專利名稱：堿性β－甘露聚糖酶的生產方法
技術領域：
本發(fā)明為微生物發(fā)酵生產新型β-甘露聚糖酶的生產方法，涉及一種新的酶制劑。
β-甘露聚糖酶(1.4-β-D-mannan mannohydrolase，β-mannanaseEC 3.2.1.78)是一種半纖維素酶，可將葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等一些植物多糖降解為甘露寡糖，與纖維素酶及木聚糖酶一起成為生物轉化中最重要的酶系。β-甘露聚糖酶廣泛存在于動物、植物及微生物中，自六十年代初，已有許多關于微生物產生β-甘露聚糖酶的報道，已知產生β-甘露聚糖酶的微生物包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophile)、野油菜黃單孢桿菌(Xanthomonas campestris)、乳酸細菌(Enterococcus sp.)、陸生梭孢菌(Thielavia terrestris)、產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、木霉(Trichoderma sp.)和鏈霉菌(Streptomyces sp.)等，近年來國內外競相研究開發(fā)這類酶制劑，并已有一些專利報道及許多研究報告。其中，涉及到不同性質酶的生產方法、純化與特性、基因分析等，包括低溫酶、高溫酶等，(JP-；JP05176767，03.06.1993，SU-；SU1514776，26.10.1987；AU-；WO9324622，18.05.1993；EP529712，1991；Ratto，M，et al.Biotechnol.lett.，10661-664，1988；Araujo，A.et al.J.Ind.Microbiol.6269-274，1990；World-J.Microbiol.Biotechnol.；11310-374，1995；J.Biotechnol.45165-172，1996；Appl.Environ.Microbiol.63169-177，1997；Appl.Biochem.Biotechnol.70-72939-953，1998；J.Biotechnol.644428-4432，1998；J.Biotechnol.，63199-210，1998；FEBS Lett.443149-153，1999；J.Bacteriol.1811643-1651，1999)。
在堿性條件下，植物多糖大分子易于溶漲，而且許多生物處理過程需要堿性條件，因此，堿性β-甘露聚糖酶具有特殊的應用價值，而涉及堿性甘露聚糖酶的專利僅有三個專利，并且都是小試條件。第一個堿性β-甘露聚糖酶的報道是日本Horikoshi等1986年的專利，產酶菌種是一株嗜堿芽胞桿菌AM-001，產酶培養(yǎng)基組成是蛋白胨、槐豆膠、K2HPO4，MgSO4，Na2CO3等，最大產酶量為36u/ml，(JP-；J03047076，12.07.1986)。第二個專利是上述酶的純化及特性(JP-；J63036775，10.11.1986)，第三個專利是熱穩(wěn)定性的堿性酶，其產酶菌株也是一株嗜堿細菌，PH8-10為最適PH，其新穎性在于具有較好的熱穩(wěn)定性，最適反應溫度為65℃(JP-；JP08051975；27.02.1996)。但所有這些菌都來自土壤，不是專性嗜堿菌，所產的酶量也不大，未見發(fā)酵工藝的報道。本發(fā)明所涉及的菌種是專性嗜堿芽胞桿菌，PH8以下不生長，具有更好的熱穩(wěn)定性，最適70℃，酶活力高達500單位/毫升發(fā)酵液以上，該水平迄今未見報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的β-甘露聚糖酶的生產菌株及堿性β-甘露聚糖酶大量生產的新方法。
本發(fā)明所采用的菌株為分離自中國內蒙堿湖的嗜堿芽孢桿菌N16-15(alkaliphilic Bacillus sp.N16-15)，該菌株在中國科學院微生物所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏(保藏號為CGMCC No.)。菌株N16-15在以甘露聚糖為碳源的培養(yǎng)條件下可產生芽胞，生長的PH范圍為PH8-11.5，在5-8％的NaCl中生長良好。
本發(fā)明所采用的液體種子培養(yǎng)基含有(克/升)淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O 0.15，NaCl 80，Na2CO310。固體斜面種子培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基中添加2％的瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基(克/升)魔芋粉10-18，旦白胨5-9，酵母粉5-7，K2HPO41-3，MgSO47H2O 0.1-0.3，NaCl70-120，Na2CO38-15，豆油2-5ml。
