專利名稱：抑制腐乳生成“白斑”的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抑制腐乳生成“白斑”的方法，確切地說，它是食用豆腐乳良好品質(zhì)的保存方法。
腐乳是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品之一，它是豆腐坯經(jīng)毛霉菌通過前發(fā)酵、腌制和后發(fā)酵而成。目前，我國腐乳生產(chǎn)企業(yè)多存在以下問題①腐乳坯裝瓶后3個月內(nèi)產(chǎn)生較多“白斑”，嚴重影響了腐乳1年貨架銷售期的感官質(zhì)量，有些企業(yè)甚至只生產(chǎn)“紅方”腐乳，用紅曲添加的辦法掩蓋腐乳生成“白斑”的不良感官現(xiàn)象；(②菌株耐熱性差，夏天不能正常生產(chǎn)；③菌株蛋白酶活性較弱，有些工廠腐乳后發(fā)酵時間長達2-3個月，腐乳組織不夠細膩。因此，優(yōu)化腐乳毛霉菌株進行腐乳發(fā)酵，并在腐乳后酵過程抑制與控制腐乳生成“白斑”，將對企業(yè)的腐乳生產(chǎn)，促進銷售，提高經(jīng)濟效益具有積極的意義。
腐乳的“白斑”為腐乳毛霉蛋白酶分解大豆蛋白過程所形成的酪氨酸結(jié)晶。酪氨酸是一種溶解度極低的氨基酸(25度下100克水只能溶解0.045克)，在腐乳后酵過程中，隨著時間延長酶解的繼續(xù)，酪氨酸逐漸增多，最后趨向過飽和結(jié)晶析出。
廣西輕工研究所的雷時奮先生認為腐乳長“白斑”，是腐乳生產(chǎn)中存在的“老、大、難”問題，它不僅影響外觀，還使人懷疑腐乳是否長霉。
經(jīng)檢索可知發(fā)表在《中國釀造》1993(4)第18-24頁，名稱為“腐乳毛霉菌種的選育”一文中介紹由于技術條件的限制，對現(xiàn)有菌種的分離，復壯，篩選及選育工作有一定難度，造成菌種退化、抵抗力差，酶系少，酶活低，腐乳成熟后質(zhì)量不理想，特別是白方腐乳存在“小白點”及色澤“褐變”現(xiàn)象更為明顯。
雖然，有些技術力量較強的企業(yè)采用了菌種選育方法，篩選蛋白酶活力強，但酪氨酸生成量限制的菌株，但從應用上看，菌種使用一段后又有退化現(xiàn)象，且大豆原料也有不穩(wěn)定因素，因而很難根除。而對大部分中小型生產(chǎn)企業(yè)來說，腐乳長“白斑“是腐乳生產(chǎn)的頭號難題。
本發(fā)明目的在菌種上進行優(yōu)化篩選，提高菌種蛋白酶活力和菌種的耐熱性能，從而縮短腐乳后酵時間和擴大腐乳生產(chǎn)季節(jié)。并同時在工藝上進行改進，當腐乳發(fā)酵成熟后用熱鈍化腐乳毛霉的蛋白酶活性，從而根本上解決了腐乳的長“白斑”問題。
本發(fā)明是由下述技術方案來實現(xiàn)的，本發(fā)明的工藝流程為先進行優(yōu)化腐乳毛霉菌株，然后進行后發(fā)酵工藝改進。其優(yōu)化腐乳毛霉菌株過程為腐乳毛霉菌株→制備孢子懸浮液→孢子熱處理→單菌株分離→酪蛋白平板初篩→單菌株蛋白酶活力測定→腐乳毛霉優(yōu)化菌株。
后發(fā)酵工藝腐乳毛霉試管斜面→麩曲三角瓶擴培→制備孢子懸浮液→接種豆腐坯上前發(fā)酵→腌坯→裝瓶(加料液)后發(fā)酵→發(fā)酵成熟→水浴或電熱等方法鈍化酶活性→進倉庫或銷售。
