專(zhuān)利名稱(chēng)：鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法，尤其指以限制酵素水解經(jīng)聚合酵素連鎖反應(yīng)法擴(kuò)增18S核糖體部份基因所得產(chǎn)物后，呈現(xiàn)一種專(zhuān)屬于冬蟲(chóng)夏草的多型性圖譜，藉此圖譜能鑒別冬蟲(chóng)夏草與其他蟲(chóng)草屬菌株的差異。
冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)是一種寄生在蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus Oberthur)幼蟲(chóng)的昆蟲(chóng)寄生型真菌所生成具有菌核與子座的復(fù)合體，其按照1996年Alexopoulos的分類(lèi)是隸屬于子囊菌綱(Ascomycetes)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、冬蟲(chóng)夏草屬(CordycepsFr)，目前本屬發(fā)現(xiàn)約400個(gè)種，其中僅少數(shù)幾種具有藥效，如蟬花(C.Sobolifera)、蛹蟲(chóng)草(C.militaris)、亞香棒蟲(chóng)草(C.hawkesii)等，其中以冬蟲(chóng)夏草(C.sinensis)為最常用的一種，其經(jīng)藥理研究后發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗腎火、延遲衰老、增強(qiáng)免疫能力等活性成份，因此成為藥用真菌研究的重心。
由于冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)所具有的藥用價(jià)值，所以現(xiàn)在以冬蟲(chóng)夏草為成份所生產(chǎn)出的保健食品已是一種流行的養(yǎng)生、保健之物；然而在冬蟲(chóng)夏草被廣泛使用的同時(shí)，究竟其成份為何？是否具備真正冬蟲(chóng)夏草的特征？或如何去確定真正的冬蟲(chóng)夏草？到現(xiàn)在尚無(wú)具體研究的定論；長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)冬蟲(chóng)夏草之類(lèi)的蟲(chóng)草研究只限于標(biāo)本采集、描述和鑒定，而對(duì)于具藥用效果的冬蟲(chóng)夏草的研究也只存在以某些代謝產(chǎn)物具有某些防治的活性成份就一語(yǔ)概括，當(dāng)然在部份的文獻(xiàn)(如附件一)中也曾由蟲(chóng)草無(wú)性型的生物多樣性的角度去了解蟲(chóng)草甚至是冬蟲(chóng)夏草的進(jìn)一步面目，然而，由于冬蟲(chóng)夏草的菌種不易采集、鑒定及保存，而且至今仍無(wú)法在人工條件下形成子座，故在分類(lèi)鑒定及生活史中有性世代與無(wú)性世代的對(duì)應(yīng)關(guān)系仍無(wú)法理清，形成至今沒(méi)有一套客觀標(biāo)準(zhǔn)的冬蟲(chóng)夏草鑒別方法可供使用的混亂局面。
有鑒于目前采用形態(tài)、生理、生化等分類(lèi)方式仍無(wú)法確定蟲(chóng)草的分類(lèi)，甚至無(wú)從判別真正的冬蟲(chóng)夏草，因此尋求上述分類(lèi)方式以外的方式是極需的。
本發(fā)明的目的即是提供一種做為鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法，其是從基因序列的角度去比較冬蟲(chóng)夏草和其他蟲(chóng)草的差異，甚至去鑒別坊間或諸如一些菌種寄存中心所有關(guān)于冬蟲(chóng)夏草稱(chēng)謂的標(biāo)本或菌種之間的差異，并藉此尋找出一種專(zhuān)屬于冬蟲(chóng)夏草的生物特征，暨以此特征成為鑒別冬蟲(chóng)夏草的一種客觀標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的具體做法是利用物種分類(lèi)鑒定上最常用來(lái)分析的rRNA基因?yàn)椴僮鲗?duì)象，此種基因具有高復(fù)制倍數(shù)(high copy number)以及演化過(guò)程中的高保留性(conserved)等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明的過(guò)程是將待鑒定物標(biāo)本或菌株處所萃取而得的DNA取其中一段18SrRNA基因，然后利用已被廣泛應(yīng)用于真菌分類(lèi)鑒定上的PCR-RFLP(聚合酵素連鎖反應(yīng)——限制酵素水解多型性圖譜)技術(shù)分析18SrRNA基因，其中以Cfo I限制酵素，水解以NS3、NS6為引子所擴(kuò)增的18SrRNA部份基因所得的水解多型性圖譜中發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草具有和任何蟲(chóng)草都不相同的DNA片段，藉著這種特性可以用來(lái)區(qū)別冬蟲(chóng)夏草和其他蟲(chóng)草的差異，也可以提供一種鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法，這樣對(duì)于時(shí)下諸多制造冬蟲(chóng)夏草保健食品的業(yè)者或是該食品的管理機(jī)關(guān)而言不啻也是一種鑒定純正冬蟲(chóng)夏草的客觀標(biāo)準(zhǔn)或參考依據(jù)。