取固體斜面培養(yǎng)基上生長良好的培養(yǎng)物少許，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置37℃，220轉/分的旋轉搖床上培養(yǎng)24小時作為一級種子液。以4％的接種量將一級種子轉接于裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000ml三角瓶中，上述條件培養(yǎng)24小時，作為二級種子液，再以3-5％的接種量，將二級種子液轉接于種子罐或發(fā)酵罐中。種子罐為50升罐，裝料體積20-30升，發(fā)酵溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉速400-450轉/分，時間20-28小時。發(fā)酵罐為250升-1噸罐，裝料量120-600升。發(fā)酵溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉速200-450轉/分。發(fā)酵時間36-48小時。
按上述方法得到的發(fā)酵液，β-甘露聚糖酶的酶活力在500u/ml以上，酶活力測定方法參照AKino，T.et al.Appl.Miarobiol.Biotechnol.26323-327，1987的方法測定以0.9ml，0.5％(W/V)槐豆膠(Locust beangam)作底粉，用pH10，0.05MOL/L甘氨酸-NaOH緩沖液加入0.1ml稀釋酶液，70℃保溫10分鐘，用二硝基水楊酸試劑測產生的還原糖，1個酶活力單位定義為上述反應條件下，一分鐘釋放1mMOL相當于D-甘露糖的還原糖的酶量。發(fā)酵液經板框過濾、中空纖維柱超濾濃縮即可獲得純凈的濃縮酶液，濃縮倍數10倍，酶收率85％以上。
本發(fā)明提供了專性嗜堿的β-甘露聚糖酶產生菌，為實現堿性β-甘露聚糖酶大量生產提供了可行的工藝，其酶活力屬世界先進水平，酶的熱穩(wěn)定性較好。該酶可有效地降解植物甘露聚糖生成甘露寡糖，為有效植物自然資源在堿性條件下的轉化利用創(chuàng)造了條件。
實施例1.
將嗜堿芽孢桿菌菌株N16-15從斜面上接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，220轉/分搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，然后轉接于4個裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，上述條件培養(yǎng)24小時，再接種于裝有120升發(fā)酵培養(yǎng)基的250升發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(克/升)魔芋粉12，大豆粉4.5，味精4.5，酵母粉7，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.3，NaCl 80，Na2CO310，豆油4ml，發(fā)酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度400轉/分。發(fā)酵過程中，菌體生長延遲期約為8小時，進入對數期后，菌體迅速生長，酶量隨之增長，穩(wěn)定期時(32-48小時)酶活力最高。發(fā)酵40小時可放罐，發(fā)酵液酶活力500u/ml以上。
發(fā)酵液以加濾紙板的板框進行過濾，過濾壓力0-2Kg/cm2，濾液由中空纖維超濾柱進行濃縮，(柱的截留分子量為6000)，基本無需壓力，濃縮10倍左右后，以10nM Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH10)洗滌濃縮酶液，并洗滌超濾柱。最終酶的總收率85％。實施例2.
將菌株N16-15從斜面上接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)24小時作為一級種子液。以3％的接種量將一級種子液接入一個裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000ml三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)24小時作為二級種子液。將二級種子液接入裝有25升種子培養(yǎng)基的50升種子發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶1.0，攪拌速度450轉/分，發(fā)酵24小時后，將其轉接入裝有600升發(fā)酵培養(yǎng)基的1噸罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(克/升)魔芋粉12，酵母粉7，大豆粉4.5，味精4.5，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.1，NaCl 120，Na2CO312，豆油4ml/升，發(fā)酵溫度35℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度240轉/分，發(fā)酵40小時，終止發(fā)酵，發(fā)酵液酶活力500u/ml以上。發(fā)酵液以加濾紙板的板框進行過濾，并加適當硅藻土作為助濾劑。濾液如例1所述進行超濾濃縮，濃縮10倍左右，總收率85％以上。實施例3.
