專(zhuān)利名稱(chēng)：葡萄糖氧化酶基因在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼葡萄糖氧化酶(GO)基因的DNA序列及其在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，包括含有GO DNA序列的植物表達(dá)載體，由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)病原菌表現(xiàn)高抗性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子、整體植物或植物體的部分或組織器官。
細(xì)菌及真菌是危害農(nóng)作物的主要病原菌。雖然目前對(duì)某些病害已找到有效的防治方法，但對(duì)大多數(shù)嚴(yán)重危害農(nóng)作物的病害尚無(wú)切實(shí)有效的防治措施。培育抗病品種是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌變異迅速，可供利用的抗原匱乏，常規(guī)育種的作用受到了很大限制。隨著分子生物學(xué)、植物病理學(xué)及基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，運(yùn)用基因工程手段提高植物的抗病性為抗病育種開(kāi)辟了一條嶄新途徑。
植物在接受到病原物的信號(hào)(Elicitor)后，導(dǎo)致受侵染部位組織的快速死亡，稱(chēng)為超敏反應(yīng)(Hypersensitive response，HR)，使病原物失去營(yíng)養(yǎng)供給，并將病原物限制在最小范圍內(nèi)。寄主植物啟動(dòng)自身的防衛(wèi)系統(tǒng)，如合成纖維素、木質(zhì)素和結(jié)構(gòu)蛋白加固細(xì)胞壁，合成植保素和抗菌蛋白及酚類(lèi)化合物的氧化(Hahlbrock &Scheel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40347-369，1989)、防衛(wèi)基因的表達(dá)(Bowles，Annu.Rev.Biochem.59873-907，1990；Dixon & Harrison，Adv.Genet.28165-234，1990)、受侵染細(xì)胞的過(guò)敏性死亡(Keen，Plant Mol.Biol.19109-122，1992)以及最終誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性(Chen et al.，Science 1621883-1886，1993)。所有這些反應(yīng)都與植物-病原互作中早期活性氧類(lèi)(active oxygen species，AOS)的快速合成有關(guān)。在氧化激增(Oxidative burst)過(guò)程中產(chǎn)生的AOS，如超氧離子(O2-)、羥自由基(OH·)、過(guò)氧化氫(H2O2)，不僅具有直接殺傷病原菌的作用，而且對(duì)激發(fā)植物的防衛(wèi)體系具有重要作用。
葡萄糖氧化酶(GO)催化β-D-葡萄糖+O2→葡萄糖酸+H2O2，由Muller(1928)首次報(bào)道。后來(lái)Kim等(Can.J.Microbiol.36199-205，1989)發(fā)現(xiàn)用于防治土傳病害的生防菌Talaromycesflavus的主要抗菌機(jī)制是通過(guò)GO產(chǎn)生H2O2。現(xiàn)已從Talaromycesflavus、Penicillium notatum、P.amagasakiense和黑曲霉(Aspergillus niger)中純化出了GO(Swobada & Massey，J.Biol.Chem.2402209-2215，1965)。其中，A.niger是GO活性較強(qiáng)的一基酸，22個(gè)前導(dǎo)肽，8個(gè)糖基化位點(diǎn)，16％的碳水化合物，包括種真菌。黑曲霉GO為一個(gè)二聚體，每個(gè)亞基70kd，含583個(gè)氨甘露糖、半乳糖、氨基葡萄糖，及1分子的輔酶FAD。FAD的結(jié)合改變了GO的構(gòu)型，使焦磷酸區(qū)不再處于酶的表面。GO除了以葡萄糖作為底物外，還催化2-脫氧-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖的氧化，但對(duì)后三者的活性較低。
由于碳水化合物的作用，賦予GO一定的特性，如100℃不沉淀、0.75％SDS溶液中穩(wěn)定、5％三氯乙酸緩慢沉淀、水溶性好、高鹽環(huán)境下沉淀等。
GO在食品保鮮方面有著廣泛的應(yīng)用，牛奶中加入0.1U/ml的GO及0.3mg/ml的葡萄糖可抑制牛奶中熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescens)的繁殖。目前在斯里蘭卡、巴基斯坦、肯尼亞等發(fā)展中國(guó)家有大量應(yīng)用。另外，還有將GO加入牙膏以防止蛀牙的報(bào)道。
H2O2不僅能夠直接殺死病原菌(Peng & Kuc，Phytopathol.82696-699，1992)，還可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的氧化交聯(lián)阻止病菌的侵入(Bradley et al.，Cell 7021-30，1992；Brisson etal.，Plant Cell 61703-1712，1994)及通過(guò)激活水楊酸合成以誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(Leon et al.，PlantPhysiol.1081673-1678，1995；Chen et al.，Science1621883-1886，1993)。用懸浮細(xì)胞試驗(yàn)，H2O2能激活植保素的合成(Apostol et al.，Plant Physiol.90109-116，1989；Davis et al.，Phytochem.32607-611，1993；Degousee et al.，Plant Physiol.104945-952，1994)。在近來(lái)的研究中，還發(fā)現(xiàn)在不親和的植物-病原互作中氧化激增產(chǎn)生的H2O2不僅可作為區(qū)域信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而且還可作為擴(kuò)散信號(hào)誘導(dǎo)周?chē)辞秩炯?xì)胞中防衛(wèi)基因如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)(Levine et al.，Cell 79583-593，1994)。葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖的氧化，生成葡萄糖酸并產(chǎn)生H2O2，目前已在數(shù)種細(xì)菌和真菌中檢測(cè)到GO的存在，但在植物和動(dòng)物中仍未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)從黑曲霉基因組中克隆葡萄糖氧化酶基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入植物，以增強(qiáng)植物的抗病性。
本發(fā)明克隆了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。該核苷酸序列所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ IDNO2所示。
本發(fā)明涉及編碼葡萄糖氧化酶或其部分的如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列及其功能等同的序列。
按照本發(fā)明的核苷酸序列，其編碼具有如SEQ ID NO2所示的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列或其部分及其它功能等同的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及適于在植物細(xì)胞中表達(dá)如上所述的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。
