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      乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因的制作方法

      文檔序號(hào):453154閱讀:232來源:國知局
      專利名稱:乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶及編碼該氧化酶的DNA。
      大多數(shù)生物通過呼吸作用獲得生命活動(dòng)必需的能量。在高等生物中,糖類,蛋白質(zhì)和脂肪酸被細(xì)胞漿中的糖酵解途徑和β-氧化降解成乙酰輔酶A(乙酰-CoA),乙酰-CoA被線粒體中的檸檬酸循環(huán)降解。產(chǎn)生的能量以NADH和FADH2中還原力的形式儲(chǔ)存。最后,NADH被位于線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞體系徹底氧化成水,形成與氧化作用偶聯(lián)的質(zhì)子濃度梯度,作為ATP合成的推動(dòng)力。
      依據(jù)種類和生長(zhǎng)環(huán)境不同,細(xì)菌的呼吸鏈通常包括不同的功能酶復(fù)合物,能量守恒效率也可能有很大差異。例如,大腸桿菌(EscherichiaColi)含至少兩種醌醇氧化酶,bo型和bd型,它們用作呼吸鏈的末端氧化酶。當(dāng)在好氣培養(yǎng)時(shí),比較具有兩種類型酶的野生型菌,只具有bo型的突變株和只具有bd型的突變株的生長(zhǎng)產(chǎn)率時(shí),發(fā)現(xiàn)只具有bd型酶的突變株的生長(zhǎng)產(chǎn)率最低,并且依賴于末端氧化酶的種類和其能量守恒效率(生物科學(xué)和生物工程學(xué)會(huì)會(huì)議報(bào)告摘要,日本,1995,主題號(hào)357)。
      棒狀菌(Coryneform bacterium)如乳發(fā)酵短桿菌和黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)為格蘭氏陽性和需氧細(xì)菌,是工業(yè)上用于生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌。盡管對(duì)于這些原核細(xì)菌(proteobacteria)的呼吸鏈末端氧化酶已做了廣泛研究,它在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上與棒狀菌相差很遠(yuǎn),對(duì)于與棒狀菌同樣是格蘭氏陽性菌而與它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)生學(xué)上有些不同的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和嗜熱芽孢桿菌(thermophilicBacillus)的呼吸鏈末部分的氧化酶也做了廣泛研究,但是還未對(duì)棒狀菌呼吸鏈中的電子傳遞體系做細(xì)致的研究。就收集對(duì)于提高有用物質(zhì)的產(chǎn)率的基本數(shù)據(jù)而言,詳細(xì)闡明棒狀菌中能量代謝的關(guān)鍵組分即呼吸鏈中的電子傳遞體系有重要意義。進(jìn)一步,如果能夠確定棒狀菌呼吸鏈中電子傳遞體系的酶及其基因,它們則可用于,如,產(chǎn)生具有更高能效的菌株。
      目前,據(jù)報(bào)道乳發(fā)酵短桿菌的呼吸與質(zhì)子傳遞相偶聯(lián),并涉及了細(xì)胞色素a,b和c(Kawahara,Y.,等(1988)農(nóng)業(yè)生物化學(xué),52(8),1979-1983)。已純化和鑒定了黃色短桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶(Kusumoto,Sone和Sakamoto“氨基酸發(fā)酵細(xì)菌,黃色短桿菌的呼吸鏈及其細(xì)胞色素bd型甲醌醇氧化酶的特征”第23屆生物能量研究組學(xué)術(shù)會(huì)議摘要,1997)。但是,沒有有關(guān)編碼棒狀菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因的報(bào)道。
      本發(fā)明是從前術(shù)觀點(diǎn)進(jìn)行的,其目的是得到棒狀菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的基因并闡明其結(jié)構(gòu)。
      本發(fā)明人根據(jù)黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的亞單位I的N末端和亞單位II的N末端氨基酸序列合成寡核苷酸,用此寡核苷酸作為引物,黃色短桿菌的染色體DNA做模板進(jìn)行PCR以獲得擴(kuò)增片段。進(jìn)一步,他們用擴(kuò)增片段作為探針篩選了野生型乳發(fā)酵短桿菌的染色體DNA文庫,成功地得到了編碼乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的基因。這樣就完成了本發(fā)明。
      也就是說,本發(fā)明提供(1)一個(gè)編碼下述(A)或(B)定義的多肽的DNA片段;(A)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,(B)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白,(2)一個(gè)編碼下述(C)或(D)定義的多肽的DNA片段;(C)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,(D)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞基I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      (3)一個(gè)編碼下述(A)或(B)定義的多肽和下述(C)或(D)定義的多肽的DNA片段;(A)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,(B)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      (C)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,(D)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      (4)上述(1)中的DNA,為下述(a)或(b)定義的DNA;(a)具有與序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(a)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      (5)上述(2)的DNA,為下述(c)或(d)定義的DNA(c)具有與序列表中SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(c)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      (6)上述(3)的DNA,為包含下述(a)或(b)定義的DNA和下述(c)或(d)定義的DNA(a)具有與序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(a)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白;并且(c)具有與序列表中SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(c)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      (7)上述(1)中定義的DNA片段,具有包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸的核苷酸序列,(8)上述(2)中定義的DNA片段具有包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸的核苷酸序列,并且(9)上述(3)中定義的DNA片段,它具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至3498位核苷酸的核苷酸序列。
      在本說明書中,術(shù)語細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性指表現(xiàn)細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素d的氧化還原差別吸收光譜的活性,它是通過消耗氧氣來氧化還原型苯醌復(fù)合物。根據(jù)具體情況,編碼細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶或其亞基的DNA片段將被稱為“本發(fā)明的DNA”。
      圖l代表了乳發(fā)酵短桿菌,嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacillusStearothermophilus)和大腸桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I的親水性分析結(jié)果。符號(hào)“☆”代表了三種氧化酶共有的氨基酸殘基。
      圖2代表了乳發(fā)酵短桿菌,嗜熱脂肪芽孢桿菌和大腸桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I的氨基酸序列對(duì)比。
      圖3代表了乳發(fā)酵短桿菌,嗜熱脂肪芽孢桿菌和大腸桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II的氨基酸序列對(duì)比。
      將在下文中給予本發(fā)明更為詳細(xì)的解釋。
      根據(jù)黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的部分氨基酸序列,可從乳發(fā)酵短桿菌的染色體DNA中獲得本發(fā)明的DNA。具體地,用根據(jù)氨基酸序列合成的寡核苷酸作為引物,黃色短桿菌的染色體DNA作為模板獲得黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因的部分序列。然后,用得到的部分序列作為探針篩選乳發(fā)酵短桿菌的染色體DNA文庫,可得到編碼乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的基因。
      可用如,Saito和Miura(生物化學(xué)和生物物理年報(bào),72 619(1963)的方法和K.S.Kirby(生物化學(xué)雜志,64.,405,(1956))的方法制備黃色短桿菌和乳發(fā)酵短桿菌的染色體DNA。獲得染色體DNA文庫的步驟包括,用合適的限制性酶部分消化染色體DNA,將得到的每一個(gè)DNA片段連接到可在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的DNA載體中以制備重組DNA,然后將此DNA導(dǎo)入大腸桿菌。載體不受特別地限制,只要是能夠用于基因克隆就可以,質(zhì)粒載體如pUCl9,pUCl8,pUCll8和pUCl19噬菌體載體如λ噬菌體DNA等都適用。
      用于PCR的引物可以是,如,具有SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示核苷酸序列的寡核苷酸。為了證實(shí)得到的PCR產(chǎn)物具有希望的序列,可通過核苷酸測(cè)序證實(shí)它含有與引物一致的序列,或證實(shí)由核苷酸序列推斷的氨基酸序列包含黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的部分氨基酸序列。
      如果用質(zhì)粒載體制備文庫則通過菌落雜交的方法,若用噬菌體載體制備文庫則通過噬斑雜交的方法,利用PCR中得到的DNA片段作為探針篩選乳發(fā)酵短桿菌的染色體文庫。通過對(duì)從克隆中制備的DNA進(jìn)行核苷酸測(cè)序,可證實(shí)雜交陽性克隆包含目的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因。也可用此探針對(duì)雜交陽性克隆初步進(jìn)行Southern分析。
      以上述方式在實(shí)施例中得到的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869株的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因的核苷酸序列列于SEQ ID NO1。預(yù)測(cè)的編碼區(qū)和由其編碼的蛋白的氨基酸序列列于SEQ ID NOS1-4。用GENETYX-Homology Version2.2.2(軟件發(fā)展有限公司),估計(jì)了嗜熱脂肪,芽孢桿菌K1041和大腸桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的編碼區(qū)和操縱子結(jié)構(gòu),并分析了其同源性。
