專利名稱：豬肺炎支原體克隆致弱株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物新菌株。
豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of swine MPS亦稱豬地方流行性肺炎、豬氣喘病)的主要病原，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。在豬呼吸道和其它部位還分離到豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis Mpo)、豬絮狀支原體(Mycoplasma flocculare Mf)、豬腹支原體(Mycoplasma sualvi)、脲原體(Ureaplasmas，尿原體)及多種無膽甾原體(Acholeplasmas)，但這些支原體并不普遍，致病意義也較小。Mhp由Mare &Switzer及Goodwin & Whitlestone于1965年分離成功，菌體呈球型到短絲狀體，菌落很小，具有不明顯的中央隆起，在豬血清瓊脂平板上不產(chǎn)生膜，也不溶解馬、牛、豬、小雞紅血細胞，營養(yǎng)要求復雜，培養(yǎng)嚴格好氧。八十年代前，國內(nèi)外完成Mhp的分離、鑒定、人工發(fā)病、診斷技術(shù)和藥物治療等系統(tǒng)研究。
但目前國際尚無豬肺炎支原體可無細胞培養(yǎng)的弱毒株，常規(guī)的豬肺炎支原體株(Mhp)或者毒力大，或者毒力弱而無免疫原性。
本發(fā)明的目的是提供一株豬肺炎支原體(Mhp)無細胞培養(yǎng)弱毒株，該株毒力較弱、安全，有較強的免疫原性，可在無細胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)。該株是由氣喘病豬病肺接種于二花臉豬進行人工發(fā)病，并進行豬肺炎支原體病原再分離，鑒定后在江蘇二號無細胞培養(yǎng)基中致弱培養(yǎng)至322代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。該株培養(yǎng)72-144小時，以特定PCR引物可擴增出的特異片段，對該株的探針有特異性雜交反應，擴增產(chǎn)物有特定基因序列。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到支原體(Mycoplasma，M.亦稱霉形體)，最早由Nocard和Roux(1898)由牛傳染性胸膜肺炎病例中分離到，第一種支原體即絲狀支原體牛型亞種(M.mycoidessubsp.bovi/M.mycoides subsp.mycoides)分離后由于其性質(zhì)難以界定，遂將這一大類微生物命名為類胸膜肺炎微生物(PPLOS)。五十年代中期，始用支原體這一名稱。1967年，Edward和Fnundt建議將其由裂殖菌綱分出來，單獨成立一個新綱軟膜體綱(Mollicutes柔膜菌綱，軟皮體綱)，支原體因缺少光合色素(葉綠素)，有別于裂殖藻綱；缺少堅硬的細胞壁和細胞壁成份，有別于裂殖菌綱；可以進行無細胞培養(yǎng)而有別于濾過性病毒。它是最小的能夠自我復制的原核生物，基因組大小只有典型細菌的20-40％。國際細菌系統(tǒng)分類委員會軟膜體綱分類分會(ICSB-ISTM)將軟膜體綱分四個目目I支原體目(Order I，Mycoplasmatales)；目II昆蟲原體目(OrderII，Entomoplasmatales)；目III無膽甾原體目(OrderIII，Acholoplasmatales)；目IV厭氧原體目(OrderIV，Anaeroplasmatales)。支原體目下設(shè)一個科即支原體科(FamilyI，Mycoplasmataceae)，科內(nèi)置兩屬支原體屬(Mycoplasma)，屬內(nèi)有120種；尿原體屬(Ureaplasma)，屬內(nèi)有6種，常見的動物支原體屬此兩屬。
Mhp克隆致弱株(以下簡稱JS-99株)的分類地位為原核生物界(Procaryotae)
軟壁菌門(Teneribacteria)軟膜體綱(Mollicutes)支原體目(Order I，Mycoplasmatales)支原體科(FamilyI，Mycoplasmataceae)支原體屬(Mycoplasma)豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)豬肺炎支原體迄今全世界只有一個種，其模式株為J(ATCC25934，NCTC10110)，YppII(ATCC25617，，NCTC10127).
