專利名稱：大處理量試驗系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求以下優(yōu)先權(quán)1997年12月19日的臨時申請60／068，291和1998年7月2日的美國專利申請09／109，076，本發(fā)明參考了其中內(nèi)容。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及使用重復(fù)的探針列陣同時進行多項、大處理量生物或化學(xué)試驗的組合物、設(shè)備和方法。有許多區(qū)域，各自具有一個通用錨分子列陣。這些錨分子與雙官能接頭分子連接，雙官能接頭分子的一部分對至少一種錨分子具有特異性，另一部分是對感興趣的靶分子具有特異性的探針。用所得探針列陣檢測一種或多種與探針特異性反應(yīng)的靶分子是否存在。根據(jù)分子反應(yīng)性質(zhì)，本發(fā)明涉及多個不同領(lǐng)域，包括但不限于新藥開發(fā)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、藥物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)。
許多分子探針排列于表面或“芯片”已被用于許多生物或化學(xué)試驗。這些試驗被用于確定靶分子是否與某種探針反應(yīng)。探針與靶分子在選定試驗條件下接觸后，由檢測設(shè)備測定靶分子是否與給定探針反應(yīng)。
這類系統(tǒng)可用于多種篩檢過程以獲取有關(guān)探針或靶分子的信息。例如，它們已被用于篩檢結(jié)合感興趣的受體的肽或潛性藥物；用于篩檢樣品中是否有種群基因突變、等位變異，或特定的病原或病原株；用于研究基因表達，以鑒定其表達與特定生理狀況、發(fā)育階段或疾病狀態(tài)等相關(guān)的mRNA。
發(fā)明概述本發(fā)明提供組合物、設(shè)備與方法，用于同時進行多項生物或化學(xué)試驗，并能夠進行多樣品大處理量分析，所述多樣品例如診斷試驗中需篩檢的多分患者樣品，用藥物開發(fā)方法進行測試的多種潛性藥物或治療藥劑。本發(fā)明提供了一種組合，用于檢測樣品中一種或多種靶分子的存在。該組合包括一個表面，具有許多空間上相互分開的區(qū)域，可稱之為測試區(qū)，并可以是孔形的，至少兩個區(qū)域基本相同。每個表面具有至少兩個，至少20或以上個，這類基本相同的區(qū)域，例如至少25、50、96、864或1536個等。每個測試區(qū)即一個含(或可能含)一種或多種靶分子的樣品引入?yún)^(qū)，并具有一個生物或化學(xué)列陣。(“含靶分子的樣品”或“檢測樣品中的靶分子”不排除不含或沒有檢測到靶分子的樣品或測定(檢測意圖)。廣義的說，本發(fā)明涉及用于檢測樣品是否含靶分子的列陣，不論是否檢測到靶分子)。該列陣包含通用“錨分子”，它們各自與雙官能分子連接，雙官能分子的一部分對錨分子具有特異性，另一部分包含對至少一種靶分子具有特異性的探針。將本發(fā)明的組合與含一種或多種靶分子的樣品接觸，靶分子選擇性地與一種(或多種)偵探分子反應(yīng)，然后接受檢測測試區(qū)內(nèi)靶分子與探針之間反應(yīng)的檢測儀的詢問，于是產(chǎn)生試驗結(jié)果。
本發(fā)明提供特別用于大處理量生物試驗的方法和組合物。在特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明可用于大處理量篩檢以發(fā)現(xiàn)新藥。例如，可在許多(例如100塊)96-孔板上同時進行大處理量試驗。每板每孔中，可用約36對錨分子-接頭進行(例如)36項測試。即，100塊板，每板96孔，每孔36項測試，總共可進行345，000項測試；例如，可同時對9，600種不同候選藥物分別進行36項不同參數(shù)或試驗的檢測。大處理量試驗比每次只測試一項參數(shù)的試驗提供更多有關(guān)每種藥物的信息。例如，能夠在一次初步大處理量的篩檢試驗中測定候選藥物是否具有選擇性、特異性和／或毒性。非大處理量方法必需許多后繼試驗來測試每一種感興趣候選藥物的這些參數(shù)。實施例15-17描述了幾種類型的大處理量篩檢試驗。能夠同時進行多種不同生物試驗和一次進行許多試驗的能力(即處理量非常大)是本發(fā)明非常重要的兩項優(yōu)點。
例如，實施例之一中，使用聚苯乙烯96孔DNA結(jié)合板(Corning Costar)，它具有結(jié)合伯胺(例如氨基酸或修飾寡核苷酸)的衍生表面，可將36種不同寡核苷酸排布在每板每孔的表面作為錨分子。可將錨分子與衍生聚苯乙烯共價連接，將這相同的36種錨分子用于所有試驗。對于任何一種特定試驗，可用給定的一組接頭分子規(guī)劃每孔表面，使之對多達36種感興趣的不同靶分子或試驗類型具有特異性，并將不同測試樣品加到各板96孔的每一孔?？啥啻问褂猛唤M錨分子重新規(guī)劃孔表面用于其他感興趣的靶分子或試驗，或與同組接頭一起多次重復(fù)使用。上述靈活性和重復(fù)使用性是本發(fā)明的又一優(yōu)點。
本發(fā)明實施例之一是用于檢測樣品中一種或多種靶分子的組合，在加入所述樣品前，它包括a)一個表面，具有多個空間上相互分開的區(qū)域，至少兩個區(qū)域基本相同，每各區(qū)域具有b)至少8種不同寡核苷酸錨分子，各自連接c)一個雙官能接頭，其第一部分對寡核苷酸錨分子具有特異性，第二部分含有對所述靶分子具有特異性的探針。
本發(fā)明的另一實施例是用于檢測樣品中一種或多種靶分子的組合，在加入所述樣品前，它包括a)一個表面，具有多個空間上相互分開的區(qū)域，至少兩個區(qū)域基本相同，每各區(qū)域具有b)至少8種不同錨分子，各自連接c)一個雙官能接頭，其第一部分對錨分子具有特異性，第二部分含有對所述靶分子具有特異性的探針。
本發(fā)明的另一實施例是檢測至少一種靶分子的方法，包括在所述靶分子與所述組合結(jié)合的有效條件下，將可能含靶分子的樣品與上述組合接觸。另一實施例是一種測定RNA表達方式的方法，包括在RNA靶分子與探針特異性雜交的有效條件下，將含作為靶分子的至少兩種RNA分子的樣品與上述組合一起培養(yǎng)，其中組合的至少一種探針是對至少一種RNA靶分子具有特異性(即選擇性)的核酸(例如寡核苷酸)。另一實施例是鑒定改變RNA表達方式的試劑(或條件)的方法，即上述測定RNA表達方式的方法，但還包括將所述試劑(或條件)存在下的RNA表達方式與另一組不同條件下的RNA表達方式相比較。
通過實施例，

圖1和2是本發(fā)明的組合，及其用于檢測mRNA靶分子的使用方法。如圖2所示，本發(fā)明的表面有15個相同的區(qū)域；在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施例中，上述測試區(qū)的每個區(qū)即微滴板上的一個孔。各測試區(qū)有6種不同錨分子，在圖中以1-6表示。圖1顯示一個錨分子，錨分子1，在本發(fā)明最佳實施例中，它是一段寡核苷酸。與錨分子1連接的是接頭分子，接頭分子1，它包括兩部分。第一部分對錨分子具有特異性，在該圖中即與錨分子特異性雜交的寡核苷酸。第二部分是對感興趣的靶分子(在此是靶mRNA)具有特異性的探針，該圖中即與靶分子雜交的寡核苷酸。雖然圖中沒有說明，其余5個錨分子分別與各自的接頭通過錨-特異性部分連接；各探針具有對(例如)不同于mRNA1的mRNA具有特異性的探針部分。以上說明的組合可同時分析多達15份不同樣品，檢測是否存在mRNA1(或同時檢測有否列陣中其余5個探針?biāo)禺愋葬槍Φ膍RNA靶分子)。為了進行試驗，在每區(qū)或每孔加入少量各種樣品，在本實施例中可以是自例如15種不同細胞系之一提取的一種RNA，在探針與靶分子雜交的有效條件下培養(yǎng)。為了確定樣品中是否有mRNA1，使用一種檢測儀，它能夠識別反應(yīng)方式，和／或詢問各區(qū)域內(nèi)特定位置是否存在信號。如果細胞系的培養(yǎng)條件為它們的mRNA在體內(nèi)被某標(biāo)簽所標(biāo)記，又如果樣品中有mRNA1，檢測器將檢測到標(biāo)記mRNA在由錨分子／探針復(fù)合物1決定的位置發(fā)出的信號。或者，mRNA可在加至區(qū)(或孔)內(nèi)之前或之后直接體外標(biāo)記?；蛘撸鐖D1所示，可在與探針雜交之前或之后間接標(biāo)記mRNA，即，通過(例如)將RNA與標(biāo)記過的“偵探”寡核苷酸(靶分子特異性報道寡核苷酸)一起培養(yǎng)，該偵探寡核苷酸與一段不同于探針?biāo)R別序列的序列互補。在所示實施例中，可同時分析15份樣品。因為用本發(fā)明可同時分析至少20或以上份樣品，例如多達1536或更多，所以，這是一種非常高效的分析系統(tǒng)。
本文中，“靶分子”指需要測定其存在、活性和／或量，并對某給定探針具有親和性的物質(zhì)。靶分子可以是人造或天然物質(zhì)。而且，它們可以其本身的樣態(tài)使用，或與其他物質(zhì)結(jié)合后使用。靶分子可以直接或通過特殊結(jié)合物質(zhì)與結(jié)合元件共價或非共價結(jié)合?？捎糜诒景l(fā)明的靶分子例如但不限于受體(囊泡上的、脂質(zhì)上的、細胞膜上的或各種其他受體)；與特定受體結(jié)合的配體、活化劑或拮抗劑；與特定抗原決定簇(例如病毒、細胞或其他物質(zhì))反應(yīng)的多克隆抗體、單克隆抗體和抗血清；藥物；核酸或聚核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、DNA、病毒RNA或DNA、EST、cDNA、RNA或DNA的PCR擴增產(chǎn)物，和它們的突變、變異或修飾體)；蛋白質(zhì)(包括例如負責(zé)剪切神經(jīng)遞質(zhì)的酶，蛋白酶，激酶等)；酶的底物；肽；輔因子；凝集素；糖；聚多糖；細胞；細胞膜；細胞器；等，以及其他可能以復(fù)合、共價交聯(lián)等形式存在的其他此類分子或其他物質(zhì)。本發(fā)明中，所謂核酸、聚核苷酸、聚核酸和寡核苷酸可互換。靶分子又稱“抗-探針”。
本發(fā)明中，“探針”是能夠被特定靶分子特異性識別的物質(zhì)，例如分子?？赡艿奶结槪蟹肿踊虬蟹肿樱结樈Y(jié)合方式類型包括受體／配體；配體／抗配體；核酸(聚核苷酸)相互反應(yīng)，包括DNA／DNA，DNA／RNA，PNA(肽核酸)／核酸；酶，其他催化劑或其他物質(zhì)與底物，小分子或效應(yīng)分子；等。本發(fā)明考慮的探針例子包括但不限于有機物、無機物或聚合物，包括金屬，螯合劑或其他與金屬特異性相互作用的化合物，塑料，細胞膜受體的活化劑和拮抗劑，毒素和毒液，病毒表位，激素(例如阿片樣肽，甾體等)，激素受體，脂類(包括磷脂)，肽，酶(例如蛋白酶或激酶)，酶底物，輔因子，藥物，凝集素，糖，核酸(包括寡核苷酸，DNA，RNA，PNA或修飾或取代核酸)，寡糖，蛋白質(zhì)，酶，多克隆和單克隆抗體，單鏈抗體或其片段。探針聚合物可以呈線性或環(huán)狀。探針能夠根據(jù)不同的活性或不同的結(jié)合行為區(qū)別磷酸化和非磷酸化的蛋白質(zhì)。凝集素之類探針能夠區(qū)分不同的糖基化蛋白。本文中，所謂核酸、聚核苷酸、聚核酸和寡核苷酸可互換。上述作為“探針”的物質(zhì)也可以作為“靶分子”，反之亦然。
任何相容性表面均可與本發(fā)明聯(lián)用。所述表面(通常是固體)可以是任何有機或無機材料或組合材料的，例如塑料，如聚丙烯或聚苯乙烯；陶瓷；硅；(熔融)二氧化硅，石英或玻璃，厚度為(例如)顯微鏡載玻片或蓋玻片；紙張，例如濾紙；重氮化纖維素；硝酸纖維素濾膜；尼龍膜；或聚丙烯酰胺凝膠墊。如果進行試驗的方法涉及光學(xué)檢測，則可使用透光基質(zhì)。在優(yōu)選實施例中，所述表面是多孔塑料表面，例如組織培養(yǎng)盤，例如24、96、256、384、864或1536孔板(例如CorningCostar DNA結(jié)合板之類修飾板)。錨分子可與表面直接連接(例如結(jié)合)，或與一種類型的表面(例如玻璃)結(jié)合，后者再與第二表面接觸，例如在一微滴板的塑料孔內(nèi)。表面的形狀并不重要。它可以是例如正方、矩形或圓形的平面；曲面；或珠、顆粒、鏈、沉淀、管、球等體面。
所述表面包括空間上分開、可定址、可鑒定的區(qū)域。各區(qū)含有一組錨分子。各區(qū)如何隔開，它們的物理特征及彼此之間的相互取向并不重要。實施例之一中，各區(qū)之間以不透液的物理屏障隔開。例如，一優(yōu)選實施例中，區(qū)域可以是多孔盤(例如組織培養(yǎng)盤)，例如24、96、256、384、864或1536孔板上的孔。或者，可在諸如玻璃表面上蝕刻形成例如864或1536個分開的淺孔?；蛘撸潮砻嫔系母鲄^(qū)可以沒有分隔或不是孔，例如塑料、玻璃或紙張平面，然后由勾畫出分開的各區(qū)的覆蓋層(例如塑料或玻璃層)界定單獨各區(qū)?？蛇x的是，在勾畫出各區(qū)之前，表面上可以已經(jīng)具有一個或多個錨分子或錨分子通過結(jié)合接頭分子所成的列陣。另一實施例中，各區(qū)內(nèi)的錨分子列陣之間可利用表面上沒有錨分子的空白區(qū)，或蠟或聚硅氧烷等化學(xué)屏障相互隔開，以防液滴擴散。另一實施例中，所述區(qū)域可以是管或液體控制通道，例如用于流動-通過試驗的那種，參見Beattie等(1995)，Clin．Chem．4700-706。表面內(nèi)或表面上的區(qū)域還可以通過表面本身的修飾來界定。例如，一塑料表面可能包括由修飾或衍生塑料制成的各部分，它們可作為加入特定類型聚合物的位置(例如可將PEG連接于聚苯乙烯表面，然后用羧基或氨基、雙鍵、醛等衍生)?；蛘撸芰媳砻婵删哂心Ｋ芏傻慕Y(jié)構(gòu)，例如凹凸，這些結(jié)構(gòu)可作為加入錨分子的平臺。測試區(qū)的相對取向可取以下形式中任何一種，包括但不限于在正方形或矩形等平面內(nèi)平行或垂直排列，在圓形等平面內(nèi)輻射狀排列，或線性排列，等等。
本發(fā)明空間上分散的各區(qū)具有多份拷貝。即，至少有2個，更好的是至少20個、或至少24、50、96、256、384、864、1536或更多個基本相同、空間上分開的區(qū)域。增加重復(fù)區(qū)域的數(shù)量可允許更大處理量的試驗。本文中，基本相同的區(qū)域指具有相同或基本相同的錨分子和／或錨分子／接頭復(fù)合物列陣的區(qū)域。本文中，基本相同的意思是某列陣或區(qū)域在如本發(fā)明所述的靶分子分析中將與另一列陣或區(qū)域行使基本相同的功能。對功能，即檢測靶分子的能力，基本沒有影響的差異與小核苷酸缺陷(缺失／插入／取代)或少量缺陷(表面結(jié)合不良)等一樣，在試驗精確度之內(nèi)，對靶分子檢測結(jié)果沒有顯著影響。
當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，并不要求表面上所有區(qū)域都基本相同。例如，如果平行檢測兩組列陣，在同一表面上包括兩組列陣可能是有益的。例如，這兩組列陣可以交替的條帶方式排列，從而有利于它們之間的比較。另一實施例中，實驗者可能希望在該表面上包括一個或多個區(qū)域，這些區(qū)域能以可區(qū)別于其他區(qū)域的方式得到檢測，并因此被用作“注冊區(qū)域”。例如，一注冊區(qū)可包含顯示出可鑒別性熒光分子的寡核苷酸或肽，這些熒光分子可被掃描儀識別，作為表面上諸區(qū)域排列位置對比的“原點”。
對于測試區(qū)的大小和物理間距沒有限制。典型區(qū)域的面積約1-700mm2，約1-40mm2更好，相距約0．5-5mm，間距一般根據(jù)相關(guān)面積選取。優(yōu)選實施例中，各區(qū)相隔約5mm。例如，各區(qū)可具有一個矩形格，例如8行6列，由近圓形錨分子點構(gòu)成，各點直徑100微米，彼此間隔500微米；這樣的一個區(qū)可占約20mm2。本發(fā)明包括更大或更小的區(qū)域面積。
還可將各區(qū)再分隔，使得同區(qū)內(nèi)部分或所有錨分子靠深凹或淺凹與相鄰錨分子物理性隔開。例如，一個區(qū)內(nèi)的次區(qū)(亞區(qū))數(shù)量可為約10-100，或更多，或更少。實施例之一中，可將1536孔板上的一區(qū)(即一孔)再分成更小的孔，例如約4-900，更好的是約16-36孔，由此形成孔內(nèi)的孔列陣。參見圖4。這樣的凹孔表面減少了人工將單個錨分子(或錨分子組)放到各設(shè)定位置的勞動強度，包含錨分子的區(qū)域大小更一致，有助于檢測與探針結(jié)合的靶分子。
