專利名稱：用于治療帕金森病的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細胞藥物，更具體地說，涉及一種用于治療帕金森的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物。
帕金森病是一種常見的中、老年疾病，其主要病因是由于腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的功能減退，從而導致一系列臨床癥狀?，F(xiàn)有的藥物治療方法易產(chǎn)生抗藥性及副作用。另一種治療方法是向腦內(nèi)移植多巴胺能細胞，以補充帕金森病人體內(nèi)多巴胺類物質(zhì)含量的不足，這種治療方法已在動物和少數(shù)病人中取得明顯效果。但多巴胺能細胞來源稀少而且容易引起免疫排斥反應，這兩大難題限制了該技術(shù)的應用?，F(xiàn)在常用的多巴胺能細胞有數(shù)種，它們各有其優(yōu)缺點(1)同種移植物雖然其免疫排斥反應小，但采用胚胎腎上腺髓質(zhì)組織或腦黑質(zhì)組織存在來源稀少和倫理學問題；采用成年帕金森病人自體腎上腺髓質(zhì)組織存在腎上腺手術(shù)創(chuàng)傷對病人打擊大和細胞功能差等問題。(2)采用微囊包裹的人嗜鉻細胞瘤株P(guān)C12，雖能分泌多巴胺類物質(zhì)，但移植腫瘤細胞存在令人擔心的危險。(3)采用來源豐富的異種腎上腺髓質(zhì)組織或腦黑質(zhì)組織存在免疫排斥反應的問題。(4)轉(zhuǎn)基因細胞目前尚難以穩(wěn)定地獲得，并且也存在免疫排斥反應的問題。目前，為克服組織細胞移植中免疫排斥反應而采用的免疫隔離技術(shù)有多種，例如大包囊、微膠囊、中空纖維管及灌流小室等，其中的微囊因體積小(小于1000μm)而利于細胞的存活和體內(nèi)種植。制作微囊的材料有許多種，例如藻酸鈉—聚賴氨酸—藻酸鈉(簡稱APA)、瓊脂糖、殼聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、聚丙烯酰胺及羧甲基纖維素鈉等，其中藻酸鈉的生物相容性高、所形成的囊膜表面較光滑而有利于在動物體內(nèi)長時間完好存在。實驗已證明，APA微膠囊具有較好的免疫保護作用，其囊膜可截割大于11萬Kd的分子(免疫球蛋白和免疫活性細胞不能穿過膜)，并且具有較好的生物相容性，在小、大動物體內(nèi)可較長時間完好地存在。在胰島、肝細胞、甲狀旁腺和基因重組人生長激素分泌細胞移植治療疾病模型動物的研究中已證明APA微囊膜具有保護異種移植物免受宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)破壞的作用。但是，迄今為止，在國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)采用APA微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞(簡稱BCC)作為藥物治療帕金森病的報導。
本發(fā)明的目的是提供一種細胞來源廣泛、不被免疫排斥、作用時間持久的用于治療帕金森病的APA微囊化動物細胞藥物。
本發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的狀況進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用下述技術(shù)方案即可達到上述目的，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、用于治療帕金森的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物，其特征在于，該細胞藥物按下列步驟制成(1)將牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞與一種濃度為10-20g/L的藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液，使每升懸浮液中含0.1-1×1010個細胞；(2)利用噴霧裝置將步驟(1)獲得的懸浮液以150-1000μm直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，兩種液體的比例為保證每升混合液含0.1-1×108個細胞，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得含牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞的藻酸鈣珠沉淀；(3)將步驟(2)獲得的沉淀物加入到一種濃度為0.3-0.7g/L的聚賴氨酸溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個細胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟(3)獲得的沉淀物加入到一種濃度為1.0-2.0g/L的藻酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