MhpJS-99株經(jīng)系列生化試驗證明為支原體屬成員，生長抑制試驗檢測血清型證明與豬肺炎支原體J株為同一種。
目前該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC NO.0396。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、有免疫原性、毒力較弱且對豬安全；2、能適應于KM2、Friis等無細胞培養(yǎng)基生長；3、本弱毒株對二花臉和其它中國地方品種豬的免疫原性尚未測試，但安全性好，對二元雜交豬免疫保護率達80％以上。
下面對該菌株的培養(yǎng)及鑒定作進一步描述一、無細胞培養(yǎng)KM2培養(yǎng)基組成及制法Eagle’s溶液 1000毫升1.7％乳蛋白水解物溶于Dubeco-Vot’s磷酸緩沖液(即含10克水解乳蛋白)600毫升自制鮮酵母抽出汁 20毫升健康豬血清 400毫升青霉素鉀鹽 40萬單位1％醋酸鉈溶液 25毫升0.4％酚紅水溶液 3.5毫升所有材料低溫下用1N NaOH溶液校正其pH到7.4-7.6，Φ0.1μl minipore濾器過濾去除細菌和支原體后，分裝貯存于4℃冰箱內(nèi)備用。
二、豬肺炎支原體JS99株形態(tài)鑒定方法瑞氏染色法鏡檢涂片、固定、干燥后，瑞氏染色，置顯微鏡下油鏡1600倍，可見分散的大量具有特定多形態(tài)的菌體。
三、豬肺炎支原體JS99株微粒凝集反應試驗鑒定方法1.微粒凝集反應的原理用一定比例的已知抗體血清與待檢培養(yǎng)抗原結(jié)合，會發(fā)生抗原—抗體凝集反應。由于此種支原體形小、凝集團塊肉眼不易察見，經(jīng)涂片染色，在顯微鏡下放大觀察，可清晰地區(qū)別微粒凝集反應與非微粒凝集反應。有凝集反應可判斷培養(yǎng)抗原為豬肺炎支原體。
2.材料準備(1)抗原豬肺炎支原體JS99株純粹培養(yǎng)物接種于江蘇2號培養(yǎng)基(KM2pH7.4)，37℃培養(yǎng)48—72小時，待pH降至6.8左右，并有均勻一致的輕微混濁時，涂片染色鏡檢?？梢姺植季鶆蚨兇獾拇罅烤哂刑囟ㄐ远嘈螒B(tài)菌體，以此培養(yǎng)物作為微粒凝集反應抗原。
(2)J株對照抗原、標準陽性血清及標準陰性血清，由江蘇省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所豬病研究室提供。血清須無菌并在56℃水浴中30分鐘滅能。
(3)江蘇2號(KM2)培養(yǎng)基。
(4)瑞氏(Wright’s)染色液。
3.操作方法(1)用不加陰性豬血清pG7.2的KM2培養(yǎng)基將J株對照抗原、待鑒定培養(yǎng)抗原作10倍稀釋。
(2)取稀釋抗原0.8毫升，加滅活的標準陽性血清及標準陰性血清0.2毫升混合于滅菌小玻瓶中(可用10毫升鏈霉素瓶代替)，用滅菌橡皮塞塞緊，于37℃中培養(yǎng)48小時后涂片。置37℃溫箱內(nèi)干燥后，用甲醇固定干燥后用瑞氏染色液染色，染色時間視氣溫高低而定夏季3—5分鐘，冬、秋季15—20分鐘；用蒸餾水沖洗干凈、干燥后，置顯微鏡下油鏡1000—1600倍以上，觀察記錄照相。
(3)本試驗均應無菌操作。
4.判定結(jié)果在顯微鏡油鏡觀察下，如支原體顯示均勻一致的分布，定為無凝集反應(—)；呈現(xiàn)小部分菌體凝集反應為(+)；大部分菌體凝集反應(++)；全部菌體凝集反應(+++)。J株對照抗原與陽性血清有++凝集反應，與陰性血清無凝集反應。豬肺炎支原體JS99株待鑒定培養(yǎng)抗原與陽性血清有++以上凝集反應。
5.說明(1)本法操作簡便，特異性高，可作為實驗室診斷鑒定的方法。
(2)應用此法鑒定豬支原體菌株，并證明豬肺炎支原體JS99株與J株屬于同一種。
(3)在實驗室與豬鼻支原體、豬滑液支原體、萊氏不需膽甾支原體的高免兔血清作微凝反應，無交叉反應。
四、權(quán)利要求書所述之豬肺炎支原體JS-99株的P46基因鑒定試驗結(jié)果P46基因是編碼Mhp細胞表面46KDa蛋白抗原的基因，該抗原可引起Mhp感染豬早期特異性免疫反應。本報告通過對弱毒MhpJS-99株P(guān)46基因的克隆測序，為MhpJS-99株的鑒定作分子標記。1.材料與方法1.1 Mhp菌株與培養(yǎng)條件 MhpJS-99株培養(yǎng)物培養(yǎng)方法培養(yǎng)基為km2培養(yǎng)基(制備方法略)，種子繼代復壯后，1∶10比例接種，37℃培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)物pH由7.6降到6.8～6.6，并呈均一混濁狀態(tài)，無沉淀。培養(yǎng)物涂片瑞氏染色鏡檢，呈特異多形態(tài)菌體，無雜菌。培養(yǎng)物稀釋作液體培養(yǎng)變色單位(colour change unit ccu)檢測MhpJS-99株濃度為10(7)～10(8)ccu/ml。