按照本發(fā)明以上所述的重組表達(dá)載體，其中包含的葡萄糖氧化酶基因表達(dá)盒包括a)5′端非編碼區(qū)；b)如上所述的核苷酸序列；c)3′端非編碼區(qū)。
按照本發(fā)明所述的的重組表達(dá)載體，其中a)所說(shuō)的5′端非編碼區(qū)由兩個(gè)增強(qiáng)子序列，一個(gè)啟動(dòng)子序列，一個(gè)衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強(qiáng)序列，和一個(gè)編碼核糖體結(jié)合蛋白的序列組成；b)所說(shuō)的3’端非編碼區(qū)包含一個(gè)多聯(lián)終止密碼子序列，一個(gè)mRNA切割序列和一個(gè)mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。
本發(fā)明還涉及含有如上所述的核苷酸序列的任何轉(zhuǎn)基因植物。
按照本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物，為抗真菌和細(xì)菌病害的轉(zhuǎn)基因植物。
按照本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中的轉(zhuǎn)基因植物可以是任何一種單子葉植物或雙子葉植物的完整植株或部分、種子及其后代。
按照本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說(shuō)的植物包括由轉(zhuǎn)基因植物作為親本雜交或轉(zhuǎn)育所產(chǎn)生的植物。
本發(fā)明的核苷酸序列及其功能等同的序列在生產(chǎn)工業(yè)及醫(yī)用葡萄糖氧化酶的各種生物表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用，其中的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為在大腸桿菌中表達(dá)葡萄糖氧化酶基因。
根據(jù)本發(fā)明的上述應(yīng)用，其中的生物表達(dá)系統(tǒng)可以是植物、昆蟲(chóng)、酵母或細(xì)菌。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1為pBIGO的構(gòu)建流程圖及圖譜。
圖2為轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交檢測(cè)圖，其中，1為λDNA/EcoR I+Hind III，2，3，4，5，6，7分別為轉(zhuǎn)基因煙草植株Kh1，Kh2，Kh4，Kh5，Kh6，Kh7，8為CK。
圖3為轉(zhuǎn)基因棉花的PCR檢測(cè)圖，其中，PCR擴(kuò)增出一條約1.8kb的條帶，說(shuō)明G0基因整合進(jìn)棉花基因組中；其中，1為轉(zhuǎn)基因單株Xh-12，2為λDNA/EcoR I+Hind III，3為CK，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N新疆822。
圖4為轉(zhuǎn)基因棉花的抗病性鑒定圖。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
為了使外源基因在植物細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上獲得高效表達(dá)，在外源基因側(cè)翼必須連接有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控元件。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了為在受體植物中高效表達(dá)上述葡萄糖氧化酶基因所需之啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的未翻譯部分和多聚腺苷酸序列、以及便于在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中篩選被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因等。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體中，所說(shuō)的5′端非編碼區(qū)由兩個(gè)增強(qiáng)子序列、一個(gè)啟動(dòng)子序列、一個(gè)衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強(qiáng)序列、和一個(gè)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過(guò)程中起促進(jìn)作用的短核苷酸序列組成。
在本發(fā)明的融合基因表達(dá)載體中使用的衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強(qiáng)序列是Ω序列。該序列富集AAC序列，在蛋白質(zhì)合成的翻譯過(guò)程中構(gòu)成核糖體和rRNA結(jié)合位點(diǎn)(Richards et al.，Eur.J.Biochem.84513-519，1987)。其中本發(fā)明使用的促進(jìn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過(guò)程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，NucleicAcids Research 12857-872，1984；Cell 44283-292，1986)。
適于與本發(fā)明GO基因連接，并在植物細(xì)胞中啟動(dòng)該編碼DNA序列轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的啟動(dòng)子包括組成型、誘導(dǎo)型、組織或器官特異性或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。例如，它們包括但不只限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S或19S啟動(dòng)子，mannopine合成酶(MAS)啟動(dòng)子，胭脂堿合成酶和章魚(yú)堿合成酶啟動(dòng)子，玉米乙醇脫氫酶啟動(dòng)子，以及二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小亞基啟動(dòng)子、傷誘導(dǎo)或病菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子、組織或器官或發(fā)育特異性表達(dá)的啟動(dòng)子等。其中，本發(fā)明優(yōu)選的是帶有加倍增強(qiáng)子元件的CaMV 35S啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子全序列如SEQ ID NO3所示。此外，很多植物病害是維管束病害，通過(guò)加接維管束特異表達(dá)的啟動(dòng)子，可提高外源基因產(chǎn)物的抗菌作用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在本發(fā)明所構(gòu)建的高效植物表達(dá)載體中，所說(shuō)的3′端非編碼區(qū)包括一個(gè)多聯(lián)終止密碼子序列，一個(gè)mRNA切割序列和一個(gè)mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。
另外，適用于本發(fā)明的GO高效植物表達(dá)載體還包括衍生于花椰菜花葉病毒或，Nopaline(Nos)基因的終止子及其他類(lèi)似的終止子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，我們使用了Nos基因的終止子。