      細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因包含兩個(gè)開放閱讀框架(從5′末端閱讀的cydA和cydB),它們分別編碼細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的亞單位I(在下文也只稱其為“亞單位I”)和其亞單位II(在下文也只稱其為“亞單位II”)。據(jù)估計(jì)cydA和cydB分別包括1551bp和1023bp,亞單位I由517個(gè)氨基酸殘基組成。亞單位II由341個(gè)氨基酸殘基組成。一個(gè)啟動(dòng)子樣序列位于cydA的上游,一個(gè)SD樣序列分別位于cydA和cydB的上游,一個(gè)終止子樣序列位于cydB的下游。因此,cydA和cydB被認(rèn)為形成一個(gè)cyd操縱子。
      盡管亞單位I的N末端氨基酸殘基的密碼子為GTG,其在序列表中相應(yīng)的氨基酸是Val,它實(shí)際上是Met。這是由于GTG被看作是起始蛋氨酸的緣故。這樣的情況在其它地方也有報(bào)道。


      圖1和圖2代表了比較本發(fā)明的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶與嗜熱脂肪性芽孢桿菌及大腸桿菌亞單位I結(jié)構(gòu)得到的親水性分析結(jié)果以及氨基酸序列對(duì)比的結(jié)果。I-VII代表跨膜螺旋區(qū),并且已證明至少有7個(gè)跨膜螺旋。從圖中的模式可以理解它們彼此相似。進(jìn)一步,含有一個(gè)醌醇結(jié)合位點(diǎn),被稱為Q環(huán)的區(qū)域位于大腸桿菌亞單位I的V和VI之間,而乳發(fā)酵短桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的cydA Q環(huán)的后半部分缺乏同源性,因此Q環(huán)被剪短了。考慮到這一點(diǎn),乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶結(jié)構(gòu)與嗜熱脂肪芽孢桿菌而不是大腸桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的結(jié)構(gòu)相似。亞單位I的氨基酸序列比較表明乳發(fā)酵短桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌有約24.7%的同源性,與大腸桿菌有約38.6%的同源性,據(jù)認(rèn)為,就亞單位I整體而言,乳發(fā)酵短桿菌的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌而不是嗜熱脂肪芽孢桿菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的結(jié)構(gòu)更相似。
      據(jù)報(bào)道,大腸桿菌cydA的H19,H186和M393以及嗜熱脂肪芽孢桿菌cydA的H21,H184和M329就作為hemb558的配體而言,是功能上重要的殘基。這些氨基酸殘基在乳發(fā)酵短桿菌cydA中也是保守的,它們是H18,H185和M350。
      圖3代表了這三種細(xì)菌的亞單位II的氨基酸序列對(duì)比。對(duì)于亞單位II,乳發(fā)酵短桿菌與嗜熱脂肪芽孢桿菌有約25.9%同源性,與大腸桿菌有約34.8%同源性。
      本發(fā)明的DNA是編碼亞單位I的DNA,它由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列編碼,本發(fā)明的DNA是編碼亞單位II的DNA,它由SEQ IDNO4所示的核苷酸序列編碼,或者本發(fā)明的DNA是編碼含有亞單位I和亞單位II的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶蛋白的DNA。亞單位I,亞單位II或細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶蛋白的制備方法包括,將這樣的DNA導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞,培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化子以使DNA表達(dá)。具有包含SEQID NO1所示的核苷酸序列第933至2483位核苷酸的核苷酸酸序列的DNA可作為編碼亞單位I的DNA,具有包含第2476至3498位核苷酸的核苷酸序列的DNA可作為編碼亞單位II的DNA,具有包含第933至3498位核苷酸的核苷酸苷序列的DNA可作為編碼兩個(gè)亞基的DNA。用通常的純化蛋白的方法如,鹽析,溶劑沉淀,凝膠過濾層析和離子交換層析,從培養(yǎng)物中收集和純化產(chǎn)生的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶蛋白或其亞基。
      本發(fā)明的編碼亞單位I的DNA或者是編碼具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列多肽的DNA,包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代,刪除,插入,添加或倒位,或者是編碼的多肽能夠組成與亞單位II一起表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白的DNA。
      本發(fā)明的編碼亞單位II的DNA或者是編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列多肽的DNA,包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代,刪除,插入,添加或倒位,或者是編碼的多肽能夠組成與亞單位I一起表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白的DNA。
      進(jìn)一步,編碼亞單位I,亞單位II或亞單位I和亞單位II都有突變的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的DNA也包含于本發(fā)明DNA中。
      術(shù)語“多個(gè)氨基酸殘基”優(yōu)選地指1-40個(gè),更優(yōu)選地1-10個(gè)氨基酸殘基。
