專利名稱：生產(chǎn)l－天冬氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用具有高天冬氨酸酶活性的微生物生產(chǎn)L-天冬氨酸的方法。
用具有天冬氨酸酶活性的微生物大腸桿菌從富馬酸銨經(jīng)酶促生產(chǎn)L-天冬氨酸的方法是已知的。日本專利公開55-35110(即JP-B-55-35110)描述了其中將大腸桿菌天冬氨酸酶固定于離子交換樹脂Duolite A-7的方法。應用生物化學和生物技術(AppliedBiochemistry andBiotechnology)第13卷231-240頁(1986)描述了連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸的方法，其中反應器中裝有大腸桿菌，所述大腸桿菌通過凝膠包埋而被固定于κ角叉菜膠中。但是，從工業(yè)化生產(chǎn)的角度來看，這些方法是不令人滿意的，因為被固定化的天冬氨酸酶活性低，或者因為凝膠包埋固定會引起擴散障礙或使擴散速率受到限制。
由于傳統(tǒng)的固定化天冬氨酸酶沒有足夠高的活性，因此，需在30℃或更高的溫度完成反應，在反應中需要冷卻，因為天冬氨酸酶會因反應熱而損失了其活性。具體地說，在超過40℃時，活性顯著降低(AppliedMicrobiology vol.27,No.5,878-885頁(1974)；Applied Microbioloyg vol.27,No.5,886-889頁(1974))。為了防止因反應熱而引起反應器中溫度的升高，需要給反應器安裝內(nèi)部冷卻管或冷卻裝置例如夾套，這樣使反應器結構復雜。此外，由于現(xiàn)有技術中固定化天冬氨酸酶的活力低，因此，不能用所述天冬氨酸酶以高LHSV完成酶促反應。在使用通過凝膠包埋固定化的天冬氨酸酶的方法中，由于擴散障礙更大，也不可能以高LHSV(液體時空速)完成酶促反應。
需要以高LHSV完成反應以便提高利用固定化天冬氨酸酶的酶促反應生產(chǎn)L-天冬氨酸的生產(chǎn)率。利用在低溫具有足夠高的反應活性并且擴散障礙低和壓力損失小的固定化天冬氨酸酶可完成所述反應。令人遺憾的是，本領域尚未制備出所述固定化天冬氨酸酶。在這種情況下，本發(fā)明人現(xiàn)已制備出具有上述優(yōu)良特性的固定化天冬氨酸酶，并已發(fā)現(xiàn)通過將底物溶液導入反應器中，同時將底物溶液的溫度控制在低于至少因反應熱引起的溫度升高而損害天冬氨酸酶穩(wěn)定性的溫度，確保固定化天冬氨酸酶的穩(wěn)定活性，則無需除去熱即可基本上以高LHSV完成反應。
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)L-天冬氨酸的方法，該方法包括固定含天冬氨酸酶的微生物細胞以產(chǎn)生固定化天冬氨酸酶；將富馬酸銨溶液加入裝有固定化天冬氨酸酶的反應器中；從反應混合物中回收產(chǎn)生的L-天冬氨酸，其中固定化天冬氨酸酶的活力為250U或更高，其中以2-35 LHSV的進料速率將富馬酸銨溶液加至反應器中。本文所用“1U”指每分鐘每毫升固定化酶產(chǎn)生1μmol L-天冬氨酸，“LHSV”表示“液體時空速”并表示每體積催化劑(以毫升計)每小時的進料底物體積(以毫升計)。
本發(fā)明所用的固定化天冬氨酸酶例如是固定化的重組微生物細胞，所述微生物細胞含有利用重組DNA技術導入的天冬氨酸酶基因。用含天冬氨酸酶的上述微生物細胞和聚合物包被球形載體即可得到固定化天冬氨酸酶。具體地講，用與下列通式代表的聚合物混合的含天冬氨酸酶的上述微生物細胞包被球形苯乙烯二乙烯基苯共聚物型離子交換樹脂載體可得到固定化天冬氨酸酶
其中Y是直接鍵或由下列分子式代表的雙功能基團
或
R1和R2各自獨立地是氫原子或有機殘基，X是陰離子，n是100-5000的整數(shù)。
舉證性的有機殘基包括含有10個碳原子以下的烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基，優(yōu)選甲基。有機殘基可包括至少一個作為取代基的鹵素或羥基，例如4-氯-2-二甲基戊基，3-乙基-2,5-二氯庚基和2-羥基-3,5-二甲基壬基，優(yōu)選3-氯-2-羥基丙基。
X的實例包括鹵素離子如F-、Cl-、Br-和I-，優(yōu)選Cl-。也可用其他單價離子如NO3-作為X。
通過上述固定方法固定上述含天冬氨酸酶基因的重組微生物細胞而得到的本發(fā)明固定化天冬氨酸酶有極高的活性并且壓力損失少以及擴散障礙小。結果，與傳統(tǒng)固定化天冬氨酸酶不同，利用本發(fā)明的固定化天冬氨酸酶可以以高LHSV完成酶促反應。
由于可將低溫富馬酸銨溶液加至反應中，所以天冬氨酸酶的壽命得到延長。
在閱讀和理解了下列詳細描述后，本發(fā)明的這些和其他優(yōu)點對于本領域技術人員來說將是顯而易見的。
本發(fā)明說明書包括在日本專利申請10-31809說明書中所公開的所有內(nèi)容，該申請是本申請的優(yōu)先權文件。發(fā)明詳述本發(fā)明可使用的含天冬氨酸酶微生物優(yōu)選是大腸桿菌、熒光假單胞菌、短桿菌屬等，已知所述微生物具有高天冬氨酸酶活性。特別優(yōu)選含有用重組DNA技術導入的天冬氨酸酶基因的重組細胞。
本發(fā)明所用的天冬氨酸酶基因優(yōu)選得自大腸桿菌和含有天冬氨酸酶活性并且已知其基因與大腸桿菌基因天然雜交的微生物，例如熒光假單胞菌、腸桿菌屬或檸檬酸桿菌屬。但是，可以使用來自任何具有天冬氨酸酶活性之微生物的天冬氨酸酶基因。
例如，利用大腸桿菌K-12(IFO3301)或熒光假單胞菌(IFO3081)的染色體DNA為模板，利用以已知天冬氨酸酶基因序列為基礎制備的引物，通過PCR擴增天冬氨酸酶基因?；蛘?，通過其他常規(guī)方法，例如將得自染色體DNA的限制片段進行電泳以回收含天冬氨酸酶基因的片段，也可得到天冬氨酸酶基因。
用于摻入由此所得的天冬氨酸酶基因的質(zhì)?？梢允侨魏文軌蛟诖竽c桿菌細胞中復制的質(zhì)粒。所述質(zhì)粒的實例包括，但不限于pUC18(Nippon Gene Co.,Ltd.)和pKK223-3(Pharmacia)。
作為用于導入已摻入天冬氨酸酶基因之質(zhì)粒的宿主微生物，可以使用大腸桿菌菌株K-12(Stratagene)等。
優(yōu)選以具有下列特性的方法固定含天冬氨酸酶的微生物細胞，所述方法應使固定化產(chǎn)物有足夠的強度，而且在加入底物溶液后不太可能引起壓力損失或擴散障礙。
優(yōu)選通過用細胞和聚合物包被球形載體表面來固定微生物細胞。更優(yōu)選的是用細胞和聚丙烯基胺聚合物的混合物包被苯乙烯二乙烯苯共聚物型離子交換樹脂的表面。作為苯乙烯二乙烯苯共聚物型離子交換樹脂和聚丙烯基胺聚合物，分別優(yōu)選Amberlite IRA96SB(Organo)和PAS-880(Nitto Boseki Co.,Ltd)。
根據(jù)上述方法，由于含天冬氨酸酶的微生物細胞本身即可被固定在載體上，因此，所述細胞中所含的天冬氨酸酶幾乎全部被固定，由此得到具有很高活性的固定化天冬氨酸酶。
通過將與PAS-880(pH7.0)混合的細胞加至含Teflon球和AmberliteIRA-96SB的茄形燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)器減壓旋轉干燥混合物，由此用細胞和PAS-880包被Amberlite IRA-96SB的表面，從而固定微生物細胞。