腐乳毛霉斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，單菌株分離培養(yǎng)基是在馬玲薯培養(yǎng)基中加入0.4％酪蛋白及0.1％去氧膽酸鈉。平板初篩培養(yǎng)基酪蛋白0.4％，瓊脂1.5-2％，用PH7.4硼酸緩沖液配制。麩曲培養(yǎng)基25克麩皮，加水130-140％，拌勻分裝三角瓶。培養(yǎng)基滅菌除麩曲培養(yǎng)基采用1kg/cm2滅菌30分鐘外，其他三種培養(yǎng)基均采用1kg/cm2滅菌20分鐘。
其基本過程為(1)制備孢子懸浮液及孢子熱處理將腐乳毛霉菌株移接于馬鈴薯斜而培養(yǎng)基上，30度培養(yǎng)3-4天，加10ml無菌生理鹽水，刮下孢子，倒入裝有20ml無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩使孢子分散后紗布過濾，采用血球計數(shù)器計數(shù)孢子濃度，并控制孢子濃度為106個/ml以上。吸取孢子懸浮液5ml置于試管中，在45度水浴中處理10分鐘后冷卻。該處理可以篩選獲得活力較強的孢子，這對選育腐乳毛霉耐高溫菌株有很大的幫助，若需要，還可以反復操作2-3次。
(2)菌株分離和初篩將熱處理的孢子液稀釋至10-3-10-4，取0.1ml涂布于分離培養(yǎng)基瓊脂平板上，30度培養(yǎng)1-2天，挑取透明圈直徑大的菌株孢子斜面培養(yǎng)，要獲得耐高溫菌株可逐級提高溫度培養(yǎng)馴化，如30度培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接在32度培養(yǎng)，32度培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于34度培養(yǎng)等。通過該操作可選出耐高溫的腐乳毛霉菌株。將生長快，溫度適應力強的腐乳毛霉分離株接種于三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，30度培養(yǎng)4天，提取酶液，用直徑10mm滅菌濾紙，放入毛霉麩曲浸提液(酶液)浸泡1小時，取出涼干后貼在酪蛋白瓊脂平板上，每個菌株液處理4-6個濾紙片，貼在一個平板上，置于40度下保溫6小時測定透明圈直徑，選取透明圈直徑大的菌株進行復篩。分離平板和初篩平板都添加0.1％去氧膽酸鈉，因其可抑制菌絲過分蔓延生長，使單菌株分離成為可能，在平板上挑取透明圈大的菌株斜面培養(yǎng)。
(3)復篩復篩是測定蛋白酶活力，采用福林法。在PH7.0，溫度40度下，以每分鐘酶促反應分解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個蛋白酶活力單位(μg/min)選擇蛋白酶活力高的菌株進行生產(chǎn)。但由于蛋白酶活力測定方法中所需試劑，設備以及測定較為復雜，一般企業(yè)未必都具備條件。因而生產(chǎn)單位也可直接對腐乳毛霉孢子進行熱處理，分離純化，提高溫度馴化培養(yǎng)，反復用酪蛋白平板初篩，選擇較耐高溫，生長速度快，菌絲白而致密，透明圈較大的菌株進行生產(chǎn)，該操作簡易，易于掌握，生產(chǎn)單位只要定期對腐乳毛霉生產(chǎn)菌進行分離復選，一定能提高腐乳生產(chǎn)的質(zhì)量和縮短發(fā)酵周期。