可使用本領(lǐng)域中已知的方法將本發(fā)明提供的適于在植物細(xì)胞中表達(dá)GO的融合基因構(gòu)建體連接到任何一種可在細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞中自我復(fù)制的載體上。這樣的載體例如包括衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒載體pUC18、pUC19。尤其是植物表達(dá)載體pBI101，pBI121以及pBI13l系統(tǒng)(Jefferson，et al.，EMBO J.163901，1987)等等。在本發(fā)明的一系列優(yōu)選實(shí)施方案中，攜帶上述GO基因構(gòu)建體的載體是pBlueScriptKS、pBI121等，后者特別適于作為制備植物表達(dá)載體的工具質(zhì)粒載體。
如前所述，為了正確地選擇和鑒定被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，本發(fā)明的上述重組表達(dá)載體還含有選擇標(biāo)記基因。所使用的選擇標(biāo)記基因的兩側(cè)可帶有各自的調(diào)節(jié)序列，以促使它們?cè)谥参镏械谋磉_(dá)。適用的選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。編碼選擇標(biāo)記的外源基因及其他基因可以包含于同一個(gè)表達(dá)載體中，或者包含于轉(zhuǎn)化時(shí)同時(shí)應(yīng)用的不同的載體中。本發(fā)明優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II)基因，并一同包含于同一個(gè)重組表達(dá)載體內(nèi)，從而保證了對(duì)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株選擇的可靠性。
因此，歸納起來(lái)本發(fā)明提供的適于在植物細(xì)胞中表達(dá)GO基因的植物表達(dá)載體包含1)GO基因表達(dá)盒；a)5′端非編碼區(qū)；b)編碼GO的如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；c)3′端非編碼區(qū)。
2)來(lái)源于pBI121的載體部分a)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptII)表達(dá)盒；b)起始復(fù)制子及與植物轉(zhuǎn)化相關(guān)的T-DNA左右邊界序列等功能結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)分別具有如前所述的構(gòu)成元件及其功能。例如，5′端的帶有加倍的增強(qiáng)子元件的啟動(dòng)子，Ω序列和Kozak序列；3′端的多聯(lián)終止序列，正確切割和加工序列，多聚腺苷酸信號(hào)序列。
通過(guò)本發(fā)明所得到的符合SEQ ID NO1的核苷酸序列可以通過(guò)DNA重組技術(shù)，連接到上面所描述的表達(dá)載體中，并使之轉(zhuǎn)入并整合到植物基因組中。而且GO基因在目標(biāo)植物中的表達(dá)可賦予該植物對(duì)病害具有較強(qiáng)的抗性。
應(yīng)該指出，上面所描述的表達(dá)載體只是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，它并不限制本發(fā)明。凡是應(yīng)用本發(fā)明所描述的GO基因所構(gòu)建的任何表達(dá)載體均包括在本發(fā)明之內(nèi)。包括如下的實(shí)現(xiàn)方式與其它一種或幾種基因重組，構(gòu)建多價(jià)基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入植物；1.與其它一種或幾種基因融合，構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入植物；2.與其它一種或幾種基因相協(xié)同，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體，同時(shí)或分步導(dǎo)入同一種植物受體。
為了在植物細(xì)胞中，特別是整株植物中表達(dá)外源抗病基因，以賦予整株植物及其種子和后代以抗病能力，必須使用適當(dāng)?shù)姆椒▽瓷鲜龇椒ㄖ苽涞臄y帶本發(fā)明的GO基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或植物體內(nèi)。
將攜帶外源基因的重組載體導(dǎo)入宿主植物或其細(xì)胞內(nèi)的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些方法包括但并不僅限于1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium-mediatedtransformation)；2)物理法，如基因槍法(Particle Bombardment或Particle gun或Gene gun)、電擊法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纖維介導(dǎo)法(Silicon carbide fiber)、電泳法(Electrophoretic transfection)等；3)化學(xué)法，如PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等；4)種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，如花粉介導(dǎo)法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等。
一種特別令人感興趣的在整體植株上導(dǎo)入外源基因的方法是本發(fā)明人使用的改進(jìn)的植物子房注射法(參見(jiàn)CN 95119563.8，1995；Zhou et al.，Enzymol.Method.101433-481，1983)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，我們選擇棉花作為GO基因轉(zhuǎn)化受體植物。棉花作為一種經(jīng)濟(jì)作物，我們考慮其主要作為紡織工業(yè)的原料，因而轉(zhuǎn)基因植物的安全性好；其次，在世界范圍內(nèi)被廣泛種植的棉花每年因病害造成的經(jīng)濟(jì)損失是十分巨大的。
因而，本發(fā)明涉及編碼GO的DNA序列，高效的植物表達(dá)載體，用所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織和整株植物的方法，以及由此產(chǎn)生的對(duì)植物病害具有抵抗能力的轉(zhuǎn)基因植物，特別是對(duì)黃、枯萎病具有抵抗能力的轉(zhuǎn)基因棉花。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了獲得對(duì)病原菌有抗性，尤其是對(duì)黃、枯萎病菌具有抗性的植物的方法，該方法包括1).構(gòu)建包含GO基因的植物表達(dá)載體；2).用任何一種可行方法將步驟1)中得到的植物表達(dá)載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)，并由此獲得對(duì)病原菌有抗性能力的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括任何植物的整株、部分、器官或組織和種子。
這里應(yīng)特別指出的是，雖然在下述實(shí)施例中以轉(zhuǎn)基因棉花為例詳細(xì)描述了本發(fā)明，但這絕不意味本發(fā)明的GO基因及其重組表達(dá)載體只適用于轉(zhuǎn)化和生產(chǎn)具有抗病能力的轉(zhuǎn)基因棉花。因此，凡使用本發(fā)明所描述的GO基因及其表達(dá)載體，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種方法導(dǎo)入任何植物或其組織或細(xì)胞中，以及由此而獲得的具有抗病能力的植物、種子和后代以及植物體的部分器官、組織或細(xì)胞，均包括在本發(fā)明之內(nèi)。