根據(jù)上述方法，可得到球形固定化產(chǎn)物，當LHSV為20時，每米固定化天冬氨酸酶層的壓力損失為2.0kg/cm2或更低(水中，20℃)。這樣以高LHSV反應就成為可能。該方法的其他優(yōu)點是擴散層足夠薄，因此可表現(xiàn)出足夠的酶活性。當LHSV為20時，每米固定化天冬氨酸酶層固定化酶的壓力損失優(yōu)選為2kg/cm2或更低，更優(yōu)選1kg/cm2或更低。用于本發(fā)明的反應器形狀通常，但不限于圓柱形反應器。反應器長度優(yōu)選為10米或低于10米，因為反應器過長會引起壓力損失。不需給反應器安裝冷卻裝置。更優(yōu)選，反應器是絕緣的。
需要在反應器前安裝一溫度可控儲槽或熱交換器以便使加至反應器中的富馬酸銨溶液保持恒溫。
通常，超過40℃時，嗜溫菌酶是不穩(wěn)定的，而且由于熱其失活也會加速。在超過40℃時，大腸桿菌天冬氨酸酶極為不穩(wěn)定，而且因熱會使其活性受到損失(Applied Microbiology vol.27,No.5,878-885頁(1974)；Applied Microbiology vol.27,No.5,886-889頁(1974))。這種因熱而引起的失活會導致固定化酶的壽命縮短。
為了防止因熱引起的天冬氨酸酶失活，就需要控制加至反應器中的富馬酸銨的溫度，以便反應器出口處反應混合物的溫度不超過40℃。
在所述溫度范圍內(nèi)，可得到具有良好穩(wěn)定性的天冬氨酸酶。在大腸桿菌的情況下，溫度范圍是40℃或低于40℃，在較低的溫度，穩(wěn)定性較高。為了用在40℃或高于40℃的最佳溫度仍穩(wěn)定的天冬氨酸酶得到相似的效果，將進料底物溶液的溫度控制在低于損傷天冬氨酸酶穩(wěn)定性的溫度，所述對天冬氨酸酶穩(wěn)定性的損傷至少是由于反應熱引起的溫度升高而導致的。用傳統(tǒng)固定化酶在上述范圍內(nèi)不能完成反應，因為傳統(tǒng)固定化酶的活力不夠。“損傷天冬氨酸酶穩(wěn)定性的溫度”，在大腸桿菌天冬氨酸酶的情況下是40℃左右，在黃色短桿菌天冬氨酸酶的情況下是48℃左右(Journai of Japan Society for Bioscience,Biotechnology,andAgrochemistry,vol.59,No.1,31-37頁，1985)，在產(chǎn)氨基酸芽孢桿菌天冬氨酸酶的情況下是50℃左右(日本專利申請3-48795)。
此外，當將富馬酸銨溶液加至反應器并在平衡狀態(tài)轉變成L-天冬氨酸時，富馬酸銨溶液的溫度將升高。在這種情況下，通過將富馬酸銨溶液溫度控制在低于40℃，就可將反應混合物的溫度保持在40℃或40℃以下。在上述范圍內(nèi)，溫度應盡可能低以便提高穩(wěn)定性。但是溫度過低可能會引起晶體富馬酸銨沉淀，因此在反應器入口的富馬酸銨溶液溫度優(yōu)選最低為10℃至33℃，更優(yōu)選15℃至28℃。
可將除大腸桿菌外的微生物天冬氨酸酶置于與上述條件相似的條件下。
具體地講，當富馬酸銨溶液的濃度為10％(按富馬酸計算)時，由于反應熱，溫度升高約7℃?？紤]固定化天冬氨酸酶的反應性，優(yōu)選在10℃至33℃，更優(yōu)選15℃至28℃，將富馬酸銨溶液加至反應器中。
當富馬酸銨溶液的濃度為20％(按富馬酸計算)時，由于反應熱，溫度升高約14℃，因此，優(yōu)選在10℃至26℃，更優(yōu)選15℃至24℃，將富馬酸銨溶液加至反應器中。用這種方法，反應器出口的反應混合物的溫度將不超過40℃，天冬氨酸酶保持穩(wěn)定。此外，在反應器內(nèi)不需進行冷卻，反應器本身的結構更加簡單。
就生產(chǎn)率而言，優(yōu)選加至反應器中的富馬酸銨溶液的速度盡可能高，但所述速度可隨富馬酸銨溶液的濃度、固定化天冬氨酸酶的活力和固定化天冬氨酸酶層的長度而變化。LHSV范圍優(yōu)選為2-35，特別為6-30，最佳為7-25。
LHSV超出上述范圍是不利的，因為富馬酸銨溶液轉變成L-天冬氨酸的轉化率將降低。另一方面，LHSV低于上述范圍也是不利的，因為會使生產(chǎn)率降低。
在反應器出口，富馬酸銨溶液轉變成L-天冬氨酸的轉化率優(yōu)選為90％或更高，最佳為95％或更高。異常低的轉化率是不利的，因為這樣會增加未反應富馬酸的量并引起成本增加。
優(yōu)選固定化天冬氨酸酶的活力為250U，最佳為500U。
當固定化天冬氨酸酶的活力為250U時，在以LHSV為2，將20％富馬酸銨溶液加至反應器中并且其入口處溫度為20℃的條件下，轉化率為99％或更高。但是，當固定化天冬氨酸酶的活力為100U，其他條件與上述相同時，轉化率降至80％。當固定化天冬氨酸酶的活力為1000U，在以LHSV為10，將20％富馬酸銨溶液加至反應器中并且其入口處溫度為23℃的條件下，轉化率為99％或更高。
如上所述，具有較高活性的固定化天冬氨酸酶能夠使反應以較高LHSV進行。
以下將描述用遺傳工程技術制備大腸桿菌或熒光假單胞菌天冬氨酸酶的方法。
(1)制備重組大腸桿菌天冬氨酸酶將從發(fā)酵研究所(Institute for Fermentaton,Osaka,Japan(IFO))購買的大腸桿菌菌株IFO3301接種至表1所示的LB培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)8小時。從1毫升培養(yǎng)物中，收集大腸桿菌細胞并懸浮在1毫升蒸餾水中。用1微升細胞懸浮液作為模板DNA用于擴增天冬氨酸酶基因。
表1LB培養(yǎng)基的組成聚胨10g酵母提取物 5gNaCl10g蒸餾水 1升(用高壓消毒鍋在121℃滅菌15分鐘)(2)用PCR擴增天冬氨酸酶基因并制備插入片段為了擴增大腸桿菌的天冬氨酸酶基因，以已知大腸桿菌菌株K-12的天冬氨酸酶基因(其核苷酸序列由SEQ ID NO:1表示，由其編碼的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示)(Biochem.J.237(2),547-557)為基礎，制備下列兩個引物引物F1:GGATAATCGTCGGTCGAAAA (SEQ ID NO:3)引物R1:CGTCATCTGACGTGCCTTT (SEQ ID NO:4)用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制備含有下列組成的反應溶液以便在下列條件下通過PCR擴增天冬氨酸酶基因組成10x緩沖液 5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶 1μl引物F1(25pmol) 1μl引物R1(25pmol) 1μl蒸餾水 34μl總量50μlPCR條件(其中將ⅱ至ⅳ重復30個循環(huán))ⅰ. 98℃,5分鐘ⅱ. 98℃,30秒ⅲ. 53℃,30秒ⅳ. 68℃,1分鐘在PCR反應結束時，在1％瓊脂糖凝膠上電泳擴增的DNA片段并用溴化乙錠染色。預期的約1600bp片段被擴增。
從凝膠上切下片段以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(3)將插入片段與載體連接存在限制酶Srf和DNA連接酶的條件下，將回收的DNA片段連接至pCR-Script Amp SK(+)克隆載體中。