      編碼與上述的亞單位I和/或亞單位II基本相同的蛋白DNA可通過如修飾核苷酸序列得到,如用定點(diǎn)突變方法以使在特定位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被替代,刪除,插入,添加或倒位。通過常規(guī)的為人熟知的突變處理,可獲得上述經(jīng)修飾的DNA。突變處理包括例如,用羥胺體外處理編碼亞單位I和/或亞單位IIDNA的方法,也包括處理微生物的方法,例如,用紫外線照射或常用于突變處理的突變劑如,N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和硝酸處理含有編碼亞單位I和/或亞單位II的DNA的,屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。
      上述核苷酸的替代,刪除,插入,添加或倒位也包括天然存在的突變(突變體或變異體),例如,以含有細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的個(gè)體差異或棒狀菌種間或?qū)匍g差異為基礎(chǔ)的突變。
      編碼與亞單位I和/或亞單位II基本相同蛋白的DNA可通過在合適的細(xì)胞中表達(dá)具有上述突變DNA并研究表達(dá)產(chǎn)物的活性獲得。編碼與亞單位I和/或亞單位II基本相同蛋白的DNA可通過從編碼具有突變的亞單位I和/或亞單位II的DNA或從具有此DNA的細(xì)胞中分離在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與DNA雜交的DNA來實(shí)現(xiàn),例如,用于分離DNA的DNA具有與SEQ ID NO1所述的核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列和/或具有與SEQ ID NO3所述的核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列,并且分離到的DNA編碼的蛋白具有亞單位I和/或亞單位II的活性。
      “嚴(yán)謹(jǐn)條件”在此指這樣的條件下,形成所謂的特異性雜交,而不形成非特異性雜交。難以用數(shù)值表達(dá)這種條件。然而,例如嚴(yán)謹(jǐn)條件包括一種條件,在這種條件下,例如,具有不少于50%同源性的DNA可以彼此雜交,而同源性低于50%的DNA彼此不能雜交。換種說法,嚴(yán)謹(jǐn)條件指在這個(gè)條件下,在與Southern雜交洗滌中普通條件一致的鹽濃度下DNA可以彼此雜交,即,60℃,1×SSC,0.1%SDS,優(yōu)選地,0.1×SSC、0.1%SDS。
      在上述條件下可以雜交的基因包括那些在基因的編碼區(qū)內(nèi)具有終止密碼子的基因和那些由于活性中心突變失去活性的基因。然而,這種不利的避免可通過將此基因與一個(gè)商業(yè)化的活性表達(dá)載體相連并研究細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性來實(shí)現(xiàn)。
      表達(dá)本發(fā)明DNA的宿主包括,如,各種細(xì)菌,如大腸桿菌,棒狀菌如,乳發(fā)酵短桿菌和黃色短桿菌,真核細(xì)胞如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。為了將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入如上述宿主中,可通過將本發(fā)明DNA插入載體并將此重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn),載體的選擇依賴于進(jìn)行表達(dá)的宿主類型??赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因重組方法進(jìn)行操作。
      本發(fā)明的DNA和/或由其細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶或其亞基可用于闡明棒狀菌的電子傳遞體系。本發(fā)明的DNA也期望用于培育生產(chǎn)具有高效能的有用物質(zhì)的棒狀菌。
      用下述實(shí)施例為參考,本發(fā)明將被特別說明。&lt;1&gt;黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的純化將培養(yǎng)至穩(wěn)定期末的黃色短桿菌ATCC14067株細(xì)菌細(xì)胞(約120g濕重)懸于200ml緩沖液中(0.5%NaCl,10mM磷酸鈉,pH7.4),立即在0.5mM玻璃顆粒存在情況下,在bead beater(Biospec)中高速攪拌以破碎細(xì)菌細(xì)胞。將破碎的細(xì)胞懸液于5,000rpm離心10分鐘以去除未破碎細(xì)菌細(xì)胞,將上清于15,000rpm離心10分鐘,進(jìn)一步將得到的上清于15,000rpm離心30分鐘。合并兩次離心的沉淀物并將其懸浮于上述緩沖液中以得到膜制備物。
      用Teflon勻漿器將上述膜制備物(5mg/ml,0.5%NaCl,10mM磷酸鈉,pH7.4)攪勻,于40,000rpm離心20分鐘,收集沉淀。沉淀中加入1.5%膽酸鈉,0.5%脫氧膽酸鈉,0.1%NaCl和10mM磷酸鈉(pH7.4),然后攪勻并于40,000rpm離心20分鐘以收集沉淀。進(jìn)一步在沉淀中加入10mM磷酸鈉(pH7.4),攪勻,于40,000rpm離心20分鐘以收集沉淀。
      用膽酸洗滌的上述膜制備物被懸于含有濃度分別為1%的表面活性劑,正壬?;?N-甲基葡糖酰胺,(n-nonanoyl-N-methylglucamide)(MEGA-9)和癸酰-N-葡糖酰胺(MEGA-10)。將此懸浮液在冰上攪勻,超聲并于40,000rpm離心20分鐘以獲得上清。
      用以1%MEGA-9,1%MEGA-10,10%甘油和10mM磷酸鈉(pH7.4)平衡的羥基磷灰石柱吸收,用濃度逐步提高的磷酸鈉梯度(0,50,150,250和400mM)洗脫以分級(jí)分離上述離心得到的上清。用還原減去氧化差示光譜(reduced minus oxidired difference spectrum)檢測(cè)組分中的細(xì)胞色素。結(jié)果,以50mM磷酸鈉洗脫的組分中檢測(cè)到了細(xì)胞色素c和b,在150mM磷酸鈉洗脫的組分中檢測(cè)到了細(xì)胞色素c,b和a,在250mM磷酸鈉洗脫的組分中檢測(cè)到了細(xì)胞色素b和d。
      以10%甘油和10mM磷酸鈉(pH7.4)透析以250mM磷酸鈉洗脫的組分,然后用以相同緩沖液平衡的DEAE-Toyopearl(Tohso)柱吸收,用濃度逐步提高的NaCl梯度(0,80,100,120,140和300mM)洗脫進(jìn)行分級(jí)分離。用氧化減去還原差示光譜檢測(cè)組分中的細(xì)胞色素。結(jié)果,以120mM濃度的NaCl洗脫的組分中檢測(cè)到了細(xì)胞色素b和d。此組分用作細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶制備物。