本文中的“錨分子”指各種如下實體或物質(zhì)(或基本相同的此類物質(zhì)的“組”，見圖7)，例如分子，它與表面結(jié)合(例如共價或非共價地固定于或連接于表面)，或者就是表面的一部分(例如塑料表面的衍生部分)，它們能夠與本文所述接頭或其他物質(zhì)發(fā)生特異性相互作用或結(jié)合。本文中，“錨分子／接頭復(fù)合物”產(chǎn)生于當(dāng)錨分子與接頭通過特異性分子結(jié)合而形成組合的時候。與接頭的相互作用可以是可逆的，例如通過共價鍵，或是不可逆的，例如通過核酸雜交。優(yōu)選實施例中，錨分子是任意長度(例如寡核苷酸)或類型(例如DNA、RNA、PNA或RNA或DNA分子的PCR產(chǎn)物)的核酸。該核酸可以是修飾或取代過的(例如，含肌苷等非天然核苷酸；通過諸如氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基甲酸酯等各種已知鍵相連；或諸如DNA-鏈霉親和素偶聯(lián)物之類半合成分子，等等)。優(yōu)選單鏈核酸。錨分子也可以是肽或蛋白質(zhì)。例如，它可以是多克隆或單克隆抗體分子或其片段，或單鏈抗體或其片段，它們與接頭的抗原或抗-抗體分子部分特異性結(jié)合；反之，錨分子可以是肽，而接頭與之結(jié)合的部分可以是抗體等。另一實施例中，錨分子可以是對特定糖具有特異性的凝集素(例如伴刀豆蛋白A或鱟、花生、綠豆、赤豆、麥芽等的凝集素)。另一實施例中，錨分子可以是一種有機分子，例如用作寡核苷酸特異性固相化學(xué)合成平臺的修飾或衍生塑料聚合物。此時，所述衍生塑料可以是分開的、衍生的多位點的列陣，它們在制造過程中共同構(gòu)成一種組合的表面。另一實施例中，錨分子可利用Ni、Zn、Ca、Mg等金屬離子之間，特定蛋白質(zhì)或螯合劑之間的差異或特異性結(jié)合。例如，錨分子可以是聚組氨酸，接頭的錨分子特異性部分可以是鎳，該錨分子通過鎳螯合劑與靶特異性探針連接?；蛘撸^分子可以是螯合劑，而探針相關(guān)部分為聚組氨酸?；蛘?，錨分子可以是無機物。例如，它可以是鈣和鎂等金屬，而接頭的錨分子特異性部分則可以是優(yōu)先性螯合劑，例如EDTA或EGTA，然后與靶特異性探針結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，許多其他類型分子也可作為錨分子，例如就探針和靶分子所論述的那些常見類型分子。
測試區(qū)內(nèi)的錨分子數(shù)量至少為2，約8至900(比之多或少也包括再內(nèi))更好，約8-300更好，約30-100(例如約64)最好。部分優(yōu)選實施例中，96個測試區(qū)(例如孔)的表面上，每區(qū)約16、36、45或100個錨分子，384個測試區(qū)(例如孔)的表面上，每區(qū)約9、16或25個錨分子。最優(yōu)選實施例中，測試區(qū)的每個錨分子具有不同于列陣內(nèi)其他錨分子的特異性。然而，兩個或多個錨分子可以具有相同的特異性，而且可以所有錨分子都相同。實施例之一中，本發(fā)明的組合具有大量測試區(qū)(例如約864、1536或更多)，這樣就可以一次處理大量測試樣品，可能只需要就少數(shù)(例如2、4、6或9個)參數(shù)對這些樣品進行測試。換言之，就具有大量區(qū)域的組合而言，可能以每區(qū)僅約2-9種錨分子為宜。
區(qū)內(nèi)或區(qū)上錨分子的物理間隔和相對取向并不重要。通常，錨分子之間的距離約0．003-5mm或更小，較好的是約0．03-1mm。本發(fā)明也包括更大或更小的錨分子間距(和面積)。錨分子彼此之間，或相對于區(qū)域邊界，可以任意取向排列。例如，它們可以呈兩維排列，例如正方形、矩形、六邊形等，或呈圓形排列，即錨分子排列成由中心發(fā)射的射線或成同心圓。錨分子也可以排列成一維線形列陣。例如，寡核苷酸可與DNA或RNA序列上的特定位置雜交，形成超分子列陣?；蛘撸^分子可排布成條形碼形式(參見圖6)。例如，錨分子可排列成彼此平行的線。各線之間的間距或各線寬度規(guī)則變化，形成類似條形碼的簡單可識別樣式，例如，第一線和第三線可以是其余線的兩倍寬，可以缺省部分線，等等?？稍谀┚€之后放一空線以劃定一測試區(qū)，還可在后繼測試區(qū)內(nèi)重復(fù)該條形碼樣式。
錨分子的樣式不必與分開的試驗孔(測試區(qū))或分開的試驗液滴的位置嚴(yán)格對應(yīng)?！霸囼灢课弧睂⒂糜诒硎驹囼灡砻嫔霞釉囼灅悠返奈恢谩?例如在多孔板上，這可以由分開的試驗樣品液滴位置，或界定單個試驗孔的壁或隔斷來界定)。錨分子樣式本身(例如，寡核苷酸錨分子的“條形碼”樣式)通過樣式識別作用被用來準(zhǔn)確確定分開的各錨分子位于何處，例如條形碼的各線根據(jù)它與其余線的相對位置而得以識別。因此，第一錨分子不必位于各試驗位置的一邊或一角。第一錨分子將通過樣式識別而不是與試驗位置的相對位置被發(fā)現(xiàn)。只要各試驗部位所用的面積足夠大，能容納至少一個完整的錨分子重復(fù)樣式單元，則不論樣式位于試驗區(qū)何處，各試驗點都將檢測該試驗部位樣品是否含由(條形碼)樣式所確定的靶分子。
錨分子不必在各測試區(qū)內(nèi)排列成嚴(yán)格或甚至固定的格式。例如，各錨分子可與顆粒、珠等結(jié)合，它們在測試區(qū)內(nèi)隨機分布。各錨分子的位置可用可檢測標(biāo)簽來測定。例如，可用不同熒光性或發(fā)光性的標(biāo)簽標(biāo)記各類錨分子的特異性接頭分子，然后可根據(jù)接頭發(fā)出的信號，例如激發(fā)或發(fā)射光譜，來鑒定包含特定接頭／錨分子對的顆粒的位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備出一組帶有各種此類固定標(biāo)簽的接頭，各自具有不同的光譜?；蛘撸梢灾苯訕?biāo)記錨分子。例如，以熒光光譜彼此不同的標(biāo)簽分別標(biāo)記各種不同類型的錨分子。或者，顆粒和珠粒等彼此可具有不同的大小或形狀。本文所述的各種標(biāo)記和檢測方法均可使用。例如，可用基于CCD的成象系統(tǒng)，掃描熒光顯微鏡或熒光活化細胞分選儀(FACS)來測定熒光。
錨分子的一部分可與接頭分子的錨特異性部分相互作用或與之結(jié)合?！跋嗷プ饔谩被颉敖Y(jié)合”在此表示，兩種物質(zhì)或化合物(例如錨分子與接頭的錨特異性部位，探針與其靶，或靶與其靶特異性報道物)彼此結(jié)合(例如附著、結(jié)合、雜交、相連、退火、共價交聯(lián)，或其他結(jié)合方式)，足以另所需的試驗得以進行。“特異性的”或“特異性地”表示，沒有任何保護技術(shù)的條件下，兩組分選擇性地彼此結(jié)合，而且一般不與不希望與被測組分結(jié)合的其他組分結(jié)合。可按照常規(guī)，例如用本領(lǐng)域的常規(guī)方法，確定獲得特異性相互作用所需的條件。
例如，對核酸而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過試驗確定例如長度、堿基組成，和互補程度等特征，使得在選定嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，某核酸(例如寡核苷酸錨分子)能與另一核酸(例如接頭的錨特異性部位)雜交，同時與其他物質(zhì)或分子(例如其他寡核苷酸接頭)的非特異性雜交最少。通常，錨分子、接頭一部分或偵探寡核苷酸的DNA序列或其他核酸序列與其結(jié)合對象具有足夠的互補性，使之能在選定嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下雜交，而且，Tm約比室溫高10-20℃(例如約37℃)。通常，寡核苷酸錨分子長約8-50個核苷酸，以15、20、25或30個核苷酸為佳。本發(fā)明中，“高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件”指，核酸間的核苷酸互補性(一致性)至少達95％，更好的是約97％-100％時才發(fā)生雜交的條件。然而，根據(jù)所需目的，可選擇互補性要求較低的雜交條件，例如需90％、85％、75％、50％等互補性的條件。雜交反應(yīng)參數(shù)中可變的是鹽濃度、緩沖液、pH、溫度、培養(yǎng)時間、甲酰胺等變性劑的量與種類，等等。(參見Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Press，New York；Hames等(1985)，Nucleic AcidHybridization，IL Press；Davis等(1986)，Basic Methods in Molecular Biology，ElsevirScience Publishing，Inc．，New York)。例如，可將核酸(例如接頭寡核苷酸)加入測試區(qū)(例如多孔板-優(yōu)選實施例中是一96或384孔或更大的板的孔)核酸的體積是約0．1-100μl(一優(yōu)選實施例中是約1-50μl，最好是約40μl)，濃度是約0．01-5μM(優(yōu)選實施例中是約0．1μM)，所在緩沖液是6X SSPE-T(0．9M NaCl，60mMNaH2PO4，6mM EDTA和0．05％Triton X-100)，與結(jié)合對象雜交約10分鐘至至少3小時(優(yōu)選實施例中是至少15分鐘)，溫度是約4-37℃(優(yōu)選實施例中約為室溫)。可選擇條件以進行大處理量的試驗。本發(fā)明實施例之一中，反應(yīng)條件近似于生理條件。
設(shè)計其他類型物質(zhì)或分子(例如多肽、凝集素，等)作為錨分子或接頭一部分，并設(shè)計它們與其結(jié)合對象發(fā)生特異性相互作用所需的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域的一般常規(guī)技術(shù)(參見，Niemeyer等(1994)，Nucleic Acids Res．22，5530-5539；Fodor等(1996)，美國專利5，510，270；Pirrung等(1992)，美國專利5，143，854)。培養(yǎng)參數(shù)包括緩沖液、鹽濃度、pH、溫度、培養(yǎng)時間、有否載體和／或降低非特異性相互作用的試劑或條件等。例如，可向含抗體錨分子的測試區(qū)(例如，優(yōu)選實施例中多孔板，即96或384孔或更大的板上的一個孔)，加入約0．1-100μl或以上(優(yōu)選實施例中是約1-50μl，最好約40μl)抗-抗體(例如抗原或抗體特異性二級抗體)，濃度約為10pM-10nM(優(yōu)選實施例中約為1nM)，所在緩沖液可例如6X SSPE-T，PBS或生理鹽水，與表面上的錨分子一起在約4-45℃(優(yōu)選實施例中是約4℃)培養(yǎng)約10分鐘至3小時(優(yōu)選實施例中是至少約15分鐘)。肽錨分子以長約5至20個氨基酸的為佳。
在本發(fā)明部分實施例中，在選定反應(yīng)條件下，列陣中的每個錨分子與各自對應(yīng)接頭的錨特異性部位相互作用，程度彼此基本相同。這能確保由錨分子特定一基本均一的接頭列陣，由此得到基本均一的探針列陣。
一個測試區(qū)內(nèi)的錨分子可以是一個“通用”組，其中每個錨分子能與一種以上不同接頭相互作用，所述的不同接頭具有一個對此類錨分子特異性的部位但帶著不同的“探針”部分；這樣，單一的通用錨分子列陣可用來規(guī)劃或定義一組不同的探針。有關(guān)這類通用錨分子列陣的靈活性可參見圖1和圖2。圖2顯示一個有15個測試區(qū)的表面，每個測試區(qū)有一個6種不同錨分子組成的列陣，在該實施例中，這些錨分子是寡核苷酸。圖1顯示了上述(寡核苷酸)錨分子中的一個，即錨分子1，它與接頭1接觸，接頭1包含一個錨分子1的特異性部位和對mRNA靶1具有特異性的第二部位?；蛘?，可換以接頭2，它和接頭1一樣有個對錨分子1的特異性部位，但它的第二部位對mRNA靶2而不是mRNA1具有特異性。這樣，錨分子1可用來指定(或規(guī)劃、或定義或確定)針對兩種或更多種不同mRNA靶中任一種的探針。產(chǎn)生和固定寡核苷酸或肽的高分辨格式(列陣)的過程昂貴、費時而且／或費力。能用預(yù)制錨分子列陣來規(guī)劃大量探針列陣是本發(fā)明的優(yōu)點之一。
雖然圖2中的通用錨分子定義了一個寡核苷酸探針格式，該錨分子列陣也可用來規(guī)劃其他探針列陣，例如受體蛋白列陣(見圖3)。顯然，因為錨分子／接頭相互作用的類型很多，所以可有許多種排列，例如，甚至可形成更復(fù)雜的多層“夾心”或“分層”探針，例如蛋白質(zhì)／抗體組合。因此，本發(fā)明錨分子表面本身提供了一個新的優(yōu)點。
本發(fā)明實施例之一中，錨分子與接頭發(fā)生可逆相互作用；這樣，一組通用探針就可重復(fù)使用，以規(guī)劃不同的探針組。例如，可通過加熱分離兩寡核苷酸將寡核苷酸錨分子與接頭的寡核苷酸部分分離，然后再與第二種接頭結(jié)合。錨分子列陣的制作昂貴、費時而且／或費力，所以，能夠重復(fù)使用是本發(fā)明又一優(yōu)點。
錨分子不一定要與接頭相互作用。例如，錨分子可與例如熒光素的可測分子偶聯(lián)(直接或間接)，因而可在一格網(wǎng)中進行定位，以記錄測試表面與探測劑之間的對應(yīng)關(guān)系?；蛘?，錨分子可用已知量可測分子標(biāo)記，作為內(nèi)部定量標(biāo)志，用于標(biāo)定。
“接頭”在此指一種雙官能物質(zhì)，具有一個對選定(指定)錨分子或錨分子亞組具有特異性的(“錨特異性”)第一部位，和對感興趣的靶分子具有特異性的(“靶特異性”)第二部位。接頭的這兩部分可通過共價或非共價鍵相連，可以直接相連也可以通過中間體相連。
當(dāng)然，接頭錨特異性部位的化學(xué)性質(zhì)與作為其反應(yīng)對象的錨分子相關(guān)。例如，如果錨分子是寡核苷酸，與之反應(yīng)的接頭的這一部分可以是例如特異性結(jié)合該寡核苷酸的肽，或在選定嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與之有效且特異性雜交的核酸。所述核酸可以是例如寡核苷酸，DNA，RNA，PNA，PCR產(chǎn)物，或取代或修飾核酸(例如，含肌苷之類非天然核苷酸；通過諸如氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基甲酸酯等各種已知鍵相連；或諸如DNA-鏈霉親和素偶聯(lián)物之類半合成分子，等等)。優(yōu)選單鏈核酸。對寡核苷酸錨分子具有特異性的接頭的這一部分長度約為8-50個核苷酸，約15、20、25或30個則更好。如果錨分子是抗體，與之反應(yīng)的接頭的這一部分可以是，例如，能與錨分子特異性相互作用的抗-抗體，抗原，或它們的小片段。與前文所述其他類型錨分子特異性相互作用并可作為接頭錨特異性部分的物質(zhì)或分子是本領(lǐng)域所熟知的，可用常規(guī)方法進行設(shè)計(參見前文)。
當(dāng)然，接頭靶特異性部位的化學(xué)性質(zhì)與作為其反應(yīng)對象的靶分子相關(guān)。例如，如果靶分子是一種特定mRNA，則接頭的靶特異性部位可以是，例如，在選定雜交條件下與該靶分子特異性結(jié)合但不結(jié)合干擾性RNA或DNA的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用本領(lǐng)域公知的方法實驗確定與靶分子結(jié)合最佳、與非特異性干擾DNA或RNA反應(yīng)最弱的寡核苷酸特征(參見前文)。通常，用來在大量非靶RNA背景中分辨靶mRNA的寡核苷酸探針長度約為8-50個核苷酸，約18、20、22或25個更好。背景競爭性靶分子不多的生化試驗所用的寡核苷酸探針可以略短。用本領(lǐng)域公知的方法(例如BLAST程序)，可從已知基因庫中挑選出如下寡核苷酸探針序列它們彼此不相關(guān)，與可能性干擾序列不相似?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法常規(guī)選定使得寡核苷酸探針與某種RNA特異性雜交的雜交條件(例如，參見前文)。例如，可將靶RNA(例如，任意容器，例如多孔(如96或384或更多孔)微滴板上孔內(nèi)的、抽提自培養(yǎng)組織或細胞的總RNA或mRNA(最好用感興趣的試劑加以處理))加入含寡核苷酸探針列陣的測試區(qū)，所述探針在諸如6X SSPE-T或其他緩沖液中，還可以含有降低非特異性結(jié)合的試劑(例如約0．5mg／ml降解鯡魚或鮭魚卵DNA，或酵母RNA)，在經(jīng)驗溫度培養(yǎng)約10分鐘至至少18小時(優(yōu)選實施例中是約3小時)。雜交嚴(yán)謹(jǐn)性可與分離錨分子與接頭錨特異性部位所用嚴(yán)謹(jǐn)性相同，或略低。如前所述，設(shè)計和使用其他類型探針也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
接頭的錨特異性部位與靶特異性部位可通過多種共價或非共價鍵相連，鍵的性質(zhì)對本發(fā)明不重要。這兩部分可直接相連或通過一中間分子相連。實施例之一中，它們都是寡核苷酸，通過諸如磷酸二酯鍵的共價鍵相連，形成一單一、共線核酸。另一實施例中，錨特異性部位是寡核苷酸，靶特異性部位是受體(例如受體蛋白)，這兩部分可通過生物素與鏈霉親和素的相互作用相連，例如圖3所示。所述連接的許多變化形式是已知的(例如，參見Niemeyer等(1994)，NAR22，5530-5539)。或者，兩部分可直接相連，例如可將寡核苷酸酰胺化后通過酰胺鍵與肽或蛋白質(zhì)直接相連，或通過酰胺鍵或脂性附著與膜組分相連。形成上述共價或非共價鍵的方法是常規(guī)的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地加以優(yōu)化。
