AFP中。
Hincha在《植物生理學(xué)雜志》(Journal of Plant Physiology)，1992，140，236-240中描述了從甘藍(lán)分離冷凍保護(hù)蛋白。Volger在Biochimicaet Biophysica Acta，412(1975)，335-349中描述了從菠菜分離冷凍保護(hù)的葉蛋白。Boothe在《植物生理學(xué)》(Plant Physiol)(1995)，108759-803中描述了從歐洲油菜(Brassica napus)分離蛋白。此外，認(rèn)為這些蛋白是冷凍保護(hù)蛋白而不是AFP。Neven在《植物分子生物學(xué)》(Plant Molecular Biology)21291-305，1993中描述了菠菜冷凍保護(hù)蛋白的DNA特征鑒定。Salzman在Am.J.Eno1.Vitic.，第44卷，第4期，1993中的ASEV/東部地區(qū)的第18屆年會(huì)的摘要和綜述中描述了在葡萄屬(Vitis)的芽中存在煮沸穩(wěn)定的多肽。盡管所述蛋白類似于魚抗凍肽，但是它們是冷凍保護(hù)蛋白而不是AFP。Lin在《生物化學(xué)生物物理研究通訊》(Biochemical and Biophysical ResearchCommunication)，第183卷，第3期，1992，第1103-1108和Lin在《植物生理學(xué)》(Plant Physiology)(1992)，99519-525中描述了得自擬南芥屬(Arabidopsis Hakaira)的15kDa冷凍保護(hù)多肽。Houde在《植物雜志》(The Plant Journal)(1995)8(4)，583-593中講述了得自小麥的冷凍保護(hù)蛋白。然而，直到現(xiàn)在仍然未將AFP應(yīng)用到市售食品。其原因之一是成本高和獲得AFP的方法復(fù)雜。另一個(gè)原因是至今已經(jīng)提出用于冷凍食品的AFP不能摻入標(biāo)準(zhǔn)配方混合料中，因?yàn)樗鼈兺诩庸み^程中尤其是在巴氏消毒法步驟中變得不穩(wěn)定。認(rèn)為這種不穩(wěn)定是由所述AFP變性引起的；這是在肽和蛋白質(zhì)普遍觀察到的眾所周知的效應(yīng)。
在我們非預(yù)公開的專利申請(qǐng)WO98/4148中，已經(jīng)描述了特別好的AFP可以從天然來源例如地衣屬(Lichen)分離。
申請(qǐng)人現(xiàn)在已經(jīng)能確定來自地衣屬特別有效的AFP的部分氨基酸序列。
因此本發(fā)明涉及可以得自地衣屬的AFP，所述AFP的表觀分子量約為24kDa，而N末端的氨基酸序列為A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L具有與上述序列高度相似的序列的蛋白也包括在我們的發(fā)明范圍內(nèi)。對(duì)于本發(fā)明的目的，其氨基酸序列與上述序列至少80％重疊的所有RI活性蛋白也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。更優(yōu)選重疊至少90％最優(yōu)選重疊高于95％，例如與上述序列相同或僅有一個(gè)或二個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。
對(duì)于本發(fā)明的目的，兩種(部分)氨基酸序列的重疊程度可以如下計(jì)算(a)對(duì)所述兩種氨基酸序列進(jìn)行序列對(duì)比并對(duì)相同并以相同順序出現(xiàn)的氨基酸數(shù)(X)進(jìn)行計(jì)數(shù)(b)氨基酸的每個(gè)變化、缺失或添加變化記為1點(diǎn)，而總變化、缺失和添加記為(Y)。
(c)現(xiàn)在可以按X*100％/(X+Y)計(jì)算重疊度。
例如，N末端的(部分)氨基酸序列A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-T-A-H-G-G-L可以如下與對(duì)照進(jìn)行序列對(duì)比A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-LA-P-A-W -M- D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L這產(chǎn)生相同位次相同氨基酸的總數(shù)17個(gè)。變化數(shù)為1個(gè)(在第四位W變成V)；添加數(shù)為2(第五位的V，第七位的G)，無(wú)缺失。因此總的變化、添加和缺失為3。這導(dǎo)致重疊度為17*100％/(17+3)=85％。