除生產(chǎn)抗病轉(zhuǎn)基因植物外，本發(fā)明還適用于生產(chǎn)工業(yè)和醫(yī)用葡萄糖氧化酶的其他各種生物表達(dá)系統(tǒng)，例如但不僅限于植物、昆蟲(chóng)、酵母或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中是在大腸桿菌中表達(dá)葡萄糖氧化酶基因，以獲取其表達(dá)產(chǎn)物，并用市售的葡萄糖氧化酶免疫兔子制備相應(yīng)的抗體，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中基因的表達(dá)。
實(shí)施例實(shí)施例1編碼GO蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的制備1.1 GO基因的克隆根據(jù)黑曲霉GO基因的DNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR引物GO-15’CT
CATGCAGACTCTCCTTGTG 3’Pst IGO-25’CA
TTATCACTGCATGGAAGCATAA 3’Xho I擴(kuò)增條件為94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃1.5分鐘。循環(huán)35次。由于GO基因內(nèi)部有一個(gè)Pst I位點(diǎn)和一個(gè)EcoR I位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物首先經(jīng)EcoR I/Xho I雙酶切后電泳，回收950bp的EX片段克隆到pBlueScriptKS的EcoR I/Xho I位點(diǎn)得到pEX；回收870bp的PE片段再經(jīng)Pst I酶切后克隆到pBlueScript KS的EcoR I/Pst I位點(diǎn)得到pPE。將EX片段克隆到pPE的EcoR I/XhoI位點(diǎn)即得到整個(gè)GO基因，命名為pGO。連同起始密碼子ATG和終止密碼子TGA共1818個(gè)堿基對(duì)(序列如SEQ ID No1)。它所編碼的GO蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO2所示。
1.2對(duì)pGO中所克隆GO基因的序列分析(1)變性模板的制備用小量提取質(zhì)粒DNA方法，制備待測(cè)pGO質(zhì)粒DNA。取1.5～2μg DNA(約2～5μl)加水至總體積32μl，然后加入8μl 2M NaOH，輕輕混勻，室溫變性10分鐘，然后加入4μlH2O，7μl 3M NaAc(pH 4.8)，120μl無(wú)水乙醇，12000rpm離心8分鐘，用70％乙醇洗2次所得的沉淀，真空抽干，溶于10μl水中，放冰上待用。
(2)退火向變性后的模板DNA中加入2μl退火buffer，2μl測(cè)序引物，輕輕混勻，瞬時(shí)離心后于65℃溫育退火5分鐘，迅速移至37℃繼續(xù)溫育10分鐘，然后于室溫放置5分鐘以上。
(3)標(biāo)記反應(yīng)先吸2μl酶稀釋buffer、然后向其中加入0.5μlT7測(cè)序酶，置于冰上，然后向退火后的模板、引物混合物中加入LabelMix 3μl，α-32P dATP 1μl；稀釋后的T7測(cè)序酶2μl，在管中輕輕吸打混勻，瞬時(shí)離心甩一下，室溫反應(yīng)5分鐘。
(4)鏈延伸終止反應(yīng)在4個(gè)離心管上分別標(biāo)上A、C、G、T，并分別加入2.5μl相應(yīng)的鏈終止液(Mix short)在37℃至少保溫1分鐘，從(3)中標(biāo)記反應(yīng)液中分別移取4.5μl反應(yīng)物加入到A、C、G、T四個(gè)管中，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，各加入5μl終止液，于37℃保溫2分鐘。
(5)測(cè)序膠的制備應(yīng)用Bio-rad公司的測(cè)序儀。
(6)量取50ml 6％測(cè)序丙烯酰胺凝膠貯備液(6％Sequencing gel1.5g甲叉雙丙烯酰胺，28.5g丙烯酰胺，240g尿素，50ml 10×TBE，加水定容至500ml)，加入500μl 10％過(guò)硫酸胺，50μl TEMED，混勻，緩慢注入到洗凈的測(cè)序板裝置中，插入點(diǎn)樣梳，室溫聚合45分鐘以上。
(7)裝置好電泳裝置，加入1×TBE電泳緩沖液(10×TBE108gTris，9.3g Na2EDTA.2H2O，55g硼酸，用H2O定溶于1000ml(pH8.3))。將樣品80℃變性2分鐘，置于冰上，上樣電泳。如有必要，當(dāng)溴酚蘭到達(dá)板底部時(shí)，進(jìn)行二次上樣，繼續(xù)電泳到二次上樣溴酚蘭至板底部。
(8)停止電泳，下膠，壓片，-70℃放射自顯影過(guò)夜，沖片閱讀。
(9)結(jié)果證明該質(zhì)粒中帶有與設(shè)計(jì)相符的GO基因插入片段。實(shí)施例2GO的大腸桿菌表達(dá)(1)挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(加有Amp 100mg/L)，于37℃，其中首選轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)取50ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(加有Amp100mg/L)，于37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。
(3)加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度為1mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)。
(4)分別在誘導(dǎo)后的1、3、5小時(shí)取出1ml經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，迅速在室溫下以12000×g離心1分鐘，棄上清。
(5)將每一沉淀重懸于100μl的1×SDS凝膠加樣緩沖液中，將所有收集的樣品貯存于0℃，以備在凝膠上加樣。
1×SDS凝膠加樣緩沖液50mmol/L TrisCl100mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)2％SDS(電泳級(jí))1％溴酚藍(lán)10％甘油(6)不含二硫蘇糖醇的1×SDS凝膠加樣緩沖液可貯存于室溫。二硫蘇糖醇可配成1mol/L貯存液凍存于-20℃?zhèn)溆谩?br> (7)融化樣品，100℃加熱3分鐘，于室溫以12000×g離心1分鐘，每種懸液取15μl加樣于適當(dāng)濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠上，用只含空白載體的細(xì)菌懸液作為對(duì)照。
(8)用考馬斯亮藍(lán)染色或用Western印跡法鑒定所誘導(dǎo)的蛋白。實(shí)施例3GO抗體制備(1)稱(chēng)取5mg葡萄糖氧化酶(Boehringer Mannheim)，加1ml無(wú)菌生理鹽水溶解。
(2)加入1ml弗氏完全佐劑(Sigma)，用注射器吸打幾次使之徹底乳化。皮下多點(diǎn)注射免疫實(shí)驗(yàn)兔。
(3)2周后第二次免疫，5mg葡萄糖氧化酶加1ml無(wú)菌生理鹽水溶解后，加入1ml弗氏不完全佐劑。徹底乳化后肌肉注射。
(4)分別于2周和4周后進(jìn)行第三、四次免疫，5mg葡萄糖氧化酶加1ml無(wú)菌生理鹽水溶解后靜脈注射。
(5)靜脈抽血1ml，4000rpm離心20分鐘。取血清進(jìn)行抗原抗體結(jié)合試驗(yàn)。實(shí)施例4GO基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建4.1 GO基因表達(dá)盒的構(gòu)建如前所述，本實(shí)施例所構(gòu)建的GO基因表達(dá)盒中包括以下基因表達(dá)調(diào)控元件5’端的35S啟動(dòng)子、加倍的增強(qiáng)子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多聯(lián)終止序列、切割序列、NOS終止子。利用質(zhì)粒pTΩ4A，經(jīng)Pst I和Xho I雙酶切后，回收3.5kb片段作為載體，將pGO中的GO基因用Pst I和Xho I切下后連接到所回收的載體上去，得到重組質(zhì)粒pTGO。