兩物質(zhì)結(jié)合(例如，通過兩核酸，兩蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)加核酸，等，的培養(yǎng))成復(fù)合物后(例如，錨分子／接頭復(fù)合物)，可對所得復(fù)合物加以處理以去除非結(jié)合物質(zhì)(例如接頭)，所用條件憑經(jīng)驗來確定，以保全特異性相互作用，而去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。例如，可在與獲得該復(fù)合物(例如，錨分子／接頭復(fù)合物)所用相同或更高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，洗滌反應(yīng)混合物1至10次，或更多次。
本發(fā)明的組合可用常規(guī)技術(shù)來制造。
可用于本發(fā)明的某些表面可方便地從供應(yīng)商處獲得。優(yōu)選實施例中，所述表面是96、384或1536孔微滴板，例如Corning Costar出售的修飾微滴板。或者，可如下制備表面上含孔，孔內(nèi)又含凹陷的表面先將鋁或鋼等材料微切削成模，然后將塑料或類似材料微注入模中，形成圖4所示結(jié)構(gòu)?；蛘?，可用圖5的三片結(jié)構(gòu)組裝成由玻璃、塑料、陶瓷等材料構(gòu)成的圖4結(jié)構(gòu)第一部分稱為分隔片(圖5a)，將形成樣品孔之間的隔斷；第二部分，稱為亞分割片(圖5b)，將形成每個測試孔內(nèi)的亞區(qū)或淺凹；笫三部分，稱為底板(圖5c)，將形成測試板的底部和測試孔的下表面。分隔片可以(例如)聚硅氧烷為材料，布滿了孔，這樣，當(dāng)三片組合時，每個孔形成測試孔的壁。亞分割片可以是(例如)聚硅氧烷薄片，呈篩網(wǎng)狀。底板可以是一玻璃平片，可以是，例如，生化試驗常用微滴板底部的形狀。底板的上表面可以是平的，如圖5c所示，或可形成與亞分割片對齊的凹陷，提供每個樣品孔內(nèi)的完全亞分割。可用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如硅片組裝所用的方法，將這三片結(jié)構(gòu)結(jié)合。
寡核苷酸錨分子、接頭部分或探測劑可用常規(guī)技術(shù)來合成，例如用市售寡核苷酸合成儀和／或?qū)⒁押铣善芜B接起來。本發(fā)明實施例之一中，功能性核酸錨分子，例如寡核苷酸錨分子，可用各種常規(guī)技術(shù)定位在測試區(qū)表面之上或之內(nèi)，所述技術(shù)包括光刻或絲網(wǎng)化學(xué)附著，噴墨沉積，毛細管技術(shù)，網(wǎng)狀或液體通道芯片，用電極列陣進行的電化學(xué)刻畫，針或刺觸碰，或變性后通過烘烤或UV輻照印到濾膜上(參見，Rava等，(1996)，美國專利5，545，531；Fodor等(1996)，美國專利5，510，270；Zanzucchi等(1997)，美國專利5，643，738；Bernnan(1995)，美國專利5，474，796；PCT WO92／10092；PCT WO90／15070)?？蓪㈠^分子置于測試區(qū)表面之上，或者，例如在聚丙烯酰胺凝膠墊中，錨分子植入表面，其一部分突出表面外與接頭反應(yīng)。優(yōu)選實施例中，用一游離氨基衍生功能性寡核苷酸錨分子的5’末端；在諸如50mM磷酸鹽，pH8．5緩沖液加1mM EDTA中稀釋至經(jīng)驗濃度(例如1μM)；用Pixus納升噴射分散器(Cartesian Technologies)以約10．4nl液滴的形式分布到一測試孔的特定位置上，該測試孔的上表面是新鮮干燥的DNA結(jié)合板(Corning Costar)。根據(jù)寡核苷酸固著和蒸發(fā)的相對速度，可能需要在制備過程中控制測試孔內(nèi)的濕度。另一實施例中，可用常規(guī)方法直接在測試區(qū)表面上合成寡核苷酸錨分子，所述方法例如寡核苷酸鏈延伸的光激活去保護(例如，聯(lián)用以定點“屏蔽”)，或用納升噴射分散器格式化分散去活化化合物的納升液滴?？蓪⒂写@取的核苷酸的全部延伸序列去保護，然后將此核苷酸遍加于表面。
肽、蛋白質(zhì)、凝集素、螯合劑、塑料及其他類型錨分子或接頭部分也可以用常規(guī)方法得到，并用合適的技術(shù)將錨分子定位在表面之上或之內(nèi)(參見。Fodor等(1996)，美國專利5，510，270；Pirrung等(1992)，美國專利5，143，854；Zanzucchi等(1997)，美國專利5，643，738；Lowe等(1985)，美國專利4，562，157；Niemeyer等(1994)，NAR22，5530-5539)。
本發(fā)明部分實施例中，所述組合被用于多種篩檢過程和／或獲取有關(guān)探針或靶分子的含量、活性或結(jié)構(gòu)的信息。這類試驗稱為多列陣板式篩檢(MAPS)法或試驗，此類試驗所用、包含錨分子或錨分子加探針列陣的表面稱為MAPS列陣或MAPS板。
反應(yīng)混合物的組分、試驗或篩檢過程可以任意次序組合。例如，可依次將錨分子、接頭和靶分子組裝起來；或在有或沒有報道物的條件下，在溶液中將靶分子與接頭相組裝，然后與錨分子接觸。
本發(fā)明實施例之一涉及檢測至少一種靶分子的方法，該方法包括a)在獲得所述靶分子與所述接頭第一雜交產(chǎn)物的有效條件下，將可能含所述靶分子的樣品與雙官能接頭接觸，所述接頭的第一部位對寡核苷酸錨分子具有特異性，其第二部位包含對所述靶分子具有特異性的探針；b)在獲得所述第一雜交產(chǎn)物與所述組合之間第二雜交產(chǎn)物的有效條件下，將所述第一雜交產(chǎn)物與所述組合接觸，在加入所述第一雜交產(chǎn)物之前，所述組合具有1)一個表面，包含多個空間上分散的區(qū)域，至少兩個區(qū)域基本相同，每個區(qū)域包含2)至少8種不同的寡核苷酸錨分子，
c)將所述第一雜交產(chǎn)物或所述第二雜交產(chǎn)物與標(biāo)記過的檢測探針接觸；d)檢測所述檢測探針。
以下試驗或方法都可以大處理量地進行，即，在每一測試板或表面上迅速地同時分析大量樣品(多達約864、1036、1536、2050或更多，這取決于組合中測試區(qū)的數(shù)量)。而且，許多板或表面可同時進行試驗。例如，在藥物開發(fā)方法中，可將大量含候選藥物(例如大量化學(xué)物質(zhì)組合文庫，如小分子、肽、寡核苷酸等物質(zhì)的變體)的樣品加到組合中分開的各區(qū)，或先加至生物或生化樣品中，然后加到組合中分開的各區(qū)，與區(qū)內(nèi)的探針列陣一起培養(yǎng)；得以對每份樣品進行分析。隨著目前高密度微滴板，DNA點植工具，在更高密度微滴板上產(chǎn)生和收集數(shù)據(jù)的激光技術(shù)等方法，機器人，改進型分散器，完備的檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理軟件的開發(fā)與問世，用本發(fā)明方法，每日可篩檢數(shù)以萬計的化合物。
例如，在以寡核苷酸為探針的實施例中，所述試驗可以是用診斷性核酸或聚核苷酸篩檢(例如，結(jié)合試驗或其他)大量樣品中有否遺傳變異或缺陷(例如，與諸如囊性纖維化等疾病相關(guān)的多態(tài)性或特殊突變。參見，例如，Iitia等(1992)Molecular and Cellular Probes 6505-512)；病原體(例如細菌、病毒、原蟲，它們的宿主是人等動物或植物)，或指示特定生理狀態(tài)或疾病的mRNA轉(zhuǎn)錄模式。包含部分EST(包括全長拷貝)的核酸探針列陣可用來測評EST源細胞(或其他細胞)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄模式。核酸探針還可檢測域特定核酸序列特異性結(jié)合的肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域(反之亦然)。
在另一實施例中，本發(fā)明的組合可用于監(jiān)測生化反應(yīng)，諸如蛋白質(zhì)、核酸、小分子等之間的相互作用-例如監(jiān)測抗原與抗體之間，受體(例如純化受體或結(jié)合于細胞膜的受體)與其配體、活化劑或拮抗劑之間，或酶(例如蛋白酶或激酶)與其底物之間相互作用的效率或特異性，或監(jiān)測底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化量的升高或降低，等等。上述生化試驗可用于描述探針或靶分子的特征，或作為篩檢試驗的基礎(chǔ)。例如，為了篩檢樣品中有否特定的蛋白酶(例如參與凝血的蛋白酶，例如蛋白酶Xa和VIIa)，可在如下組合上分析樣品，即，組合中的探針是對各種感興趣的蛋白酶具有特異性的熒光性物質(zhì)。如果靶蛋白酶結(jié)合并切割底物，通常，因為兩能量轉(zhuǎn)移對之間的切割分離，底物將發(fā)出熒光，于是可測得信號。另一實施例中，為了篩檢樣品中有否特定的激酶(例如，Src，酪氨酸激酶或ZAP70)，可在以下組合上分析含一種或多種感興趣激酶的樣品，即組合中的探針是可被感興趣激酶之一選擇性磷酸化的肽。使用本領(lǐng)域公知、可按常規(guī)確定的條件，可在合適的緩沖液中，將樣品與底物列陣及輔因子一起培養(yǎng)一段經(jīng)驗時間(在某些試驗中，例如在研究調(diào)節(jié)感興趣激酶活性的因素的生化試驗中，可以調(diào)節(jié)各種激酶的濃度，使得每種底物的磷酸化速度相近)?？稍诮?jīng)驗確定的條件下處理(例如洗滌)反應(yīng)物以去除激酶和不需要的反應(yīng)組分，然后可如下檢測被磷酸化的底物，例如，與熒光標(biāo)記的抗磷酸酪氨酸或抗磷酸絲氨酸抗體(例如，濃度約10nM左右)等可測試劑一起培養(yǎng)，于是可測到信號。另一實施例是進行結(jié)合試驗。例如，可在合適的磷酸化肽探針列陣上分析諸如GRB2 SH2或ZAP70 SH2等SH2結(jié)構(gòu)域；或在特定受體探針列陣上篩檢血清有否免疫缺陷。此外，還可以以此類列陣方式進行酶聯(lián)試驗。本發(fā)明的組合還可用于檢測活性高于或低于相應(yīng)野生型的突變酶；或篩檢除草劑或殺蟲劑等藥劑。
當(dāng)然，可用MAPS試驗測定樣品中活性靶分子的含量，條件是探針不被完全占滿，即，不超過90％的探針被靶分子結(jié)合(或與之反應(yīng)或雜交)。在此條件下，得以定量靶分子是因為靶分子越多則被結(jié)合的探針越多。另一方面，如果90％以上的探針被結(jié)合，所含靶分子的增加不顯著增加與探針結(jié)合的靶分子。前述各種類型的靶分子均可以這種方式定量。例如，實施例6描述了寡核苷酸靶分子的定量。而且，它還顯示，即使靶分子大大過量(例如，含量大到令MAPS探針列陣上所有可反應(yīng)探針被飽和)，通過向結(jié)合混合物加入已知量的非標(biāo)記靶分子，就可以“使反應(yīng)靈敏度遷移”，從而得以定量如此大量的靶分子。
另一實施例中，可用本發(fā)明的組合篩檢調(diào)節(jié)靶分子與給定探針之間相互作用的試劑。一種試劑可能通過與探針、靶分子或靶分子與探針?biāo)蓮?fù)合物直接或間接相互作用而調(diào)節(jié)靶分子／探針之間的相互作用。所述調(diào)節(jié)有多種形式，包括但不限于提高或降低靶分子對探針的親和力，提高或降低靶分子與探針結(jié)合的速度，競爭性或非競爭性地抑制探針與靶分子的結(jié)合，或有時，提高或降低探針或靶分子的活性，而這種活性則導(dǎo)致探針／靶分子之間相互作用的增強或減弱。這類試劑可以是人造或天然物質(zhì)。此外，這類試劑可以其本來狀態(tài)或與其他物質(zhì)形成的聚合體被使用；它們能共價或非共價、直接或通過一特定的結(jié)合性物質(zhì)與結(jié)合元件連接。例如，為了鑒定“血液稀釋劑”或與致凝血蛋白酶級聯(lián)成員之一反應(yīng)的藥劑，可用許多候選藥物測試感興趣的蛋白酶的混合物，然后如前所述測定活性。本發(fā)明還可用于測定許多其他藥劑，包括除草劑和殺蟲劑。實施例16和17描述了關(guān)于選擇性抑制特定激酶的藥劑，或關(guān)于選擇性抑制劑SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化肽之間相互作用的藥劑的大處理量試驗。
另一實施例中，本發(fā)明的組合可用于篩檢改變基因表達模式的試劑?？捎霉押塑账崃嘘囪b定某些mRNA，它們從一組基因進行表達的方式與特定的生理狀態(tài)或發(fā)育階段，或與疾病狀態(tài)相關(guān)(“相關(guān)性”基因、RNA或表達模式)?！跋嚓P(guān)”或“相關(guān)性”表示RNA的合成方式與細胞的生理狀況相關(guān)，而不一定表示給定RNA的表達負責(zé)或?qū)е绿囟ǖ纳頎顟B(tài)。例如，可鑒定這樣一個小mRNA亞組，它們在細胞內(nèi)被表達，受到正調(diào)和／或負調(diào)，因此作為特定疾病狀態(tài)的模型；這種被改變的表達方式與不表現(xiàn)出病理表型的正常細胞內(nèi)的表達方式相比，就可作為病態(tài)的標(biāo)志(“指示”基因、RNA或表達模式)?！跋嚓P(guān)性”與“標(biāo)志”兩詞可互換使用。例如，經(jīng)肉豆蔻酸佛波酯等腫瘤促進劑處理的細胞可能表現(xiàn)出類似腫瘤生長早期所見的基因表達模式。在另一種癌癥模型中，小鼠胰腺瘤細胞(細胞系TGP61)被腺病毒感染時，表現(xiàn)出c-Jun和MIP-2表達增加，而諸如GAPDH和L32等管家基因的表達則基本不受影響。
接觸疾病模型細胞后直接或間接，體內(nèi)或體外(或在組織培養(yǎng)物中)改變標(biāo)志表達模式的實際可作為患該病的生物體(例如，人或其他動物，或植物)的治療劑或藥物。試劑還可能通過直接接觸核酸而改變表達模式，例如在體外(試管)表達系統(tǒng)中。本文中，“改變”表示引起參與可測知反應(yīng)的分子等物質(zhì)的量和／或活性的增加或減少。本發(fā)明的組合可用于篩檢此類試劑。例如，可將一系列細胞(例如來自疾病模型)與一系列試劑接觸(例如，接觸約10分鐘至約48小時，或更久)，并用常規(guī)公知方法(例如市售試劑盒)抽提總RNA或mRNA。如果需要擴增RNA，可用諸如RT-PCR擴增等標(biāo)準(zhǔn)方法(參見，Innis等(1996)，PCR ProtocolsA Guideto Methods in Amplification，Academic Press，New York)?？勺尦樘嵛?或其擴增產(chǎn)物)與大量基本相同的列陣接觸(例如一起培養(yǎng))，所述列陣包含針對相應(yīng)標(biāo)志RNA的探針，于是可鑒定出與標(biāo)志表達模式改變相關(guān)的試劑。實施例15描述了一個大處理量的試驗，用于篩檢可能改變病態(tài)相關(guān)基因表達模式的化合物。
同樣，也可鑒定改變與特定生理狀態(tài)或發(fā)育階段相關(guān)的表達模式的試劑。此類試劑可以是人造或天然物質(zhì)，包括環(huán)境因素，例如參與胚胎發(fā)育或調(diào)節(jié)生理反應(yīng)的物質(zhì)，或重要的農(nóng)用物質(zhì)例如除草劑或殺蟲劑。此外，這類試劑可以其本來狀態(tài)或與其他物質(zhì)形成的聚合體被使用；它們能共價或非共價、直接或通過一特定的結(jié)合性物質(zhì)與結(jié)合元件連接。
本發(fā)明的另一實施例是一種試劑盒，用于在樣品中檢測至少一種靶分子，它包括a)一個表面，具有許多分散的區(qū)域，至少兩個區(qū)域基本相同，每區(qū)至少有8種不同的錨分子(寡核苷酸，或本文所述的任意一種)，b)一個容器，含至少一種雙官能分子，它的第一部位對至少一種錨分子具有特異性，第二部位包含對至少一種所述靶分子具有特異性的探針。
實施例之一中，提供以上a)中所述的表面和一組說明書，說明如何將至少一種所述錨分子與雙官能接頭分鐘相連，所述接頭分子具有對至少一種錨分子具有特異性的第一部位和含對至少一種所述靶分子具有特異性的探針的第二部位。說明書還包括，例如，表面上每種錨分子的描述，錨分子數(shù)量及其所在位置的說明，以及將接頭與錨分子特異性相連(締合或結(jié)合)的方案。例如，如果錨分子是寡核苷酸，說明書包括每種錨分子的序列，供操作者籍此設(shè)計出接頭上與之互補的錨特異性部位，以便與該錨分子特異性相互作用(例如與之雜交)；如果錨分子是肽，說明書將提供有關(guān)，例如，與該肽特異性相互作用的抗體的信息。說明書可能還包括將錨分子與接頭結(jié)合的方案，例如雜交(或其他結(jié)合類型)的條件和試劑，例如溫度和培養(yǎng)時間，去除不結(jié)合分子(例如洗滌)的條件和試劑，等等。此外，說明書可能包括有關(guān)構(gòu)造和使用本文所述各種對照接頭的信息，和用本發(fā)明組合進行的定量、校準(zhǔn)、“微調(diào)”或標(biāo)定試驗等方法的信息。說明書可包括任何本申請所揭示的參數(shù)、條件或?qū)嵤┓绞?，這些都可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)方法進行。
