專利名稱：一種培養(yǎng)葛仙米的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種培養(yǎng)葛仙米的方法。
念珠藻是藍(lán)藻門孢子植物，是一個絲狀藻類“屬”，其原植體由許多直徑數(shù)微米的纖細(xì)藻絲集結(jié)成群體，群體形狀因“種”而異，如發(fā)菜(Nostocflageliforme Kuetz)、地木耳(Nostoc commune)、葛仙米(Nostocsphaeroides)在新鮮狀態(tài)下分別呈頭發(fā)狀、木耳狀或小球(珠)狀，干燥后程度不等地有所縮變。由于藍(lán)藻是原核生物，也被歸類為細(xì)菌。中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB-collection，CAS)、法國、美國、日本、德國等地方都收藏有不少念珠藻藻種。念珠藻不僅在自然界普遍發(fā)生，而且自古以來是許多民族的天然食品。葛仙米、發(fā)菜和地木耳等三種念珠藻都是我國一些地區(qū)人民的傳統(tǒng)食物，其中，葛仙米因其豐富的營養(yǎng)價值，在《本草綱目》、《本草綱目補遺》、《野菜博錄》、《陜西中草藥》及《梧州府志》等古籍中已有詳細(xì)記載。葛仙米具有食療、保健、滋補等功效，天然采集品目前市售價高達(dá)每公斤人民幣1600元。發(fā)菜遠(yuǎn)銷海內(nèi)外，資源開發(fā)與草場保護已發(fā)生尖銳矛盾。葛仙米的學(xué)名為球形念珠藻?！案鹣擅住笔瞧湓谥袊磦鹘y(tǒng)稱謂的名稱。相傳晉朝的煉丹家、藥學(xué)家葛洪，在任官期間遭貶謫途經(jīng)鄂西北某鎮(zhèn)時一病不起。因為其時民不聊生，幾無充饑之食，幸虧當(dāng)?shù)氐牡咎铩⑸降刂挟a(chǎn)一種類似木耳的食物，人們以此充饑。葛洪因此度過難關(guān)，并醫(yī)好了自己的病。葛洪發(fā)現(xiàn)，這種食物對恢復(fù)體力、調(diào)氣、養(yǎng)顏、治療一些病癥十分有益。他將這種食物作為藥物為他人治病，而且，當(dāng)他后來被朝廷如回得到重新啟用時，將這種食物饋贈給娘娘治好了夜盲癥，人們因此把這種原稱為田木耳的東西改稱作葛仙米。葛仙米的天然生產(chǎn)狀況已經(jīng)衰落，需求和采集式生產(chǎn)的矛盾不可回避。隨著人類活動加劇，近年來，葛仙米的生長地逐漸縮小，產(chǎn)量也不斷減少。其天然年產(chǎn)量不足五噸，而且日趨減少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了需求，隨著近年來的旅游資源開發(fā)，過度的采集又帶來了生態(tài)、環(huán)境破壞和自然資源萎縮。過去許多葛仙米的高產(chǎn)田如今已難覓葛仙米的“仙蹤”。這與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)大量使用的人工合成的化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，與全球氣候變化、環(huán)境狀況改變也不無關(guān)系。葛仙米產(chǎn)區(qū)有很大的局限性，在全球范圍雖然不少地方可能發(fā)現(xiàn)其分布，但實際只在有限的地區(qū)能形成群落，甚至在一個區(qū)域內(nèi)，其分布也呈現(xiàn)出特異的選擇性，或一水之隔，或隔山相望，或處山之陽陰，都有可能構(gòu)成葛仙米能或不能生長的差別。這種特異性說明在天然條件下，葛仙米的生長對自然條件的選擇極為嚴(yán)格。葛仙米要求的生長條件是多種多樣的，如礦質(zhì)營養(yǎng)，溫度，光照，水的酸堿度，以及有無有害氣體、農(nóng)藥、自然天敵等。全球氣候變暖，環(huán)境變化和污染已不是短期內(nèi)憑一部分人的意志可以改變的，欲求糧食的豐收，農(nóng)藥與化肥的使用也不可避免。于是矛盾就出來了，一方面是葛仙米產(chǎn)量下降，而人們的需求上升；另一方面是產(chǎn)地減少。但至今見到葛仙米人工培養(yǎng)的報道。
