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      人源含硒抗體酶的制備方法

      文檔序號(hào):559236閱讀:253來源:國知局
      專利名稱:人源含硒抗體酶的制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于人源含硒抗體酶的制備方法。
      硒依賴型谷胱甘肽過氧化物酶是生物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激酶系的重要成員,它的催化基團(tuán)為硒代半胱氨酸。谷胱甘肽過氧化物酶通過催化谷胱甘肽氧化,還原過氧化氫及有機(jī)氫過氧化物分子以起到減少生物膜的損傷,保護(hù)機(jī)體的作用。谷胱甘肽過氧化物酶的缺乏與多種疾病的發(fā)生有關(guān),如心腦血管疾病,癌癥,帕金森氏癥。
      中國專利94102481.4和96112628.0公開了題目分別為“化學(xué)突變具有底物結(jié)合部位的單克隆抗體制備含硒抗體酶的方法”和“活力高于天然酶的含硒抗體酶的制備方法”,其中專利94102481.4的制備過程為利用谷胱甘肽和2,4-二硝基氯苯反應(yīng)產(chǎn)物S-二硝基苯取代的谷胱甘肽作為半抗原,以戊二醛作為交聯(lián)劑與載體蛋白牛血清白蛋白偶聯(lián)制成全抗原,免疫小鼠,篩選得到對(duì)半抗原特異的單克隆抗體4A4;用苯甲基磺酰氟活化單抗可變區(qū)絲氨酸殘基上的羥基,再用硒化氫處理,將絲氨酸誘變?yōu)槲腚装彼?,成為具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的抗體酶Sec-4A4,活力為1239酶活力單位/微摩爾,為天然兔肝谷胱甘肽過氧化物酶活力的0.21倍。專利96112628.0的制備過程為用系列疏水基團(tuán)-C2H5、-C4H9、-C3H7修飾S-二硝基苯取代的谷胱甘肽,產(chǎn)物作為半抗原以戊二醛作為交聯(lián)劑與牛血清白蛋白偶聯(lián)制成全抗原,免疫小鼠,用苯甲基磺酰氟活化得到的單抗可變區(qū)上的絲氨酸殘基上的羥基,再用液體硒氫化鈉作為親核試劑與活化的羥基反應(yīng),在每一個(gè)抗體分子的疏水腔中引入一個(gè)硒代半胱氨酸,制成具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的抗體酶,活力為天然谷胱甘肽過氧化物酶的1.6倍到10倍。
      以上報(bào)道的具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的抗體酶的制備方法雖然活力較高,但由于這兩種方法使用的抗體均為鼠的單克隆抗體,制備成本高,技術(shù)要求復(fù)雜,而且應(yīng)用于人體治療時(shí)必然產(chǎn)生人抗鼠反應(yīng),因此不是臨床治療的理想選擇,而人源抗體酶由于對(duì)人體沒有免疫原性,必將成為臨床應(yīng)用的最佳選擇。
      目前世界上唯一一例有報(bào)道的人源化抗體酶是將鼠源單抗的互補(bǔ)決定區(qū)嫁接到人抗體的框架區(qū)得到的,這樣制備的抗體酶雖然已有部分人抗體的特征,卻由于保留了鼠源抗體中仍然對(duì)人體具有免疫原性的互補(bǔ)決定區(qū),影響治療效果,因此需要發(fā)展新的人源抗體酶制備方法,滿足未來醫(yī)學(xué)要求。
      本發(fā)明的目的是提供一種新的人源抗體酶的制備方法,最大限度降低抗體酶應(yīng)用于人體產(chǎn)生的免疫原性,采用基因工程手段提高抗體酶的產(chǎn)量,降低抗體酶的制備成本。
      本發(fā)明是利用根據(jù)疏水腔修飾法設(shè)計(jì)合成的半抗原作為抗原,從噬菌體展示的人單鏈抗體庫中篩選得到半抗原特異的單鏈抗體基因,利用突變引物構(gòu)建了高效表達(dá)單鏈抗體的載體,通過化學(xué)方法把催化基團(tuán)硒代半胱氨酸引入到由大腸桿菌高效表達(dá)的特異抗體中,最后獲得了具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的人源含硒抗體酶。
      本發(fā)明的具體制備步驟I.半抗原的設(shè)計(jì)與合成系列半抗原結(jié)構(gòu)如下
      R=-C4H9,-C6H11,-CH2(C6H5),-CH(CH3)2,-CH2CH2CH(CH3)2取0.8-1.2g谷胱甘肽與2,4-二硝基氯苯在10℃反應(yīng),得到S-二硝基苯取代的谷胱甘肽;將0.1-0.5g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽加入2-5ml相應(yīng)的醇正丁醇或異丙醇或芐醇或正己醇或異戊醇,冰浴,通入過量的干燥氯化氫至飽和,在4-20℃放置5-80hr,反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為系列半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯。
