專利名稱：牛FcγRI、FcγRⅢ和CD14的cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及牛的DNA序列，特別是涉及對(duì)牛FcγRI，F(xiàn)cγRIII和CD14的cDNA序列分析。眾所周知，人和動(dòng)物對(duì)病原體的抵抗力(免疫力)有特異性和非特異性之分，采取一些人為的措施和手段例如接種疫苗，注射免疫球蛋白，服用中草藥免疫增強(qiáng)劑等都可以引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到提高人和動(dòng)物的免疫能力的目的。免疫反應(yīng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩種應(yīng)答形式。當(dāng)機(jī)體遇到病原細(xì)菌感染時(shí)，即產(chǎn)生以抗體為主的體液免疫；若人和動(dòng)物體遇到病毒、霉形體或寄生蟲(chóng)等病原體感染時(shí)，產(chǎn)生以細(xì)胞因子為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但二者不是單獨(dú)作用，而是相輔相成并有機(jī)地結(jié)合在一起，共同對(duì)付病原體。事實(shí)證明，免疫球蛋白G(IgG)是抗體的主要成份，當(dāng)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟動(dòng)時(shí)，IgG通過(guò)與細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，激活靶細(xì)胞，使后者產(chǎn)生并釋放細(xì)胞因子及其它活性物質(zhì)，誘發(fā)機(jī)體一系列免疫反應(yīng)，最終將病原體殺死或清除。由此看來(lái)，存在于白細(xì)胞表面的IgG的Fc受體在機(jī)體的免疫反應(yīng)中扮演著極其重要的角色。
免疫球蛋白G的Fc受體(FcγR)包括牛FcγRI、FcγRII和FcγRIII，它們分別被稱為CD64、CD32和CD16。其主要功能是參與機(jī)體對(duì)異物的識(shí)別和清除，ADCC、抗原的處理和提呈、抗體和細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中起橋梁作用。CD14為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁主要成份脂多糖(LPS)及脂多糖結(jié)合蛋白復(fù)合物(LBP)的受體，也是一種白細(xì)胞分化抗原，它在機(jī)體細(xì)胞因子產(chǎn)生調(diào)控方面，尤其在病原體為革蘭氏陰性菌的疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸方面起著重要作用。因此，研究這些受體和CD14的結(jié)構(gòu)不但在理論上有助于理解其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，闡明它在體內(nèi)的作用機(jī)制，還可以從實(shí)踐中進(jìn)一步探索提高機(jī)體免疫能力的方法。
近年來(lái)對(duì)IgG Fc受體的研究已成為分子免疫學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。據(jù)我們查新檢索，與本研究相關(guān)的文獻(xiàn)國(guó)外有3篇，國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類報(bào)道。1992年英國(guó)學(xué)者Symons用分子雜交方法獲得了牛FcγRI的部分編碼基因(約0.7kb)，但不是全長(zhǎng)基因，未能反映出FcγRI的全部基因結(jié)構(gòu)；另外，Collins等英國(guó)學(xué)者在1997年發(fā)表了用RT-PCR方法獲得來(lái)源于牛腸系膜淋巴結(jié)單核細(xì)胞的牛FcγRIII的編碼基因，全長(zhǎng)為0.75kb，我們獲得的牛FcγRIII的編碼基因?yàn)?.5kb，和Collins等報(bào)道的差異較大，可能屬于另一類型；日本學(xué)者Ikeda等在1997年發(fā)表了牛CD14的全長(zhǎng)基因序列，但他們是從染色體基因中獲得的，在其編碼序列中含有內(nèi)含子，我們是從反轉(zhuǎn)錄后的cDNA文庫(kù)中調(diào)取的編碼牛CD14的全長(zhǎng)基因，不含有內(nèi)含子，更能反映牛CD14mRNA的真實(shí)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的目的在于以牛做為反芻動(dòng)物的代表對(duì)其IgG Fc受體FcγRI、FcγRIII及CD14的編碼基因進(jìn)行克隆和序列分析。
本發(fā)明的技術(shù)方案是用健康牛的肺巨噬細(xì)胞構(gòu)建牛的cDNA文庫(kù)，采用標(biāo)記磁微粒技術(shù)結(jié)合PCR方法對(duì)構(gòu)建的牛肺巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，分別克隆到了牛的FcγRI，F(xiàn)cγRIII和CD14的編碼基因。
其具體的做法是(1)首先構(gòu)建牛的cDNA文庫(kù)。用PBS將肺泡中的巨噬細(xì)胞洗出，用尼龍膜過(guò)濾除去沉淀后制成細(xì)胞懸液，用CsCl作墊層進(jìn)行超速離心以提取牛肺巨噬細(xì)胞的總RNA，再用OLIGO(dT)柱層析方法分離出mRNA，用隨機(jī)引物將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。加T4DNA聚合酶補(bǔ)平，再將含有BstXI酶切質(zhì)粒pCDM8，回收大片段，然后用修飾過(guò)的cDNA與pCDM8大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3，構(gòu)成牛的cDNA文庫(kù)。