1.2 PCR引物的設(shè)計 從Internet下載Futo(1996)在GenBank登載的J株(ATCC 25934)P46基因(命名MYC46KDSA，1740bp DNA序列)，該序列187～192為-10序列，222～230為RBS序列，235～1494為編碼P46抗原蛋白的CDS。用Gold key軟件修正各種PCR產(chǎn)物設(shè)計指標，最終在320～1680獲得一對引物，在此區(qū)間內(nèi)模板序列無HindIII、BamHI酶切位點，根據(jù)克隆質(zhì)粒pUC19 polylink酶切位點的要求，在引物5′和3′分別添加了HindIII和Bam HI酶切位點及3個保護性堿基，引物G+C％為53～56，無發(fā)夾和二聚體，其序列為(3′為反向互補)5′GGC AAG CTT CAG GTT GTA GAC AGA CAG，3′ACC GGA TCCGTC ACA TCA GAA AGA GC。1.3 PCR模板的制備MhpJS-99株培養(yǎng)物100ml經(jīng)0.05mol pH7.2 PBS離心、洗滌3次后，沉淀以1ml PBS懸浮。Mhp染色體DNA用Boehringer Manuheim公司的High pure PCRTemplate preparation Kit提純吸取200ul Mhp懸液，加200ul結(jié)合緩沖液(含6M guanidine-HCL，10mM urea，10mM Tris-HCL，20％ Triton X-100(v/v)，pH4.4(25℃))，40ul蛋白酶k溶液(90mg凍干蛋白酶k溶于4.5ml重蒸水，-20℃保存)，立即混勻，72℃溫育10min，再加100μl異丙醇，混合后反應液移入帶兩層玻璃纖維絨(吸附DNA用)的聚丙烯管，8000rpm 1min離心，棄液體。管中再加500μl沖洗液(含20mM NaCl，2mMTris-HCL，80％乙醇(v/v)，25℃pH7.5)，離心棄沖洗液，再重復沖洗后，加200ul預熱到70℃的DNA洗脫緩沖液(10mM Tris，pH8.5，25℃)，8000rpm離心1min，收集Mph染色體DNA洗脫液，Backman毛細管紫外檢測儀測得洗脫DNA濃度為6ng/ul，可作PCR模板用。1.4 PCR擴增 引物由中科院上海植生所合成，每管為1個OD值，5′、3′引物分別含0.00370、0.00384μM DNA。分別加123、5ul、128、2ul滅菌重蒸水溶解，引物濃度均成為30pM/ul。Taq DNA聚合酶及緩沖液為Promega公司產(chǎn)，產(chǎn)品號C0010，濃度5u/ul，10X緩沖液含有500mM kcl，100mM Tris-HCL(pH9.0)，1％ TritonX100，15mM Mgcl2。dNTP，Promega公司產(chǎn)，含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2.5mM/ul。
PCR擴增儀Perkin Elmer DNA Thormel cycler。擴增條件設(shè)置為預變性96℃ 8min；94℃ 1min，45℃ 1min，72℃ 3min，循環(huán)35次；延伸72℃ 10min。
PCR擴增在0.5ml eppendorf管內(nèi)分別加入模板2ul，5′引物2ul，3′引物2ul，10×緩沖液5ul，dNTP4ul，滅菌重蒸水35ul，總體積為50ul。加20ul滅菌石臘油后，96℃變性8min，冷卻確至室溫后，迅速在反應液中加入1ul Taq DNA聚合酶，繼續(xù)進行循環(huán)和延伸反應，擴增產(chǎn)物以1％的瓊脂糖電泳測定。1.5電泳與照相 PCR產(chǎn)物10ul加2ul 6×凝膠加樣緩沖液(0.25％溴酚藍，4％(w/v)蔗糖水溶液，300mM NaoH，6mM/L EDTA)，在1％瓊脂糖凝膠上按《分子克隆》方法電泳。電泳儀為Mupid-2微型DNA電泳儀(Cosmo Bio Co.LTD.生產(chǎn))，按8～10v/cm電泳45min，凝膠在溴化乙錠(0.5ug/ml，pH8.0，1×TAE)中染色30～45min，紫外燈下檢查。凝膠相片拍攝和條帶分析用Kodak Digital Science 1D系統(tǒng)，標準分子量參照系用寶靈曼公司的1kb DNA Ladder。1.6電泳產(chǎn)物回收 PCR產(chǎn)物電泳后，用1％低融點(LMP)瓊脂糖回收(參照《分子克隆》)。LMP瓊脂糖塊加200ul pH8.0 TE于65℃溫育5min，瓊脂糖溶解后加入等量體積的蒸餾酚，混勻，12000rpm 5min離心，小心吸取上清，再等體積加入1∶1(v/v)混合的酚、氯仿溶液，混勻，12000rpm 5min離心，再等體積加入氯仿抽提一次。最后吸出的水相加0.1體積3M/L乙酸鈉和2倍體積4℃的乙醇沉淀DNA，-20℃過夜。12000rpm10min離心，棄上清，4℃ 75％乙醇小心漂洗沉淀，50ul重蒸水溶解，-20℃保存。