      II.半抗原特異的人單鏈抗體基因的篩選用10-40μg/ml半抗原包被免疫平皿,加入人噬菌體展示的單鏈抗體庫,15-37℃溫浴2hr;0.05M,PH7.2的磷酸鈉緩沖液洗平皿;加入0.5-2.5ml,20-150mmol/L的三乙胺,20-40℃放置8-15min;用0.4-1.0ml,0.5-1.2mol/L,PH7.0-8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液中和洗脫液;洗脫下的噬菌體加入到OD值為0.2-1.0的5-15ml的大腸桿菌TG1中,于20-40℃侵染25-40min;在含100μg/ml的氨芐青霉素和1%的葡萄糖的2×TY中擴(kuò)大培養(yǎng)TG1,利用野生的噬菌體M13K07捕獲特異噬菌體;重復(fù)以上過程3-6次,酶聯(lián)免疫法檢測(cè)篩選得到的特異噬菌體抗體。
      III.人原單鏈抗體的高效表達(dá)、復(fù)性及純化提取特異抗體基因,測(cè)序,在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)突變引物,擴(kuò)增抗體基因,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將抗體基因組裝到pET21a表達(dá)載體上,獲得了以包含體形式高效表達(dá)的單鏈抗體。將從1L培養(yǎng)物中收獲的菌體重懸于PH8.0,含有2mM β-巰基乙醇和0.01%溶菌酶的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液中,超聲破碎菌體,12000rpm離心20分鐘,沉淀即為包含體。包含體經(jīng)2M氯化鈉溶液,0.5%Triton X-100和4M尿素洗滌后,溶于3-12ml,含6M鹽酸胍,PH為7.0-9.0,10-50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽變性液中,用BIO-RAD公司的蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在50ml含0.2-1.0M精氨酸,1-5mM乙二胺四乙酸,1-3M鹽酸胍的0.1-0.8M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽復(fù)性液中滴加變性蛋白溶液,每隔0.5-2.5hr滴加一次,共滴加3-8次,0-12℃放置過夜。濃縮、透析除去鹽酸胍,凍干。凍干的蛋白干粉溶于PH7.0-9.0,10--50mM的磷酸鈉緩沖液中,經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-75分離純化,收集主峰,即為單鏈抗體純品。
      IV.催化基團(tuán)的引入把0.4-1.2×10-5mmol/L單鏈抗體純品,溶于無氧水中,加入2.0-5.0×10-5mmol/L苯甲基磺酰氟,15-30℃振蕩1-3hr,在氮?dú)獗Wo(hù)下加入0.5-2.5×10-4mol/L硒氫化鈉溶液,30-40℃保溫25-40hr,反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-10除鹽后,即得具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的人源抗體酶。活力達(dá)到天然酶的0.03-0.8倍。
      本發(fā)明使用的人源抗體庫的構(gòu)建原料來自于未經(jīng)免疫的正常人外周血淋巴細(xì)胞,單鏈抗體除重鏈可變區(qū)的第三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)是人工合成的,由4-12個(gè)氨基酸組成,其余部分全部來自于人抗體家族,因此化學(xué)修飾從該抗體庫中篩得的單鏈抗體獲得的人源抗體酶,理論上將極大限度的降低對(duì)人體的免疫原性,具有分子量小,組織穿透力強(qiáng),有利于親和標(biāo)記,突變等優(yōu)點(diǎn),是直接應(yīng)用于臨床治療的理想選擇。而且與制備單克隆抗體相比,從抗體庫中篩選抗體方法簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)條件要求低,不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù),只需要幾周就可以得到特異抗體,時(shí)間上遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于制備單克隆抗體所需要的6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。
      本發(fā)明使用突變引物擴(kuò)增抗體基因,使原來不表達(dá)單鏈抗體的大腸桿菌高效表達(dá)了單鏈抗體,這一技術(shù)上的突破,為在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白提供了有益的經(jīng)驗(yàn)。