如本發(fā)明其他部分所述，操作者可在本發(fā)明表面上固定一個或多個給定的錨分子列陣，多種接頭，由此形成多種探針列陣。而且，操作者可以從本發(fā)明表面去除任意一組給定接頭而加上另一組(與第一組相同或不同)，使得給定表面可重復(fù)使用多次。這種靈活性和可重復(fù)使用性也是本發(fā)明的優(yōu)點。
另一實施例中，本發(fā)明的組合可用于繪制EST圖譜(被表達序列標(biāo)簽)。即，可用MAPS試驗確定一組EST中哪些(如果有)來自同基因的不同(或部分重疊)部分，哪寫(如果有)是獨特的。圖18，19，20和21顯示這樣一個試驗，該實施例中的試驗是測定16種EST中哪些(如果有)與一共同基因“連鎖”。該試驗(圖18)的第一步，組裝以下列陣其中，有待定位的每種EST由至少一個與之對應(yīng)的寡核苷酸探針代表。數(shù)量等于(或大于)有待定位的EST的列陣分布于表面上分散的各區(qū)(例如孔)；在所示實施例中，組合的表面有16個孔，各含一個由16種不同EST-特異性寡核苷酸(編號1-16)組成的列陣。“對應(yīng)于”一種EST(即“EST-特異性”)的寡核苷酸對該EST的互補性足以使該寡核苷酸在選定嚴(yán)謹(jǐn)性條件下特異性地與該EST雜交，而不與其他不相關(guān)的EST雜交。這種對應(yīng)于一種EST的寡核苷酸能與編碼或非編碼cDNA鏈，或與mRNA(在最適條件下)特異性結(jié)合，所述cDNA和所述mRNA是由EST源基因合成的。本發(fā)明的其他部分討論了為獲得特異性雜交，設(shè)計寡核苷酸時所要考慮的因素和需要優(yōu)化的雜交參數(shù)。為了組裝列陣，制備接頭分子，各自具有對通用列陣錨分子具有特異性的部分和包含對應(yīng)于有待定位的EST之一的寡核苷酸探針的部分；接頭，如本發(fā)明其他部分所述，與錨分子相連。下一步，取一等份含核酸(例如，mRNA或單鏈或變性cDNA)混合物的樣品，其中可能含與一種或多種寡核苷酸探針互補的序列，將其加至含探針列陣的各區(qū)(孔)；然后，在常規(guī)確定的最適條件下培養(yǎng)混合物，從而允許核酸與互補探針結(jié)合。如果數(shù)種EST特異性探針與一種核酸的不同部分互補，該核酸將與列陣中這些探針各自所在位置結(jié)合。
下一步，將不同的偵探寡核苷酸(所示實施例中即1-16號標(biāo)志)加至各區(qū)(孔)(見圖19)。偵探寡核苷酸被設(shè)計成針對有待定位的各EST。各EST特異性偵探而不是探針寡核苷酸對應(yīng)于EST的不同(至少部分不重合)部分，這樣，探針與偵探寡核苷酸就不會相互干擾。例如，以圖21所示的EST為例，它們對應(yīng)于圖18-20中的EST1、2和6。圖21顯示，EST1和2都來自X基因(它們是“連鎖的”)，EST6則來自另一不相關(guān)的基因。如果含mRNA混合物(其中包括來自X基因的)的樣品等份與圖18-20所示探針列陣一起培養(yǎng)，在最適條件下，X基因的mRNA將在探針1和2位雜交，而不會在探針6位雜交。(當(dāng)然，加入的每種mRNA的摩爾量都必需過量于它可雜交探針的總數(shù))。如果將偵探寡核苷酸1加至測試區(qū)(孔)1，它將與結(jié)合于探針列陣1和2位的X基因的mRNA雜交，而不會在6位雜交。同樣，如果在另一孔-例如2號孔-加入偵探寡核苷酸2，它也將在1和2位結(jié)合，而不會在6位。以此方式，能夠大處理量地確定哪些EST是連鎖的，即，編碼同基因的不同部分，哪些EST是獨特的。對于圖20所示的假設(shè)實施例，頭3個EST編碼同一基因的不同部分，末5個EST編碼另一基因的不同部分，其余EST則似乎不連鎖。本發(fā)明其他部分結(jié)合其他MAPS試驗討論了雜交條件，最適洗滌步驟，檢測方法，等等。為了證實MAPS試驗得到的連鎖信息，可以用EST-特異性寡核苷酸探針對作為有義和反義引物進行PCR反應(yīng)。每組連鎖EST將產(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物。注意，該配對PCR測試可直接用來確定連鎖性，而不需要使用連鎖MAPS試驗；然而，這需要許多反應(yīng)，必需合成每個EST引物作為有義和反義鏈。對所示實施例來說，這需要180個此類反應(yīng)。
本發(fā)明一方面內(nèi)容涉及測定大量EST中哪些與一給定核酸互補的方法，它包括a)固定化的寡核苷酸探針列陣與含給定核酸測試樣品一起培養(yǎng)，至少列陣中探針之一對應(yīng)于各所述EST，從而獲得所述寡核苷酸探針與所述核酸之間的雜交產(chǎn)物，
b)所述雜交產(chǎn)物與偵探寡核苷酸一起培養(yǎng)，該偵探寡核苷酸對應(yīng)于所述寡核苷酸探針之一所對應(yīng)的EST，但它與所述寡核苷酸探針分別對該EST的不同部分具有特異性，c)檢測所述列陣中哪些寡核苷酸探針被所述偵探探針標(biāo)記，其中，所述寡核苷酸探針列陣被固定在組合的一個區(qū)域，所述組合包括1)一個表面，具有與所研究EST等量、空間上分散的、基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含2)與所研究EST等量的不同錨分子，各錨分子與以下物質(zhì)結(jié)合3)雙官能接頭，所含第一部分對錨分子具有特異性，所含第二部分包含對應(yīng)于至少一種所述EST的寡核苷酸探針。
本發(fā)明還涉及以上所述方法，其中，一種或多種所述EST可能與所述核酸互補，各所述EST含兩段不同的寡核苷酸序列，第一段定義一個對應(yīng)于所述EST的探針，第二段定義一個對應(yīng)于所述EST的偵探寡核苷酸，該方法包括a)含所述核酸分子的樣品與組合中至少一個區(qū)接觸，所述區(qū)具有寡核苷酸探針列陣，至少其中之一對應(yīng)于各所述EST，b)所述樣品與所述區(qū)域一起培養(yǎng)，從而令所述核酸分子與EST對應(yīng)性寡核苷酸探針結(jié)合，所述探針與所述核酸的一部分互補，c)所述區(qū)域與偵探寡核苷酸一起培養(yǎng)，所述區(qū)含有與一種或多種所述EST對應(yīng)性寡核苷酸探針結(jié)合的核酸分子，所述偵探寡核苷酸對應(yīng)于所述列陣中所述給定寡核苷酸探針之一所對應(yīng)的EST，由此令偵探寡核苷酸與核酸分子結(jié)合，該核酸分子已經(jīng)與所述給定寡核苷酸探針或與所述核酸互補的其他寡核苷酸探針相結(jié)合，d)檢測所述偵探寡核苷酸，從而鑒定所述列陣中哪些EST對應(yīng)性寡核苷酸探針與核酸上結(jié)合所述給定EST對應(yīng)性寡核苷酸探針的部分互補，進而鑒定哪些EST與所述核酸互補，其中，所述寡核苷酸探針列陣固定在組合的一個區(qū)域內(nèi)，所述組合包括1)一個表面，具有與所研究EST等量、空間上分散的、基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含2)與所研究EST等量的不同錨分子，各錨分子與以下物質(zhì)結(jié)合3)雙官能接頭，所含第一部分對錨分子具有特異性，所含第二部分包含對應(yīng)于至少一種所述EST的寡核苷酸探針。
EST定位試驗的各部分可以任意順序組合。例如，可順次組裝錨分子、接頭和EST；或者在有或沒有報道物的條件下，在溶液中連接接頭與EST，然后加入錨分子中。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容涉及測定大量EST中哪些與給定核酸互補的方法，它包括a)將一組雙官能寡核苷酸接頭分子與可能含給定核酸的測試樣品一起培養(yǎng)，以獲得所述寡核苷酸探針與所述核酸之間的第一雜交產(chǎn)物，所述接頭分子各自的第一部分對應(yīng)于至少一種所述EST的探針，第二部分對錨分子寡核苷酸具有特異性，b)將所述第一雜交產(chǎn)物與一固定寡核苷酸錨列陣一起培養(yǎng)，以形成包含所述錨分子、所述寡核苷酸探針和所述核酸的第二雜交產(chǎn)物，其中，各寡核苷酸錨對應(yīng)于至少所述接頭分子之一的錨特異性部分，c)將所述第一雜交產(chǎn)物或第二雜交產(chǎn)物與偵探寡核苷酸一起培養(yǎng)，所述偵探寡核苷酸對應(yīng)于所述寡核苷酸探針之一所對應(yīng)的EST，但它與寡核苷酸探針對EST上不同部位具有特異性，d)檢測哪些寡核苷酸探針被所述偵探寡核苷酸所標(biāo)記，其中，所述寡核苷酸錨固定在組合的一個區(qū)域上，所述組合包括1)一個表面，具有與所研究EST等量、空間上分散的、基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含2)與所研究EST等量的不同錨分子。
當(dāng)然，上述定位EST的方法可用于確定測試序列(例如聚核苷酸)在任意感興趣核酸上的位置。例如，可以確定兩種或更多克隆DNA片段或cDNA是否屬于同一基因組DNA。該方法有助于闡明復(fù)雜長基因的結(jié)構(gòu)。以類似的方式，可確定一段或多段切出序列或編碼序列是否屬于同一基因組DNA。這樣的測定可用于，例如，診斷試驗，區(qū)分以差異剪接為特征的正常與病態(tài)。定位方法的其他應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容涉及一種測定大量聚核苷酸中哪些與給定核酸互補的方法，其中，可能一種或多種所述聚核苷酸與所述核酸互補，各所述聚核苷酸包含兩段不同的寡核苷酸序列，第一段定義一個對應(yīng)于所述聚核苷酸的寡核苷酸探針，第二段定義一個對應(yīng)于所述聚核苷酸的偵探寡核苷酸，該方法包括a)將含有所述核酸分子的樣品與組合中至少一個區(qū)接觸，所述區(qū)具有一個寡核苷酸探針列陣，至少探針之一對應(yīng)于各所述聚核苷酸，
b)將所述樣品與所述區(qū)域一起培養(yǎng)，令所述核酸分子與所述聚核苷酸對應(yīng)性寡核苷酸探針結(jié)合，所述探針與所述核酸的一部分互補，c)將所述區(qū)域與偵探寡核苷酸一起培養(yǎng)，以令偵探寡核苷酸與核酸分子結(jié)合，所述區(qū)域具有與一種或多種所述聚核苷酸對應(yīng)性寡核苷酸探針結(jié)合的所述核酸，所述偵探寡核苷酸對應(yīng)于給定寡核苷酸探針?biāo)鶎?yīng)的聚核苷酸，所述核酸分子已經(jīng)與所述給定寡核苷酸探針或與所述核酸互補的其他寡核苷酸探針相結(jié)合，d)檢測所述偵探寡核苷酸，從而鑒定所述列陣中哪些聚核苷酸對應(yīng)性寡核苷酸探針與核酸的一部分互補，所述核酸分子能與聚核苷酸對應(yīng)性給定寡核苷酸探針結(jié)合，從而鑒定哪些聚核苷酸與所述給定核酸互補，其中，所述寡核苷酸探針列陣固定在組合的一區(qū)域上，所述組合包括1)一個表面，具有與所研究聚核苷酸等量、空間上分散的、基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含2)與所研究聚核苷酸等量的不同錨分子，各錨分子與以下物質(zhì)結(jié)合3)雙官能接頭，所含第一部分對錨分子具有特異性，所含第二部分包含對應(yīng)于至少一種所述聚核苷酸的寡核苷酸探針。
在本發(fā)明另一方面內(nèi)容中，上述定位EST或其他聚核苷酸的方法還包括在步驟之間去除樣品中不結(jié)合的部分。
在本發(fā)明另一實施例中，一種或多種感興趣的RNA靶(例如mRNA或其他類型RNA)通過逆轉(zhuǎn)錄被轉(zhuǎn)化成cDNA，然后將這些cDNA與探針列陣雜交。圖8顯示這類試驗。如本文所述，由細胞或組織制備RNA抽提物(或純化mRNA)。然后向RNA樣品中加入對感興趣的RNA具有特異性的逆轉(zhuǎn)錄酶和寡核苷酸引物，用可常規(guī)確定并優(yōu)化的公知方法或過程生產(chǎn)cDNA第一鏈?！疤禺愋浴币镏?，與感興趣的mRNA的互補性足以在選定嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與之結(jié)合，并為逆轉(zhuǎn)錄酶所識別，但不與雜核酸結(jié)合(參見有關(guān)獲得特異性雜交的適宜反應(yīng)條件的論述)。殘留RNA-不被特異性引物所識別的mRNA和／或RNA抽提物中其他污染性RNA(例如tRNA或rRAN)-可用多種核糖核酸酶或化學(xué)方法去除，例如堿處理，只留下將與MAPS列陣接觸的單鏈cDNA。該方法因使用逆轉(zhuǎn)錄酶而不必大量處理RNA，RNA對核酸酶很敏感，因而很難處理。而且，特異性逆轉(zhuǎn)錄引物所增加的特異性為本發(fā)明又增加了一個特異性層次。
或者，可在與探針列陣雜交前先擴增上述cDNA，以增加信號強度。上述寡核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶引物其5’端可含成為RNA聚合酶(例如T7、T3或SP2聚合酶，等)特定起始位點的序列(可長約22-27個核苷酸)。圖8所示實施例中，逆轉(zhuǎn)錄酶引物中加入的是T7啟動子序列。向cDNA中增加聚合酶識別位點，可作為多輪轉(zhuǎn)錄中相應(yīng)RNA聚合酶的識別位點(例如體外轉(zhuǎn)錄，即IVT)?？蛇x的是，可用PCR及合適的引物進一步擴增由此產(chǎn)生的mRNA或cDNA本身。轉(zhuǎn)錄和PCR的過程是本領(lǐng)域所熟悉的。
上述方法先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA靶轉(zhuǎn)化為cDNA，然后在MAPS板上分析，該方法可取代標(biāo)準(zhǔn)MAPS試驗用于前文所述各種以RNA為基礎(chǔ)的試驗。
本發(fā)明另一實施例中，一種或多種感興趣的核酸靶與特定的聚核苷酸保護片段雜交，然后進行核酸酶保護過程，并在MAPS板上分析與感興趣的靶雜交的保護片段。如果感興趣的靶是RNA而保護片段是DNA，核酸酶保護／MAPS試驗(NPA-MAPS)可減少處理RNA的需要，RNA因極易被污染性核酸酶降解而很難處理。在這樣的NPA-MAPS試驗中，探針列陣中的探針與感興趣的靶核酸具有相同的鏈型，而不是象在標(biāo)準(zhǔn)MAPS試驗中那樣與它們互補。圖9顯示了一個NPA-MAPS試驗的實施例。
NPA-MAPS試驗中，感興趣的靶可以是各種核酸，例如基因組DNA、cDNA、病毒RNA或DNA，rRNA、tRNA、mRNA、寡核苷酸、核酸片段、修飾核酸、合成核酸等。本發(fā)明優(yōu)選實施例中，該方法被用于分析存在于組織或細胞RNA抽提物的一種或多種mRNA。先在選定嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件(參見前文有關(guān)獲得特異性雜交的適宜反應(yīng)條件的論述)下將含感興趣靶的樣品與一種或多種保護片段雜交。保護片段即一段聚核苷酸，它可以是例如RNA、DNA(包括PCR產(chǎn)物)、PNA或修飾或取代過的核酸，它對感興趣的核酸靶的一部分具有特異性?！疤禺愋浴北Ｗo片段表示這樣的聚核苷酸，它與其結(jié)合對象的互補性足以在選定嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與之雜交而不與其他不相關(guān)的核酸雜交。保護片段的長度可至少10個核苷酸，以50-100個為佳，或者是全長cDNA。在優(yōu)選實施例中，保護片段是單鏈DNA寡核苷酸。單獨一次雜交反應(yīng)可包含對多達100或更多靶分子具有特異性的保護片段。雜交后，用一種或多種核酸酶的混合物處理樣品，基本上破壞掉除被保護片段外的所有核酸，所述保護片段已經(jīng)與感興趣的核酸和(可選)靶核酸的一部分雜交，它們經(jīng)雜交而在核酸酶保護過程中不被降解(呈雙鏈雜交體)。例如，如果樣品含細胞提取物，該步驟可基本破壞不需要的核酸(例如所感興趣之外的基因組DNA、tRNA、rRNA和mRNA)。各種核酸酶均可使用，包括，例如，胰RNA酶，綠豆核酸酶，S1核酸酶，RNAse A，核糖核酸酶T1，外切核酸酶III等，這取決于雜交復(fù)合物和樣品中不需要的核酸的性質(zhì)。RNAse H對于消化與DNA保護片段結(jié)合的殘留RNA特別有用。這些酶的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域所熟悉的，并可按經(jīng)驗進行優(yōu)化。此外，可使用化學(xué)方法，例如堿水解RNA。根據(jù)需要，可再用本領(lǐng)域熟悉的方法處理樣品以去除不雜交的物質(zhì)，和／或滅活或去除殘留的酶(例如苯酚萃取、沉淀、柱過濾等)。雜交，然后核酸酶消化和(可選)化學(xué)降解，這一過程就是核酸酶保護法；許多核酸酶保護法已經(jīng)被描述過(參見，例如，Lee等(1987)，Meth．Enzymol．152，633-648．Zinn等，(1983)，Cell 34，865-879)。經(jīng)核酸保護處理，然后(可選)將核酸酶滅活的樣品與MAPS探針列陣接觸，進行普通MAPS試驗步驟。如本文就標(biāo)準(zhǔn)MAPS試驗所述，結(jié)合的保護片段可通過與標(biāo)記的靶特異性報道物雜交而被檢測到，或者，可用可測分子共價或非共價地標(biāo)記保護片段本身。