4.2 GO基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建用Hind III/EcoR I切下pTGO中的5.3kb的GO基因表達(dá)盒，克隆到植物表達(dá)載體pBI121中的Hind III/EcoR I位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pBIGO。這就是所構(gòu)建的GO植物表達(dá)載體。其質(zhì)粒圖譜及構(gòu)建過(guò)程如附圖1所示。實(shí)施例5GO植物表達(dá)載體向模式植物煙草中的導(dǎo)入及鑒定5.1 LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取LBA4404單菌落接種于5ml YEB(含鏈霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值約為0.6。將菌液轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管中，冰浴30分鐘，5000rpm離心5分鐘，用2ml 20mM的CaCl2重懸菌體，按每管200μl分裝于無(wú)菌小離心管中。
5.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LBA4404細(xì)胞在200μl LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中分別加入2μg重組質(zhì)粒pBIGODNA，置冰浴5分鐘，然后轉(zhuǎn)至液氮中冷凍8分鐘，迅速于37℃水浴中溫育5分鐘后，加入800μl YEB培養(yǎng)基，28℃ 250rpm預(yù)培養(yǎng)4～5小時(shí)，然后涂鋪含有卡那霉素的YEB固體平板，28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌菌落帶有相應(yīng)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。
5.3煙草的遺傳轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備28℃過(guò)夜分別培養(yǎng)帶有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌50ml，5000rpm離心5分鐘，收集菌體沉淀，用液體MS(Murashige& Skoog，1962)培養(yǎng)液洗滌一次，再用MS重懸至OD600＝0.2～0.4。
(2)浸染取煙草無(wú)菌苗葉片，用刀切成邊長(zhǎng)約0.5厘米的小方塊，在農(nóng)桿菌懸液中浸泡5～10分鐘，然后用滅菌濾紙吸干。
(3)共培養(yǎng)將葉塊擺放在不加抗生素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA 2mg/L)中(上面墊兩層濾紙)于25℃避光共培養(yǎng)3天。
(4)選擇培養(yǎng)將葉片繼代到選擇培養(yǎng)基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中在光照培養(yǎng)箱中(光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí))培養(yǎng)至抗性芽的出現(xiàn)。
(5)抗性小苗的獲得將愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS+Kan100mg/L+Carb 500mg/L)，每隔兩周繼代培養(yǎng)一次，最后種植到小塑料缽中。
5.4轉(zhuǎn)基因煙草的Southern鑒定取1～3克煙草鮮葉片，加等量Al2O3用液氮研磨，將粉末置于50ml離心管中，加入20ml DNA提取緩沖液(100mM Tris.HCl pH8.0，500mMNaCl，10mM β-巰基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，劇烈振蕩1分鐘，加入4ml 10％SDS，輕輕混勻，于65℃加熱10～20分鐘，至顏色翠綠，加入冰冷5M KAc 4ml，冰上放置30分鐘，然后在4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清，用0.6倍異丙醇沉淀后，用RNase處理，純化備用。
(1)將植物DNA用Pst I酶切過(guò)夜，通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并照相。
(2)將膠置于小盤(pán)中加入200ml變性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)振蕩45分鐘。
(3)棄去變性液，用蒸餾水漂洗數(shù)次，加入中和液(1M Tris，pH7.4，1.5M NaCl)200ml，振蕩30分鐘，然后更換新的中和液，繼續(xù)中和15分鐘。
(4)剪相應(yīng)大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，于蒸餾水中均勻濕透后，將NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含NaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g pH7.0)中，放置20分鐘。
(5)使用Bio-rad公司的轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜1小時(shí)。
(6)去掉膠塊，標(biāo)記好加樣孔位置，用6×SSC洗膜5分鐘，然后紫外照射5分鐘，以固定DNA。2×SSC洗膜，室溫風(fēng)干。
(7)將NC膜卷入雜交瓶中，加入20ml預(yù)雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，200μg/ml魚(yú)精DNA)，使膜均勻浸潤(rùn)無(wú)氣泡，然后置于DNA分子雜交儀中68℃預(yù)雜交過(guò)夜。
(8)探針的標(biāo)記采用Promega公司隨機(jī)引物試劑盒標(biāo)記。取適量待標(biāo)記DNA片段，95～100℃變性2分鐘迅速置于冰上，在一新的Eppendrof管中，依次加入5×labeling buffer 10μldCTP，dGTP，dTTP，混合物2μl變性模板25ngBSA 2μlα-32P-dATP5μlKlenow酶1μl加H2O至總體積 50μl(9)輕輕混勻，室溫反應(yīng)60分鐘。95℃變性2分鐘置于冰上。加入2μl 0.5M EDTA。
(10)向預(yù)雜交完畢的袋中加入變性探針30～50μl，重新封好繼續(xù)于68℃雜交8～10小時(shí)。
(11)取出雜交膜用2×SSC、0.5％SDS洗膜30分鐘，用2×SSC、0.1％SDS洗15分鐘，再用0.1×SSC、0.5％SDS于42℃洗膜30分鐘～數(shù)小時(shí)，中間更換新的洗膜液。
(12)1×SSC洗膜2分鐘，用吸水紙吸去水珠，用保鮮膜包好膜，暗室中壓片。
(13)-70℃放射自顯影3-6h后洗片。