個細胞，混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為40-70mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個細胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞沉淀物；(6)將步驟(5)獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉(zhuǎn)移入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療帕金森病的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物保存。
2、如第1項所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物，其中所述的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞優(yōu)選具有80％以上的純度。
3、如第1項所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物，在其步驟(2)中優(yōu)選是將步驟(1)獲得的懸浮液以180-500μm直徑的微滴狀態(tài)分散。
在使用時，只要將本發(fā)明的APA微囊化BCC(2-8×106個細胞)以常規(guī)腦立體定位技術(shù)一次性地注入病人的腦紋狀體內(nèi)即可在1周內(nèi)迅速收到糾正其異常行為的效果，并且治療作用時間可維持12個月以上。
下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進行較詳細的解釋。
在上述的幾項技術(shù)方案中，第1項為必要解釋特征，而第2、3項屬于優(yōu)選的技術(shù)特征。
在本發(fā)明中所述的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞(BCC)是指在牛腎上腺髓質(zhì)中能被含鉻染料染色的細胞，它可分泌單胺類物質(zhì)，因此可以用來補充帕金森病人腦內(nèi)多巴胺類物質(zhì)含量的不足，從而起到治療帕金森病的效果。
BCC的獲得與純化方法不屬于本發(fā)明的范圍而是屬于常規(guī)技術(shù)。例如，可以使用膠原酶(Collagenase)與牛的腎上腺作用，使其中膠原組織分解，然后配合機械方法將牛腎上腺組織分離成單個細胞，接著使用170目(88μm)網(wǎng)孔的篩網(wǎng)過濾，牛腎上腺髓質(zhì)細胞(含嗜鉻細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和血細胞)穿過濾網(wǎng)，將網(wǎng)下液離心，棄去上清液，即獲得了上述各種牛腎上腺髓質(zhì)細胞的沉淀物，其中，嗜鉻細胞約占細胞總數(shù)的50-60％，內(nèi)皮細胞和成纖維細胞二者共約占細胞總數(shù)的40-50％，由于血細胞的形態(tài)很小，因此通常都不將其計算在總細胞內(nèi)，應予指出，由于BCC在牛腎上腺髓質(zhì)細胞總數(shù)中約占50-60％，因此即使不進行純化也能應用于本發(fā)明中。但是為了提高治療效果，優(yōu)選將其純化至BCC約占細胞總數(shù)的80％以上。作為BCC的純化方法，例如可以采用常規(guī)的貼壁純化法，其原理是根據(jù)不同種類的細胞具有不同程度的貼壁傾向來進行分離。例如對于含有嗜鉻細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和血細胞的混合液來說，在培養(yǎng)瓶中在數(shù)小時內(nèi)，大部分成纖維細胞貼壁，而大部分嗜鉻細胞、內(nèi)皮細胞和血細胞不貼壁，因此換瓶時可除去大部分成纖維細胞。又因血細胞不貼壁生長，故可以通過培養(yǎng)較長時間(例如24-48小時)，待嗜鉻細胞及內(nèi)皮細胞貼壁后再次換瓶即可除去大部分血細胞。如此經(jīng)過兩次換瓶即可使BCC的純度達到細胞總數(shù)(血細胞除外)的80％以上。
關(guān)于細胞的計數(shù)方法，可以采用常規(guī)的染色后顯微鏡下觀察計數(shù)的方法。例如可以采用胎盤藍染色法(Trypanblue stain)，見于《組織培養(yǎng)溶劑和試劑》(Tissue CultureMedia and Reagents)，第1566頁。
在屬于本發(fā)明的必要技術(shù)特征的6個操作步驟中，各個步驟所用的溶液量可以根據(jù)限定的細胞數(shù)目來掌握。例如，在上述本發(fā)明技術(shù)方案1的步驟(1)所獲得的懸浮液中每升含有0.1-1×1010個細胞，而在步驟(2)的混合液中每升含有0.1-1×108個細胞，也就是步驟(1)的懸浮液中的細胞濃度相當于步驟(2)的混合液中細胞濃度的約100倍，因此，如果從步驟(1)的懸浮液中取出1ml，則在步驟(2)中最好將其分散到100ml的氯化鈣溶液中。余此類推。