優(yōu)選實施例中，保護片段直接被標(biāo)記，而不是通過與靶特異性報道物雜交而被標(biāo)記。例如，報道物通過配體-抗配體相互作用與保護片段結(jié)合，例如，將鏈霉親和素酶復(fù)合物加入生物素化的保護寡核苷酸。另一實施例中，保護片段被化學(xué)修飾(例如直接與辣根過氧化物酶(HRP)或熒光染料偶聯(lián))，然后(例如，在經(jīng)酶或化學(xué)處理剪切下該修飾之后)檢測帶有或不帶保護片段的核酸部分的該化學(xué)修飾。在任一上述方法中，保護片段可在與對應(yīng)接頭分子雜交之后或之前標(biāo)記。
為了控制核酸酶保護過程正常進行，即，不雜交的核酸按要求被降解，可以設(shè)計一種或多種含懸垂(非雜交性)節(jié)段的保護片段，如果過程進行正常，則這些節(jié)段將被核酸酶剪切掉?？赏ㄟ^與一段互補標(biāo)記檢測探針雜交來測定懸垂片段的有無，或者，可用可測分子共價或非共價地標(biāo)記保護片段的懸垂部分本身。這一控制可在樣品與探針列陣接觸之前進行，或作為MAPS試驗的一部分。實施例15描述了一個此類控制試驗的實例。當(dāng)然，因為不同的標(biāo)記很容易區(qū)別(例如不同吸收光譜的熒光團)，所以同一試驗可包括數(shù)種差異標(biāo)記的寡核苷酸。而且，在試驗進行過程中，可用凝膠電泳分析的標(biāo)準(zhǔn)核酸保護試驗來驗證保護片段是否如期望地被加工。
NPA-MAPS試驗可用于樣品中靶分子的定量。如果加入的保護片段的摩爾量大大過量于靶分子，足以使雜交反應(yīng)驅(qū)向完全，則核酸保護步驟之后殘留的保護片段量將反映樣品中的靶分子量。實施例12和13描述了一個如此定量反應(yīng)的實例。
NPA-MAPS試驗可作為任一上述用到MAPS試驗的方法的補充。
在優(yōu)選實施例中，聚核苷酸保護片段是用質(zhì)譜而不是在MAPS板上測定的。在最佳實施例中，在雜交或核酸酶消化過程中，聚核苷酸都不與固體表面結(jié)合。雜交后，可用核酸酶或化學(xué)處理降解雜交的靶分子，留下保護片段與曾與靶分子雜交的片段量呈正比?；蛘?，可處理樣品以留下靶分子的雜交部分(單鏈)或靶分子與保護片段雜交形成的雙鏈，然后對其進行分析?？蓪⒂写治龅臉悠放c其他雜交或核酸酶混合物分離(例如用乙醇沉淀或親和性層析吸附)，稀釋或溶解，用適合大處理量的環(huán)注法注入質(zhì)譜儀。優(yōu)選實施例中，用本領(lǐng)域熟悉的方法，將有待分析的樣品吸附于一表面，并通過激光解吸進行分析。因為可以用靈敏度最高的Fourier轉(zhuǎn)化質(zhì)譜(FTMS)(或其他類似先進技術(shù))，所以可測知毫微微或以下的保護片段。
可將一份或多份樣品中有待測定的保護片段設(shè)計成對所用質(zhì)譜儀只發(fā)出一種信號。實施例之一中，各保護片段可經(jīng)雜交和核酸酶處理后具有獨特的分子量，根據(jù)它們的分子量、離子化特征及片段化模式，足以測出它們的濃度。為了提高靈敏度或協(xié)助分析復(fù)雜的混合物，可用提供獨特信號的化學(xué)部分修飾保護片段(例如衍生)。例如，可用不同天然或非天然氨基酸衍生各保護片段通過酰胺鍵將氨基酸結(jié)合于寡核苷酸鏈上雜交部分的一處或多處。用能量適宜的質(zhì)譜儀，斷鏈發(fā)生在酰胺鍵處，釋放出特征氨基酸部分。這種以中等大小(分子量約80-200)化學(xué)組分作為質(zhì)譜標(biāo)簽的方法是較好的，因為如此大小的分子一般易被測知。另一實施例中，化學(xué)修飾是具有明確質(zhì)譜信號的有機分子，例如四烷基銨基團，它能夠衍生另一分子，例如一氨基酸。另一實施例中，正離子或負離子信號通過與某種試劑反應(yīng)而被增強。例如，要增強正離子的檢測，可將吡喃鎓鹽(例如四氟硼酸2-4-二噻吩基，6-乙基吡喃鎓，或其他)與胺反應(yīng)形成吡啶鎓鹽；可用任意其他增強劑形成其他正電官能團(參見，例如，Quirke等(1994)Analytical Chemistry 66，1302-15)。同樣，可用許多本領(lǐng)域公知的試劑反應(yīng)形成負離子增強劑。當(dāng)然，化學(xué)修飾的檢測可在從核酸上剪切下來之后，或仍與核酸結(jié)合時進行。通過以可區(qū)別的方式鑒定每一保護片段，可在一次試驗中分析(例如篩檢)大量不同的靶分子(例如2、6、10、16或更多的不同靶分子)。許多此類試驗快速而方便。所以，可以如前所述，大處理量地進行一種或一組此類試驗。
不論寡核苷酸是根據(jù)其質(zhì)量還是用獨特的分子標(biāo)簽進行檢測，各種測信分子在已知濃度的純制劑中的代號可被詳盡地加以特征描述。因而可以將信號準(zhǔn)確定量。對欲用質(zhì)譜法檢測的分子來說，無法準(zhǔn)確預(yù)計強度和概況。分子被離子化的趨勢，分子內(nèi)部所有化學(xué)鍵對斷鏈的敏感性，各片段帶多電荷或單電荷的程度，都太復(fù)雜，因而無法預(yù)計。然而，對于一個具有固定能量和樣品處理方式的儀器來說，信號的強度和概況具有很好的重復(fù)性。因此，對于每個探針來說，可用純標(biāo)準(zhǔn)物描述信號的特征，從而可準(zhǔn)確地將實驗信號翻譯成含量。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一涉及檢測一種或多種感興趣的核酸分子的方法，包括用一種或多種保護片段對含感興趣核酸的樣品進行核酸酶保護，質(zhì)譜法檢測雜交的雙鏈、或被保護核酸、或保護片段。
核酸的質(zhì)譜分析是本領(lǐng)域所熟悉的。參見，例如，Alper等(1998)Science2792044-2045和Koster的美國專利5，605，798。
除上述之外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員還知道許多其他大處理量的試驗。
多探針試驗的優(yōu)點之一是能夠在各探針列陣中包含大量“對照”探針，它們與實際實驗探針經(jīng)歷相同的反應(yīng)條件。例如，列陣內(nèi)各區(qū)可含有陽性和／或陰性對照?！瓣栃詫φ铡痹诖吮硎疽阎芘c靶分子充分反應(yīng)，或以可定量或可定性方式與之反應(yīng)的探針，它們因而成為探針／靶分子相互作用的(內(nèi)部)標(biāo)準(zhǔn)物。這樣的探針可作為，例如，雜交效率的對照?！瓣幮詫φ铡痹诖吮硎疽阎旧喜慌c靶分子相互作用的對照探針。這樣的探針可作為，例如，反應(yīng)特異性的對照。作為可用對照的實例，有以下實驗，其中用一個寡核苷酸探針列陣篩檢調(diào)節(jié)一組某疾病相關(guān)基因表達的試劑。作為內(nèi)部對照以校準(zhǔn)某些變量，例如各樣品內(nèi)裂解細胞數(shù)量、mRNA回收率、或雜交效率，某探針列陣可包含對表達水平據(jù)估計不受被測試劑改變的一種或多種基礎(chǔ)或組成型管家基因(例如肌動蛋白、微管蛋白等結(jié)構(gòu)基因)或DNA結(jié)合性蛋白質(zhì)(例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等)具有特異性的探針。此外，要確定被測試劑是否具有副作用，例如細胞致死性或毒性，探針列陣可包含如下探針?biāo)鼈儗υ诩毎绦蛩劳鲋姓T導(dǎo)的基因或受細胞創(chuàng)傷(例如熱休克蛋白)或細胞毒性(例如p450基因)條件誘導(dǎo)的基因具有特異性。
列陣中還可包含用于實驗靈敏度“微調(diào)”的其他對照探針。例如分析調(diào)節(jié)與特定病態(tài)相關(guān)mRNA產(chǎn)生的試劑的試驗。如果先前的試驗提示該組內(nèi)一相關(guān)mRNA(如mRNA-A)的產(chǎn)量如此之高以至于其信號淹沒了其余mRNA的信號，則可調(diào)節(jié)接頭，對試驗進行“微調(diào)”，使得信號強度相等?！胺忾]接頭”含有針對mRNA-A的錨特異性寡核苷酸序列，但沒有探針特異性序列，可添加它們以稀釋靶特異性接頭，從而降低試驗對該mRNA的靈敏度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照傳統(tǒng)方法常規(guī)確定封閉接頭與非封閉接頭的適當(dāng)比例。
本發(fā)明試驗中的待測樣品可包含任意上述或其他靶分子。液體待測樣品可以是適合測試區(qū)大小的任意體積，約為100nl至100μl。優(yōu)選實施例中，在一塊1536孔微滴盤的各孔中加約1μl的液滴?？捎萌魏芜m合大處理量分析的方法將樣品與探針列陣接觸，例如移液、噴墨分散或用多針頭器具。在探針與靶分子發(fā)生結(jié)合或其他有效相互作用的有效條件(例如鹽濃度、pH、溫度、培養(yǎng)時間，等，參見前文)下培養(yǎng)樣品。這些條件可常規(guī)確定。培養(yǎng)后，可處理(例如洗滌)樣品以去除不結(jié)合的靶分子，所用條件可經(jīng)驗確定，目的是完好保留特異性相互作用而去除非特異性結(jié)合的物質(zhì)。例如，可在與獲得探針／靶分子結(jié)合所用嚴(yán)謹(jǐn)性條件相同或更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下洗滌樣品1至10次或更多次。
可用各種方法制備含靶RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA或總RNA)的樣品。例如，可將作為抽提mRNA來源的體外細胞培養(yǎng)物平板接種于表面的區(qū)域上，例如鋪在微滴板的單個孔內(nèi)?？蛇x的是，在這些細胞達到要求的細胞密度后，可用感興趣的試劑進行處理，所述試劑例如激發(fā)劑或潛性治療劑，可用各種方法將其加入細胞，例如用多針頭器具(例如Beckman的96或384針工具)，或通過移液或噴墨分散，然后根據(jù)具體試驗，與細胞一起培養(yǎng)約15分鐘至48小時?？捎霉椒?例如市售試劑盒)常規(guī)制備自體外或體內(nèi)來源的組織或細胞抽提的總RNA、mRNA等。
可選的是，可通過雜交前預(yù)先用核酸酶保護法(NP)處理樣品從RNA樣品中至少部分去除可能與感興趣的RNA競爭結(jié)合特異性探針的核酸(例如與感興趣的RNA至少具有部分序列同源性的基因組DNA、rRNA、tRNA或mRNA)。將過量的某種核酸加入樣品，并在選定嚴(yán)謹(jǐn)性條件下一起培養(yǎng)，該核酸(即“保護片段”，可以是RNA、DNA或PNA)至少與感興趣RAN的一部分互補，而且其序列與感興趣RNA的特異性探針序列部分或完全重合，所述條件下，保護片段將與感興趣的RNA特異性雜交(參見前文有關(guān)適宜反應(yīng)條件的論述)。在這一步，可添加對樣品內(nèi)任一或所有RNA具有特異性的保護片段(例如100種，或更多)。雜交反應(yīng)后，用一種或多種核酸酶的混合物處理樣品，基本上破壞除各感興趣RNA上與保護片段互補部分之外，或除保護片段與被保護RNA所成雙鏈之外的所有核酸。下一步中，可通過雙鏈變性并用合適的酶消化來去除雙鏈中的保護片段，所述的酶只降解保護片段而保持被保護RNA基本完好。許多核酸酶可用于上述消化步驟，例如胰腺RNAse，綠豆核酸酶，RNAse H，S1核酸酶(在高鹽或低鹽消化條件下)，RNAse A，核糖核酸酶T1，內(nèi)切核酸酶III，內(nèi)切核酸酶VII，RNAse CL3，RNAse PhyM，RNAse U2等，根據(jù)雜交復(fù)合物和樣品中不需要的核酸的性質(zhì)來選擇。這些酶的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域所熟悉的，并可常規(guī)確定和優(yōu)化。根據(jù)需要，可用本領(lǐng)域所熟悉的方法處理樣品以去除不雜交的物質(zhì)和／或滅活或去除殘留的酶(例如苯酚萃取、沉淀、柱層析，等)。然后，將處理后的樣品與探針列陣接觸。為了控制特異性雜交和后繼核酸酶保護過程正常進行，反應(yīng)混合物可包括被標(biāo)記的保護片段。為了控制核酸酶保護過程正常進行，即，非雜交核酸按要求被消化，可設(shè)計一種或多種包含懸垂節(jié)段(不雜交)的保護片段，如果試驗進行正常，則這些懸垂將被切除。通過用互補性標(biāo)記探針進行雜交，或用可測分子標(biāo)記保護片段懸垂部分本身，可檢測懸垂片段的有無。
對任一本發(fā)明方法來說，可用多種方法標(biāo)記靶分子，這些方法是本領(lǐng)域所熟悉的，而且在本文的其他部分有所描述(例如，檢測核酸酶保護片段部分)。例如，靶分子可直接或間接與提供檢測信號的化學(xué)基團偶聯(lián)，所述基團例如化學(xué)發(fā)光分子，或催化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光分子的酶，或熒光素或cy5之類熒光分子，或例如鑭系金屬之一的時間分辨熒光分子，或放射性化合物?；蛘撸蟹肿涌稍谂c探針反應(yīng)之后以一種或多種靶特異性報道物(例如抗體、圖1所示的寡核苷酸，或前文就與探針及靶分子結(jié)合所述的多種分子中的任一種)進行標(biāo)記。也可以使用各種更復(fù)雜的夾心檢測方法。例如，可將靶分子與一雙官能分子雜交，該分子的第一部分具有對靶分子的特異性，第二部分可被通用(共同)報道物(例如標(biāo)記過的聚核苷酸、抗體等)識別?？稍O(shè)計雙官能分子，從而在各試驗中按使用所需數(shù)量的共同報道物。
如何在獲得結(jié)合或其他穩(wěn)定相互作用的有效條件下將靶分子與靶特異性報道物一起培養(yǎng)的方法可按常規(guī)確定(參見前文)。例如，可將熒光寡核苷酸報道物(濃度約10nM至1μM或更高，以約30nM為佳，在諸如6X SSPE-T緩沖液中)與結(jié)合靶分子在約15-45℃(以室溫為佳)一起培養(yǎng)約15分鐘至2小時(以約30-60分鐘為佳)。培養(yǎng)后，可處理(例如洗滌)樣品以去除未結(jié)合的靶特異性報道物，經(jīng)驗確定處理條件保留特異性相互作用，而去除非特異性結(jié)合的物質(zhì)。例如，可在與獲得靶分子／報道物結(jié)合所用嚴(yán)謹(jǐn)性條件相同或更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下洗滌樣品1至10次，或更多次。
用靶特異性報道物進行標(biāo)記為原來的雜交反應(yīng)增加了一層特異性，例如，一種靶特異性寡核苷酸針報道物對一靶核酸序列中不同于探針核苷酸的部分，或探針和報道物抗體識別靶抗原不同表位。此外，用靶特異性報道物進行標(biāo)記可使反應(yīng)的靈敏度“遷移”。例如，如果作為相關(guān)表達模式一部分的靶mRNA表達水平很低，通過將結(jié)合的靶與數(shù)種(約2種至5種以上)各自與靶mRNA不同部位結(jié)合的靶特異性報道物雜交可增強信號水平。
獨立檢測兩種標(biāo)記的能力允許MAPS試驗中再多一種對照。部分(約10-100％)針對特定錨位(圖7顯示了3個錨位，各含許多基本相同的錨分子(A、B或C))的接頭可在一個末端連接一個標(biāo)記(例如熒光團)。例如，羅丹明或Cy5熒光團可連接在接頭的5’端。這種修飾接頭稱為“對照接頭”。在接頭與對照接頭混合物與錨分子結(jié)合，含靶分子的樣品與所得探針列陣一起培養(yǎng)后，可使用帶有不同熒光團(例如熒光素或諸如化學(xué)發(fā)光劑等其他檢測標(biāo)記)的靶特異性報道物(或，可用熒光團或其他檢測標(biāo)記直接標(biāo)記靶分子)；然后可測定兩種信號的比例。有對照接頭就能夠標(biāo)定測試區(qū)內(nèi)和測試區(qū)之間的有效(例如能夠與接頭相互作用)錨分子的數(shù)量(即，測試列陣各位置結(jié)合靶分子的容量，用于將信號歸一化)，作為定量結(jié)合探針的基礎(chǔ)，幫助錨位的定址和／或提供陽性對照，例如因為樣品內(nèi)沒有靶分子而沒有信號的情況。本發(fā)明另一實施例中，還可用兩種不同的標(biāo)記(例如熒光團)檢測兩群不同的靶分子；然而，能夠通過空間區(qū)分信號來識別靶分子的存在的能力允許將一種標(biāo)記用于不同的靶分子。
本發(fā)明另一實施例中，對靶分子具有特異性的“錨分子”不與接頭結(jié)合，而直接與靶分子結(jié)合，然后靶分子可與靶特異性報道物相互作用。