具有N末端(部分)氨基酸序列A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L的蛋白也因此包括在本發(fā)明中。
修飾型的上述蛋白也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，因此所述修飾實(shí)際上不影響冰重結(jié)晶抑制特性，例如其糖基化型。
對(duì)于本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)約24kDa的分子量是指用標(biāo)準(zhǔn)參比標(biāo)記在SDS-PAGE上測(cè)定的20-28kDa范圍內(nèi)的任何分子量，更優(yōu)選該分子量為22-26kDa。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)AFP可以得自地衣屬，尤其是Umbilicaria antarctica物種。
盡管抗凍蛋白開始得自于地衣屬，但是用其它方法(例如用基因修飾技術(shù))生產(chǎn)的抗凍蛋白也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，因此例如對(duì)微生物或植物進(jìn)行基因修飾以產(chǎn)生上述蛋白。這些蛋白也包括在所述術(shù)語(yǔ)“可得自地衣屬”。
能夠編碼上述AFP的核酸序列也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
含能夠編碼本發(fā)明AFP的核酸序列的載體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)以上信息，還可能的是基因修飾其它天然來源，使得它們產(chǎn)生上文鑒定的有益的AFP。
申請(qǐng)人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以上序列的AFP改善了冰重結(jié)晶抑制特性。測(cè)定冰重結(jié)晶抑制特性的合適的試驗(yàn)描述于實(shí)施例，包括快速冷凍至至少40℃(例如-80℃)，然后于-6℃保藏一小時(shí)。按照本發(fā)明的AFP最好在冰重結(jié)晶抑制測(cè)定(如實(shí)施例中所述)后提供的冰顆粒大小為15μm或15μm以下，更優(yōu)選5-15μm。
本發(fā)明的AFP可以方便地用于食品，優(yōu)選用于冷凍食品或計(jì)劃冷凍的食品。在例如冷凍前通過巴氏消毒法或滅菌加熱的制品中特別優(yōu)選使用AFP。在冷凍糖食制品中尤其優(yōu)選使用。
這類食品的實(shí)例為諸如冰淇淋混合料的冷凍糖食混合料和冷凍前預(yù)定進(jìn)行巴氏消毒的糖水冰糕混合料。這類混合料通常貯藏于室溫。合適的制品形式例如包裝于例如袋或小袋中的粉型混合料。所述混合料在例如加入水和任選的其它成分以及可任選充氣后能夠形成所述冷凍食品的基礎(chǔ)。
合適混合料的另一實(shí)例可以是必要時(shí)在加入其它組分和任選的其它充氣后可以冷凍的液體混合料(任選充氣)。
上述混合料的明顯優(yōu)點(diǎn)是，所述AFP成分的存在使得所述混合料可以在靜止的條件下冷凍，例如在商店或家用冰箱中冷凍而不會(huì)形成不可接受的冰晶形狀，因而具有不同于通常通過靜止冷凍獲得的制品的結(jié)構(gòu)。
非常方便的是，這些混合料可以包裝于密封容器中(例如紙盒、袋、盒、塑料容器等)。對(duì)于單個(gè)等份，所述包裝大小一般為10-1000g。對(duì)于多個(gè)等份，包裝大小高至500kg可能是合適的。所述所裝大小一般為10-5000g。
如上所述，其中使用所述AFP的優(yōu)選制品是冷凍糖食，例如冰淇淋或糖水冰糕。優(yōu)選AFP水平為成品重量的0.00001-0.5％。假如使用干混合料或濃縮物，所述濃度可以較高以保證最終冷凍制品中的水平在上述范圍內(nèi)。
對(duì)于本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)冷凍糖食包括含乳冷凍糖食，例如冰淇淋、冷凍酸牛奶、冷凍果子露、清涼果子飲料、牛奶凍和冷凍蛋奶甜羹、糖水冰糕、granita和冷凍果糊。對(duì)于某些應(yīng)用，不大推薦在發(fā)酵食品中使用。
在所述冷凍糖食品中的固體(例如糖、脂肪、食用香料等)水平最好高于4％(重量)，例如高于30％(重量)，更優(yōu)選40-70％(重量)。