本發(fā)明中專(zhuān)屬于冬蟲(chóng)夏草的多型性圖譜是具有570，300，50bp的DNA片段長(zhǎng)度；聚合酵素連鎖反應(yīng)法的各階段反應(yīng)條件為起始變性階段98℃、2min；變性階段95℃、45sec；煉合階段52℃、45sec；延展階段72℃、2min；循環(huán)次數(shù)35周期；最后延展階段72℃、10min。
以下是利用本發(fā)明較佳實(shí)施例進(jìn)行冬蟲(chóng)夏草或其他蟲(chóng)草鑒定的說(shuō)明；為證明本發(fā)明的客觀性，其待鑒定物分別取自不同來(lái)源的冬蟲(chóng)夏草標(biāo)本及寄存于各菌種中心似為冬蟲(chóng)夏草的菌株，另外并加入具有藥用效果的蛹蟲(chóng)草(C.militaris)及其他蟲(chóng)草做為并同的鑒定比較，以符合其采樣的完整性；如表一及表二即是本次鑒定的對(duì)象物，其中表一的冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)和蛹蟲(chóng)草(C.militaris)均取自不同的來(lái)源，同一個(gè)來(lái)源的樣品再依其所萃取DNA的組織或部位的不同予以細(xì)分并賦予編號(hào)，以鑒定在同一冬蟲(chóng)夏草標(biāo)本的菌核及子座的物性是否相同；在表一中發(fā)明人將酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)列為鑒定的對(duì)象的意義在于藉酵母菌已知的DNA片段為標(biāo)準(zhǔn)以確定其他蟲(chóng)草在限制水解后所呈現(xiàn)的的多型性圖譜的DNA片段的可靠性；表二則是對(duì)應(yīng)表一而生，其是在藉此次鑒定了解一般市售的天然冬蟲(chóng)夏草或其他蟲(chóng)草與寄存的蟲(chóng)草菌株的物性是否相同。
本發(fā)明所分析的對(duì)象是針對(duì)自待鑒定物上所萃取的DNA，然而DNA的范圍甚廣，有些片段過(guò)短(如附

圖1的5.8SrRNA基因)而無(wú)分析的價(jià)值，有些片段則過(guò)長(zhǎng)而難以有效地進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，所以本發(fā)明針對(duì)的是DAN中較完整且長(zhǎng)度適中的18SrRNA進(jìn)行分析，而且在每次進(jìn)行聚合酵素連鎖反應(yīng)(polymerase chain reaction簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)時(shí)也只是針對(duì)以某些引子組(如附圖1的NS1、NS4)來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增的，這些引子的基因序列及位置見(jiàn)表三，在往后的說(shuō)明中，本發(fā)明將著重在以NS1、NS4引子組及NS3、NS6引子組進(jìn)行PCR反應(yīng)。
附表四乃表一中各組供鑒定的樣品以NS1、NS4為引子組進(jìn)行PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的18SrRNA基因產(chǎn)物再分別以限制酵素Hpa II、Rsa I、Hae III、Sau3A及Cfo I水解后的多型性圖譜(polymorphism)中所測(cè)得的DNA片段；由表四的酵母菌(S.cerevisiae)的各組DNA片段得知和既知的酵母菌的DNA片段相同，證明此表中的其他蟲(chóng)草待鑒定物所得的DNA片段為可信的；另外由表四中所呈現(xiàn)的DNA片段亦可證明二個(gè)事實(shí)，一是取自不同來(lái)源的冬蟲(chóng)夏草標(biāo)本，但都具有相同的基因圖譜(DNA片段)，所以證實(shí)這些冬蟲(chóng)夏草均源于同一物種；二是從同一樣本的子座和菌核均有相同的DNA片段證實(shí)，一冬蟲(chóng)夏草乃由單一的基因所組成；在表四中Sau3A限制酵素，由于無(wú)法進(jìn)行蛹蟲(chóng)草(C.militaris)的水解(無(wú)DNA片段的形成)，故在以后的鑒定中將此限制酵素予以排除。
表五則是表二中各組供鑒定的菌種以NS1、NS4為引了組進(jìn)行PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的18SrRNA基因產(chǎn)物再分別以限制酵素Hpa II、Rsa I、Hae III及Cfo I水解后的多型性圖譜中所測(cè)得的DNA片段；由表五對(duì)照表四可知，在待鑒定的菌種中只有編號(hào)ATCC 36337的蟲(chóng)草(Cordyceps.Sp.)具有和表四冬蟲(chóng)夏草(C.Sinensis)同樣的DNA片段，可證明該蟲(chóng)草菌種應(yīng)和表四的冬蟲(chóng)夏草標(biāo)本是源于同一物種；另外由此表中亦可觀察到以HpaII、RsaI及Hae III為限制酵素的水解后的多型性圖譜中并無(wú)法區(qū)別ATCC 36337和其他待鑒定物DNA片段，只有以Cfo I限制酵素水解所得的多型性圖譜可以有明確的分別，因此在以后的鑒定過(guò)程中只采以Cfo I限制酵素進(jìn)行水解。