靶分子，不論標(biāo)記與否，都可用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進行檢測(參見，例如，F(xiàn)odor等(1996)，美國專利5，510，270；Pirrung等(1992)，美國專利5，143，854；Koster(1997)，美國專利5，605，798；Hollis等(1997)，美國專利5，653，939；Heller(1996)，美國專利5，565，322；Eggers等(1997)美國專利5，670，322；Lipshutz等(1995)BioTechniques 19，442-447；Southern(1996)Trends in Genetics 12，110-115)。檢測方法包括以酶為基礎(chǔ)的檢測，比色法，SPA，放射性自顯影，質(zhì)譜法，電學(xué)方法，吸光度或發(fā)光度檢測(包括化學(xué)發(fā)光或電發(fā)光)，和檢測(例如)微小粒子標(biāo)簽造成的光散射。也可以檢測熒光標(biāo)記，例如通過電荷偶合裝置造影(CCD)或熒光顯微(例如掃描或共焦熒光顯微)，或通過掃描系統(tǒng)與CCD列陣或光電倍增管聯(lián)合，或使用以列陣為基礎(chǔ)的技術(shù)進行檢測(例如，可測定一測試區(qū)每10微米的表面勢能，或在分辨率足夠高的條件下利用表面等離子體共振)?；蛘?，列陣可含這樣的標(biāo)記它能因向接頭、靶分子或報道物上的標(biāo)記轉(zhuǎn)移能量(或能量被其改變)而被測定。在大量基于熒光的檢測系統(tǒng)中包括熒光強度、熒光極化(FP)、時間分辨的熒光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和均勻時間釋放的熒光(HTRF)。對重復(fù)條形碼樣格式的分析可通過格式識別(根據(jù)與其他點或線的相對位置尋找各特定經(jīng)標(biāo)記靶分子相應(yīng)的點或線)和其后的標(biāo)記強度定量來完成。條形碼識別裝置和用于分析單維或兩維列陣的計算機軟件可用常規(guī)方法制造和設(shè)計，而且／或者可以購買(例如，參見Rava等(1996)，美國專利5，545，531)。
制造和使用本發(fā)明的方法包括如前所述制備表面或測試區(qū)，合成或純化并連接或組裝本文所述的錨分子、接頭、探針和偵探探針等物質(zhì)，以及如前所述檢測和分析經(jīng)標(biāo)記或帶標(biāo)簽的物質(zhì)，這些都是熟悉的常規(guī)技術(shù)。除前文參考文獻中的方法之外，參見，例如，轉(zhuǎn)讓給Affymax、Affymetrix、Nanogen、Protogene、Spectragen、Miilipore和Beckman(本發(fā)明所用即它們的產(chǎn)品)的專利；分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書，包括前文所引用的那些；和Cozette等(1991)的美國專利5，063，081；Southern(1996)，Current Opinion in Biotechnology 7，85-88；Chee等(1996)Science 274，610-614；和Fodor等(1993)Nature 364，555-556。
附圖簡述圖1顯示寡核苷酸的設(shè)計，其中，接頭1包含一個對錨分子1具有特異性的部分和另一個對靶mRNA1具有特異性的部分(探針)，其中，標(biāo)記的檢測探針1對靶mRNA1上的一段序列具有特異性，它不同于接頭的靶特異性部分序列。
圖2顯示包含15個測試區(qū)的表面，各區(qū)包含一個6種寡核苷酸錨分子組成的列陣。
圖3顯示用于受體結(jié)合試驗的接頭設(shè)計，其中，接頭的錨特異性部分通過生物素與鏈霉親和素分子與探針部分(受體蛋白)連接，其中對受體具有特異性的配體以熒光標(biāo)記分子進行標(biāo)記。B生物素。SA鏈霉親和素。Rec受體蛋白。配體受體的天然或合成配體。*與配體連接的熒光標(biāo)記分子。
圖4顯示含21個測試區(qū)的表面，各區(qū)又被再分割成16個亞區(qū)(凹陷)。
圖5a，5b和5c顯示可組裝成圖4所示表面的3片結(jié)構(gòu)。圖5a代表孔分隔片；圖5b代表亞分割片；圖5c代表底板。
圖6代表2個測試區(qū)，各含“條形碼”樣格式的探針(或錨分子)線性排列。
圖7表示含3種錨分子(A、B和C)的測試區(qū)，各種錨分子以多拷貝(組)形式存在。各組錨分子所在位置稱為一個“位”。
圖8顯示一試驗，其中，特異性逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的cDNA在MAPS板上進行試驗。
圖9顯示使用核酸酶保護過程的試驗(NPA-MAPS試驗)。由細胞或組織制備樣品RNA，以波形線表示。向RNA樣品中加入一組聚核苷酸保護片段，以粗的黑白線表示。保護片段的黑線部分表示與特異性RNA靶分子互補并與之雜交的節(jié)段。白線部分表示懸垂部分與互補序列相鄰但不與靶分子互補的序列。加入過量的保護片段。在所有存在的靶分子與保護片段雜交后，用合適的核酸酶混合物處理樣品并進行化學(xué)處理，破壞掉不需要的未雜交RNA和未雜交聚核苷酸。例如，S1核酸酶可破壞所有單鏈DNA。因此，過量的保護片段和結(jié)合保護片段的未雜交懸垂部分被水解?？杉尤氚ê颂呛怂崦窰在內(nèi)的核糖核酸酶，或堿加熱樣品來水解RNA。留下的是許多經(jīng)剪切的保護片段，它們反映了樣品中曾含有的各種靶RNA的量。用MAPS雜交試驗測定留下的保護片段。
圖10顯示MAPS試驗的雜交特異性。
圖11顯示錨分子與接頭結(jié)合的動力學(xué)。
圖12顯示對兩種寡核苷酸靶的MAPS試驗。
圖13顯示靈敏度遷移的定量。
圖14顯示4種寡核苷酸接頭／錨分子組合的熔點測定。
圖15顯示以NPA-MAPS進行的mRNA試驗。
圖16顯示用NPA-MAPS的稀釋曲線。
圖17顯示檢測含磷酸酪氨酸殘基的肽的試驗。
圖18顯示制作EST圖譜的第一步在MAPS板上的通用錨分子列陣上組裝對應(yīng)于各待定位EST的接頭。將包含16種不同寡核苷酸探針的接頭固定到微滴板上16孔各自的表面上，排列成4×4的矩陣。第一位是寡核苷酸1，它與第一EST序列的一部分互補，16種待測EST以此類推。
將由EST源基因生成的cDNA或mRNA加入16個孔，在適宜條件下令其雜交。因此，任何含有16種EST序列之一的cDNA或mRNA都將固定到其互補探針?biāo)诘奈恢谩?br> 圖19顯示制作EST圖譜的下一步將偵探寡核苷酸加入MAPS板。板上各孔得到一種對應(yīng)于待定位EST之一的偵探寡核苷酸。各偵探寡核苷酸是一段與用于檢測的分子偶聯(lián)的寡核苷酸，例如，如果檢測方法是熒光造影，則該分子是熒光素。各偵探核苷酸與EST之一互補，但不同于EST特異性探針，所以，與同一EST互補的探針和偵探寡核苷酸可同時與之結(jié)合。
洗滌后，各孔中加入一種偵探寡核苷酸，如圖中數(shù)字所示。即，具有與第一EST互補序列的偵探寡核苷酸加入第一孔，以此類推。
圖20a和b顯示圖18和圖19所示制作EST圖譜的結(jié)果。偵探寡核苷酸雜交和用適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)性條件洗滌后，微滴板上的16孔用(例如)基于CCD的熒光造影儀造影。圖20a顯示特定格式的結(jié)果。預(yù)計，各EST特異性偵探寡核苷酸將標(biāo)記被對應(yīng)EST特異性探針?biāo)潭ǖ膍RNA或cDNA。例如，探針5在該處結(jié)合含第5EST序列的cDNA或mRNA，所以，第5偵探寡核苷酸也應(yīng)與該同一位置的cDNA或mRNA雜交。這是所示特定格式信息的情況，即各檢測寡核苷酸標(biāo)記相匹配的探針。此外，頭3個偵探寡核苷酸各自標(biāo)記頭3個探針?biāo)潭ǖ腸DNA或mRNA，說明這些序列位于同一基因上。同理，最后5個EST也似乎是連鎖的。圖20b顯示了以上信息確定的連鎖關(guān)系。
圖21顯示圖18-20中探針、偵探寡核苷酸和EST1、2和6的關(guān)系。
圖22顯示大處理量的試驗。
實施例實施例1雜交特異性(參見圖10)用噴墨分散器，Pixus系統(tǒng)(Cartesian Technologies，Inc．，Irvine，CA)制作一塊通用MAPS板，在微滴板的各孔內(nèi)形成相同的DNA格網(wǎng)。所有寡核苷酸均購自Biosource International(Camarillo，CA)。對于該板，各孔內(nèi)如鍵盤(圖左側(cè))所示分布7種不同寡核苷酸。各種寡核苷酸均以10nl液滴形式分布于DNA結(jié)合板孔(Corning Costar)上的2個位置，它們含于含500mM磷酸鈉，pH8．5和1mM EDTA的2μM溶液中，任其干燥。固定后，用50mM Tris pH8封閉各孔，然后用0．1％SDS在5×SSP緩沖液中所成溶液洗去沒有與表面共價結(jié)合的寡核苷酸。
將熒光標(biāo)記的接頭寡核苷酸加到洗滌后的板上，在6×SSPE加0．1％TritonX-100中室溫雜交30分鐘。這是一種優(yōu)選的接頭固定方案。接頭寡核苷酸在合成過程中以Cy5進行衍生，與特異性錨著寡核苷酸的25堿基節(jié)段互補。7種錨分子和接頭的序列如下(都是從3’到5’)#1錨分子*SEQ ID1TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC接頭**SEQ ID2GTCGTTTCCATCTTTGCAGTCATAGGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGARNA模擬物(小鼠C-jun)SEQ ID3CTATGACTGCAAAGATGGAAACGACGATACTGAGTTGGACCTAACATTCGATCTCATTCA偵探寡核苷酸***SEQ ID4TGAATGAGATCGAATGTTAGGTCCA#2錨分子*SEQ ID5CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC接頭**SEQ ID6CTAGGCTGAAGTGTGGCTGGAGTCTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTGRNA模擬物(小鼠MIP-2)SEQ ID7AGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGGATACTGAGTCTGAACAAAGGCAAGGCTAACTGAC偵探寡核苷酸***SEQ ID8GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG#3錨分子*SEQ ID9GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG接頭**SEQ ID10ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCGRNA模擬物(小鼠GAPDH)SEQ ID11CCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGATACTGAGTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC偵探寡核苷酸***SEQ ID12GTCATCATACTTGGCAGGTTTCTCC#4錨分子*SEQ ID13GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA接頭**SEQ ID14CTACCGAGCAAACTGGAAATGAAATTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTCRNA模擬物(小鼠L32蛋白)SEQ ID15ATTTCATTTCCAGTTTGCTCGGTAGGATGCTGAGTGAGTCACCAATCCCAACGCCAGGCT偵探寡核苷酸***SEQ ID16AGCCTGGCGTTGGGATTGGTGACTC#5錨分子SEQ ID17CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG接頭**SEQ ID18
CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG6#錨分子*SEQ ID19CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC接頭**SEQ ID20GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG#7錨分子*SEQ ID21GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG接頭**SEQ ID22CGAAGAGATGCATAACGCGGCGCCG*5’端為酰胺，有C12間隔基的合成錨分子**5’端連有Cy5的合成接頭***5’端連有生物素的合成偵探寡核苷酸向各孔加入一種接頭或接頭混合物(如圖所示)。(在標(biāo)有“全部”的孔中加入7種接頭的混合物)。培養(yǎng)，并以5×SSP洗滌3次后，用Tundra造影儀(IRI，St．Catherines，Ontario)得到該圖右側(cè)的熒光照片。如圖所示，接頭通過與互補錨分子的特異性結(jié)合自安裝于表面。
在各孔中重復(fù)該過程，分散有8種不同錨分子的孔除外，然后，接頭與錨分子優(yōu)先結(jié)合。在24、96、384、864或1536孔板的各孔中用36、64等不同錨分子重復(fù)全過程。實施例2結(jié)合動力學(xué)(參見圖11)圖中顯示不同濃度的Cy5衍生1號接頭與其互補固定錨分子的雜交速度。如圖1所示制備通用MAPS板，但錨分子1固定于各孔的4個位置。培養(yǎng)在室溫下，5×SSP加0．1％Tween-20中進行，各孔用5×SSP洗滌3次，測定結(jié)合熒光。用Tundra得到測試板的熒光照片，用Tundra軟件，扣除背景，算出各孔內(nèi)各位置的累積熒光強度。圖中繪制的是2個重復(fù)孔之一中4個位置累積熒光強度的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例3熒光接頭按照前述方法，用一種錨著寡核苷酸固定于各孔內(nèi)1個位置(最上方2行)、4個位置(后4行)或16個位置(下面2行)。用實施例1所述優(yōu)選方案，將互補的、熒光標(biāo)記的接頭固定于各孔。洗滌后，用Tundra獲取測試板的熒光照片。各位置上的熒光量反映可有多少接頭與靶分子雜交。重復(fù)位置測得的信號量具有高度的重現(xiàn)性。
實施例4結(jié)合曲線將不同濃度的靶核苷酸加至實施例3制備的測試板。已結(jié)合的接頭含有一段25元的序列與靶分子的一部分互補。加入30或100微升靶分子在5×SSC加0．05％SDS中所成的溶液，覆蓋測試板，50℃培養(yǎng)過夜。靶分子與固定接頭雜交后，用優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光法顯現(xiàn)靶分子。加入30nM生物素化的偵探寡核苷酸，它含一段25元序列與靶分子上另一部分(不是與接頭互補的部分)互補。可在洗去未結(jié)合的靶分子后，加入生物素化的偵探分子反應(yīng)30分鐘，或者，可以與靶分子一起加入，進行一晝夜的雜交。偵探分子結(jié)合后，表面以5×SSC洗滌2次，以含0．1％Tween-20和1％PEG的1×SSP(SSPTP)洗滌1次，室溫下加入250μg／ml與鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶(HRP∶SA，購自Pierce，Rockford，Ill．)在SSPTP中的1∶50，000稀釋液反應(yīng)5小時，用SSPTP洗孔4次，用超信號紫外試劑(Pierce)洗滌1次，并用它培養(yǎng)。數(shù)分鐘后，用Tundra造影儀采集發(fā)光照片，例如，可在CCD列陣內(nèi)累積造影5分鐘。在靶分子濃度僅為約5×10-13M的孔中即可看到低水平信號；當(dāng)濃度達到約10-10M時，信號量達到飽和。重復(fù)位置測得的信號具有高度重現(xiàn)性。實施例52種寡核苷酸的試驗(參見圖12)所示的結(jié)合曲線顯示用2種不同靶寡核苷酸，以前述優(yōu)選方案進行的MAPS雜交試驗。用4種不同的錨著寡核苷酸制備通用MAPS板，各錨分子分別于各孔內(nèi)重復(fù)點4次。第2和第4錨分子的互補接頭寡核苷酸自安裝于表面。各孔內(nèi)加入40μl所示濃度的兩種靶分子，50℃培養(yǎng)過夜。如前所述，以各靶分子的生物素化的特異性檢測寡核苷酸與之結(jié)合，然后加入HRP∶SA，進行化學(xué)發(fā)光造影，如此顯現(xiàn)各結(jié)合的靶分子的量。圖的下部，對圖象強度進行了定量。用Tundra造影儀套裝中的軟件沿圖上部所示箭頭之間的線掃描圖象強度，在1．1pM的靶分子最低濃度，掃描圖象在各位置都顯示清晰的高斯峰，最左端即0濃度靶分子樣品中，沒有可識別的背景峰。
實施例6靈敏度遷移(圖13)可用MAPS雜交試驗測定一組寡核苷酸的濃度將它們固定于表面，并進行標(biāo)記。這對于中低濃度的寡核苷酸很有效。此時可將兩種樣品區(qū)分開來，因為，一種樣品含寡核苷酸較多，則結(jié)合的也較多。另一方面，如果靶定寡核苷酸的濃度對表面來說已飽和(即，如果高得足以占據(jù)所有位點)，則濃度進一步升高也不會結(jié)合更多，則不能定量。然而，可通過添加非標(biāo)記競爭性配體來改變靶分子的結(jié)合曲線。