在步驟(2)中形成藻酸鈣珠的作用是為了在步驟(5)中獲得含牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞的微囊創(chuàng)造條件。在步驟(5)中，檸檬酸鈉的鈉離子將藻酸鈣珠中的鈣離子置換之后便形成了具有許多小孔隙的微囊。在這些微囊中含有許多BCC，而在BCC的周圍又包裹著藻酸鈉。
對藻酸鈣珠的形成方法沒有特殊限定，只要是能將含有BCC的藻酸鈉懸浮液以足夠微小的液滴分散于氯化鈣溶液中既可。該藻酸鈉懸浮液微滴的直徑通常應在150-1000μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選在180-500μm的范圍內(nèi)。如果微滴直徑在1000μm以上，則最后獲得的微囊過大，在注射入人或動物的機體時容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有針頭注射法、噴霧法等，優(yōu)選是噴霧法，最優(yōu)選的是利用加拿大多倫多大學制造的靜電微囊發(fā)生器(見《酶學方法》“微囊化胰島細胞一種生物內(nèi)分泌胰”SUN，A.M.Micro-encapsulation of pancreatic islet cella bio-artificial endocrine pancreas.InMethods inEnzymology，第137卷，第575-580頁，1988年)進行的噴霧的方法。
上面對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了較詳細的解釋，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀了上文及下文所附的實施例和實驗例之后將能很容易地理解本發(fā)明。
通過大量動物實驗證實，將適當劑量的APA微囊化BCC以常規(guī)腦立體定位技術(shù)一次性注入帕金森病模型動物腦紋狀體內(nèi)，可糾正帕金森病動物的異常行為、使腦組織內(nèi)多巴胺類物質(zhì)含量升高。APA微囊可保護移植物免受宿主體免疫系統(tǒng)的破壞，使得微囊化BCC可在異種動物體內(nèi)較長期的存活。微囊化BCC腦內(nèi)移植對帕金森病能很好地發(fā)揮治療作用，效果明確而持久。
與本領(lǐng)域的同類現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列有益效果1、與采用人腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞相比，作為多巴胺分泌細胞源的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞可以大批量地和高純度地獲得。
2、大量實驗已證實，按本發(fā)明制得的APA微囊具有很好的免疫保護作用，從而可使BCC在異種宿主體內(nèi)較長期地發(fā)揮治療作用。
3、按本發(fā)明制得的APA微囊體積小(直徑180-500μm)，因而至少具有3個優(yōu)點(1)利于營養(yǎng)物和代謝物的擴散，使囊內(nèi)細胞易于較長期的存活(1年以上)；(2)使腦內(nèi)移植手術(shù)操作簡便，對組織損傷小，只需以簡單的腦立體定位技術(shù)即可將微囊注入腦組織內(nèi)；(3)在腦內(nèi)對神經(jīng)組織產(chǎn)生的刺激和壓迫作用較小。
4、與其它材料的免疫隔離膜相比，APA微囊具有很好的生物相容性。即具有可大批量生產(chǎn)、操作簡便、療效可靠、質(zhì)量穩(wěn)定、使用安全等優(yōu)點?？稍谂R床應用中開辟廣闊的使用前景。
5、BCC在宿主體內(nèi)可持續(xù)分泌多巴胺類物質(zhì)，產(chǎn)生持續(xù)的治療作用，避免了長期用藥而產(chǎn)生的抗藥性。
6、可采用低溫技術(shù)保存微囊化BCC，便于長距離運輸和批量供應。
概括地說，本發(fā)明具有治療帕金森病的效果明顯、作用時間長、使用安全、操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定、可大批量生產(chǎn)、生產(chǎn)周期短等特點?？稍谂R床應用中具有廣闊的使用前景。
下面舉出實施例和實驗例來進一步地解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些具體例的限定。
實施例1BCC的分離與純化1、從屠宰場取到12個新鮮的牛腎上腺(在室溫下的缺血時間不超過1小時)，在冷藏條件下迅速運回實驗室備用。
2、從腎上腺的靜脈注入濃度為1g/L的膠原酶I(collagenase I)溶液，每個腎上腺注入膠原酶I溶液5ml，然后在37℃下放置30分鐘，以便讓膠原酶與牛腎上腺細胞周圍的膠質(zhì)充分反應。
3、沿腎上腺縱軸切開皮質(zhì)，分離出髓質(zhì)并將其剪碎。
4、向全部已剪碎的髓質(zhì)組織中加入60ml濃度為1g/L的膠原酶I溶液，再放置30分鐘。
