專利名稱：幾丁質(zhì)酶和抗菌肽基因雙價(jià)抗病載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種幾丁質(zhì)酶和抗菌肽基因雙價(jià)抗病載體pChima。
作物病蟲害是影響作物產(chǎn)量的主要因素之一，一般可使作物減產(chǎn)20-30％。作物病害主要有細(xì)菌、真菌和病毒性病害，其中所有的高等植物都受多種真菌的侵害。傳統(tǒng)的病害防治方法主要有1、通過有性雜交育種，選用作物本身的抗性基因選育抗病品種。但存在可利用的抗性品種資源少、選育時(shí)間長、抗病品種易出現(xiàn)抗性喪失等現(xiàn)象；2、施用化學(xué)殺菌劑。施用藥劑污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡；3、采用栽培技術(shù)措施等。近年來隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，外源基因轉(zhuǎn)化已開始在作物遺傳育種中得到廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外科學(xué)家利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在作物抗病育種方面做了大量的工作，并獲得了一些轉(zhuǎn)基因抗病植株。到目前為止的現(xiàn)有技術(shù)中，主要有植物保衛(wèi)基因和抗菌肽基因。幾丁質(zhì)酶是一種以幾丁質(zhì)——β-1，4-N-乙酰葡萄糖胺線性同聚物為底物的水解酶，幾丁質(zhì)酶具有降解病原真菌細(xì)胞壁的作用，從而對(duì)病原菌的侵染和擴(kuò)展具有抑制作用。通過把幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入水稻、煙草、番茄、油菜等植物的研究說明了其抗病性得到了提高。陽離子抗菌肽是80年代初發(fā)現(xiàn)的對(duì)細(xì)菌和部分真菌具有廣譜抗性的一類短肽，具有很強(qiáng)的殺菌效果，致死濃度低0.25-4μg/ml。陽離子抗菌肽的作用機(jī)理是通過抗菌肽兩性分子的α螺旋或β折疊，改變靶細(xì)胞膜的通透性，使靶細(xì)胞因內(nèi)容物泄露而死亡。但是在上述的轉(zhuǎn)基因植株中，都只是單一的轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因或者是轉(zhuǎn)抗菌肽基因或是其它抗性基因，幾丁質(zhì)酶主要是分解植物的細(xì)胞壁，抗菌肽主要破壞細(xì)胞質(zhì)，兩者各自的作用單一，因而存在抗性不高、抗菌譜窄等缺陷。
本發(fā)明的目的在于提供一種把抗真菌的幾丁質(zhì)酶基因(Chi)與抗細(xì)菌和部分真菌的抗菌肽基因(CEMA)容納在同一個(gè)植物表達(dá)載體上，讓其同時(shí)表達(dá)、協(xié)同作用，同時(shí)破壞病菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)以提高轉(zhuǎn)基因植物抗性和廣譜性的轉(zhuǎn)基因雙價(jià)載體。
本發(fā)明的具體內(nèi)容為如

圖1所示的雙價(jià)載體，該載體由NoS啟動(dòng)子NoSpro、新酶素基因NPT II、NoS終止子NoSter、增強(qiáng)子序列EH、35S啟動(dòng)子CaMV35Spro、抗菌肽基因CEMA、NoS終止子NoSter、35S啟動(dòng)子CaMV35Spro、苦瓜幾丁質(zhì)酶基因Chi和NoS終止子NoSter依次連接而成，幾丁質(zhì)酶基因Chi和抗菌肽基因CEMA位于同一載體上。該載體依次通過以下步驟得到圖1為本發(fā)明示意圖1、苦瓜幾丁質(zhì)酶的克隆提取苦瓜的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并利用λgt11做載體，構(gòu)建其cDNA文庫。用來源于玉米的幾丁質(zhì)酶基因作探針，從所構(gòu)建的cDNA文庫中篩選陽性克隆，測(cè)序后得到苦瓜的幾丁質(zhì)酶基因，共1103bp。將得到的苦瓜幾丁質(zhì)酶基因做亞克隆，克隆到質(zhì)粒載體pBluescript IIKS+的Ksp I位點(diǎn)間，命名為pKS-Chi。
2、苦瓜幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)載體pBChi的構(gòu)建pKS-Chi經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I消化后，回收1Kb的片段。將pBI121用Xba I和Sac I消化后，回收其中的11.2Kb的載體片段。然后用連接酶將兩個(gè)片段連接在一起，就得到苦瓜幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)載體pBChi。其中苦瓜幾丁質(zhì)酶基因處于CaMV35S啟動(dòng)子和NoS終止子的控制之下。
3、pChima雙價(jià)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒pSUPC4用HindIII和EcoR I消化，回收其中的小片段。再將苦瓜幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)載體pBChi用限制性內(nèi)切酶HindIII消化，然后加入回收的小片段和一個(gè)接頭