后發(fā)酵工藝改進為腐乳毛霉試管菌株→麩曲三角瓶擴培→制備孢子懸浮液→接種豆腐坯上前發(fā)酵→腌坯→裝瓶(加料液)后發(fā)酵→發(fā)酵成熟→水浴或電熱等鈍化酶活性→進倉庫或銷售。
本發(fā)明選育耐高溫和蛋白酶活力強的腐乳毛霉菌株進行腐乳發(fā)酵，按常規(guī)菌種擴培制備孢子懸浮液，接種豆腐坯前發(fā)酵，鹽腌，裝瓶添加料液后發(fā)酵，在腐乳后發(fā)酵成熟后(腐乳組織塊柔軟風味鮮美)，采用蒸汽熱，電熱或水浴熱等方法來鈍化腐乳毛霉蛋白酶活性，使腐乳由常規(guī)下腐乳坯裝瓶后3個月產(chǎn)生“白斑”延遲到一年甚至更長時間都不長“白斑”，并且色、香、味等感官良好，從而在根本上解決了腐乳長“白斑”的“老、大、難”問題。
至于熱對腐乳毛霉蛋白酶活力影響測定，可以幫助選擇加熱處理的條件，本發(fā)明采用優(yōu)化腐乳毛霉菌株，通過麩曲培養(yǎng)浸提酶液后，對酶液分別用50度，55度，60度，70度溫度下處理不同時間，測定其中性蛋白酶活力，結(jié)果如表1所示。
從上表看出，溫度對蛋白酶活力有重要的影響。有了這些實驗數(shù)據(jù)，可以根據(jù)實際情況，選擇合適的溫度與加熱時間對腐乳發(fā)酵成熟的產(chǎn)品進行熱處理，以鈍化一部分或相當一部分酶的活力，使腐乳在較長的銷售與貯藏過程中減少酪氨酸的生成量，從而有效控制了腐乳產(chǎn)品的酪氨酸結(jié)晶問題。同時，可以發(fā)現(xiàn)，腐乳發(fā)酵初步成熟或完全成熟后的短期時間里是沒有“白斑”的，只有當放置2-3個月后才產(chǎn)生白斑。因此，選擇發(fā)酵成熟后進行熱處理，并控制酶失活率在60％-80％范圍，使得余酶繼續(xù)保持腐乳的后繼發(fā)酵。該考慮是有益于腐乳產(chǎn)品的口感與質(zhì)量的。腐乳裝瓶后包裝入箱發(fā)酵，當成熟后再延至一些時間，可在室內(nèi)(密封)安裝電熱管升溫加熱，該辦法實施較為簡便，對每瓶腐乳成品來說，成本提高甚微，(也可以用蒸汽熱等其他方法)雖然加熱工藝也給生產(chǎn)帶來多一道工序，但從產(chǎn)品質(zhì)量和工廠效益看，增加該工序是很有必要的。
以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
孢子熱處理時懸浮液中孢子含量106個/ml以上，將孢子菌懸液置于45度水浴中處理10分鐘，可以篩選活力較強的孢子，這對選育腐乳毛霉耐高溫菌株有很大的幫助，若需要，該操作還可以反復操作2-3次，具體做法是一次熱處理后平板培養(yǎng)，制備孢子懸浮液二次熱處理。篩選耐高溫菌株還可以在培養(yǎng)過程逐步提高溫度馴化培養(yǎng)。
篩選腐乳毛霉蛋白酶活力強且生長速度快的菌株，在分離腐乳毛霉單菌落和初篩時，都在培養(yǎng)基中添加0.4％酪蛋白和0.1％去氧膽酸鈉制成平板，并在菌落形成，菌絲過分蔓延生長時，挑取透明圈大的單菌落斜面培養(yǎng)，分離平板添加去氧膽酸鈉對毛霉菌絲的過分蔓延生長有抑制作用，而在平板中加入酪蛋白，可以初步檢測其不同菌株的蛋白酶活力。
使用優(yōu)化菌株生產(chǎn)腐乳，一般腌坯裝瓶20～30天后發(fā)酵便成熟了。但為了使腐乳的鮮美風味更好，可將后發(fā)酵期延至一個月，而后將瓶裝腐乳置于70～80度水浴處理1小時，或用60度以上熱空氣蒸汽熱等方法處理半天至一天，該處理可使腐乳毛霉蛋白酶活力失活，其失活程度受處理溫度、時間及介質(zhì)傳熱等因素影響，一般腐乳成熟后以鈍化60-80％酶活為準，腐乳后發(fā)酵成熟后，用熱方法鈍化腐乳毛霉蛋白酶活力，所采用的溫度要使腐乳受熱的溫度達到50度以上，若溫度在35-45度時會加速蛋白酶活性，從而生成更多的腐乳“白斑”。