將含插入片段的轉化體命名為PUaspE1菌株。將菌株PUaspE1接種至3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中并在37℃振蕩培養(yǎng)過夜。從1.5ml培養(yǎng)物收集細胞，再用堿SDS方法從細胞中回收質(zhì)粒。將質(zhì)粒命名為pUaspE1。
質(zhì)粒中插入片段的定序表明以與載體啟動子相反的方向插入了天冬氨酸酶基因。
為了相對于啟動子以向前的方向正確地連接天冬氨酸酶基因，用限制酶SacⅠ和BamHⅠ從質(zhì)粒pUaspE1中裂解出插入片段以導入pUC19(Nippon Gene Co.,Ltd.)。具體地講，首先用BamHⅠ裂解質(zhì)粒pUaspE1，然后在用SacⅠ裂解前，通過乙醇沉淀收集DNA。在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離裂解的DNA片段，然后從凝膠上切下以便用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA插入片段。
(4)制備載體將1μg質(zhì)粒pUC19(Nippon Gene Co.,Ltd.)用限制酶BamHⅠ裂解，然后通過乙醇沉淀回收所得的DNA片段，再用SacⅠ裂解。在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離裂解的DNA片段，然后從凝膠上切下以便用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收靶DNA作為載體。
(5)將插入片段與載體相連在16℃，經(jīng)30分鐘，用Ligation high(Toyobo Co.,Ltd.)將均已用相同限制酶裂解過的插入片段和載體相連。
(6)轉化大腸桿菌為了轉化大腸桿菌，將2μl反應混合物加至200μl感受態(tài)大腸桿菌細胞(由Stratagene生產(chǎn)的XL2-Blue MRF’超感受態(tài)細胞)中，所述反應混合物含有帶連接的插入片段的載體。將大腸桿菌轉化體鋪在含100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)過夜。
作為對照，將用不含插入片段的質(zhì)粒pUC18轉化的大腸桿菌鋪在含100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)過夜。
撿出出現(xiàn)的20個菌落，接種至含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)。8小時后，將IPTG(異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)加至培養(yǎng)基中達到1mM的濃度，然后在30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。從1毫升培養(yǎng)物中回收細胞。
同樣，培養(yǎng)不含插入片段的對照轉化體以回收細胞。通過加入1毫升表2所示的富馬酸銨底物溶液懸浮回收的細胞，然后使其在30℃反應1小時。
表220％富馬酸銨底物溶液的組成富馬酸 200g25％氨水200g硫酸鎂 2.5g離子交換水 500g在用25％氨水將反應混合物的pH調(diào)整至8.3后，加入離子交換水達到1升的總體積。在分析反應混合物時，在含插入片段的大腸桿菌轉化體中，轉變成L-天冬氨酸的轉變百分比為99.5％，而不含插入片段的對照轉化體的轉變百分比為5％。
將含插入片段的一個轉化體命名為PUaspE2。將PUaspE2菌株接種至3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，然后在37℃培養(yǎng)8小時。從1.5ml培養(yǎng)物中，用堿SDS方法回收質(zhì)粒，將其命名為pUaspE2。用限制酶SmaⅠ裂解質(zhì)粒pUaspE2，然后用限制酶HindⅢ裂解，接著用1％瓊脂糖凝膠電泳以確定DNA片段的大小。出現(xiàn)了大小分別為約2960bp和約1600bp的兩個片段。
用PUaspE2菌株接種3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，然后在37℃振蕩培養(yǎng)。8小時后，將IPTG加至培養(yǎng)基中達到1mM的濃度，然后在30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。從1毫升培養(yǎng)物中回收細胞，其在OD660nm的密度為8.0。將細胞懸浮在10毫升20％富馬酸銨底物溶液中，然后在30℃反應1小時。用HPLC分析反應混合物。以L-天冬氨酸產(chǎn)率和細胞密度為基礎計算天冬氨酸酶活性，其活性為2,000,000μML-天冬氨酸/小時/OD660nm細胞密度。
同樣，培養(yǎng)并回收不含插入片段的一個對照轉化體。其在OD660nm的密度為8.5。將細胞懸浮在10毫升20％富馬酸銨底物溶液中，然后在30℃反應1小時。用HPLC分析反應混合物。以L-天冬氨酸產(chǎn)率和細胞密度為基礎計算天冬氨酸酶活性，其活性為10,000μM L-天冬氨酸/小時/OD660nm細胞密度。
PUaspE2菌株的天冬氨酸酶活性是不含天冬氨酸酶基因插入片段之菌株的200倍。
(7)培養(yǎng)重組大腸桿菌用能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組體大腸桿菌菌株PUaspE2接種10個試驗試管，每個試管含有3毫升通過將100ppm氨芐青霉素加至表1所示培養(yǎng)基而制備的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，用試驗試管中的培養(yǎng)物分別接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升與上述用1mMIPTG補充的培養(yǎng)基具有相同組成的培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。
從這些培養(yǎng)物中，離心收集細胞。測量的細胞的天冬氨酸酶活性為1.05mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。
(8)制備重組熒光假單胞菌天冬氨酸酶用從發(fā)酵研究所，Osaka(IFO)購買的熒光假單胞菌菌株IFO3081接種表1所示的LB培養(yǎng)基，然后在30℃培養(yǎng)8小時。從1毫升培養(yǎng)物收集細胞，然后懸浮在1毫升蒸餾水中。用1μl細胞懸浮液作為模板DNA用于擴增天冬氨酸酶基因。