      用13.5%凝膠對(duì)上述酶制備物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并將之轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。對(duì)膜上與亞單位I和亞單位II一致的部分進(jìn)行氨基酸序列分析以測(cè)定N末端氨基酸序列。氨基酸序列分別示于SEQID NO5(亞單位I)和SEQ ID NO6(亞單位II)。&lt;2&gt;分離乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因用菌落雜交篩選乳發(fā)酵短桿菌染色體DNA文庫以得到含有細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因的克隆。
      根據(jù)上述黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的部分氨基酸序列,合成兩種寡核苷酸。其一是根據(jù)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I的N-末端氨基酸序列制備的(bbd1SEQ ED NO7),另外一個(gè)是根據(jù)亞單位II的N-末端氨基酸序列制備的(bbd2SEQ ID NO8)。
      用上述bbd1和bbd2作引物,ATCC14067株的染色體DNA進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為,94℃變性1分鐘后,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括,95℃變性45秒,50℃退火60秒,62℃鏈延伸90秒。結(jié)果,產(chǎn)生了約1500bp,800bp和100bp的片段。根據(jù)純化蛋白估計(jì)的亞單位I的分子量為56.4kD以及報(bào)道的其它細(xì)菌的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I的分子量,1500bp的片段被認(rèn)為是所希望的PCR產(chǎn)物。所以,在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物,從凝膠上切下約1.5kbp的片段以抽提DNA。
      用DNA補(bǔ)平試劑盒(Takara Shuzo)將DNA片段末端補(bǔ)平,并用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)將其連接到用SamaI消化及用堿性磷酸酶處理過的PUC118載體中。用得到的重組引物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue株。
      從得到的轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒,測(cè)定插入的核苷酸序列。用熒光素標(biāo)記的引物M4(Takara Shuzo,SEQ ID NO9)作為正向引物,熒光素標(biāo)記的引物RV-MF(Takara Shuzo,SEQ ID NO10)作為反向引物根據(jù)熱序列熒光標(biāo)記的引物循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham Life Science)的說明書,進(jìn)行核苷酸測(cè)序。結(jié)果,根據(jù)與引物的同源性證實(shí)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因包含于質(zhì)粒中。將此部分克隆命名為BD1。
      用前述的引物M4和RV-M用PCR方法擴(kuò)增BD,用DIG DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim)制備DIG(地高辛)標(biāo)記的探針。
      用前述探針篩選乳發(fā)酵短桿菌染色體DNA文庫。用Sau3A1部分消化乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA,將產(chǎn)物插入pUC18的BamHI位點(diǎn),用得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1B1ue以得到此文庫。用上述以DIG標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)化子克隆進(jìn)行菌落雜交。
      用利用標(biāo)有堿性磷酸酶的抗DIG抗體的DIG檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim)檢測(cè)探針。
      從雜交陽性的克隆中制備質(zhì)粒,并以EcoRI和PstI消化,然后用BD1作為探針對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行Southem印跡。結(jié)果,獲得兩個(gè)陽性克隆。含有插入片段的陽性克隆分別被命名為BD21和BD31。BD21約3.8kbp,BD31約為9.0kbp。這些克隆被亞克隆,核苷酸序列被測(cè)定。結(jié)果示于SEQ ID NO1。期望的編碼區(qū)及由其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列示于SEQ ID NOS1-4。
      序列表&lt;110&gt;Ajinomoto有限公司&lt;120&gt;乳發(fā)酵短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶基因&lt;130&gt;OP852&lt;140&gt;&lt;141&gt;&lt;150&gt;JP10-164019&lt;151&gt;1998-06-11&lt;160&gt;10&lt;170&gt;PatentIn Ver.2.0&lt;210&gt;1&lt;211&gt;3936&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;乳發(fā)酵短桿菌&lt;220&gt;&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(933)..