實施例(1)制備孢子懸浮液將腐乳毛霉菌株移接于馬玲薯斜面培養(yǎng)基，30度培養(yǎng)3天，在一支斜面中加入10ml無菌生理鹽水，刮下孢子，倒入裝有無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中振蕩，后用四層滅菌紗布過濾，收集得濾液并控制孢子為5.6×106個/ml。
(2)孢子熱處理和較耐高溫腐乳毛霉菌株的分離吸取孢子懸浮液5ml置于15×15mm的無菌試管中，置于45度水浴中處理10分鐘，即時冷卻，稀釋至10-3，取10-2，10-3稀釋管0.1ml涂在分離平板上，30度培養(yǎng)1天后，挑取11株菌絲生長較快而密集的單菌落斜面培養(yǎng)，生長后轉(zhuǎn)移斜面，逐步提高溫度馴化培養(yǎng)篩選獲得在34度下還生長良好的菌種5株，比原菌株最高生長良好的溫度提高了約10％。
(3)酪蛋白平板初篩將5株單菌株連同原菌株分別接于三角瓶麩曲皮培養(yǎng)基中，30度培養(yǎng)4天，每個三角瓶加入100ml無菌水，搗碎培養(yǎng)物，在40度水浴中浸提1小時，后用濾紙過濾收集濾液，用10mm滅菌濾紙片浸泡麩曲浸提液1小時，取出濾片紙涼干，分別貼在酪蛋白平板上，每個樣液重復4-6次，每個平板貼4-6塊濾紙片，置40度下保溫6小時，后測定透明圈直徑，選取3株透明圈大的菌株進行蛋白酶活力測定。
(4)菌種復篩在單菌株蛋白酶活力測定中，3株透明圈大的菌株連同原菌株進行三角瓶麩皮培養(yǎng)，后同上法提取酶液，采用福林法測定中性蛋白酶，酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活力，篩選得1株中性蛋白酶，酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活力分別高于原菌株19.2％，30.8％和15％的腐乳毛酶優(yōu)化菌株。
(5)腐乳發(fā)酵將優(yōu)化的腐乳毛霉菌種接種于三角瓶麩皮培養(yǎng)基中30度培養(yǎng)2天，每瓶加入冷開水500ml浸泡半小時，振蕩均勻后用無菌紗布過濾得到孢子接種液。大豆按常規(guī)法制備豆腐坯，并控制含水量為68-70％，切割后將孢子液噴霧于豆塊上，室溫下(26-30度)培養(yǎng)30小時，后用18波美度鹽水腌坯24小時或直接用鹽腌2-7天，取出后裝瓶并加料液密封，室溫下后發(fā)酵至一個月成熟。
(6)鈍化腐乳毛霉蛋白酶活力①將發(fā)酵成熟的腐乳20瓶(每瓶400克)置于80度水浴中加熱1小時，后自然冷卻貯存，結(jié)果是腐乳已貯存近2年都不長“白斑”，從感官上看，組織塊完整，淡黃色，口感好，風味美。
②將發(fā)酵成熟的腐乳40瓶(每瓶400克)置于培養(yǎng)箱中，用55-60度熱空氣處理1天，后自然冷卻貯存，結(jié)果也同水浴法，長期保存，腐乳的品質(zhì)良好。
③將發(fā)酵成熟的瓶裝腐乳置于密閉貯藏間里，用電熱管加熱升溫至55--60度處理1天，腐乳保藏1年都未長白斑。