(9)用PCR擴增天冬氨酸酶基因并制備插入片段為了擴增熒光假單胞菌的天冬氨酸酶基因，以已知熒光假單胞菌菌株IFO3081的天冬氨酸酶基因的核苷酸序列(J.Biochem.100,697-705(1986))為基礎，制備下列兩個引物引物F2GGGCATATGATCTCCGTCATGTCCTCTGCTGCATCTTTCCG(SEQ ID NO:5)引物R2CCCGGATCCTTAGGCCTTCAGCGGACCAAGCGTGGGG(SEQ ID NO:6)用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制備含有下列組成的反應溶液以便在下列條件下通過PCR擴增天冬氨酸酶基因組成10x緩沖液 5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶 1μl引物F2(25pmol) 1μl引物R2(25pmol) 1μl無菌水 34μl總量50μlPCR條件(其中將ⅱ至ⅳ重復30個循環(huán))ⅰ.98℃,5分鐘ⅱ． 98℃,30秒ⅲ． 55℃,30秒ⅳ.68℃,1分鐘在PCR反應結束時，在1％瓊脂糖凝膠上電泳擴增的DNA片段并用溴化乙錠染色。預期的約1500bp片段被擴增。
從凝膠上切下片段以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ同時裂解回收的DNA，通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離所得的NdeⅠ-BamHⅠ片段，然后從凝膠上切下以按上述用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(10)制備載體為了通過PCR制備在質(zhì)粒pUC18的β-半乳糖苷酶結構基因的起始和終止密碼子位置分別含有NdeⅠ和BamHⅠ限制酶位點的載體DNA片段，制備下列兩個引物引物F3:CCCCATATGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAATATACGAGCC(SEQ ID NO:7)引物R3CCCGGATCCTTAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACC(SEQ ID NO:8)用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制備含有下列組成的反應溶液以便在下列條件下通過PCR擴增天冬氨酸酶基因組成10x緩沖液 5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶 1μl引物F3(25pmol)1μl引物R3(25pmol)1μl無菌水34μl總量 50μlPCR條件(其中將ⅱ至ⅳ重復30個循環(huán))ⅰ. 98℃,5分鐘ⅱ98℃,30秒ⅲ． 55℃,30秒ⅳ. 68℃,1分鐘在PCR反應結束時，在1％瓊脂糖凝膠上電泳擴增的DNA片段并用溴化乙錠染色。預期的約2400bp片段被擴增。
從凝膠上切下片段以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ同時裂解回收的DNA，通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離所得的NdeⅠ-BamHⅠ片段，然后從凝膠上切下以按上述用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(11)將插入片段與載體相連在16℃，經(jīng)30分鐘，用Ligation high(Toyobo Co.,Ltd.)將均已用相同限制酶裂解過的插入片段和載體相連。
(12)轉化大腸桿菌為了轉化大腸桿菌，將2μl反應混合物加至200μl感受態(tài)大腸桿菌細胞(由Stratagene生產(chǎn)的XL2-Blue MRF’超感受態(tài)細胞)中，所述反應混合物含有帶連接的插入片段的載體。將大腸桿菌轉化體鋪在含100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)過夜。
作為對照，將用不含插入片段的質(zhì)粒pUC18轉化的大腸桿菌鋪在含100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)過夜。
撿出出現(xiàn)的20個菌落，接種至含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)。8小時后，將IPTG加至培養(yǎng)基中達到1mM的濃度，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。從1毫升培養(yǎng)物中回收細胞。
同樣，培養(yǎng)不含插入片段的一個對照轉化體以回收細胞。
將回收的細胞懸浮在1毫升表2所示的富馬酸銨底物溶液中并在30℃反應1小時。
分析反應混合物。結果在含插入片段的大腸桿菌轉化體中，轉變成L-天冬氨酸的轉化％為99.5％，而不含插入片段的對照轉化體的轉化％為5％。
將含插入片段的轉化體命名為PUaspP1。用菌株PUaspP1接種3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)8小時。從1.5毫升培養(yǎng)物中用堿SDS法回收質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為pUaspP1。用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ裂解該質(zhì)粒，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳以確定DNA片段的大小。出現(xiàn)了大小為約2400bp和約1500bp的兩個片段。
用PUaspP1菌株接種3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，然后在37℃振蕩培養(yǎng)。8小時后，將IPTG加至培養(yǎng)基中達到1mM的濃度，然后在30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。從1毫升培養(yǎng)物中回收細胞，其在OD660nm的密度為8.0。將細胞懸浮在10毫升20％富馬酸銨底物溶液中，然后在30℃反應1小時。通過HPLC分析反應混合物。以L-天冬氨酸產(chǎn)率和細胞密度為基礎計算天冬氨酸酶活性，其活性為2,500,000μML-天冬氨酸/小時/OD660nm細胞密度。
同樣，培養(yǎng)并回收不含插入片段的一個對照轉化體。其在OD660nm的密度為7.0。將細胞懸浮在10毫升20％富馬酸銨底物溶液中，然后在30℃反應1小時。通過HPLC分析反應混合物。以L-天冬氨酸產(chǎn)率和細胞密度為基礎計算天冬氨酸酶活性，其活性為10,000μM L-天冬氨酸/小時/OD660nm細胞密度。
PUaspP1菌株的天冬氨酸酶活性是不含天冬氨酸酶基因插入片段之菌株的250倍。