獲取4種不同寡核苷酸靶的結(jié)合數(shù)據(jù)，它們在約為3nM時都對表面飽和(即達到最大結(jié)合)。向各孔都加入非標(biāo)記的競爭性靶分子，標(biāo)記核苷酸的結(jié)合發(fā)生漂移，濃度較低則結(jié)合較少，飽和濃度被提高。例如，可以加入靶分子1和3的競爭性寡核苷酸，但不加靶分子2和4的競爭性寡核苷酸。這樣，只使靶分子1和3的試驗靈敏度發(fā)生遷移。這樣，如果預(yù)計寡核苷酸的相對量已知，就可以在一個試驗孔中測定許多不同濃度的寡核苷酸靶分子。
可以如上所述，根據(jù)數(shù)據(jù)定量寡核苷酸靶分子之一的結(jié)合。圖13定量顯示，試驗中包含競爭性寡核苷酸使得用于分析該靶分子的曲線向高濃度遷移。實施例74種探針的熔點(圖14)將MAPS測得的與錨寡核苷酸特異性雜交的4種不同熒光標(biāo)記接頭寡核苷酸的量繪制成溫度的函數(shù)。4種寡核苷酸先在50℃，300nM雜交1小時。然后，用不含探針的SSC洗孔，如前所述用熒光測定結(jié)合量(50℃點)。然后，在55℃培養(yǎng)30分鐘并測定結(jié)合熒光，以此類推至所有圖中溫度。實施例8檢測方法兩種檢測方法可直接比較。MAPS板上固定有4種寡核苷酸錨分子，各自在每孔的4個位置，每孔中加入兩種寡核苷酸，兩者都含共價連接的cy5或含生物素基團。如觀察和測定熒光接頭所述，測定表面熒光。按照就隨后加入HRP∶SA和化學(xué)發(fā)光底物的MAPS所述，測定化學(xué)發(fā)光。產(chǎn)生的信號大致為相同的數(shù)量級。然而，由于孔與孔彼此分開的微滴板幾何形狀，以及偶爾出現(xiàn)的液泡或液體的minisucus，表面熒光圖象中的反射可能干擾數(shù)據(jù)解讀。實施例9化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物可以象比較MAPS試驗的檢測方法一樣比較作為辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物的兩種產(chǎn)物。如實施例8所述制備MAPS板，與生物素化的接頭寡核苷酸一起培養(yǎng)。然后，加入與鏈霉親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶(AlkPhos∶SA)或HRP∶SA，然后洗滌，向孔中加入CDP-Star(Tropix)和AlkPhos∶SA，或加入ECL-Plus和HRP∶SA。按照生產(chǎn)商就Western印跡中標(biāo)記所做的建議，用SA衍生的酶和底物進行標(biāo)記。這兩種底物(以及其他底物)都可用來評價寡核苷酸與MAPS板的雜交。實施例100．6mm的分辨率測定本系統(tǒng)的MAPS試驗分辨率制備每孔4種不同寡核苷酸錨分子的MAPS板，各種錨分子在每孔中重復(fù)4個位置，柵距(中心距)0．6mm。然后，如前所述，與cy5衍生的接頭或生物素化的接頭雜交，檢測并掃描。表面熒光測定的分辨率較高(可減小柵距)。化學(xué)發(fā)光檢測中，相鄰位置沒有完全分開，在這樣的間距，計算機解卷積能明確分辨單個峰。實施例11測試核酸酶保護方案在測定核酸酶保護方案中雜交和核酸酶處理的最佳條件的實驗中，用Ambion(Austin，Texas)的核酸酶保護試驗試劑盒來提供條件、緩沖液和酶。以三種緩沖液之一配制8種樣品。Hyb Buff1是100％雜交緩沖液(Ambion)；Hyb Buff2是75％雜交緩沖液加25％雜交稀釋緩沖液(Ambion)；Hyb Buff3是兩種緩沖液各50％。合成一段70元寡核苷酸，其中60個殘基與被測mRNA互補(BiosourceInternational，Camarillo，CA)，按照Ambion建議的補骨脂素-熒光素標(biāo)記方案，用補骨脂素-熒光素(Schleicher and Schuell，Keene，NH)標(biāo)記。簡而言之，保護片段以20μl TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8)稀釋至50μg／ml，煮沸10分鐘，在冰水中迅速冷卻。加入130μg／ml補骨脂素-生物素的DMF溶液4μl，用手持式長波UV光源在40℃照射45分鐘。通過飽和丁醇萃取去除游離的補骨脂素-熒光素。所用的mRNA是GAPDH反義mRNA，是用T7啟動子和MaxiScript試劑盒(Ambion)從反義質(zhì)粒(Ambion的pTRI-GAPDH-小鼠反義對照模板)制備的。另外合成60元的短保護片段，進行相同的標(biāo)記。保護片段的序列為全長保護片段SEQ ID23CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA短保護片段SEQ ID24CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT如下雜交在20℃或37℃，將20nM保護片段與60nM GAPDH mRNA混合，最終體積為10μl。雜交后，按照生產(chǎn)商的說明加入200μl核酸酶混合物(Ambion核酸酶保護試劑盒1∶200稀釋的核酸酶混合物)，在同樣溫度培養(yǎng)30分鐘。用雜交抑制緩沖液(Ambion)終止水解，沉淀出寡核苷酸，用乙醇洗滌。加入10μl 1×凝膠上樣緩沖液(Ambion)，在15％TBE-尿素凝膠上分離寡核苷酸。凝膠在運行緩沖液中轉(zhuǎn)動30分鐘，放在一塑料板上，用Tundra造影，用熒光濾光片選擇激發(fā)和發(fā)射波長。圖象在CCD列陣上累積造影2分鐘。最佳條件是在Hyb Buff2中37℃培養(yǎng)或在Hyb Buff3中22℃培養(yǎng)樣品。在這些樣品中，沒有可測的全長保護片段殘留，發(fā)現(xiàn)有大量部分全長保護片段，其大小明顯與短保護片段相同的。實施例12NPA-MAPS進行的mRNA試驗(見圖15)采用完整的NPA-MAPS方案，雜交和核酸酶處理條件與實施例11所述相似。該試驗共運行了10份樣品。它們都包含等量的70元寡核苷酸保護片段和不同量的GAPDH mRNA。10μl含0．08mg／ml酵母RNA的50％雜交緩沖液加50％稀釋緩沖液的雜交樣品90℃加熱6分鐘，簡單離心，37℃加熱5分鐘，令其冷卻至19℃，培養(yǎng)19小時。然后在每份樣品中加入200μl核酸酶混合物，19℃放置30分鐘。每份樣品取60μl進行MAPS試驗。加入2μl 10N NaOH和2μl 0．5MEDTA，樣品90℃加熱15分鐘，70℃加熱15分鐘，冷卻至室溫20分鐘。然后，用2μl 10M HCl中和樣品，加入12μl含2M HEPES pH7．5和200nM對保護片段具有特異性的生物素化偵探寡核苷酸的20×SSC和1μl 10％SDS。混合樣品，80℃加熱5分鐘，各樣品吸出兩份35μl，加至MAPS板的兩孔(各樣品一分為二，在MAPS板上平行試驗)。該板是按照標(biāo)準(zhǔn)MAPS方案制備的，已經(jīng)固定有對保護片段具有特異性的自安裝的CY-5衍生接頭。覆蓋MAPS板，50℃培養(yǎng)過夜，如前所述進行檢測和發(fā)光，在對照試驗中不加核酸酶，以觀察MAPS僅檢測保護片段的情況。在圖的下半部分，顯示了對上排孔的強度掃描(如用造影儀進行分析那樣)。圖中列出了樣品內(nèi)GAPDHmRNA的含量(即，加至MAPS板后各重復(fù)孔內(nèi)的量)。
用于MAPS板的寡核苷酸為
錨分子*SEQ ID25CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC接頭**SEQ ID26CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATGCTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG保護片段(與小鼠GAPDH的反義mRNA互補)SEQ ID27CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA偵探寡核苷酸***-5’端以生物素標(biāo)記SEQ ID28AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT*5’端為酰胺，有C12間隔基的合成錨分子**5’端連有Cy5的合成接頭***5’端連有生物素的合成偵探寡核苷酸實施例13稀釋曲線，NPA-MAPS(圖16)對實施例12討論并顯示于圖15的數(shù)據(jù)進行定量，并繪制成稀釋曲線。所繪8點是兩重復(fù)孔在各種mRNA濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。上面還重合以結(jié)合曲線，其形式為結(jié)合分?jǐn)?shù)=最大結(jié)合*1／(1+IC50／L)其中的最大結(jié)合是飽和濃度時的最大結(jié)合，結(jié)合分?jǐn)?shù)是在配體濃度L時的結(jié)合量，IC50是結(jié)合分?jǐn)?shù)為最大結(jié)合一半時的配體濃度。該曲線在圖中以紅點表示，以圖中所示的最佳擬和值(fit value)IC50=4．2毫微微摩爾繪制。實施例14小鼠肝總RNA抽提物中GAPDH mRNA的NPA-MAPS試驗用NPA-MAPS試驗分析小鼠總RNA提取物中的GAPDH mRNA，并繪制稀釋曲線。用Qiagen試劑盒制備來自小鼠肝臟的總RNA。在含0．5M乙酸鎂的70％乙醇中沉淀RNA，重懸在含0．05％SDS和1．8nM保護片段的10μl 5×SSC中。所加保護片段長70個堿基，其中60個與小鼠GAPDH互補。使用與小鼠GAPDHmRNA互補的片段(“保護片段”)，或使用該序列的互補序列作為陰性對照(“反義片段”)。
含保護片段的RNA樣品在90℃加熱5分鐘，將樣品冷卻至70℃進行雜交，經(jīng)一晝夜任其緩慢冷卻至室溫。加入30μl S1核酸酶(Promega)以1×S1核酸酶緩沖液(Promega)所配1∶10稀釋液，19℃培養(yǎng)30分鐘，用1．6μl 10N NaOH和2．7μl0．5M EDTA終止。樣品在90℃加熱15分鐘，然后在37℃變性15分鐘以破壞RNA，用1．6μl 10M HCl中和，在MAPS板上，5×SSC中含0．05％SDS，補充了200mM HEPES，pH7．5，并在其中加入30nM生物素化的檢測寡核苷酸的，在其中培養(yǎng)過夜。洗滌，并用SA-HRP顯色。信號量隨小鼠RNA減少(樣品分別含500、170、50、5或0．5μg小鼠總RNA)而減少。兩份對照樣品中不加S1核酸酶。只看到互補保護片段的信號。
所用寡核苷酸用于反義對照(與實施例12相同的寡核苷酸)錨分子*SEQ ID25CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC接頭**SEQ ID26CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATGCTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG保護片段(與GAPDH的小鼠反義mRNA互補)SEQ ID27CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTCTAA偵探寡核苷酸***-5’端以生物素標(biāo)記SEQ ID28AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT用于有義GAPDH mRNA樣品錨分子*SEQ ID25CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC接頭**SEQ ID29ATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG保護片段(與GAPDH的小鼠mRNA互補)SEQ ID30AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGCTTGTCTAA偵探寡核苷酸***SEQ ID31CGAGAAATATGACAACTCACTCAAG
*5’端為酰胺，有C12間隔基的合成錨分子**5’端連有Cy5的合成接頭***5’端連有生物素的合成偵探寡核苷酸實施例15有對照的核酸酶保護MAPS試驗由小鼠肝臟抽提mRNA，如實施例14進行核酸酶保護，但GADPH特異性保護片段含60個與小鼠GADPH互補的核苷酸，后面是3’端的15個與靶分子不互補的“懸垂”核苷酸。雜交和核酸酶消化后，如實施例14所述，留下的保護片段與MAPS板雜交，但用2種不同的寡核苷酸檢測片段來檢測被固定的保護片段。檢測片段之一與保護片段的GAPDH特異性部分互補，另一檢測片段作為對照與保護片段的15堿基懸垂互補。將各檢測片段用于不同的重復(fù)樣品(即，位于不同的孔)，這樣，兩檢測片段可被相同的檢測分子所標(biāo)記。本實施例中，兩檢測片段都被HRP標(biāo)記。不加核酸酶，可看到來自兩檢測片段的信號；但是，進行了核酸酶消化后，只能檢測到對應(yīng)于GAPDH序列的信號。GAPDH特異性信號的量比沒有進行核酸酶消化時的少，因為，加入的保護片段相對存在的GAPDHmRNA過量。這使得GAPDH mRNA量成為保護性雜交的限制因素，這樣，所形成雙鏈雜交體的量(亦即免受核酸酶消化的保護片段的量)反映mRNA的量。當(dāng)反應(yīng)混合物中沒有mRNA時，加入核酸酶后檢測不到任何信號。以上證明雜交和消化步驟的進行合乎要求。
當(dāng)給定試驗包括對應(yīng)于多種靶分子的保護片段時，每一種都含同樣的15堿基懸垂部分。這使得同一檢測片段可用于測試全部樣品的其余懸垂。實施例16篩檢改變某病態(tài)相關(guān)基因表達的化合物的轉(zhuǎn)錄試驗使用的是人腫瘤細胞系。已知它30個基因的表達水平高于正常細胞。(即，有30個基因比在正常細胞中更多地被用來在這些基因指導(dǎo)下合成mRNA，然后合成蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄試驗通過測定有多少各基因的mRNA來測定基因的使用頻率)。用MAPS板上的核酸酶保護試驗測試8800種化合物，看在化合物存在下培養(yǎng)細胞是否減少30種相關(guān)基因中部分的表達而不影響6個正?；?組成型，“管家”基因)的表達。任何具有上述效果的化合物都可在將來用于開發(fā)治療這種腫瘤的藥物。
在100塊96孔聚苯乙烯板上各孔內(nèi)加約10，000至100，000個細胞，培養(yǎng)2天，直至它們覆蓋各孔表面。各板上8個孔內(nèi)的細胞任其生長，不加任何物質(zhì)。向各板上其余88孔內(nèi)加入不同的一種化合物，從而可檢測化合物的單獨作用。一次使用100塊板，則可測試或篩檢8800種化合物。細胞在化合物存在下培養(yǎng)24小時，然后收獲細胞進行試驗。按照有關(guān)從96孔板上樣品制備RNA的說明處理各板上的細胞(例如，根據(jù)Qiagen RNeasy96試劑盒)。制得RNA后，以NPA-MAPS法測定36種不同mRNA各自的量，這其中包括30個相關(guān)基因和6個正?！肮芗摇被颉Ｏ蚋骺准尤敫髯詫?yīng)于感興趣基因之一的36種DNA寡核苷酸保護片段，讓它們在選定嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與各自靶mRNA序列雜交。然后，加入S1核酸酶破壞過量的未雜交DNA，并對樣品進行化學(xué)處理以破壞RNA。留下的是36個基因各自的寡核苷酸保護片段，其含量與各樣品中被處理細胞內(nèi)的mRNA量成正比。
100塊96孔板上各孔內(nèi)具有一個36種不同錨寡核苷酸組成的列陣，向各孔內(nèi)加入36種不同的接頭寡核苷酸進行制備。接頭自安裝于各孔表面，將通用板轉(zhuǎn)化為具有各自針對36種寡核苷酸保護片段的特異性探針的MAPS板。各接頭的一部分對36種錨分子之一具有特異性，另一部分對36種保護寡核苷酸之一的一節(jié)段具有特異性。將100塊樣品板上各孔內(nèi)的寡核苷酸樣品加至100塊MAPS板上對應(yīng)孔內(nèi)。在選定嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下雜交后，加入針對各靶分子的帶有化學(xué)發(fā)光酶的檢測寡核苷酸，這樣，各孔內(nèi)各特定位置的發(fā)光將與樣品內(nèi)mRNA含量成正比。顯示相關(guān)基因量減少而對6個管家基因沒有影響的孔都是有意義的。加入這些樣品的化合物可能是開發(fā)抗腫瘤引物的起點。實施例17誘導(dǎo)型和組成型的基因表達按照實施例14所述，由非感染(對照)小鼠和被腺病毒感染后1小時的(感染)小鼠的肝臟制備RNA。各份樣品用60μg肝RNA，制備重復(fù)樣品。各試驗孔包含3組重復(fù)位置，對應(yīng)于上述3個基因。各位置含有一種錨分子，它與含有探針的接頭結(jié)合，探針與保護片段互補，保護片段對應(yīng)于3個基因之一。按照實施例12進行核酸酶保護MAPS，采集和掃描圖象。顯示的是3種mRNA靶各自重復(fù)孔的粗略圖象數(shù)據(jù)和強度掃描。掃描線上的數(shù)字是各種情況的累積強度和標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=4)。預(yù)計不發(fā)生改變的管家基因GAPDH在感染樣品中顯示1．3倍的中度增加，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著意義。MIP-2和c-jun轉(zhuǎn)錄分別增加4倍和6倍。以上發(fā)現(xiàn)顯示，與作為對照的組成型表達基因GAPDH相比，MIP-2和c-jun兩基因的表達因腺病毒感染而增強。實施例18篩檢選擇性抑制酪氨酸或絲氨酸激酶的化合物的酶試驗(圖17)激酶是使磷酸酯與蛋白質(zhì)結(jié)合的酶。已知許多激酶刺激正常和腫瘤細胞的生長。因此，抑制特定激酶(并非所有激酶)的化合物可用來檢測激酶是否參與致病，如果是，則可以此作為藥物開發(fā)的起點。例如，參與刺激細胞生長或參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的5種酪氨酸激酶是src，lck，fyn，Zap70和yes。各激酶的底物已部分確定，是含有一個酪氨酸的短肽。激酶的某些特異性彼此重迭，因而，不同的激酶可同等地磷酸化某些肽，而優(yōu)先磷酸化另一些。對這5種激酶來說，挑選了36種表現(xiàn)出譜特異性和重迭特異性的肽底物。