結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交結(jié)果為陽(yáng)性(圖2)。實(shí)施例6制備花粉管通道法轉(zhuǎn)化植物用植物表達(dá)載體pBIGO超純度質(zhì)粒DNA6.1大量提取質(zhì)粒pBIGO(1)接單菌落于20ml帶有相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)將菌液轉(zhuǎn)入4000ml液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)8～12小時(shí)；(3)5000rpm離心5分鐘，收集菌體；(4)用STE 100ml懸浮洗滌菌體，合并各管于2個(gè)500ml離心管中，重新離心去上清；(5)分別向每管加入80ml Solution I(50mM蔗糖，10mM EDTA，25mM Tris-HCl pH8.0)，將菌體懸浮后加入160ml新配制的SolutionII(0.2M NaOH，1％SDS)，輕輕混勻數(shù)次，冰上放置10分鐘，再加入120ml預(yù)冷的Solution III(每100ml含5M KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸餾水28.5ml)，輕輕混勻，冰上放置30分鐘；(6)8000rpm離心15分鐘，收集上清，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10分鐘；(7)8000rpm離心15分鐘，70％乙醇洗滌一次，溶于4ml TE(10mM Tris pH8.0，1mM EDTA pH8.0)中，加RNase 8μl(10mg/ml)37℃處理1小時(shí)；(8)用酚、氯仿抽提純化，乙醇沉淀后溶于3ml TE中。
6.2超速離心進(jìn)一步純化提取的質(zhì)粒DNA(用Beckman公司超速離心機(jī))(1)在一個(gè)50ml離心管中加入2.9ml DNA溶液，6.6ml飽和氯化銫溶液及1ml溴化乙錠溶液(EB，10mg/ml)，混勻待用。
(2)上步中如有許多沉淀，則8000rpm離心5分鐘。
(3)將上述混合液轉(zhuǎn)入兩個(gè)5.2ml超速離心管中，用Beckman超速離心機(jī)專(zhuān)用設(shè)備熱封管口。
(4)用vTi80轉(zhuǎn)頭室溫真空離心20小時(shí)，6,5000rpm。
(5)在暗室中紫外光下，先在離心管上部用針頭穿孔，然后用5ml一次性注射器吸出質(zhì)粒亮帶。
(6)用水飽和正丁醇抽提數(shù)次去EB。
(7)用TE稀釋三倍后，用二倍無(wú)水乙醇4℃沉淀，離心，溶解后稀釋待用。實(shí)施例7植物子房注射法(花粉管通道法)轉(zhuǎn)化棉花編碼GO抗病蛋白質(zhì)的基因在植物中的高效表達(dá)，對(duì)于產(chǎn)生具有高抗病性的轉(zhuǎn)基因植物是最為關(guān)鍵的，但是外源基因轉(zhuǎn)化植物是否能獲得成功，也是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域科技人員熟知的利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電激法等方法轉(zhuǎn)化植物雖然有許多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不僅受到實(shí)驗(yàn)室條件和昂貴的儀器及費(fèi)用極高等的限制，更重要的是上述方法都有一個(gè)不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用的優(yōu)良植物品種，由于基因型的不同，不能或難以通過(guò)器官發(fā)生或胚胎發(fā)生途徑再生成植株。在這種情況下，本發(fā)明通過(guò)植物子房注射技術(shù)或稱(chēng)花粉管通道法，成功地獲得了具有高抗病能力的轉(zhuǎn)基因棉花。子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物的優(yōu)點(diǎn)在于1)適合于所有的基因型；2)方法簡(jiǎn)單，有效；3)不受實(shí)驗(yàn)室條件、儀器設(shè)備的限制，且費(fèi)用低；4)速度快，一年內(nèi)即可獲得轉(zhuǎn)基因植物種子及后代。
在本實(shí)施例中，子房注射外源基因的時(shí)間是在棉花開(kāi)花授粉后約10-24小時(shí)之間。如在珠心孔道封閉之前，用微量注射器將外源基因溶液注射到子房?jī)?nèi)，外源基因即可通過(guò)珠孔和珠心孔道，逐漸擴(kuò)散到或在珠心孔道封閉的過(guò)程中被擠壓到剛受精后的胚囊內(nèi)。在受精卵分裂的過(guò)程中，外源基因被整合到受精卵細(xì)胞的基因組中，從而完成外源基因?qū)牒驼系倪^(guò)程。
棉花是常異花授粉作物，為保持品種(系)的相對(duì)純度，在開(kāi)花的前一天下午，將要在第二天開(kāi)花的蕾用線扣緊，使花辨不能張開(kāi)，以使其自花授粉。開(kāi)花后約10小時(shí)左右，即當(dāng)天開(kāi)花的晚6點(diǎn)鐘左右花粉管進(jìn)入胚囊后，即可進(jìn)行外源基因的注射。注射前將花辨連同雄蕊剝?nèi)ヂ冻鲇租?，抹去幼鈴頂端的花柱，將吸取外源基因溶液的微量注射器，沿中軸垂直插入幼鈴大小的2/3處，再將微量注射器向上提到1/3的地方，留下約幼鈴1/3的注入空間，緩慢將注射裝置內(nèi)的外源溶液注射到注入空間內(nèi)。此后，外源DNA溶液將沿著珠孔和珠心孔道向受精胚囊內(nèi)擴(kuò)散，或由于珠心孔道在逐漸封閉而被擠壓進(jìn)受精胚囊中實(shí)現(xiàn)基因的整合。一般注射的外源基因溶液為10μl，DNA總量約為0.25～0.5μg。外源基因注射后，為了防止和減少幼鈴的脫落，提高成鈴率，在幼鈴柄基部用毛筆涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夾在幼鈴柄基部和莖(枝)之間，同時(shí)將注射外源基因的幼鈴所在的枝條項(xiàng)端摘掉，以保持幼鈴的充分營(yíng)養(yǎng)，有利于成鈴和鈴內(nèi)種子的發(fā)育。
對(duì)收獲種子的后代進(jìn)行抗病及分子檢測(cè)，獲得抗病棉植株。實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因抗病棉的分子生物學(xué)檢測(cè)及抗病性測(cè)試對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)基因棉花植株分別進(jìn)行了PCR檢測(cè)及抗病性鑒定。證實(shí)了GO基因已導(dǎo)入到棉花中并表達(dá)。
附圖3提供了抗病棉植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果的照片。PCR擴(kuò)增出一條1.8kb的特異帶，證明了GO基因已成功地轉(zhuǎn)入到棉花基因組中。在轉(zhuǎn)基因棉的抗黃、枯萎病溫室和田間病圃鑒定中，獲得了抗病性明顯提高的單株，見(jiàn)圖4。如圖4所示，轉(zhuǎn)基因棉花播種出苗后，用枯萎7號(hào)小種按3％(w/w)的比例混入營(yíng)養(yǎng)缽?fù)寥肋M(jìn)行接種。四周后再用黃萎北京菌系接種，具體方法是用1.2×107cfu/ml的黃萎病菌液，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽加10ml，進(jìn)行大菌量枯、黃萎病混合鑒定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花抗黃、枯萎病能力明顯高于對(duì)照棉花。序列表(1)SEQ ID NO1的信息