(13)培養(yǎng)重組大腸桿菌用能夠表達熒光假單胞天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌菌株PUaspP1接種10個試驗試管，每個試管含有3毫升通過將100ppm氨芐青霉素加至表1所示培養(yǎng)基而制備的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，用試驗試管中的培養(yǎng)物分別接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升與上述用1mM IPTG補充的培養(yǎng)基具有相同組成的培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。
從這些培養(yǎng)物中，離心收集細胞。測量的細胞的天冬氨酸酶活性為0.85mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。
下文將通過下列實施例更詳細地描述本發(fā)明。但是本發(fā)明的技術范圍不限于所述實施例。實施例1用能夠表達熒光假單胞菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspP1接種10個試驗試管，每個試管含有3毫升通過將100ppm氨芐青霉素加至表1所示培養(yǎng)基而制備的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，用試驗試管中的培養(yǎng)物分別接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升通過將1mM IPTG和100ppm氨芐青霉素加入到表3所示的培養(yǎng)基中制得的培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。從這些培養(yǎng)物中，離心收集細胞。天冬氨酸酶的活力為0.19mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。
表3培養(yǎng)基組成富馬酸 10g硫酸銨 5gKH2PO41gK2HPO43gMgSO4·7H2O 0.5gNaOH 6.5g,pH6.3酵母提取物 20g(用高壓消毒鍋在121℃滅菌15分鐘)將70g PAS-880(Nitto Boseki Co.,Ltd.)(用堿將pH調(diào)至7.0左右)和230g去離子水徹底混合，在其中將收集的細胞分散均勻。將300毫升離子交換樹脂(由Organo,Japan生產(chǎn)的AmberliteIRA-96SB型C1，平均顆粒大小為0.5mm)和200個Teflon球(每個0.5英寸)放在6L茄形燒瓶中，向其中加入1/6上述細胞分散液。在30℃用蒸發(fā)器將混合物旋轉干燥1小時以便用細胞包被離子交換樹脂。該步驟重復6次后，除去Teflon球得到珠樣的固定化天冬氨酸酶。所述固定化天冬氨酸酶的活力為354U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的50毫升填充柱形反應器(1cm直徑)。負載的固定化天冬氨酸酶層的長度為約64厘米。為了使反應器絕熱，用熱絕緣材料即聚苯乙烯泡沫包覆該柱。經(jīng)用熱絕緣材料包覆的Teflon管，以100毫升/小時(LHSV=2.0)的流速將底物溶液(每升含200g富馬酸，200g25％氨水，0.25gMgSO4·7H2O；用氨水將pH調(diào)至8.3)加至柱中以完成連續(xù)反應。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.77％。流出物的溫度為33℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到99.7％。
為了測量固定化天冬氨酸酶的壓力損失，使水(20℃)流過該柱。結果，當LHSV為20(1L/小時)時，每米固定化天冬氨酸酶層的壓力損失為0.8kg/cm2。實施例2用能夠表達熒光假單胞菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspP1接種10個試驗試管，每個試管含有3毫升通過將100ppm氨芐青霉素加至表1所示培養(yǎng)基而制備的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，用試驗試管中的培養(yǎng)物分別接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升通過將1mM IPTG和100ppm氨芐青霉素加入到表3所示的培養(yǎng)基中制得的培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。從這些培養(yǎng)物中，離心收集細胞。天冬氨酸酶的活力為0.85mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。
按照與實施例1相同的方法固定細胞以得到固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為2800U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按照實施例1的描述進行連續(xù)反應。負載的固定化天冬氨酸酶層的長度為約13厘米。以100毫升/小時(LHSV=10.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中以完成連續(xù)反應。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.6％。流出物的溫度為33℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到99.5％。實施例3用能夠表達熒光假單胞菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspP1接種10個試驗試管，每個試管含有3毫升通過將100ppm氨芐青霉素加至表1所示培養(yǎng)基而制備的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，用試驗試管中的培養(yǎng)物分別接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升通過將1mM IPTG和100ppm氨芐青霉素加入到表3所示的培養(yǎng)基中制得的培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。從這些培養(yǎng)物中，離心收集細胞。天冬氨酸酶的活力為0.85mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。