從上述可知用熱的方法在腐乳發(fā)酵成熟后將腐乳蛋白酶活性鈍化或使其相當部分酶失活，是保證腐乳長期不長“白斑”，保證腐乳良好品質(zhì)的有效措施。從實際結(jié)果而言，該方法遏制了腐乳“白斑”形成，又不影響腐乳的組織，顏色和風味，而成熟腐乳未采取熱處理的樣品在3-4個月貯藏期內(nèi)生成“白斑”，至半年“白斑”已長得密密麻麻，感官極不好。該方法從生產(chǎn)應用看，要考慮到介質(zhì)的傳熱，熱分布均勻性等因素制定加熱條件。采用熱鈍化發(fā)酵成熟的腐乳毛霉蛋白酶活，要使腐乳的溫度達到50度以上，若溫度太低，不能起到鈍化酶活，抑制“白斑”生成的作用。
權利要求
1.抑制腐乳生成“白斑”的方法，包括優(yōu)化腐乳毛霉菌株、后發(fā)酵工藝兩步驟，其特征在于(1)優(yōu)化腐乳毛霉菌株的方法腐乳毛霉菌株→制備孢子懸浮液→孢子熱處理→單菌株分離→酪蛋白平板初篩→單菌株蛋白酶活力測定→腐乳毛霉優(yōu)化菌株。(2)后發(fā)酵工藝腐乳毛霉試管斜面→麩曲三角瓶擴培→制備孢子懸浮液→接種豆腐坯上前發(fā)酵→腌坯→裝瓶(加料液)后發(fā)酵→發(fā)酵成熟→水浴或電熱鈍化酶活性→進倉庫或銷售。
2.根據(jù)權利要求1的抑制腐乳生成“白斑”的方法，孢子熱處理時懸浮液中孢子含量106個/ml以上，將孢子菌懸液置于45度水浴中處理10分鐘，篩選活力較強的孢子。
3.根據(jù)權利要求1的抑制腐乳生成“白斑”的方法，篩選腐乳毛霉蛋白酶活力強且生長速度快的菌株，在分離腐乳毛霉單菌落和初篩時，都在培養(yǎng)基中添加0.4％酪蛋白和0.1％去氧膽酸鈉制成平板，并在菌落形成，菌絲過分蔓延生長時，挑取透明圈大的單菌落斜面培養(yǎng)，平板添加去氧膽酸鈉對毛霉菌絲的過分蔓延生長有抑制作用，而在平板中加入酪蛋白，初步檢測其不同菌株的蛋白酶活力。
4.根據(jù)權利要求1的抑制腐乳生成“白斑”的方法，使用優(yōu)化菌株生產(chǎn)腐乳，腌坯裝瓶20-30天后發(fā)酵便成熟了，而后將包瓶裝腐乳置于70～80度水浴處理1小時，或用60度以上熱空氣等方法處理半天至一天，該處理可使腐乳毛霉蛋白酶活力失活，其失活程度受處理溫度、時間及介質(zhì)傳熱等因素影響，一般腐乳成熟后以鈍化60-80％酶活為準，腐乳后發(fā)酵成熟后，用熱方法鈍化腐乳毛霉蛋白酶活力，所采用的溫度要使腐乳受熱的溫度達到50度以上，若溫度在35-45度時會加速蛋白酶活性，從而生成更多的腐乳“白斑”。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制腐乳生成“白斑”的方法,其優(yōu)化腐乳毛霉菌株為腐乳毛霉菌株→制備孢子懸浮液→孢子熱處理→單菌株分離→酪蛋白平板初篩→單菌落菌株進行蛋白酶活力測定→腐乳毛霉優(yōu)化菌株。后發(fā)酵工藝改進為腐乳毛霉試管菌株→麩曲三角瓶擴培→制備孢子懸浮液→接種豆腐坯上前發(fā)酵→腌坯→裝瓶(加料液)后發(fā)酵→發(fā)酵成熟→水浴或電熱等方法鈍化酶活性→進倉庫或銷售。本發(fā)明使腐乳由常規(guī)下腐乳坯裝瓶后3個月產(chǎn)生“白斑”延遲到一年甚至更長時間都不長“白斑”。
文檔編號A23L1/20GK1254519SQ9911452
公開日2000年5月31日 申請日期1999年10月30日 優(yōu)先權日1999年10月30日
發(fā)明者邱宏端, 郭養(yǎng)浩 申請人:福州大學