專利名稱：一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人CDV-1的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是小鼠CDV-1蛋白的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
內(nèi)臟皮脂腺病幼鼠(juvenile visceral steatosis mice，JVS mice)帶有類Reye綜合癥表型，表現(xiàn)為脂肪肝、高血氨、低血糖和生長遲緩等(Lab Anim.1989，2283-87)。它們體內(nèi)缺乏脂肪酸β-氧化作用中的必需載體——肉堿。β-氧化作用主要在細(xì)胞線粒體基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行。脂肪酸在線粒體膜外被活化成脂酰輔酶A.再與肉堿反應(yīng)生成脂酰肉堿后才能進(jìn)入線粒體基質(zhì)以進(jìn)行以后的脂肪酸氧化分解作用。用肉堿對JVS鼠進(jìn)行治療后，各種癥狀均消失(J.Biol.Chem.1992，2675032-5035)。
1997年，Masuda等人用mRNA差異顯示法尋找14天齡的JVS鼠心室中的差異表達(dá)基因(FEBS Lett.1997，408221-224)。他們找到四個(gè)在JVS鼠心室中表達(dá)上調(diào)的基因和一個(gè)表達(dá)下調(diào)的新基因CDV(carnitine deficiency-associated gene expressed in ventricle)。CDV有三種mRNA形式，分別為1.1kb、1.3kb和2.6kb長。其中兩種短mRNA僅在心臟中發(fā)現(xiàn)，它們的cDNA命名為CDV-1而2.6kb的mRNA在心臟、腎臟和腦中有表達(dá)，在骨骼肌和肝臟中未見，它的cDNA命名為CDV-1R(CDV-1-related gene)。本發(fā)明的人CDV-1基因，尚屬首次報(bào)道。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼小鼠CDV-1蛋白的一個(gè)同系物，本發(fā)明的小鼠CDV-1蛋白的同系物被命名為人CDV-1。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的小鼠CDV-1蛋白的同系物，該蛋白被命名為人CDV-1蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的CDV-1多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的CDV-1核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ IDNo.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人CDV-1蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人CDV-1蛋白活性的多肽的方法，該方法包括
(a)將編碼具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人CDV-1蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人CDV-1蛋白的重組細(xì)胞(c)在適合表達(dá)入CDV-1蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞(d)分離出具有人CDV-1蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為498個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQID No.3，其中開放讀框位于118-441位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人CDV-1蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中118-441位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框118-441位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中118-441位核苷酸序列同源性低至約70％簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下。更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人CDV-1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人CDV-1蛋白多肽”指具有人CDV-1蛋白活性的SEQ ID No.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人CDV-1蛋白相同功能的、SEQ ID No.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人CDV-1蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與人CDV-1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人CDV-1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人CDV-1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人CDV-1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人CDV-1多肽編碼序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人CDV-1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CDV-1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括人CDV-1多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人CDV-1的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有人CDV-1多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人CDV-1的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人CDV-1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人CDV-1多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人CDV-1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CDV-1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CDV-1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CDV-1蛋白的分子，也包括那些并不影響人CDV-1蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人CDV-1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段抗體重鏈；抗體輕鏈遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人CDV-1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人CDV-1或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol. 6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CDV-1功能的抗體以及不影響人CDV-1功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CDV-1基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CDV-1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人CDV-1的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人心臟λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A5’-CAGTATGATAGCTGTGCAGCAG-3’為正向引物，寡核苷酸B5’-GAGATTAGGCTTATAGCTAGTGG-3’為反向引物，進(jìn)行PCR。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序后得到SEQ ID No.3的全長cDNA序列。