按照實施例1所述的方法固定細胞以得到固定化天冬氨酸酶，不同之處是僅將一半的細胞用于固定。固定化天冬氨酸酶的活力為560U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例2所述完成連續(xù)反應，但用恒溫器將底物溶液保持在23℃。以100毫升/小時(LHSV=10.0)的流速將底物溶液加至柱中以完成連續(xù)反應。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.6％。流出物的溫度為36℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到99.5％。實施例4用能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE2接種10個試驗試管，每個試管含有3毫升通過將100ppm氨芐青霉素加至表1所示培養(yǎng)基而制備的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，用試驗試管中的培養(yǎng)物分別接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升通過將1mM IPTG和100ppm氨芐青霉素加入到表3所示的培養(yǎng)基中制得的培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。從這些培養(yǎng)物中，離心收集細胞。天冬氨酸酶的活力為1.27mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。
按照與實施例1所述相同的方法固定細胞以得到固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為3200U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。以100毫升/小時(LHSV=10.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中以完成連續(xù)反應。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.6％。流出物的溫度為33℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到99.6％。
為了測量固定化天冬氨酸酶的壓力損失，使水(20℃)流過該柱。結果，當LHSV為20(1L/小時)時，每米固定化天冬氨酸酶層的壓力損失為0.7kg/cm2。實施例5按實施例4所述培養(yǎng)能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE2以收集細胞。天冬氨酸酶活性為1.00mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。除僅用1/10所得細胞外，按實施例1所述得到固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為265U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。以20毫升/小時(LHSV=2.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中。反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.2％。流出物的溫度為31℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到99.2％。實施例6按實施例4所述培養(yǎng)能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE2以收集細胞。天冬氨酸酶活性為1.20mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。按實施例1所述從細胞制備固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為3600U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。以200毫升/小時(LHSV=20.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中以完成連續(xù)反應。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為97.0％。流出物的溫度為33℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到97.0％。實施例7按實施例4所述培養(yǎng)能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE2以收集細胞。天冬氨酸酶活性為1.20mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。按實施例1所述從細胞制備固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為3600U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。以250毫升/小時(LHSV=25.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為90.0％。流出物的溫度為31℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到90.0％。實施例8按實施例4所述培養(yǎng)能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE2并經(jīng)兩次固定過程以制備約600毫升固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為3000U。將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中一星期，用其中的500毫升填充柱形反應器(1英寸直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。固定化天冬氨酸酶層的長度為80厘米。
在底物溶液溫度為24℃進料速率為5升/小時(LHSV=10)的條件下完成反應。反應開始后2小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.4％。
反應開始后3小時，將進料速率改為10L/小時(LHSV=20)。1小時后，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸的摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為98.2％。
反應開始后4小時，將進料速率改為12.5L/小時(LHSV=25)。1小時后，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸的摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為96.3％。
反應開始后7小時，將進料速率改為15L/小時(LHSV=30)。1小時后，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸的摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為93.8％。