5、用一個網(wǎng)孔為170目(88μm)的鋼網(wǎng)過濾，收集網(wǎng)下液。
6、將網(wǎng)下液離心分離，棄去上清液，獲得含牛腎上腺髓質(zhì)細胞(包括BCC、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和血細胞)的沉淀物。
7、用臺盤藍染色法進行計數(shù)，獲得的細胞總數(shù)(血細胞除外)為5.8×107，細胞存活率為90％。
8、將細胞轉(zhuǎn)移入2個培養(yǎng)瓶中，每瓶加入DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液(其中還含有青霉素100單位/ml、鏈霉素100μg/ml、小牛血清10體積％、)20ml，置于一臺溫度為37℃，含5體積％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，5小時后換瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，使BCC絕大部分貼于瓶壁上，待用。
通常至少需要培養(yǎng)24小時以上，在用于制備微囊化動物細胞藥物時，只需將培養(yǎng)瓶中的溶液去除，用常規(guī)胰酶消化法將BCC從培養(yǎng)瓶中收集下來即可作進一步的處理。
應予說明，實施例1的方法屬于常規(guī)技術(shù)，它對本發(fā)明不起任何限定作用。
實施例2微囊化動物細胞藥物的制備1、使用按實施例1的方法獲得的BCC，離心分離，獲得BCC的沉淀物，用生理鹽水洗滌并稀釋至1ml，將其移至離心管內(nèi)。
2、用臺盤藍染色法計數(shù)，所獲得細胞總數(shù)為3×106個細胞，其中BCC的純度為82％。
3、向其中加入1ml濃度為15g/L的藻酸鈉溶液，用攪拌法將其制成懸浮液。
4、用靜電微囊發(fā)生器(electrostatic dropletgenerator，加拿大多倫多大學制造)將懸浮液噴入到100ml濃度為100mmol/L的氯化鈣溶液中，在10分鐘后獲得了一種直徑在180-500μm范圍內(nèi)的含細胞的藻酸鈣珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
5、將藻酸鈣珠加入到50ml濃度為0.5g/L的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室溫下放置10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。
6、將步驟5獲得的沉淀物加入到60ml濃度為1.5g/L的藻酸鈉溶液中，混合均勻，在室溫下放置10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。
7、將步驟6獲得的沉淀物加入到60ml濃度為55mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放置10分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得含BCC的微囊化動物細胞沉淀物。
8、用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌沉淀物，然后將此沉淀物轉(zhuǎn)移入實施例1的步驟8所述的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為注射用微囊化BCC藥物待用。
實驗例1微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞腦內(nèi)移植治療帕金森病(PD)樣大鼠的應用1、使用20只Wister品系大鼠作為實驗對象，每只大鼠的重量為300±30g。
2、采用常規(guī)的6-OHDA誘發(fā)方法使20只大鼠均變成PD樣模型動物。
3、對5只大鼠的腦內(nèi)注入空微囊(不含BCC的微囊)，對另外5只大鼠的腦內(nèi)注入濃度為9g/L的氯化鈉溶液1ml，結(jié)果表明，這10只大鼠均不能糾正PD樣大鼠的異常行為。
4、對5只大鼠植入未包囊的BCC3×104個細胞，對另外5只大鼠植入微囊包裹的BCC 3×104個BCC個細胞。結(jié)果表明，這10只大鼠均在1周內(nèi)迅速糾正其異常行為并且觀察到其腦組織內(nèi)多巴胺類物質(zhì)含量升高(升高20-120％)。APA微囊包裹組的治療效果(100％的PD樣大鼠有效)和作用時間(超過10個月)明顯優(yōu)于未包囊組(50％的PD樣大鼠有效、作用時間1-6個月)，微囊組在治療后10個月時可觀察到微囊化BCC在大鼠腦內(nèi)完好存在，腦組織無明顯的炎性反應，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。
實驗例2微囊化BCC腦內(nèi)移植治療帕金森病(PD)樣猴的應用1、使用9只恒河猴子作為試驗對象。
2、采用常規(guī)的MPTP誘發(fā)方法使這9只猴子均變成PD樣模型動物。