按照本發(fā)明的冷凍糖食可以用適合生產(chǎn)冷凍糖食的任何方法生產(chǎn)。然而，特別優(yōu)選的是，在巴氏消毒前和所述冷凍過程開始前，充分混合所有所述配方成分。所述冷凍過程最好可以包括硬化步驟，例如至-30華氏度或更低。
將一滴3μl的所述樣品置于22mm蓋玻片上。然后在上面放置一個(gè)16mm直徑蓋玻片，在所述樣品上放置200g重量以保證均一的玻片厚度。蓋玻片的邊緣用透明指甲油密封。
將所述玻片放置在Linkham THM 600溫控顯微鏡載物臺(tái)上。將所述載物臺(tái)快速降溫(每分鐘50℃)至-40℃以產(chǎn)生大量小晶體。然后將所述載物臺(tái)溫度快速升高(每分鐘50℃)至-6℃并保持于該溫度。
于-6℃用Leica Aristoplan顯微鏡觀察到所述冰相。偏振光和λ片用來增強(qiáng)所述冰晶的對(duì)比度。用35mm顯微鏡照相術(shù)于T=0和T=1小時(shí)記錄所述冰相的狀態(tài)(冰晶的大小)。通過沿所述晶體的周邊畫線測(cè)定冰晶大小(長(zhǎng)度)。把一批冰淇淋的每個(gè)單獨(dú)的冰晶的最大長(zhǎng)度輸入詳細(xì)記錄表，在此表中對(duì)所述數(shù)據(jù)組進(jìn)行分析以得到平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
測(cè)試冰重結(jié)晶抑制特性的另一方法如下用改進(jìn)的“splat分析”(Knight等，1988)檢測(cè)抗凍活性。將在30％(w/w)蔗糖中的待研究的溶液2.5μl轉(zhuǎn)移到潔凈、適當(dāng)標(biāo)記的、16mm圓形蓋玻片上。第二張蓋玻片放置于所述溶液滴上，并在指與母指間將所述夾層結(jié)構(gòu)擠壓在一起。將所述夾層結(jié)構(gòu)放入在-80℃的干冰盒中保持的己烷浴中。當(dāng)所有夾層結(jié)構(gòu)制備完備后，用在干冰中預(yù)冷的鑷子將夾層結(jié)構(gòu)從-80℃己烷浴轉(zhuǎn)移到保持在-6℃的含己烷的觀察室內(nèi)。在轉(zhuǎn)移到-6℃后，可以看到夾層結(jié)構(gòu)從透明變?yōu)椴煌该魍庥^。用攝像機(jī)記錄圖像并用20x目鏡取入圖像分析系統(tǒng)(LUCIA，Nikon)。在時(shí)間=0時(shí)記錄每個(gè)splat的圖像，并在30-60分鐘后再次記錄。比較兩個(gè)分析中的冰晶大小。如果與t=0時(shí)的大小相比，30-60分鐘時(shí)的大小相似或僅中度增大(即是說增大不足20％，更優(yōu)選增大不足10％，最優(yōu)選增大不足5％)，這表明冰晶重結(jié)晶抑制特性良好。
一般來說，這些試驗(yàn)可用于任何含AFP和水的合適組合物。在這種試驗(yàn)組合物中的AFP水平一般不是非常重要，而可以是例如0.0001-0.5％(重量)，更優(yōu)選0.0005-0.1％(重量)，最優(yōu)選0.001-0.05％(重量)，例如0.01％(重量)。
任何含AFP和水的合適組合物均可以用來進(jìn)行所述試驗(yàn)。然而，獲得純化型的AFP一般是不必要的。對(duì)于實(shí)際應(yīng)用，通常制備天然物質(zhì)的液體提取物或提取汁液，其中可以測(cè)試該提取物或汁液，這就應(yīng)該足夠了。
將0.15g NH4SO4溶解于1ml上清液中，該溶液于4℃溫育30分鐘。于30，000g離心10分鐘后，將0.3g NH4SO4溶解于該步驟的上清液中，并將該溶液于4℃溫育30分鐘。將該溶液于30，000g離心10分鐘，并棄去上清液。將沉淀再懸浮于0.2ml水中，連續(xù)稀釋該溶液，在30％(w/w)蔗糖的水溶液中制備原始提取物用于半定量的splat分析。在所述原始提取物至高于200倍的稀釋液以及所述沉淀物至800倍的稀釋液中可以檢測(cè)到(用上述方法)splat活性，表明在所述NH4SO4沉淀物中已經(jīng)收獲到存在于原始提取物中的總splat活性的二分之一以上。
于所述再懸浮的沉淀物中加入200μl 0.1M TrisHCl pH7.5，該溶液于10kDa截留microcon(Amicon)中濃縮至150μl。用SMART層析系統(tǒng)(Pharmacia)以100μl/分鐘的流速，將100μl該溶液上樣于在50mM Tris HCl pH 7.5預(yù)平衡的Q-Sepharose柱，以100μl收集流分。在50mM TrisHCl pH 7.5中洗出800μl后，將1.5ml內(nèi)的0-0.5MNaCl梯度上該柱，于280nm監(jiān)測(cè)所述洗出液。在30％(w/w)蔗糖中稀釋50倍后，按實(shí)施例Ⅰ中所述測(cè)試流分的splat活性。發(fā)現(xiàn)活性與在約0.1M NaCl洗脫、主要收集于流分14中的OD280峰有關(guān)。