反應開始后9小時，將進料速率改為17.5L/小時(LHSV=35)。1小時后，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為90.3％。
反應開始后11小時，將進料速率改為20L/小時(LHSV=40)。1小時后，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸的摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為85.8％。比較實施例1用大腸桿菌菌株K-12(IFO3301)接種10個試驗試管，每個試管含3毫升表3所示培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)。8小時后，分別用試驗試管中的培養(yǎng)物接種10個Sakaguchi燒瓶，每個燒瓶含100毫升表3所示培養(yǎng)基，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過夜。從這些培養(yǎng)物中離心收集細胞。天冬氨酸酶活性為0.063mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。從所得細胞按實施例1所述制備固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為126U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。以20毫升/小時(LHSV=2.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為86.4％。流出物的溫度為31℃。反應開始后7天和1個月，轉化率分別為86.8％和86.2％。比較實施例2按實施例5所述培養(yǎng)能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE1以制備固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為263U。
按實施例1所述，經(jīng)用絕熱材料包覆的Teflon管，以20毫升/小時(LHSV=2.0)的流速將底物溶液(每升含200g富馬酸，200g25％氨水，0.25gMgSO4·7H2O；用氨水將pH調(diào)至8.3)加至柱中以完成連續(xù)反應。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸的摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為99.7％。流出物的溫度為43℃。反應開始后7天和1個月，轉化率分別為94.5％和77.6％。比較實施例3按實施例4所述培養(yǎng)能夠表達大腸桿菌天冬氨酸酶的重組大腸桿菌菌株PUaspE2以收集細胞。天冬氨酸酶活性為1.20mol L-天冬氨酸/小時/g細胞。從這些細胞按實施例1所述制備固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力為3500U。
4℃，將上述制備的固定化天冬氨酸酶浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過夜，用其中的10毫升填充柱形反應器(1cm直徑)以便按實施例1所述完成連續(xù)反應。以300毫升/小時(LHSV=30.0)的流速將底物溶液(20℃)加至柱中。
反應開始后3小時，分析反應混合物。所得的反應產(chǎn)物即L-天冬氨酸的摩爾數(shù)基本上等于消耗的富馬酸的摩爾數(shù)。反應轉化率為75.0％。流出物的溫度為31℃。反應開始后7天，甚至1個月，轉化率仍達到75.0％。
根據(jù)本發(fā)明的方法，利用具有高天冬氨酸酶活性的微生物可以以高產(chǎn)率得到L-天冬氨酸。
不偏離本發(fā)明范圍和精神的各種其他修飾對于本領域技術人員是顯而易見并很容易完成的。因此，不能認為本文權利要求的反應僅限于本文所描述的范圍，而應給權利要求以更寬的解釋。
本文引用的所有文獻包括專利和專利申請均全文引入本文作為參考。
下列是本文描述的序列資料序列表SEQ ID NO:1:序列長度1573序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線性分子類型cDNA到mRNA來源大腸桿菌序列描述SEQ ID NO:1ggggataatc gtcggtcgaa aaacattcga aaccacatat attctgtgtg ttaaagcaa 60atcattggca gcttgaaaaa gaaggttcac atg tca aac aac att cgt atc gaa 114Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu1 5gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa gtt cca gct gat gcc tac tat ggt 162Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly10 15 20gtt cac act ctg aga gcg att gta aac ttc tat atc agc aac aac aaa 210Val His Thr Leu Arg Ala Ile Val Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys25 30 35 40atc agt gat att cct gaa ttt gtt cgc ggt atg gta atg gtt aaa aaa 258Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys45 50 55gcc gca gct atg gca aac aaa gag ctg caa acc att cct aaa agt gta 306Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val60 65 70gcg aat gcc atc att gcc gca tgt gat gaa gtc ctg aac aac gga aaa 354Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys75 80 85tgc atg gat cag ttc ccg gta gac gtc tac cag ggc ggc 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1410Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu425 430 435 440gtc gtt ctg gaa cgc ggt ctg ttg act gaa gcg gaa ctt gac gat att 1458Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile445 450 