(2)將一定數(shù)量的COS-7細(xì)胞鋪到培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)至50％連成片時(shí)(約24h)，每孔各加進(jìn)一定量的牛肺巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)和轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24h后，倒掉培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM洗一次，加EDTA消化COS-7細(xì)胞，并收集到離心管中。
(3)分別用雞的卵清蛋白或抗牛CD14單克隆抗體按要求標(biāo)記磁微粒。取適量標(biāo)記磁微粒加到所收集的COS-7細(xì)胞中，混勻并在室溫下孵育，將管子放在一塊磁鐵上片刻，待磁微粒沉淀后棄上清，重復(fù)洗3次，然后提取沉淀細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
(4)參考牛FcγRI和FcγRIII的已知基因片段序列，以及人和小鼠CD14基因中的保守序列，用引物分析軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，按每10個(gè)為一組，混合培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待有特異性DNA條帶時(shí)，再用PCR擴(kuò)增該組的單個(gè)菌落的質(zhì)粒DNA，直到篩選到單個(gè)的陽(yáng)性菌落為止。
(5)提取單個(gè)陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA，將插入片段亞克隆至克隆載體中，用自動(dòng)序列測(cè)定系統(tǒng)，進(jìn)行熒光素標(biāo)記測(cè)序。


圖1為牛FcγRIcDNA的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從圖1中可以看出，牛FcγRI的cDNA序列共1.4kb，其中含有編碼基因1047bp，共編碼349個(gè)氨基酸，含有16個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列和有23個(gè)氨基酸組成的穿膜區(qū)以及5個(gè)可識(shí)別的N-連接糖基化位點(diǎn)，另有6個(gè)半胱氨酸組成的三個(gè)環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
圖2為牛FcγRIII的cDNA序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從圖2中可以看出，牛FcγRIII cDNA序列共590bp，其中含有編碼基因504bp，共編碼168個(gè)氨基酸，它含有16個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，22個(gè)氨基酸組成的穿膜區(qū)和3個(gè)可識(shí)別的N-連接糖基化位點(diǎn)，另有一個(gè)C2環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
圖3為牛CD14的cDNA序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。從圖3中可以看出，牛CD14的cDNA序列共有1166bp，含有編碼基因1119bp，共編碼373個(gè)氨基酸。其中含有20個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列和3個(gè)可識(shí)別的N-連接糖基化位點(diǎn)。
實(shí)施例一，牛FcγRI cDNA序列的克隆方法及測(cè)序。
用上述方法構(gòu)建牛cDNA文庫(kù)，將一定數(shù)量的COS-7細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞學(xué)研究所)鋪到培養(yǎng)孔中，在37℃培養(yǎng)至50％連成片時(shí)，約24h，每孔各加入2μg牛肺巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)和20μl轉(zhuǎn)染試劑(Gibco公司，美國(guó))，轉(zhuǎn)染24h，倒培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM(Gibco公司，美國(guó))洗一次，加0.02％的EDTA消化COS-7細(xì)胞，并收集到E ppendorf管中。
用雞卵清蛋白(華美生物工程公司)按說(shuō)明書(shū)要求標(biāo)記磁微粒[DynabeadsM450(Tosylactivated)購(gòu)自挪威Dynal A.S公司]后，再加?？闺u卵清蛋白的血清吸附標(biāo)記的磁微粒，然后取該磁微粒100μl(1∶10稀釋)加到COS-7細(xì)胞中，混勻并在室溫下孵育30min，將存放有細(xì)胞的Eppendorf管放于一磁鐵上片刻，等到磁微粒沉淀后棄上清液，再加適量PBS，重復(fù)洗3次，然后按Hirt法提取沉淀細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061/P3(購(gòu)于Invitrogen公司)。