用連接酶連接后就得到了此雙價(jià)載體pBChi。
步驟3中質(zhì)粒pSUPC4為抗菌肽CEMA基因，是現(xiàn)有技術(shù)，來源于天蠶素基因(Cecropin A)和蜂毒素基因(Mellitin)的部分序列，共28個(gè)氨基酸。CEMA基因位于含有一個(gè)增強(qiáng)序列的CaMV 35S啟動(dòng)子和NoS終止子之間，并受它們的控制。
圖1為pChima雙價(jià)載體的圖譜，其中各符號(hào)的意思如下LBT-DNA區(qū)左邊界 CaMV35Spro35S啟動(dòng)子RBT-DNA區(qū)右邊界 CEMA抗菌肽基因NoSproNoS啟動(dòng)子 Chi苦瓜幾丁質(zhì)酶基因NPTII新酶素基因 HindIII、EcoR I限制性NoSterNoS終止子 內(nèi)切酶EH增強(qiáng)子序列本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，由于把抗真菌的幾丁質(zhì)酶基因(Chi)與抗細(xì)菌和部分真菌的抗菌肽基因(CEMA)共同容納在同一個(gè)植物表達(dá)載體上，pChima雙價(jià)載體可使寄主植物同時(shí)產(chǎn)生幾丁酶和抗菌肽，幾丁酶分解真菌細(xì)胞壁，使真菌細(xì)胞膜暴露于陽離子抗菌肽的作用之下，兩者協(xié)同作用，破壞病菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，因而大大提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗性和廣譜性。該載體既可用于水稻、小麥、玉米、甘蔗等單子葉作物，也可用于棉花、油菜、大豆、花生等雙子葉作物，還可用于蔬菜、園藝、林業(yè)等方面。
實(shí)施例1、提取苦瓜的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并利用λgt11做載體，構(gòu)建其cDNA文庫。用來源于玉米的幾丁質(zhì)酶基因作探針，從所構(gòu)建的cDNA文庫中篩選陽性克隆，測(cè)序后得到苦瓜的幾丁質(zhì)酶基因，共1103bp。將得到的苦瓜幾丁質(zhì)酶基因做亞克隆，克隆到質(zhì)粒載體pBluescript II KS+的Ksp1位點(diǎn)間，命名為pKS-Chi。
2、pKS-Chi經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I消化后，回收1Kb的片段。將pBI121用Xba I和Sac I消化后，回收其中的11.2Kb的載體片段。然后用連接酶將兩個(gè)片段連接在一起，就得到苦瓜幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)載體pBChi。其中苦瓜幾丁質(zhì)酶基因處于CaMV35S啟動(dòng)子和NoS終止子的控制之下。
3、將抗菌肽CEMA基因質(zhì)粒pSUPC4用HindIII和EcoRI消化，回收其中的小片段。再將苦瓜幾丁酶基因的表達(dá)載體pBChi用限制性內(nèi)切酶HindIII消化，然后加入回收的小片段和一個(gè)接頭
用連接酶連接后就得到了此雙價(jià)載體pBChi。
權(quán)利要求
1.一種幾丁質(zhì)酶和抗菌肽基因雙價(jià)抗病載體pChima，由NoS啟動(dòng)子NoSpro、新酶素基因NPT II、NoS終止子NoSter、增強(qiáng)子序列EH、35S啟動(dòng)子CaMV35Spro、抗菌肽基因CEMA、NoS終止子NoSter、35S啟動(dòng)子CaMV35Spro、苦瓜幾丁質(zhì)酶基因Chi和NoS終止子NoSter依次連接而成，其特征在于幾丁質(zhì)酶基因Chi和抗菌肽基因CEMA位于同一載體上。
全文摘要
一種幾丁質(zhì)酶和抗菌肽基因雙價(jià)抗病載體pChima,由于把抗真菌的幾丁質(zhì)酶基因(Chi)與抗細(xì)菌和部分真菌的抗菌肽基因(CEMA)共同容納在同一個(gè)植物表達(dá)載體上、讓其同時(shí)表達(dá),幾丁酶分解真菌細(xì)胞壁,使真菌細(xì)胞膜暴露于陽離子抗菌肽的作用之下,兩者協(xié)同作用,破壞病菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì),因而大大提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗性和廣譜性。該載體既可用于水稻、小麥、玉米、甘蔗等單子葉作物,也可用于棉花、油菜、大豆、花生等雙子葉作物,還可用于蔬菜、園藝、林業(yè)等方面。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1246539SQ9911924
公開日2000年3月8日 申請(qǐng)日期1999年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者裴炎, 周國慶, 候磊, 羅小英, 楊光偉, 楊星勇, 李德謀, 肖月華, 李名揚(yáng) 申請(qǐng)人:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)