CDV-1為JVS鼠在典型的心臟生長過度癥中差異表達(dá)的蛋白，本發(fā)明的人CDV-1為研究人類中相關(guān)的致病分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1，人CDV-1的cDNA序列的克隆和測定
1.引物擴(kuò)增以人心臟λgtlleDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A5’-CAGTATGATAGCTGTGCAGCAG-3’(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5’-GAGATTAGGCTTATAGCTAGTGG-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A/B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約500bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共498bp，詳細(xì)序列見SEQ ID No.3，其中開放讀框位于118-441位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人CDV-1的氨基酸序列，共107個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID No.4。
實(shí)施例2，同源比較用本發(fā)明的人CDV-1的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與JVS鼠中的CDV-1有顯著的同源性。用PCGENE軟件分析可以看出，它們的蛋白的同源性為90.7％，相似性為95.4％(見附表1)。因此，可以推測本發(fā)明的人CDV-1蛋白為JVS鼠CDV-1的同系物，并具有類似的功能。
1997年，Masuda等人在研究JVS鼠典型的心臟過度生長癥的分子機(jī)制過程中，找到了一個(gè)表達(dá)下調(diào)的新基因CDV(carnitine deficiency-associated gene expressed in ventricle)(FEBS Lett.1997，408221-224)。CDV有三種mRNA形式，分別為1.1kb、1.3kb和2.6kb長。其中兩種短mRNA僅在心臟中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)水平在JVS鼠中顯著下降，它的cDNA命名為CDV-1；而2.6kb的mRNA在心臟、腎臟和腦中有表達(dá)，在骨骼肌和肝臟中未見，表達(dá)水平在JVS鼠和對照鼠中無差別，它的cDNA命名為CDV-1R(CDV-1-related gene)。CDV-1編碼的107個(gè)氨基酸和CDV-1R的C末端308-414位的氨基酸序列完全一致。兩條肽鏈具親水性和堿性，含有較多數(shù)量的賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸(本發(fā)明的人CDV-1蛋白含賴氨酸13.1％、谷氨酸11.2％、谷氨酰胺13.1％、亮氨酸8.4％)。序列分析表明，它們可能含有卷曲螺旋(coiled-coil)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中對應(yīng)區(qū)域?yàn)?MIKNLEVQLRRATDEMKAYISSYQQEKRKAIREQYTKNTAEQENL45。這些新肽段的生物學(xué)功能和致病聯(lián)系尚不清楚。已有的研究結(jié)果表明CDV-I的兩種mRNA在心臟中特異表達(dá)并在JVS鼠的心室而非心房受到抑制，經(jīng)肉堿治療后，它們的水平會(huì)上升至對照鼠水平。本發(fā)明人的CDV-1基因?yàn)檠芯亢蚃VS鼠相當(dāng)?shù)娜祟惢颊叩闹虏》肿訖C(jī)理提供了新的依據(jù)。
實(shí)施例3，人CDV-1在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人CDV-1的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID No.5和6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人CDV-1 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TCAGGTCGACATGATTAAGAACCTAGAAG-3’(SEQ ID No.5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人CDV-1編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’端引物序列為
5’-TTGGAAGCTTTCACAGTATTAGCCGGTCC-3’(SEQ ID No.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人CDV-1的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人CDV-1的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人CDV-1。用6M鹽酸胍(PH5.0)從柱中洗脫人CDV-1?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(PH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約13KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.4的序列一致。
實(shí)施例4，人CDV-1在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人CDV-1的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID No.7和8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人CDV-1 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TCAGAAGCTTATGATTAAGAACCTAGAAG-3’(SEQ ID No.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人CDV-1編碼序列的19個(gè)核苷酸3’端引物序列為5’-TTGGGATATCTCACAGTATTAGCCGGTCC-3’(SEQ ID No.8)該引物含有EcoRV限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人CDV-1的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和EcoRV消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人CDV-1的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為13KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.4的序列一致。
實(shí)施例5，制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人CDV-1基因翻譯產(chǎn)物的能力來評估。