(I)序列特征(A)名稱(chēng)GO基因(B)長(zhǎng)度1818堿基對(duì)(C)類(lèi)型核苷酸(D)鏈型單鏈(E)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類(lèi)型編碼葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列(III)假定的非(IV)反義非(V)序列描述SEQ ID NO1ATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTTGTGGTCTCCCTCGCTGCGGCCCTGCCACACTAC60ATCAGGAGCAATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGATCCCAAGGATGTCTCCGGCCGC120ACGGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTCTGACTGGACTCACCACCGCTGCTCGTCTG180ACGGAGAACCCCAACATCAGTGTGCTCGTCATCGAAAGTGGCTCCTACGAGTCGGACAGA240GGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGACATCTTTGGCAGCAGTGTAGACCAC300GCCTACGAGACCGTGGAGCTCGCTACCAACAATCAAACCGCGCTGATCCGCTCCGGAAAT360GGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAG420GTTGACTCTTGGGAGACTGTCTTTGGAAATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCC480TACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCAC540TACTTCAACGCATCCTGCCATGGTGTTAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGCGACACC600GGCGATGACTATTCTCCCATCGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCGAAGACCGGGGCGTT660CCCACCAAGAAAGACTTCGGATGCGGTGACCCCCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACC720TTGCACGAAGACCAAGTGCGCTCCGATGCCGCTCGCGAATGGCTACTTCCCAACTACCAA780CGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAGTATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAAC840GGCACCACCCCTCGTGCCGTTGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAAC900GTTTACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCGGGCTCCGCTGTCTCTCCCACAATCCTC960GAATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATCCTGGAGCCCCTTGGTATCGACACCGTCGTT 1020GACCTGCCCGTCGGCTTGAACCTGCAGGACCAGACCACCGCTACCGTCCGCTCCCGGATC 1080ACCTCTGCTGGTGCAGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCCACCTTCAACGAGACCTTT 1140GGTGACTATTCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCAGTGGGCCGAA 1200GAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACCACCGCCTTGCTCATCCAGTACGAGAAC 1260TACCGCGACTGGATTGTCAACCACAACGTCGCGTACTCGGAACTCTTCCTCGACACTGCC 1320GGAGTAGCCAGCTTCGATGTGTGGGACCTTCTGCCCTTCACCCGAGGATACGTTCACATC 1380CTCGACAAGGACCCCTACCTTCACCACTTCGCCTACGACCCTCAGTACTTCCTCAACGAG 1440CTGGACCTGCTCGGTCAGGCTGCCGCTACTCAACTGGCCCGCAACATCTCCAACTCCGGT 1500GCCATGCAGACCTACTTCGCTGGGGAGACTATCCCCGGTGATAACCTCGCGTATGATGCC 1560GATTTGAGCGCCTGGACTGAGTACATCCCGTACCACTTCCGTCCTAACTACCATGGCGTG 1620GGTACTTGCTCCATGATGCCGAAGGAGATGGGCGGTGTTGTTGATAATGCTGCCCGTGTG 1680TATGGTGTGCAGGGACTGCGTGTCATTGATGGTTCTATTCCTCCTACGCAAATGTCGTCC 1740CATGTCATGACGGTGTTCTATGCCATGGCGCTAAAAATTTCGGATGCTATCTTGGAAGAT 1800TATGCTTCCATGCAGTGA 1818(2)SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)名稱(chēng)GO(B)長(zhǎng)度605個(gè)氨基酸(C)類(lèi)型氨基酸(D)鏈型單鏈(E)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(II)分子類(lèi)型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列(III)假定的非(IV)反義非(V)序列描述SEQ ID NO2Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala Leu Pro His Tyr20Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg40Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu60Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg80Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His100Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn120Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln140Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala160Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His180Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr200Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val220Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr240Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln260Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn280Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn300Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu320Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val340Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile360Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe380Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu400Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn 420Tyr Arg Asp Trp Ile Mal Asn His Asn Val Ala Tyr ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala 440Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile 460Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu 480Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly 500Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala 520Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val 540Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val 560Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro pro Thr Gln Met Ser Ser 580His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp 600Tyr Ala Ser Met Gln(3)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度802堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(II)分子類(lèi)型外源基因表達(dá)盒5’端帶有加倍增強(qiáng)子的35S啟動(dòng)子序列DNA(III)假定的非(IV)反義非(V)序列描述SEQ ID NO3CAAGCTTCAT ACAGAGCTCA ATGACAAGAA GAAAATCTTC GTCAACATGG TGGAGCTCTC 60bTTACGAACGA CACGATTGTC TACTCCAAAA ATATCAAAGA TACAGTCTCA GAAGACCAAA 120bGGGCAATTGA GACTTTTCAA CAAAGGGTAA TATCCGGAAA CCTCCTCGGA TTCCATTGCC 180bCAGCTATCTG TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TTACAATGCC 240bATCATTGCGA TAAAGGAAAG GCCATCGTTG AAGATGCCTC TGCCGACAGT GGTCCCAAAG 300bATGGACCCCC ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA 360bAGCAAGTGGA TTGATGTGAT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG 420bGGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC 480bAGCTATCTGT CACTTTATTG TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT TACAATGCCA 540bTCATTGCGAT AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA 600bTGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA 660bGCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC 720bTTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTGAAA 780bTCACCTCTAG AGGATCCCCG GG802b
權(quán)利要求
1.編碼葡萄糖氧化酶或其部分的如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列及其功能等同的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，特征在于其編碼具有如SEQID NO2所示的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列或其部分及其它功能等同的蛋白質(zhì)。
3.適于在植物細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求1的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組表達(dá)載體，其中包含的葡萄糖氧化酶基因表達(dá)盒包括a)5′端非編碼區(qū)b)根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列c)3′端非編碼區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組表達(dá)載體，其中a)所說(shuō)的5′端非編碼區(qū)由兩個(gè)增強(qiáng)子序列，一個(gè)啟動(dòng)子序列，一個(gè)衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因的翻譯增強(qiáng)序列，和一個(gè)編碼核糖體結(jié)合蛋白的序列組成；b)所說(shuō)的3’端非編碼區(qū)包含一個(gè)多聯(lián)終止密碼子序列，一個(gè)mRNA切割序列和一個(gè)mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。
6.含有權(quán)利要求1所指定的核苷酸序列的任何轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因植物，其中的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為抗真菌和細(xì)菌病害的轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因植物，其中的轉(zhuǎn)基因植物可以是任何一種單子葉植物或雙子葉植物的完整植株或部分、種子及其后代。
9.根據(jù)權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說(shuō)的植物包括由轉(zhuǎn)基因植物作為親本雜交或轉(zhuǎn)育所產(chǎn)生的植物。
10.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列及其功能等同的序列在生產(chǎn)工業(yè)及醫(yī)用葡萄糖氧化酶的各種生物表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中的生物表達(dá)系統(tǒng)包括植物、昆蟲(chóng)、酵母或細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼葡萄糖氧化酶(GO)基因的DNA序列及其在培育抗病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用,包括含有GO DNA序列的植物表達(dá)載體,由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞,以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)病原菌表現(xiàn)高抗性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代,包括植物種子、整體植物或植物體的部分或組織器官。除生產(chǎn)抗病轉(zhuǎn)基因植物外,本發(fā)明還適用于生產(chǎn)工業(yè)和醫(yī)用葡萄糖氧化酶的其它各種生物表達(dá)系統(tǒng),例如但不僅限于植物、昆蟲(chóng)、酶母或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1229139SQ9910039
公開(kāi)日1999年9月22日 申請(qǐng)日期1999年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月28日
發(fā)明者賈士榮, 王志興 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心