采用Symons等發(fā)表的編碼牛FcγRI的部分基因片段，用引物分析軟件設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，F(xiàn)1為5′CGATGACAGTGGTGAATA，F(xiàn)2為5′-GGCTGCGCTTGATAAGAT。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，按每10個(gè)為一組，混合培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，待有特異性DNA條帶時(shí)，再用PCR擴(kuò)增該組的單個(gè)菌落的質(zhì)粒DNA，直到篩選到單個(gè)的陽(yáng)性菌落為止。提取單個(gè)陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA，將插入片段亞克隆至pUC19(購(gòu)自華美生物工程公司)，用ABI公司的373A自動(dòng)序列測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行熒光素標(biāo)記測(cè)序，可獲得前面公布圖1的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列及分析結(jié)果。
序列分析表明，牛FcγRI由349個(gè)氨基酸構(gòu)成，其氨基酸序列與人和小鼠FcRI的同源性分別為64.8％和61.9％。
實(shí)施例二，牛FcγRIII cDNA序列的克隆方法及測(cè)序。
1、牛肺巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建同實(shí)施例一，不重述。
2、PCR引物的設(shè)計(jì)及合成參照Collins等發(fā)表的從牛腸系膜淋巴結(jié)的單核細(xì)胞中獲得的FcγRIII的基因序列，用OLIGO引物分析軟件(4.1版)設(shè)計(jì)一對(duì)引物上游引物為5′-CACTCTAACACACAGCATGT，下游引物是5′-TGGGTGAAGGATCCTCAGAT，后者含有BamHI酶切位點(diǎn)，引物由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所合成。
3、PCR擴(kuò)增條件及其產(chǎn)物的鑒定取牛cDNA文庫(kù)4μl，加dNTP至終濃度為200μM，MgCl2為1.5mM，上下游引物各為0.2μM，Taq酶1.5U，總體積50μl，反應(yīng)條件為94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和酶切鑒定。
4、PCR產(chǎn)物的克隆和序列分析，先用Wizard PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega公司，美國(guó))按說(shuō)明書(shū)要求對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，再將PCR產(chǎn)物用Klenow酶補(bǔ)平，用BamHI酶切后，與Puc19-SmaI-BamhI連接，構(gòu)成pUR3.
5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選重組子，將酶切鑒定過(guò)的重組子用Qiagen試劑盒(GmbH公司，德國(guó))提取并純化后，再用373A自動(dòng)序列測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行熒光素標(biāo)記測(cè)序，可獲得前面公布圖2的牛FcγRIII的cDNA核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列及分析結(jié)果。
實(shí)施例三，牛CD14 cDNA序列的克隆方法及測(cè)序。
按上述方法構(gòu)建牛肺巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)。COS-7細(xì)胞、磁微粒、大腸桿菌MC1061/P3、穿梭質(zhì)粒pCDM8和質(zhì)粒pUC19，其來(lái)源同實(shí)施例一或二，不再注明。
單克隆抗體CC-G33的制備用Tritonx-100裂解分離的牛外周血白細(xì)胞，離心取上清，再用Sepharose柱進(jìn)行親和層析，取純化物免疫SPF Balb/c小鼠制備單克隆抗體，用FACSan技術(shù)鑒定單抗的特異性。
磁微粒的抗體標(biāo)記取4×107個(gè)Dyhabeads，加單克隆抗體CC-G33約5μg，按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行標(biāo)記。
陽(yáng)性細(xì)胞的篩選按1×105個(gè)/孔的數(shù)量將COS-7細(xì)胞鋪到6孔培養(yǎng)板(35mm)中，37℃培養(yǎng)至50％連成片時(shí)(約24h)，按Lipofectin試劑盒(GibcoBRL公司，美國(guó))說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔加2μg cDNA文庫(kù)和20μl轉(zhuǎn)染劑。轉(zhuǎn)染24h后倒去培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM洗一次，加0.02％的EDTA消化COS-7細(xì)胞，并收集到Eppendorf管中，洗后加標(biāo)記磁微粒100μl(1∶10稀釋)，混勻并在室溫下孵育30min，將管子放于一磁鐵上片刻，待磁粒沉淀后棄上清，再加適量PBS，重復(fù)3次，然后按Hirt法提取沉淀細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1063/P3。