SEQ ID No.1～8的說明SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CAGTATGATA GCTGTGCAGC AG 22SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GAGATTAGGC TTATAGCTAG TGG23SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)長度498bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.3(xii)1 CAGTATGATA GCTGTGCAGC AGGCCTCGAA AGCAATCGGT CCAAATTAGA ACAGGAAGTT61 AGAAGACTCC GTGAAGAATG TCTTCAAGAA GAAAGTAGAT ACCATTATAC AAATTGTATG121 ATTAAGAACC TAGAAGTTCA ACTTCGTCGT GCTACTGATG AGATGAAGGC ATATATCTCT181 TCTTATCAAC AAGAAAAAAG AAAGGCAATT AGGGAACAGT ATACCAAAAA TACTGCTGAA241 CAAGAAAACC TTGGAAAGAA ACTTCGGGAA AAACAAAAAG TTATACGAGA AAGTCATGGT301 CCAAATATGA AACAAGCAAA AATGTGGCGT GATTTGGAAC AATTAATGGA ATGTAAGAAA361 CAGTGCTTTC TGAAACAACA AAGCCAAACT TCCATTGGTC AGGTAATTCA GGAGGGTGGG421 GAGGACCGGC TAATACTGTG AATTCTTGTG TCATCGTTTG GGGTTTTACT TGATACCACT481 AGCTATAAGC CTAATCTCSEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)長度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型多肽(xi)序列描述SEQ ID No.41 Met Ile Lys Asn Leu Glu Val Gln Leu Arg Arg Ala Thr Asp Glu16 Met Lys Ala Tyr Ile Ser Ser Tyr Gln Gln Glu Lys Arg Lys Ala31 Ile Arg Glu Gln Tyr Thr Lys Asn Thr Ala Glu Gln Glu Asn Leu46 Gly Lys Lys Leu Arg Glu Lys Gln Lys Val Ile Arg Glu Ser His61 Gly Pro Asn Met Lys Gln Ala Lys Met Trp Arg Asp Leu Glu Gln76 Leu Met Glu Cys Lys Lys Gln Cys Phe Leu Lys Gln Gln Ser Gln91 Thr Ser Ile Gly Gln Val Ile Gln Glu Gly Gly Glu Asp Arg Leu106 Ile LeuSEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 5TCAGGTCGAC ATGATTAAGA ACCTAGAAG 29SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGGTT TCACAGTATT AGCCGGTCC 29SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGATTAAGA ACCTAGAAG 29SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGATATC TCACAGTATT AGCCGGTCC29表I人CDV-1蛋白與JVS鼠CDV-1蛋白的同源比較進(jìn)行同源比較的兩個(gè)序列是hCDV-1—人CDV-1蛋白殘基總數(shù)107JVSCDV-1—JVS鼠CDV-1蛋白殘基總數(shù)107比較真值表結(jié)構(gòu)-遺傳真值表開放間隔罰分10單位間隔罰分10表示一致殘基的符號為“|”表示相似殘基的符號為“.”＂被認(rèn)為是相似的氨基酸為A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，WhCDV-1-MIKNLEVQLRRATDEMKAYISSYQQEKRKAIREQYTKNTAEQENLGKKLR -50||||||| |||||||||||.|| ||||||||||||||| .||||||||||JVSCDV-1 -MIKNLEVELRRATDEMKAYVSSDQQEKRKAIREQYTKNITEQENLGKKLR -50hCDV-1-EKQKVIRESHGPNMKQAKMWRDLEQLMECKKQCFLKQQSQTSIGQVIQEG -100|||| .||||||||||||||||||||||||||||||||| .|||||||||JVSCDV-1 -EKQKAVRESHGPNMKQAKMWRDLEQLMECKKQCFLKQQSPASIGQVIQEG -100hCDV-1-GEDRLIL-107|||||.|JVSCDV-1 -GEDRLVL-107同源性97(90.7％)相似性5(4.7％)插入人CDV-1蛋白的間隔數(shù)0插入人JVS鼠CDV-1蛋白的間隔數(shù)0
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列。
4.一種分離的人CDV-1蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人CDV-1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人CDV-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人CDV-1蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸118-441位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人CDV-1蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人CDV-1蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人CDV-1蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的人CDV-1蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的探針分子，其特征在于是指能與人CDV-1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合與其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
11.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的探針分子，其特征在于，它具有人CDV-1多肽編碼序列中15～50個(gè)連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列——人CDV－1的cDNA序列。該cDNA編碼的蛋白是小鼠CDV－1的一個(gè)同系物,它與SEQ ID No.3中從核苷酸118—441位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列編碼一具有SEQ ID No.4所示的序列的多肽。此外,還提出了生產(chǎn)具有人CDV－1蛋白活性的多肽的方法。本發(fā)明為進(jìn)一步研究CDV－1相關(guān)的致病分子機(jī)理打下了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK1252449SQ9911396
公開日2000年5月10日 申請日期1999年8月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月9日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 張宏來, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)