本發(fā)明的目的是提供了一種培養(yǎng)葛仙米的方法，方法易行，操作方便，解決了葛仙米生長快，產(chǎn)量高、營養(yǎng)好的問題。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施進行葛仙米的養(yǎng)殖，首先是培養(yǎng)液的制配，培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽利用市售粗鹽，溶于自來水即可，營養(yǎng)液采用BG110培養(yǎng)基配方，利于葛仙米生長，配制時營養(yǎng)鹽按順序加入，減少沉淀的產(chǎn)生，然后將配制好的培養(yǎng)液進行滅菌。其次是藻種制備A、原種，野外采集藻種，實驗室分離純化，得到不同品系的無雜藻、無菌、易培養(yǎng)、產(chǎn)量高、成色好的藻株；B、段殖體(藻殖段)培養(yǎng)，利用培養(yǎng)得來的球形體，在實驗室進行藻殖段大量誘導(dǎo)，然后以藻殖段為種子，進行大量培養(yǎng)；C、擴大制種，將原種的球形體破碎或誘導(dǎo)的藻殖段擴大培養(yǎng)，獲得的微型群體作為規(guī)模培養(yǎng)的接種物。3、培養(yǎng)，在進行靜置規(guī)模化培養(yǎng)葛仙米時，可采取逐級培養(yǎng)，因為一次培養(yǎng)的周期為9-11天，由微小群體培養(yǎng)在10天內(nèi)很難達(dá)到理想的大小(直徑約0．5cm)。這就要求不斷地轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物至另一培養(yǎng)器或更換培養(yǎng)液，逐級增大球形群體的體積。4、培養(yǎng)實時監(jiān)控，建立監(jiān)控條件和標(biāo)準(zhǔn)。需要的設(shè)備儀器溫度計，光度計，酸堿指示計，顯微鏡(帶熒光)，微機等，以及常規(guī)的實驗室設(shè)備和技術(shù)支持。將所有資料建立數(shù)據(jù)庫，微機管理。5、球形體篩選收獲，比起其它的微藻米，葛仙米的收獲要容易的多。它得大群體肉眼可見，不具漂浮性，這就容易通過過濾的方法來收集。6、提高篩上球形體的機械強度，生長快的球形體往往機械強度低，在干燥后不能很好的保持較美觀的形狀，在食用前重吸水后也不能恢復(fù)原形。所以在收獲前提高球形體的機械強芳就顯得尤為重要。7、收獲與干燥，將提高了機械強度的藻體曬干、風(fēng)干或烘干均可。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果設(shè)備簡單，操作方便，無污染，營養(yǎng)好，安全性高，葛仙米培養(yǎng)的過程中吸收二氧化碳，并向大氣中排放出氧氣，可起到凈化空氣的作用，不產(chǎn)生有害或有毒物質(zhì)，培養(yǎng)液鹽度低，酸堿度接近于自然水體，可循環(huán)利用。生長過程短，葛仙米生長快，10天就可完成對數(shù)生長，效率高，適量接種的培養(yǎng)物，10天后干物質(zhì)量可達(dá)1g／L每立方米培養(yǎng)液可收獲1kg干藻，可用于球狀體所有水生念珠藻的培養(yǎng)，廣泛適用于城鄉(xiāng)規(guī)模化培養(yǎng)。
實施例培養(yǎng)葛仙米的方法其步驟如下1、培養(yǎng)液配制(1000ml)將稱好或配制好的貯藏液加入水的順序是硫酸鎂0．07-0．08g、氯化鈣0．03-0．042g、檸檬酸0．005-0．007g、檸檬鐵銨0．005-0．007g、乙二酸四乙酸二鈉鹽0．001-0．002g、碳酸鈉0．03-0．05g、土壤浸出液2．5-3．5ml、微量元素A51ml、磷酸氫二鉀0．07-0．09g，配制好的培養(yǎng)液用118-122℃高溫條件下滅菌20分鐘，冷卻后使用。