1.7 P46基因PCR提純產(chǎn)物和PUC19質(zhì)粒DNA HindIII、Bam HI雙酶切和回收 在0.5ml eppendorf管中進行①P46基因雙酶切反應PCR提純產(chǎn)物 32ulBam HI 10u/ul2ulHindIII 10u/ul 2ulBuffer E 10×4ul反應總體積 40ul②質(zhì)粒Puc19雙酶切反應pUC19 0.5ug/ul 10ulBam HI 10u./ul 2ulHindIII 10u./ul 2ulBuffer E 4ul滅菌重蒸水 22ul反應總體積 40ul37.5℃反應45min，產(chǎn)物按1.6方法電泳回收。1.8連接反應Puc19回收液 13ulPCR產(chǎn)物酶切回收液 36ulT4 DNA連接酶1u./ul 5ul10X連接酶緩沖液 6ul反應總體積 60ul16～20℃連接12hr，取出其中的10ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。1.9轉(zhuǎn)化、篩選重組子 按常規(guī)方法制備大腸桿菌JM105株的感受態(tài)細胞，將含60ul新鮮感受態(tài)細胞的eppendorf管置冰水中，加入1.8連接反應產(chǎn)物10ul，冰水中放置30min，再于42℃水浴2min，加入1ml LB，37℃振蕩培養(yǎng)1hr，稍加離心，去上清，約余500ul。吸200ul涂布接種含有氨芐青霉素和已涂布40ul X-gal貯存液(20mg/ml二甲基甲酰胺、4ul異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)溶液(200mg/ml))作選擇性標記的瓊脂培養(yǎng)皿上，靜置10min后，倒置平板37℃培養(yǎng)18小時，挑選白色單菌落，再接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)管，37℃振蕩培養(yǎng)8hr，提取質(zhì)粒。1.10重組子質(zhì)粒的鑒定 提取的重組子質(zhì)粒10ul按1.7中pUC19質(zhì)粒雙酶切反應的方法以Bam HI、HindIII雙酶切，酶切后電泳檢查。1.11克隆基因的測序 中科院上海植生所進行，用酶法熒光分析系統(tǒng)測序，以P46基因5′PCR引物為寡核苷酸引物。2.結(jié)果2.1 MhpJS-99株模板DNA的提取用石英毛細管吸取5～8ul模板DNA提取液，在Backman DU-600 spctrophotometer上測得OD260為0.12，OD280為0.06，OD260/OD280＝2.0，證明核酸純度較高，模板DNA濃度為0.12×50＝6ng/ul。2.2P46基因的PCR擴增 PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果經(jīng)Kodak DigitalScience 1D照相分析，目的基因為1.37kb，與設(shè)計期待長度1377bp相一致，PCR產(chǎn)物濃度為0.025μg/ml。2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切后產(chǎn)生2.6kb、1.4kb兩條帶，酶切結(jié)果表明約1.37kb的P46基因已插入pUC19。2.4克隆基因的部分測序及序列分析測序結(jié)果與J株P(guān)46基因序列及堿基組成比較結(jié)果如下1.MhpJS-99株P(guān)46基因(1-501)與J株基因的部分序列(366-866)比較102030405060GNGGGCCGAGACTCTAAAACATAAAGTAAGTAATGATTCTATTCGAATAGCACTAACCGA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::ACAAGCCGAGACTCTAAAACATAAAGTAAGTAATGATTCTATTCGAATAGCACTAACCGA375 385 395 405 415 425708090 100 110 120TCCGGATAATCCTCGATGAATTAGTGCCCAAAAAGATATTATTTCTTATGTTGATGAAAC::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::TCCGGATAATCCTCGATGAATTAGTGCCCAAAAAGATATTATTTCTTATGTTGATGAAAC435 445 455 465 475 485130 140 150 160 170 180AGAGGCAGCAACTTCAACAATTACAAAAAACCAGGATGCACAAAATAACTGACTCACTCA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::AGAGGCAGCAACTTCAACAATTACAAAAAACCAGGATGCACAAAATAACTGACTCACTCA495 