采用SMART層析系統(tǒng)(Pharmacia)，將40μl流分14以流速40μl/分鐘上樣于在50mM TrisHCl pH 7.5中預(yù)平衡的Superdex 75凝膠滲透柱。于OD280和OD215監(jiān)測(cè)洗出液，在上樣后從0.6ml開始以80μl收集流分，在1.1-1.6ml之間以50μl收集流分，在1.6-3ml之間以100μl收集流分。將1μl的每一流分在30％(w/w)蔗糖中稀釋25倍，并分析splat活性。發(fā)現(xiàn)活性與用流分9和10中1.2ml保留物洗脫的OD280和OD215峰有關(guān)。通過測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)記(Sigma)的保留體積(Ve)和經(jīng)藍(lán)葡聚糖上柱測(cè)定空隙容積(Vo)為0.91ml，從而校準(zhǔn)所述Superdex柱。繪制log10Mr對(duì)Ve/Vo的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定與所述地衣splat活性有關(guān)的OD280峰的表觀分子量為30kDa。
合并從Superdex柱洗脫的32μl流分9和10，并在10kDa截留microcom(Amicon)中濃縮至10μl，將3.5μl 4×SDS-PAGE樣品緩沖液加至從Superdex柱洗脫的10μl流分9和10中以及從Q-sepharose柱洗脫的流分12-16中。在于95℃加熱5分鐘并于10，000g離心3分鐘后，將每種樣品10μl加樣至4％積層凝膠孔中，經(jīng)12％0.75mm厚的SDS-PAGE微型凝膠(Biorad)電泳分離多肽。電泳后凝膠染色并在考馬斯亮藍(lán)中固定，在甲醇∶醋酸∶水(1∶4∶5)w/w中脫色。這顯示從Superdex柱洗脫的濃縮合并的流分9和10中的多肽的表觀分子量為24kDa。當(dāng)所述凝膠用Biorad銀染色試劑盒按照廠商的說明進(jìn)行銀染時(shí)，在從Q-sepharose柱洗脫流分14中和從Superdex柱洗脫的流分9和10中可檢測(cè)到相同表觀分子量的多肽。
在用基本上與上述相同的方法進(jìn)一步純化蛋白后，從24kDa多肽獲得以下N末端氨基酸序列A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L。
采用與所述雙向分離的第一向凝膠組分相同、只是用Biolyte 3-5兩性物取代Biolyte 4-7兩性物組成的平板凝膠、純化地衣抗凍蛋白的單向等電聚焦，在銀染色后顯示一條等電點(diǎn)低于3.6的帶。
權(quán)利要求
1．可以得自地衣屬的抗凍蛋白以及該蛋白的修飾型和同種型，所述蛋白的表觀分子量為20-28kDa，其N末端氨基酸序列顯示與A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L至少80％重疊。
2．具有以下N末端氨基酸序列的權(quán)利要求1的抗凍蛋白以及該蛋白的修飾型和同種型，所述氨基酸序列為A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L。
3．權(quán)利要求1或2的抗凍蛋白，其分子量為22-26kDa。
4．權(quán)利要求1或2的抗凍蛋白，顯示與權(quán)利要求1或2的部分序列至少90％重疊。
5．權(quán)利要求1或2的抗凍蛋白，顯示與權(quán)利要求1或2的部分序列100％重疊。
6．權(quán)利要求1的抗凍蛋白，其中所述修飾包括糖基化作用。
7．編碼一項(xiàng)或多項(xiàng)前述權(quán)利要求的抗凍蛋白的核酸序列。
8．包含按照權(quán)利要求1或2的抗凍蛋白的食品。
9．為冷凍糖食的按照權(quán)利要求8的食品。
全文摘要
可以得自地衣屬的抗凍蛋白以及該蛋白的修飾型和同種型,所述蛋白的表觀分子量為20—28kDa,其N末端氨基酸序列顯示與A－P－A－V－V－M－G－D－A－E－S－F－G－A－I－A－H－G－G－L至少80%重疊。
文檔編號(hào)A23G9/38GK1284085SQ98813206
公開日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1998年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月22日
發(fā)明者C·M·賽德伯托姆, M·F·斯馬爾伍德, L·J·拜爾斯 申請(qǐng)人:尤尼利弗公司