2、藻種制備(1)原種將野外采集的葛仙米球形體用70％的乙醇溶液快速洗滌20秒鐘，然后在滅過菌的培養(yǎng)液中洗滌3遍。將此球形體放在玻璃漿器中，加入少量無菌培養(yǎng)液，稍許勻漿。制備無菌培養(yǎng)液的1．2％的瓊脂平板，將上述球形體的勻漿液涂布在瓊脂平板上，用封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于26-36℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約1個月后，就可看到有小的球形體生長在瓊脂平面上，這就是葛仙米藻種。
(2)藻種的無菌純化將上述方法得到的球形體勻漿破碎，接入含有0．5％蔗糖，100ug／l氨芐青霉素，0．1％酵母提取物的培養(yǎng)液中，置黑暗條件下，30-35℃培養(yǎng)24小時。然后離心，無菌培養(yǎng)液洗滌3次，將藻體同(1)涂平板培養(yǎng)，獲得球形體。即為無菌培養(yǎng)物(可顯微檢測是否有菌)。
(3)藻殖段制種將上述分離的藻種接種于培養(yǎng)液，在玻璃培養(yǎng)器中通氣培養(yǎng)。通氣量為1-10L／分鐘。約10天后，收集直徑約3-10mm的球形體用無菌的蒸餾水洗滌一次，然后重新放到新鮮無菌培養(yǎng)液中，置于光照培養(yǎng)箱，在25-30℃，5-100μE．m-2．s-1光強下誘導(dǎo)2-3天。將懸浮在培養(yǎng)液中的藻殖段轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液中靜止或通氣培養(yǎng)，制備藻種。
(4)擴大制種將球形體勻漿，接入培養(yǎng)液，按照(1)培養(yǎng)條件，通氣培養(yǎng)，制備藻種。
3、制備藻種得到較大的理想的球形體的關(guān)鍵(即逐級培養(yǎng))是球形體的逐級培養(yǎng)。因此培養(yǎng)物制備可以分為4步(1)原種制備(見1)；(2)將原種破碎物或藻殖段接入培養(yǎng)液，在玻璃培養(yǎng)器中以1-10L／分鐘的速度通氣培養(yǎng)，并施以光照，強度在10-800μE．m-2．s-1之間。10-30天后，收集小球形體，無菌培養(yǎng)液洗滌3次。此球形體稱一級培養(yǎng)物。(3)將一級培養(yǎng)物按步驟(2)再培養(yǎng)一次，10-30天后，球形體長大到約直徑1mm，稱此球形體為二級培養(yǎng)物，洗滌后的二級培養(yǎng)物就可作為大量培養(yǎng)的接種物。
4、培養(yǎng)(1)培養(yǎng)場地與培養(yǎng)器(光生物反應(yīng)器，photobioreactor)選擇采光好、水源方便的地方作為培養(yǎng)場地?？稍诼短旎蛩芰洗笈镏?，或有條件的地方在玻璃溫室安置光生物反應(yīng)器。光強在10μE．m-2．s-1和全日照光強之間均可。光生物反應(yīng)器有一個進樣口(加培養(yǎng)液和接種，在反應(yīng)器上部)一個排液口(排放培養(yǎng)液，在反應(yīng)器底部)，一個通氣口(在反應(yīng)器底部)，并配備一個孔徑約0．5cm的不銹鋼篩，用來篩選合格的球形體。
(2)接種與培養(yǎng)將二級培養(yǎng)物作為接種物，以每升培養(yǎng)液0．5-2g濕重的比例接種于光生物反應(yīng)器。用空氣充氣泵通氣(通氣起到攪動和提供CO2的作用)以1-10L／min的速度從通氣口通氣。為了見少氣體對培養(yǎng)物的污染，地進入反應(yīng)器之前，將氣體以棉花和PH值為1-3的濃硫酸水溶液過濾。通氣量由閥門控制。
5、實時監(jiān)控建立的監(jiān)控條件和標(biāo)準(zhǔn)。溫度10-30℃；光強10-800μE．m-2．s-1pH8．0-8．9；其它微生物如細(xì)菌，真菌和雜藻檢測(1)涂平板法將培養(yǎng)液涂布在細(xì)菌培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基上，37℃溫培24小時以上后，觀察是否由菌落出現(xiàn)；(2)顯微觀察取少量培養(yǎng)液，加入DAPI(一種熒光染料)至終濃度1μg／ml染色5分鐘，在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)觀察。若發(fā)現(xiàn)有藍(lán)綠運動亮點，即為污染微生物。(3)顯微鏡下直接觀察是否有雜藻存在。營養(yǎng)鹽濃度檢測方法參看美國出版的Standard Methods for Water and Waste Water一書。