455ttc tcc gta cag aat ctg atg cac ccg gct tac aaa gca aaa cgc tat 1506Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr460 465 470act gat gaa agc gaa cag taatcgtaca gggtagtaca aataaaaaag 1554Thr Asp Glu Ser Glu Gln475gcacgtcaga tgacgtgcc 1573SEQ lD NO:2:序列長度478序列類型氨基酸分子類型蛋白質(zhì)來源大腸桿菌序列描述SEQ ID NO:2Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu1 5 10 15Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Val20 25 30Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val35 40 45Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu50 55 60Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys65 70 75 80Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp85 90 95Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr 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325 330 335Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met340 345 350Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile355 360 365Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr370 375 380Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val385 390 395 400Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn405 410 415Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala420 425 430Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu435 440 445Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His450 455 460Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln465 470 475SEQ ID NO:3:序列長度20序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:3ggataatcgt cggtcgaaaa 20SEQ ID NO:4:序列長度19序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:4cgtcatctga cgtgccttt 19SEQ ID NO:5:序列長度41序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:5gggcatatga tctccgtcat gtcctctgct gcatctttcc g 41SEQ ID NO:6:序列長度37序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:6cccggatcct taggccttca gcggaccaag cgtgggg37SEQ ID NO:7:
序列長度62序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:7ccccatatgt gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aatatacgac 60cc 62SEQ ID NO:8:
序列長度42序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:8cccggatcct tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cc 4權利要求
1．用于生產(chǎn)L-天冬氨酸的方法，該方法包括固定含天冬氨酸酶的微生物細胞以產(chǎn)生固定化天冬氨酸酶；將富馬酸銨溶液加至裝有固定化天冬氨酸酶的反應器中；和從反應混合物中回收生產(chǎn)的L-天冬氨酸，其中固定化天冬氨酸酶的活力為250U或更高，其中以LHSV為2-35的進料速率將富馬酸銨溶液加至反應器中。
2．根據(jù)權利要求1的方法，其中將要被加入反應器的富馬酸銨溶液的溫度控制在低于損害天冬氨酸酶穩(wěn)定性的溫度，所述損害至少是因天冬氨酸酶與富馬酸銨反應過程中產(chǎn)生的熱而引起的富馬酸銨溶液溫度升高而導致的。
3．根據(jù)權利要求1的方法，其中要被加入反應器的富馬酸銨溶液的溫度為10-33℃。
4．根據(jù)權利要求1的方法，其中含天冬氨酸酶的微生物是含有通過重組DNA技術導入的天冬氨酸酶基因的重組微生物細胞。
5．根據(jù)權利要求1-4任意一項的方法，其中通過用含天冬氨酸酶的微生物細胞和聚合物的混合物包被球形載體而得到固定化天冬氨酸酶。
6．根據(jù)權利要求1-5任意一項的方法，其中所述固定化天冬氨酸酶是通過與下列通式代表的聚合物混合的含天冬氨酸酶的微生物細胞包被球形苯乙烯二乙烯基苯共聚物型離子交換樹脂載體而制得的
其中Y是直接鍵或由下列分子式代表的雙功能基團
或
R1和R2各自獨立地是氫原子或有機殘基，X是陰離子，n是100-5000的整數(shù)。
7．根據(jù)權利要求1-6任意一項的方法，其中當LHSV為20時，所述固定化天冬氨酸酶的壓力損失為每米固定化天冬氨酸酶層2.0kg/cm2或更低(用水，20℃)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)L－天冬氨酸的方法,該方法包括:固定含天冬氨酸酶的微生物細胞以產(chǎn)生固定化天冬氨酸酶;將富馬酸銨溶液加至裝有固定化天冬氨酸酶的反應器中;從反應混合物中回收生產(chǎn)的L－天冬氨酸,其中固定化天冬氨酸酶的活力為250U或更高,其中以LHSV為2—35的進料速率將富馬酸銨溶液加至反應器中。
文檔編號C12N11/08GK1229142SQ9910074
公開日1999年9月22日 申請日期1999年2月12日 優(yōu)先權日1998年2月13日
發(fā)明者向山正治, 小松崎聡美 申請人:株式會社日本觸媒