      本發(fā)明使用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成本低,繁殖速度快,所獲得的單鏈抗體復(fù)性率高,復(fù)性后的蛋白易于純化,而且已被證實(shí)對(duì)過氧化氫損傷的心肌細(xì)胞具有防護(hù)作用,這些特點(diǎn)十分有利于大規(guī)模生產(chǎn),為今后的實(shí)際應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
      本發(fā)明提供的實(shí)施例如下實(shí)施例1把溶于40ml乙醇的1.3675g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽滴加到溶于25ml 1mol/L的氫氧化鈉溶液的2.5g谷胱甘肽中,在10℃反應(yīng)10min后,用鹽酸調(diào)PH值到2.5左右,有黃色固體析出,抽濾,熱水重結(jié)晶,55℃烘干,得到S-二硝基苯取代的谷胱甘肽,產(chǎn)率93%。
      將0.5g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽加入5ml正丁醇中,冰浴,通人過量的干燥氯化氫至飽和,在20℃放置25hr。反應(yīng)結(jié)束后,淺黃色產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二丁酯,產(chǎn)率85%。
      用10μg/ml半抗原包被免疫平皿,加入人噬菌體展示的單鏈抗體庫,37℃溫浴2hr;磷酸鈉緩沖液洗平皿;加入150mmol/L三乙胺0.5ml,20℃放置8min;用1.2mol/L,PH7.0的0.4ml三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液中和洗脫液;洗脫下的噬菌體加入到15ml OD值為0.2的TG1中,于37℃侵染30min;在含100μg/ml的氨芐青霉素和1%的葡萄糖的2×TY中擴(kuò)大培養(yǎng)TG1,利用野生的噬菌體M13K07捕獲特異噬菌體;重復(fù)以上過程3次,酶聯(lián)免疫法檢測(cè)篩選得到的特異噬菌體抗體3B10。
      在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)3B10基因序列設(shè)計(jì)5’端突變引物,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將抗體基因組裝到pET21a表達(dá)載體上;收獲菌體,提取并洗滌包含體;包含體溶于12ml含6M鹽酸胍,PH為9.0,50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽變性液中,用BIO-RAD公司的蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在50ml含0.2M精氨酸,1mM乙二胺四乙酸,1M鹽酸胍的0.1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽復(fù)性液中滴加變性蛋白溶液,每隔0.5hr滴加一次,共滴加8次,12℃放置過夜。濃縮、透析除去鹽酸胍,凍干。凍干的蛋白干粉溶于10mM,PH9.0的磷酸鈉緩沖液中,經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-75分離純化,收集主峰,電泳檢驗(yàn)為一條帶,分子量為31.4kD。
      把0.4×10-5mmol/L單鏈抗體純品,溶于無氧水中,加入2.0×10-5mmol/L苯甲基磺酰氟,15℃振蕩3hr,在氮?dú)獗Wo(hù)下加入0.5×10-4mol/L硒氫化鈉溶液,30℃保溫40hr,反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖凝膠SephadexG-10除鹽后,即得具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的人源抗體酶Sec-3B10,活力為72.2U/μmol,是天然酶的1.2×10-2倍。
      實(shí)施例2將0.4g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽加入4ml正芐醇中,冰浴,通入過量的干燥氯化氫至飽和,在15℃放置80hr。反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二芐酯,產(chǎn)率47%。