3、對其中的1只猴的腦內(nèi)植入空微囊，結(jié)果表明，其異常行為不能得到糾正。
4、對其中的2只猴的腦內(nèi)植入未包囊的BCC(分別為2×106和8×106個BCC)；對其余6只猴腦內(nèi)植入微囊包裹的BCC(在2-8×106個BCC范圍內(nèi))，這8只猴均在1周左右糾正其PD樣猴的異常行為，并且觀察到其腦組織內(nèi)多巴胺類物質(zhì)含量明顯升高(提高了80-200％)。未包囊組治療作用時間持續(xù)約1個月后消失，而APA微囊包裹組的治療作用時間已超過12個月。未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。
權(quán)利要求
1.用于治療帕金森病的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物，其特征在于，該細胞藥物按下列步驟制成(1)將牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞與一種濃度為10-20g/L的藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液，使每升懸浮液中含0.1-1×1010個細胞；(2)利用噴霧裝置將步驟(1)獲得的懸浮液以150-1000μm直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，兩種液體的比例為保證每升混合液含0.1-1×108個細胞，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得含牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞的藻酸鈣珠沉淀；(3)將步驟(2)獲得的沉淀物加入到一種濃度為0.3-0.7g/L的聚賴氨酸溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個細胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟(3)獲得的沉淀物加入到一種濃度為1.0-2.0g/L的藻酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個細胞，混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為40-70mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個細胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞沉淀物；(6)將步驟(5)獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉(zhuǎn)移入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療帕金森病的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物保存。
2.如權(quán)利要求1所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物，其特征在于，其中所述的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞具有80％以上的純度。
3.如權(quán)利要求1所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞藥物，其特征在于，在其步驟(2)中將步驟(1)獲得的懸浮液以180-500μm直徑的微滴狀態(tài)分散。
全文摘要
用于治療帕金森病的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞(簡稱BCC)藥物,其制法是:1.將BCC懸浮于藻酸鈉溶液中;2.將該懸浮液分散于氯化鈣溶液中以形成藻酸鈣珠沉淀;3.將該沉淀與聚賴氨酸溶液混合以包裹聚賴氨酸膜并沉淀;4.將該沉淀與藻酸鈉溶液混合以包裹藻酸鈉膜;5.用檸檬酸鈉置換出沉淀物中的鈣離子以微囊化BCC;6.將微囊化BCC轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)液中,待用。該細胞藥物能在人腦內(nèi)長期地分泌多巴胺,植入一次可維持療效12個月以上。
文檔編號C12N11/00GK1242197SQ9910905
公開日2000年1月26日 申請日期1999年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月16日
發(fā)明者薛毅瓏, 王魯寧, 王振福, 李新建, 鐘大光, 崔忻, 高軍茂, 齊增飛, 羅蕓, 孫綿方 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院臨床醫(yī)學基礎(chǔ)研究所, 薛毅瓏