使用100塊96孔測試板；各孔包含36種通用寡核苷酸錨分子。制備36種接頭將通用寡核苷酸列陣(只有錨分子)轉(zhuǎn)變成包含肽底物的列陣。合成這36種肽底物，各自通過酰胺鍵與具有5’氨基的寡核苷酸共價連接。所述寡核苷酸具有與錨分子特異性雜交的序列。將肽／寡核苷酸接頭加至MAPS板上所有孔內(nèi)，它們自安裝于表面。
為了進行篩檢，向各孔加入適當(dāng)濃度的5種激酶(以盡可能平衡底物的磷酸化速度)和8800種不同待測化合物之一。檢測化合物直接抑制分離的酶的能力。加入只結(jié)合酪氨酸被磷酸化的肽的標(biāo)記抗體，檢測列陣內(nèi)各肽磷酸化的量。有意義的是在部分而非全部磷酸酪氨酸位置表現(xiàn)出減少的那些孔。加入這些孔的化合物可進一步測試，作為部分被測激酶的選擇性抑制劑。
該試驗顯示在圖17上部。制備嵌合接頭，其中與錨分子之一互補的25個堿基對與一種酪氨酸磷酸激酶的肽底物交聯(lián)。該嵌合寡核苷酸-肽底物自安裝于寡核苷酸錨分子列陣上，用激酶來磷酸化嵌合物的肽部分，酶反應(yīng)后，用連有檢測熒光團或酶的抗磷酸酪氨酸或抗磷酸絲氨酸抗體測定肽的磷酸化量。
試驗結(jié)果顯示于圖下部。用均雙官能交聯(lián)劑DSS(Pierce)將寡核苷酸接頭的5’氨基與帶有磷酸化酪氨酸的合成肽的N末端連接。單字母的該肽序列TSEPQpYQPGENL(SEQ ID32)，其中pY代表磷酸酪氨酸。嵌合分子直接使用，或先調(diào)至pH14放置60分鐘以部分水解酪氨酸上的磷酸基團。在MAPS板內(nèi)，在所示濃度，經(jīng)1小時，磷酸化的或部分去磷酸化的嵌合分子自安裝于互補錨分子上。洗滌，并用0．3％BSA的SSPTP溶液封閉各孔后，加入與HRP交聯(lián)的抗磷酸酪氨酸抗體(一SSPTP所配1∶3000稀釋液)(抗體4G10購自Upstate Biotechnology，LakePlacid NY)，反應(yīng)1小時，用化學(xué)發(fā)光底物Super Signal Blaze測定結(jié)合抗體的量。所示的圖象的CCD列陣上的1分鐘累積。如所預(yù)計的，發(fā)現(xiàn)與寡核苷酸-肽結(jié)合的磷酸酯的量有差異。該差異是測定以不同可能性抑制劑處理時一系列激酶活性的試驗基礎(chǔ)。實施例19檢測SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化肽之間相互作用的選擇性抑制劑的結(jié)合試驗SH2結(jié)構(gòu)域是部分生長調(diào)節(jié)蛋白的?？縼喕?。該結(jié)構(gòu)域以不完善的特異性與含有磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合。即，有些磷酸酪氨酸肽與一種或數(shù)種SH2蛋白結(jié)合，另一些則與許多SH2蛋白廣泛結(jié)合。
該試驗的接頭是與寡核苷酸共價連接的磷酸化的肽。選擇能夠與一組選定SH2蛋白結(jié)合的肽。接頭將通用MAPS板轉(zhuǎn)變成具有SH2蛋白基團特異性配體的測試板。制備100塊帶有這種配體的96孔MAPS板。分離蛋白質(zhì)，用例如cy5熒光分子標(biāo)記。
為了篩檢SH2結(jié)構(gòu)域／磷酸肽相互作用的抑制劑，向100塊96孔MAPS板的各孔內(nèi)加入標(biāo)記的SH2蛋白組，并每孔加一種不同的測試化合物。因此可檢測各化合物單獨對SH2蛋白與其磷酸肽配體相互作用的效果。該試驗測定與結(jié)合于表面的各肽接頭結(jié)合的SH2蛋白的熒光。對于表現(xiàn)為部分而非全部位置熒光減弱的孔，加入其中的化合物可接受進一步試驗，作為可能的SH2停靠作用的選擇性抑制劑。
實施例20大處理量的篩檢(圖22)所示的是一塊大處理量的MAPS板，顯示在一次實驗種檢測來自96孔的信號。在80孔內(nèi)，以16份重復(fù)測定與相同寡核苷酸的雜交。如圖所示，1280次雜交實驗的重現(xiàn)性非常高。最左欄和最右欄是對照，用于不同濃度寡核苷酸信號的標(biāo)準(zhǔn)化。
以類似方式，可在各孔內(nèi)測試16種不同的寡核苷酸，該測試在板上80個孔內(nèi)重復(fù)。當(dāng)然，還可在各孔內(nèi)實驗更多的不同寡核苷酸或其他探針(例如100種寡核苷酸探針)，并同時實驗許多測試板(例如，100塊96孔微滴板)?？蓪Ω鳂悠愤M行大量實驗(后一種情況中約為100種不同實驗)，并可同時對大量樣品進行實驗(例如，后一種情況中，約96×100即9600種不同樣品)，因而具有處理量大的特點。
根據(jù)以上所述，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可輕易發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的本質(zhì)特征，并可在本發(fā)明構(gòu)思和范圍內(nèi)修改本發(fā)明以適應(yīng)不同用途和情況。
無需更多贅述，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠利用以上描述對本發(fā)明進行最充分的運用。所以，以上優(yōu)選實施例只應(yīng)理解成對所公開的其他內(nèi)容的說明而不是限定。
本發(fā)明參考了所有在此引用的專利申請、專利和出版物。
權(quán)利要求
1．一種用于檢測樣品中一種或多種靶分子的組合，在加入所述樣品之前它包括a)一個表面，具有許多空間上分開的區(qū)域，其中至少2個基本相同，各區(qū)包含b)至少8種不同寡核苷酸錨分子，各自連接c)雙官能接頭，該接頭具有對寡核苷酸錨分子特異性的第一部分，和包含所述靶分子的特異性探針的第二部分。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中各區(qū)包含至少64種不同寡核苷酸錨分子。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，具有至少96至1536個基本相同的區(qū)域。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中各區(qū)包含30至100個探針，各自對不同的靶分子具有特異性。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，具有96個基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含16、36、46或100種不同的寡核苷酸錨分子。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，具有384個基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含9、16或25種不同寡核苷酸錨分子。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，具有1536個基本相同的區(qū)域，各區(qū)包含4或9種不同寡核苷酸錨分子。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中各區(qū)再分割成更小的亞區(qū)。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中各區(qū)還包含雜交效率和特異性的對照。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中各區(qū)還包含位點靶分子結(jié)合容量的對照。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中所述探針是核酸。
12．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中所述探針是肽或蛋白質(zhì)分子。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述組合，其中所述肽或蛋白質(zhì)分子與帶有偶聯(lián)分子的所述接頭分子的第一部分偶聯(lián)。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述組合，其中的偶聯(lián)分子是生物素或鏈霉親和素。
15．根據(jù)權(quán)利要求1所述組合，其中所述探針是酶的底物或受體的配體。
16．一種用于檢測樣品中一種或多種靶分子的組合，在加入所述樣品之前它包括a)一個表面，具有許多空間上分開的區(qū)域，其中至少2個基本相同，各區(qū)包含b)至少8種不同錨分子，各自連接c)雙官能接頭，該接頭具有對錨分子特異性的第一部分，和包含所述靶分子特異性探針的第二部分。
17．一種檢測樣品中至少一種靶分子的方法，它包括在所述靶分子與權(quán)利要求1所述組合結(jié)合的有效條件下，將可能含所述靶分子的樣品與權(quán)利要求1所述組合接觸。
18．一種檢測一種或多種靶分子的方法，它包括a)在所述靶分子與權(quán)利要求1所述組合結(jié)合的有效條件下，將可能包含所述靶分子的樣品與權(quán)利要求1所述組合接觸，b)將所述組合和所有結(jié)合的靶分子與經(jīng)標(biāo)記的檢測探針接觸，c)檢測所述檢測探針。
19．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，其中所述經(jīng)標(biāo)記的檢測探針產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。
20．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，其中測定的是靶分子。
21．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，還包括對所述樣品進行核酸酶保護。
22．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，它鑒定RNA表達模式，其中所述靶分子是至少2種RNA分子，所述組合的所述探針是至少對所述靶mRNA之一具有特異性的寡核苷酸，所述樣品與所述組合的培養(yǎng)是在所述RNA靶與所述探針特異性雜交的有效條件下進行的。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述方法，它鑒定改變RNA表達模式的試劑，它還包括比較所述試劑存在下所產(chǎn)生的RNA表達模式和另一組不同條件下所產(chǎn)生的RNA表達模式。
24．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，其中所述靶分子是保護片段。
25．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，它還包括a)將RNA抽提物與一種或多種保護片段在所述保護片段與抽提物內(nèi)感興趣RNA雜交的有效條件下一起培養(yǎng)，b)用一種或多種核酸酶處理所述抽提物，有效消化除與感興趣RNA雜交的保護片段和所述RNA雜交部分之外幾乎全部核酸，c)去除除與感興趣RNA雜交的保護片段之外幾乎全部核酸，提供含有作為靶分子的保護片段的樣品。
26．根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，其中所述組合包含大量所述區(qū)域，所述方法是一種大處理量方法。
27．一種快速分析大量樣品的方法，它包括將各樣品置于權(quán)利要求1所述組合的分開區(qū)域，檢測有無所述靶分子。
28．一種檢測至少一種靶分子的方法，包括a)在獲得所述靶分子與所述接頭之間第一雜交產(chǎn)物的有效條件下，將可能包含靶分子的樣品與雙官能接頭接觸，所述接頭具有對寡核苷酸錨分子特異性的第一部分，和包含所述靶分子的特異性探針的第二部分，b)在獲得所述第一雜交產(chǎn)物與所述組合之間第二雜交產(chǎn)物的有效條件下，將所述第一雜交產(chǎn)物與組合接觸，所述組合在加入所述第一雜交產(chǎn)物之前包含1)一個表面，具有許多空間上分開的區(qū)域，其中至少2個基本相同，各區(qū)包含，2)至少8種不同寡核苷酸錨分子，c)將所述第一雜交產(chǎn)物或所述第二雜交產(chǎn)物與標(biāo)記過的偵探探針接觸，d)檢測所述偵探探針。
29．一種用于檢測樣品中至少一種靶分子的試劑盒，它包括a)一個表面，具有許多空間上分開的區(qū)域，其中至少2個基本相同，各區(qū)包含至少8種不同寡核苷酸錨分子，b)一套有關(guān)將至少一種所述寡核苷酸錨分子與雙官能接頭連接的說明，所述接頭具有對至少一種寡核苷酸錨分子具有特異性的第一部分，和包含對至少一種所述靶分子具有特異性的探針的第二部分。
30．根據(jù)權(quán)利要求29所述試劑盒，它包含c)一種含有至少一種雙官能接頭的容器，所述接頭具有對至少一種寡核苷酸錨分子具有特異性的第一部分，和包含對至少一種所述靶分子具有特異性的探針的第二部分。
31．一種檢測一種或多種感興趣的核酸的方法，它包括用一種或多種保護片段對含所述核酸的樣品進行核酸酶保護，用質(zhì)譜法檢測雜交雙鏈分子、或單鏈的被保護核酸分子、或保護片段。
32．根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中的方法是一種大處理量的方法。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述方法，其中所檢測的核酸是保護片段。
34．根據(jù)權(quán)利要求33所述方法，其中檢測至少2種不同保護片段。
35．根據(jù)權(quán)利要求33所述方法，其中檢測至少16種不同保護片段。
36．根據(jù)權(quán)利要求32所述方法，其中所檢測的核酸是雜交雙鏈分子。
37．根據(jù)權(quán)利要求32所述方法，其中所檢測的核酸是被保護的核酸。
38．根據(jù)權(quán)利要求32所述方法，其中所測定的是所述感興趣的核酸。
39．根據(jù)權(quán)利要求38所述方法，其中所測定的核酸是保護片段。
40．根據(jù)權(quán)利要求32所述方法，其中所述保護片段被化學(xué)修飾，并檢測帶有或不帶保護片段核酸部分的所述化學(xué)修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用重復(fù)的探針列陣同時進行多項、大處理量生物或化學(xué)試驗的組合物、設(shè)備和方法。本發(fā)明的組合包括一個表面,其上有多個測試區(qū),其中至少兩個,更好的是至少20個,基本相同,每個測試區(qū)上是通用錨分子列陣。這些錨分子與雙官能接頭分子連接,雙官能接頭分子的一部分對至少一種錨分子具有特異性,另一部分則是對感興趣的百分制具有特異性的探針。用所得的探針列陣檢測一種或多種與探針特異性反應(yīng)的靶分子是否存在或測試其活性。本發(fā)明實施例之一中,測試區(qū)(可以是孔)又分為更小的亞區(qū)(低凹或淺凹)。本發(fā)明實施例之一測定了EST的圖譜。另一實施例檢測靶核酸的存在:用聚核苷酸片段保護靶分子不被核酸酶消化,然后用質(zhì)譜分析被保護的聚核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK1290306SQ98813273
公開日2001年4月4日 申請日期1998年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月19日
發(fā)明者史蒂芬·費爾德, 理查德·克利斯 申請人:史蒂芬·費爾德, 理查德·克利斯