      用20μg/ml半抗原包被免疫平皿,加入人噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選,重復(fù)吸附、洗滌、洗脫、富集步驟三次,酶聯(lián)免疫法檢測(cè),得到的特異噬菌體抗體4F4。在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)4F4的基因序列設(shè)計(jì)5’端突變引物,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將4F4基因組裝到pET21a表達(dá)載體上,表達(dá)的單鏈抗體包含體的提取洗滌方法與實(shí)施例1相同。在50ml含1.0M精氨酸,5mM乙二胺四乙酸,3M鹽酸胍的0.8M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽復(fù)性液中滴加變性蛋白溶液,每隔2.5hr滴加一次,共滴加3次,0℃放置過夜。濃縮、透析除去鹽酸胍,凍干。凍干的蛋白干粉溶于50mM,PH7.0的磷酸鈉緩沖液中,經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-75分離純化,收集主峰,把1.2×10-5mmol/L單鏈抗體純品,溶于無氧水中,加入5.0×10-5mmol/L苯甲基磺酰氟,30℃振蕩1hr,在氮?dú)獗Wo(hù)下加入2.5×10-4mol/L硒氫化鈉溶液,40℃保溫25hr,反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖凝膠SephadexG-10除鹽后,得到的人源抗體酶Sec-4F4活力為28.8U/μmol,是天然酶的4×10-3倍。
      實(shí)施例33ml正己醇加入到0.4g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽中,冰浴,通入過量的干燥氯化氫至飽和,在10℃放置30hr。反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二己酯,產(chǎn)率72%。
      用40μg/ml半抗原包被免疫平皿,加入人噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選,重復(fù)吸附、洗滌、洗脫、富集步驟三次,酶聯(lián)免疫法檢測(cè),得到的特異噬菌體抗體5A8。在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)5A8的基因序列設(shè)計(jì)5’端突變引物,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將5A8基因組裝到pET21a表達(dá)載體上,表達(dá)的單鏈抗體包含體的處理方法與實(shí)施例1相同。得到的人源抗體酶Sec-5A8活力126U/μmol,是天然酶的2.7×10-2倍。
      實(shí)施例42ml異丙醇加入0.1g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽中,冰浴,通人過量的干燥氯化氫至飽和,在10℃放置20hr。反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二異丙酯,產(chǎn)率60%。
      篩選步驟同實(shí)施例3,得到特異噬菌體抗體2D7。在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)2D7的基因序列設(shè)計(jì)5’端突變引物,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將2D7基因組裝到pET21a表達(dá)載體上,表達(dá)的單鏈抗體包含體的處理方法與實(shí)施例2相同。得到的人源抗體酶Sec-2D7活力194U/μmol。
      實(shí)施例54ml異戊醇加入0.2g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽中,冰浴,通人過量的干燥氯化氫至飽和,在4℃放置10hr。反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二異戊酯,產(chǎn)率65%。
      篩選步驟同實(shí)施例3,得到的特異噬菌體抗體6C5。在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)6C5的基因序列設(shè)計(jì)5’端突變引物,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將6C5基因組裝到pET21b表達(dá)載體上,表達(dá)的單鏈抗體包含體的處理方法與實(shí)施例2相同。得到的人源抗體酶Sec-6C5活力256U/μmol。
      權(quán)利要求
      1.一種人源含硒抗體酶的制備方法,其特征在于具體制備步驟有以下四步I.半抗原的設(shè)計(jì)與合成系列半抗原結(jié)構(gòu)如下