(2483)&lt;400&gt;1ggatcctctc tgttcaaaac agcacctact cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg 60acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaattttaag tttcacgtcc 120aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc 180tcgtcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgtctgccg aattctcaat tgggaacgaa 240acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct 300ttgtgaccta tcacaaggct gatgatgtat ccgaagtact cgttaccagg atgaactcgt 360cgatccgaat acccttcatt ggtattcccg cggcaaccga aagatcacgt ctaatgagat 420caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctt catgtttttg tgaagaagga cgatgccgaa 480ggccttgatt tcttctacct tggtcaagcg cattcagaaa acagcaaaca gtcatcgatg 540cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg gtcacaatgg atctacagtt 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      1. 一個(gè)編碼下述(A)或(B)定義的多肽的DNA片段;(A)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,(B)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      2. 一個(gè)編碼下述(C)或(D)定義的多肽的DNA片段;(C)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,(D)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞基I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      3. 一個(gè)編碼下述(A)或(B)定義的多肽和下述(C)或(D)定義的多肽的DNA片段;(A)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,(B)具有序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。(C)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,(D)具有序列表中SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽,它可包括氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代,刪除,插入,添加或倒位,組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      4. 權(quán)利要求1的DNA,為下述(a)或(b)定義的DNA;(a)具有與序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(a)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      5. 權(quán)利要求2的DNA,為下述(c)或(d)定義的DNA(c)具有與序列表中SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(c)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      6. 權(quán)利要求3的DNA,為包含下述(a)或(b)定義的DNA和下述(c)或(d)定義的DNA(a)具有與序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(a)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位II聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白、并且(c)具有與序列表中SEQ ID NO3所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸一致的核苷酸序列的DNA;或(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(c)的核苷酸序列雜交的DNA序列,它編碼的多肽可組成能夠與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位I聯(lián)合表現(xiàn)細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶活性的蛋白。
      7. 權(quán)利要求1的DNA片段,具有包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至2483位核苷酸的核苷酸序列。
      8. 權(quán)利要求2的DNA片段,具有包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第2476至3498位核苷酸的核苷酸序列。
      9. 權(quán)利要求3的DNA片段,具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第933至3498位核苷酸的核苷酸序列。
      全文摘要
      根據(jù)黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶亞單位ⅠN末端和亞單位ⅡN末端的氨基酸序列合成寡核苷酸,用此寡核苷酸作引物,黃色短桿菌染色體DNA作模板進(jìn)行PCR,以上述得到的擴(kuò)增片段為探針,從乳發(fā)酵短桿菌染色體文庫中獲得編碼黃色短桿菌細(xì)胞色素bd型醌醇氧化酶的基因。
      文檔編號(hào)C12R1/13GK1239142SQ99108450
      公開日1999年12月22日 申請(qǐng)日期1999年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月11日
      發(fā)明者曾根旉史 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社
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