將嗜堿芽孢桿菌菌株N16-15從斜面上接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，220轉/分搖床上振蕩培養(yǎng)24小時，然后轉接于4個裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，上述條件培養(yǎng)24小時，再接種于裝有120升發(fā)酵培養(yǎng)基的250升發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(克/升)槐豆膠12，蛋白胨9，酵母粉6，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.3，NaCl 80，Na2CO310，豆油4ml，發(fā)酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度400轉/分。發(fā)酵40小時放罐，發(fā)酵液酶活力500u/ml以上。
發(fā)酵液以加濾紙板的板框進行過濾，過濾壓力0-2Kg/cm2，濾液由中空纖維超濾柱進行濃縮，(柱的截留分子量為6000)，基本無需壓力，濃縮10倍左右后，以10mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH10)洗滌濃縮酶液，并洗滌超濾柱。最終酶的總收率85％。
權利要求
1，一種微生物發(fā)酵法生產β-甘露聚糖酶的新方法，其特征在于生產堿性β-甘露聚糖酶所采用的微生物是專性嗜堿芽胞桿菌，通過種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液通過板框過濾和中空纖維超濾進行過濾濃縮，制備堿性β-甘露聚糖酶。
2，根據權利要求1所述方法，其特征在于生產堿性β-甘露聚糖酶的微生物是專性嗜堿芽胞桿菌N16-15(alkaliphilic Bacillussp.)，在以甘露聚糖為碳源的培養(yǎng)基條件下，可產生芽胞。
3，根據權利要求1所述的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基是指每升培養(yǎng)基中含有淀粉5克，蛋白胨10克，酵母粉5克，K2HPO41克，MgSO4-7H2O 0.15克，NaCl 80克，Na2CO310克。發(fā)酵培養(yǎng)基是每升培養(yǎng)液中含有魔芋粉10-18克，旦白胨5-9克，酵母粉5-7克，K2HPO41-3克，MgSO47H2O 0.1-0.3克，NaCl 70-120克，Na2CO38-15克，豆油2-5ml。
4，根據權利要求2所述的方法，其特征在于專性嗜堿芽胞桿菌N16-15置于種子培養(yǎng)基的溫度為37℃，搖床轉速為220轉/分，振蕩培養(yǎng)24小時，置于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度為35℃±1℃，通氣量為1∶0.75，罐發(fā)酵攪拌速度為400轉/分，發(fā)酵時間為32-48小時。
5，根據權利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵液的過濾采用通用的板框過濾，濾液可加適量的硅藻土作為助濾劑，過濾壓力可以在0-2Kg/cm2之間。
6，根據權利要求1所述的方法，其特征在于板框過濾液可以采用中空纖維過濾裝置濃縮，中空纖維過濾截留分子量為6000最宜。超濾緩沖液為pH10的10mM Na2CO3-NaHCO3。
7，根據權利要求1所述的方法，其特征在于本方法所制備的β-甘露聚糖酶可應用于甘露聚糖的水解。
全文摘要
一種新堿性β－甘露聚糖酶的生產方法。嗜堿芽孢桿菌N16—5以魔芋粉、大豆粉等為原料,發(fā)酵生產β－甘露聚糖酶,生產條件簡單,發(fā)酵液的酶活力500u/ml以上,后提取收率80%以上。該酶的最適反應pH為10.0,最適反應溫度為70℃,在甘露寡糖生產具有重要的應用價值。該發(fā)明提供了一種新型β－甘露聚糖酶的微生物發(fā)酵生產方法。
文檔編號C12N9/42GK1266096SQ9910283
公開日2000年9月13日 申請日期1999年3月5日 優(yōu)先權日1999年3月5日
發(fā)明者馬延和, 周培瑾, 劉洪燦 申請人:中國科學院微生物研究所