      R=-C4H9,-C6H11,-CH2(C6H5),-CH(CH3)2,-CH2CH2CH(CH3)2取0.8-1.2g谷胱甘肽與2,4-二硝基氯苯在10℃反應(yīng),得到S-二硝基苯取代的谷胱甘肽,將0.1-0.5g S-二硝基苯取代的谷胱甘肽加入2-5ml相應(yīng)的醇正丁醇或異丙醇或芐醇或正己醇或異戊醇,冰浴,通入過量的干燥氯化氫至飽和,在4-20℃放置5-80hr,反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物用乙醚洗滌,干燥,即為系列半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯;II.半抗原特異的人單鏈抗體基因的篩選用10-40μg/ml半抗原包被免疫平皿,加入人噬菌體展示的單鏈抗體庫,15-37℃溫浴2hr,0.05M,PH7.2的磷酸鈉緩沖液洗平皿,加入0.5-2.5ml,20-150mmol/L的三乙胺,20-40℃放置8-15min,用0.4-1.0ml,0.5-1.2mol/L,PH7.0-8.0的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液中和洗脫液,洗脫下的噬菌體加入到OD值為0.2-1.0的5-15ml的大腸桿菌TG1中,于20-40℃侵染25-40min,在含100μg/ml的氨芐青霉素和1%的葡萄糖的2×TY中擴(kuò)大培養(yǎng)TG1,利用野生的噬菌體M13K07捕獲特異噬菌體,重復(fù)以上過程3-6次,酶聯(lián)免疫法檢測(cè)篩選得到的特異噬菌體抗體;III.人原單鏈抗體的高效表達(dá)、復(fù)性及純化提取特異抗體基因,測(cè)序,在保持氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)突變引物,擴(kuò)增抗體基因,利用NdeI/HindIII酶切位點(diǎn)將抗體基因組裝到pET21a表達(dá)載體上,獲得了以包含體形式高效表達(dá)的單鏈抗體,將從1L培養(yǎng)物中收獲的菌體重懸于PH8.0,含有2mM β-巰基乙醇和0.01%溶菌酶的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液中,超聲破碎菌體,12000rpm離心20分鐘,沉淀即為包含體,包含體經(jīng)2M氯化鈉溶液,0.5%Triton X-100和4M尿素洗滌后,溶于3-12ml,含6M鹽酸胍,PH為7.0-9.0,10-50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽變性液中,用BIO-RAD公司的蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,在50ml含0.2-1.0M精氨酸,1-5mM乙二胺四乙酸,1-3M鹽酸胍的0.1-0.8M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽復(fù)性液中滴加變性蛋白溶液,每隔0.5-2.5hr滴加一次,共滴加3-8次,0-12℃放置過夜,濃縮、透析除去鹽酸胍,凍干,凍干的蛋白干粉溶于PH7.0-9.0,10--50mM的磷酸鈉緩沖液中,經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-75分離純化,收集主峰,即為單鏈抗體純品;IV.催化基團(tuán)的引入把0.4-1.2×10-5mmol/L單鏈抗體純品,溶于無氧水中,加入2.0-5.0×10-5mmol/L苯甲基磺酰氟,15-30℃振蕩1-3hr,在氮?dú)獗Wo(hù)下加入0.5-2.5×10-4mol/L硒氫化鈉溶液,30-40℃保溫25-40hr,反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-10除鹽后,即得具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的人源抗體酶。
      全文摘要
      本發(fā)明屬于人源含硒抗體酶的制備方法。本發(fā)明利用S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯作為半抗原,從人源噬菌體展示的單鏈抗體庫中篩選得到半抗原特異的單鏈抗體,化學(xué)修飾在大腸桿菌中利用突變引物高效表達(dá)的特異抗體,將催化基團(tuán)引入到抗體的活性部位,成功獲得了具有谷胱甘肽過氧化物酶活力的人源含硒抗體酶。本發(fā)明提供的人源含硒抗體酶制備方法具有技術(shù)先進(jìn),產(chǎn)量高,成本低的特點(diǎn),有明顯的臨床應(yīng)用潛力。
      文檔編號(hào)C12N9/00GK1274007SQ9910423
      公開日2000年11月22日 申請(qǐng)日期1999年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月13日
      發(fā)明者趙大慶, 王琳, 丁蘭, 閻錫蘊(yùn), 倪嘉纘 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所
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