505 515 525 535 545190 200 210 220 230 240GCAAGCTAATTTAAGTCCAGCACCAAAAGGATTTATTATTGCCCCTGAAAATGGAAGTGG::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::GCAAGCTAATTTAAGTCCAGCGCCAAAAGGATTTATTATTGCCCCTGAAAATGGAAGTGG555 565 575 585 595 605250 260 270 280 290 300AGTTGGAACTGCTGTTAATACAATTGCTGATAAAGGAATTCCGATTGTTGCCTATGATCG::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::AGTTGGAACTGCTGTTAATACAATTGCTGATAAAGGAATTCCGATTGTTGCCTATGATCG615 625 635 645 655 665310 320 330 340 350 360ACTAATTACTGGATCTGATAAATATGATTGGTATGTTTCTTTTGATAATGAAAAAGTTGG::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::ACTAATTACTGGATCTGATAAATATGATTGGTATGTTTCTTTTGATAATGAAAAAGTTGG675 685 695 705 715 725370 380 390 400 410 420CGAATTACAAGGTCTTTCACTTGCTGCGGGTCTATTAGGAAAAGAPGATGGTGCTTTTGAT:::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::: :::::::::::::::CGAATTACAAGGTCTTTCACTTGCGGCGGGTCTATTAGGAAAAGAAGATGGTGCTTTTGAT735 745 755 765 775 785430 440 450 460 470 480TCCCTTGATCCACTGAATGAATATCTAAAPTCCCPTATGCCCCAPGAGACAPTTTCTTT:: ::::::::::::::::::::::::: :: : ::::::::: :::::: :::::::TCAATTGATCAAATGAATGAATATCTAAAATCACATATGCCCCAAGAGACAATTTCTTT795 805 815 825 835 845490 500 510TPATACAPTCGCGGGTTCCPAGATGAGC@: ::::: ::::::::::: :::::::TTATACAATCGCGGGTTCCCA855 865 875P堿基缺失。表1.MhpJS-99株P(guān)46基因堿基組成與J株的比較
比較J株和MhpJS-99株P(guān)46基因的部分結(jié)構(gòu)基因的10～490堿基，(J株位于376～857)，在10～385位堿基均相同，僅在202位J株基因由G變?yōu)锳，在385～490之間有14處變異，分別為5個A缺失，5個A變?yōu)镃，1個A變?yōu)門，1個G變?yōu)門，2個T缺失?？傮w上A、T的缺失或變異占87％。比較J株(366-867)和MhpJS-99株P(guān)46基因(1-501)的堿基成分，J株G+C％為36.13，MhpJS-99株為37.72，后者略多。
MhpJS-99株P(guān)46基因的測序，可為MhpJS-99株的鑒定作分子標記。
權(quán)利要求
1.豬肺炎支原體克隆致弱株，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC NO.0396。
全文摘要
本發(fā)明提供一株豬肺炎支原體(Mhp)無細胞培養(yǎng)弱毒株,該株毒力較弱、安全,有較強的免疫原性,可在無細胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)。該株是由氣喘病豬病肺接種于二花臉豬進行人工發(fā)病,并進行豬肺炎支原體病原再分離,鑒定后在江蘇二號無細胞培養(yǎng)基中致弱培養(yǎng)至322代次以上,形成有免疫原性的弱毒菌株。該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號是:CGMCC No.0396。
文檔編號C12N1/20GK1244580SQ9911427
公開日2000年2月16日 申請日期1999年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者邵國青, 金洪效, 毛洪先, 錢建飛, 侯繼波, 何家惠 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所