PCR引物的設(shè)計(jì)和重組質(zhì)粒的鑒定參考人和小鼠CD14基因中的保守序列，用OLIGO引物分析軟件(4.1版)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，hu2(5′-GAGCATTGCCCAAGCACACT)和Hu3(5′-GCCCAGCGAACGACAGATTG)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為308bp。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，按每10個(gè)為一組，混合培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃變性1min，60℃退火1min和72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，待有特異性DNA條帶時(shí)，再用PCR擴(kuò)增該組的單個(gè)菌落的質(zhì)粒DNA，直到篩選出單個(gè)的陽(yáng)性菌落為止。
牛CD14基因的克隆和序列分析用HindIII和XbaI雙酶切重組質(zhì)粒，回收插入片段，亞克隆至pUC19中，再用373A自動(dòng)序列測(cè)定系統(tǒng)(ABI，美國(guó))進(jìn)行熒光素標(biāo)記測(cè)序。獲得前面公布圖3的核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列及分析結(jié)果。
牛CD14與人及鼠的CD14同源性比較通過(guò)序列比較發(fā)現(xiàn)，牛CD14基因的核苷酸序列與人及小鼠的CD14的同源性分別為78％和69％，所推導(dǎo)的氨基酸序列與人CD14的同源性為73.5％，而與鼠CD的同源性僅為61.4％，三者之間的氨基酸序列的同源性為55％。
權(quán)利要求
1.一種牛FcγRI的cDNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有編碼基因1047個(gè)堿基對(duì)(bp)，共編碼349個(gè)氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有16個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列、23個(gè)氨基酸組成的穿膜區(qū)和5個(gè)可識(shí)別的N-連接糖基化位點(diǎn)，另有6個(gè)半胱氨酸組成的三個(gè)環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
5.一種牛FcγRIII的cDNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有編碼基因504bp，共編碼168個(gè)氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的cDNA序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有16個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列、22個(gè)氨基酸組成的穿膜區(qū)和3個(gè)可識(shí)別的N-連接糖基化位點(diǎn)，另有一個(gè)C2環(huán)狀胞外結(jié)構(gòu)域。
9.一種牛CD14的cDNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA序列，含有核苷酸序列和所推導(dǎo)的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA序列，核苷酸序列中含有編碼基因1119bp，共編碼373個(gè)氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cDNA序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有20個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列和3個(gè)可識(shí)別的N-連接糖基化位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛的DNA序列,特別是涉及對(duì)牛FcγRI,FcγRⅢ及CD14進(jìn)行分子克隆和cDNA序列分析。采用健康牛肺巨噬細(xì)胞構(gòu)建牛cDNA文庫(kù),用標(biāo)記磁微粒技術(shù)結(jié)合PCR方法對(duì)構(gòu)建牛cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選,分別克隆到了牛FcγRI,FcγRⅢ和CD14的編碼基因。牛FcγRIcDNA序列含有核苷酸1.4kb,其中含有編碼基因1047bp,共編碼349個(gè)氨基酸;牛FcγRⅢcDNA序列590bp,其中含有編碼基因504bp,共編碼168個(gè)氨基酸;牛CD14cDNA序列1166bp,含有編碼基因1119bp,共編碼373個(gè)氨基酸。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1266900SQ99103330
公開(kāi)日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1999年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月16日
發(fā)明者閻玉河, 張改平, 鄧瑞廣, 李培慶, 楊艷艷, 李學(xué)伍, 郭軍慶, 李青梅, 王愛(ài)萍 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所