表六是表一中各組供鑒定的樣品以NS3、NS6為引子組進(jìn)行PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的18SrRNA基因產(chǎn)物以限制酵素Cfo I水解后的多型性圖譜中所測(cè)得的DNA片段；表七則是表二中各組供鑒定的菌種以NS3、NS6為引子組進(jìn)行PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的18SrRNA基因產(chǎn)物以限制酵素Cfo I水解后的多型性圖譜中所測(cè)得的DNA片段；由表五中證實(shí)以限制酵素Cfo I水解后的多型性圖譜可以明確地區(qū)分野生冬蟲(chóng)夏草樣品(編號(hào)Cs7528A1、Cs7528A2、Cs7528JF、Cs7528JH、Cs7528Jt、Cs1014df、Cs1014db)和似冬蟲(chóng)夏草菌種(編號(hào)ATCC36337)與其他蟲(chóng)草的不同，但ATCC36337究竟是否具有真正冬蟲(chóng)夏草的物性，由表四、表五的以NS1、NS4為引子組所得知的結(jié)果顯然無(wú)從驗(yàn)證，因此在表六、表七則選擇NS3、NS6為引子組所擴(kuò)增的18SrRNA基因，并以Cfo I進(jìn)行PCR產(chǎn)物的水解；由其水解后的DNA片段觀察，天然冬蟲(chóng)夏草(C.sinensis)的DNA片段均相同(如表六)，再配合表四的結(jié)果足以證明其的確是源于同一物種的冬蟲(chóng)夏草，反觀表七中的ATCC36337經(jīng)Cfo I水解后的DNA片段與天然冬蟲(chóng)夏草不同，但表七的蛹蟲(chóng)草(C.militaris ATCC26848)和表六的蛹蟲(chóng)草(C.militaris Cm824a、LM1207f)的DNA片段卻相同，此結(jié)果除了說(shuō)明ATCC 36337并非一種純冬蟲(chóng)夏草外，也以NS3、NS6為引子組的PCR反應(yīng)及以限制酵素Cfo進(jìn)行PCR產(chǎn)物水解所獲得的多型性圖譜中可以快速、明確地區(qū)分冬蟲(chóng)夏草和其他蟲(chóng)草在DNA片段上的差異，藉此可訂定出專(zhuān)屬于冬蟲(chóng)夏草的物性，并將此鑒定方式歸為一種鑒別冬蟲(chóng)夏草特性的參考依據(jù)。
在本發(fā)明進(jìn)行PCR過(guò)程中，其各階段的反應(yīng)條件為將欲擴(kuò)增的DNA在98℃下加熱2分鐘(min)使其到達(dá)初始的變性階段，然后在95℃下進(jìn)行45秒(sec)的變性反應(yīng)，接著在52℃下進(jìn)行45秒的煉合過(guò)程，再升溫至72℃使其延展擴(kuò)增2分鐘；重復(fù)上述所有過(guò)程35次，最后再于72℃的溫度下進(jìn)行10分鐘的延展擴(kuò)增。
綜上所述，本發(fā)明確實(shí)能在傳統(tǒng)形態(tài)、生理、生化等分類(lèi)模式外提供一種更客觀的冬蟲(chóng)夏草鑒定模式，并藉此解決目前冬蟲(chóng)夏草與其他蟲(chóng)草在分類(lèi)上的模糊窘境。
表一
表二
>表三<
<p>表四<
<p>表五
表六
表七
權(quán)利要求
1.一種鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法，其特征在于自待鑒定物上所萃取的DNA以聚合酵素連鎖反應(yīng)法進(jìn)行以NS3、NS6為引子的18S核糖體部份基因的擴(kuò)增，經(jīng)擴(kuò)增后的聚合酵素連鎖反應(yīng)產(chǎn)物再以Cfo I限制酵素予以水解；其中聚合酵素連鎖反應(yīng)產(chǎn)物需能被Cfo I水解及水解后能呈現(xiàn)一種專(zhuān)屬于冬蟲(chóng)夏草的多型性圖譜。
2.如權(quán)利要求1所述的鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法，其特征在于專(zhuān)屬于冬蟲(chóng)夏草的多型性圖譜是具有570，300，50bp的DNA片段長(zhǎng)度。
3.如權(quán)利要求1所述的鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法，其特征在于聚合酵素連鎖反應(yīng)法的各階段反應(yīng)條件為起始變性階段98℃、2min；變性階段95℃、45sec；煉合階段52℃、45sec；延展階段72℃、2min；循環(huán)次數(shù)35周期；最后延展階段72℃、10min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法,其是自待鑒定物上所萃取的DNA以聚合酵素連鎖反應(yīng)法(PCR)進(jìn)行以NS3,NS6為引子的18S核糖體部份基因(18SrRNA Gene)的擴(kuò)增,經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物再以Cfo I限制酵素予以水解;其中PCR產(chǎn)物可以被Cfo I水解及水解后的多型性圖譜中具有570,300,50bp的DNA片段長(zhǎng)度。藉此專(zhuān)屬圖譜能鑒別冬蟲(chóng)夏草與其他蟲(chóng)草屬菌株的差異。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1271776SQ9910613
公開(kāi)日2000年11月1日 申請(qǐng)日期1999年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月27日
發(fā)明者許瑞祥, 陳志升 申請(qǐng)人:羅森, 王世任, 許瑞祥