若檢測的值不在上述范圍內(nèi)，則需通過相應(yīng)的措施解決。如溫度可通過調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度控制；避開嚴(yán)寒和酷暑季節(jié)；光強度光強低的晚上或陰天可開動照明設(shè)備，光強過高時采取遮光方法。pH通過酸或堿調(diào)節(jié)。微生物污染嚴(yán)重時則需徹底更換培養(yǎng)液，并對反應(yīng)器進行滅菌處理。營養(yǎng)不足時則注入新鮮培養(yǎng)液或添加營養(yǎng)鹽等等。
6、篩選收獲首先制得孔略小于0．5cm的不銹鋼篩子，將欲收獲培養(yǎng)物過篩。直徑0．5cm左右的球形體留在篩子上，這些就是我們所要獲得的產(chǎn)品(稱為篩上球形體)。篩下來的小群體和培養(yǎng)液在處理后繼續(xù)培養(yǎng)。
7、提高篩上球形體的機械強度將過篩后直徑大于0．5cm的球形體通過下面任一途徑提高機械強度。
(1)在培養(yǎng)液中加入1．5g／L的Na2CO3，將球形體轉(zhuǎn)移到這種含有新鮮培養(yǎng)液中，以培養(yǎng)時的同樣條件通氣培養(yǎng)3-5天，收獲即可。
(2)將合格的球形體靜置于原培養(yǎng)液中，于低溫下(1-10℃)靜置10-15。并注意，在靜止時，要將反應(yīng)器置于少于10μE．m-2．s-1的光強下以防止球形體的裂解。
8、干燥收獲的球形體若不及時干燥，就會腐爛變質(zhì)。干燥時，由于球形體胞外具有的多糖有高粘性，因此極易與盛放器皿黏結(jié)在一起。因此在干燥時把藻體放在絹布或絲網(wǎng)上就可避免黏結(jié)。干燥的方法有篩干，風(fēng)干或烘干。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)葛仙米的方法，其特征是A、培養(yǎng)液制配；將配制好的貯藏液加入水中的順序是，硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二酸四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉、土壤浸出液、微量元素A5、磷酸氫二鉀按比例配制；B、藻種制備首先將葛仙米球形體用乙醇溶液快速洗滌，其次是將藻種無菌純化，第三是藻殖段制種，第四是擴大制種；C、制備接種物；D、培養(yǎng)；E、實時監(jiān)控；F、篩選收獲；J、提高篩上球形體的機械強度；H、干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)葛仙米的方法，其特征是培養(yǎng)液制配硫酸鎂 0．07-0．08g；氯化鈣 0．03-0．042g；檸檬酸 0．005-0．007g；檸檬酸鐵銨 0．005-0．007g；乙二酸四乙醇二鈉鹽 0．001-0．002g；碳酸鈉 0．03-0．05g；土壤浸出液 2．5-3．5ml；微量元素A51ml；磷酸氫二鉀 0．07-0．09g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)葛仙米的方法，其特征是藻種制備首先將葛仙米球形體用70％乙醇溶液洗滌，在滅過菌的培養(yǎng)液中洗滌，將球形體放在玻璃勻漿器中，加入無菌培養(yǎng)液，再將球形體的勻漿液涂布在瓊脂平板上，用封口膜將培養(yǎng)皿封好，置于26℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；其次是藻種無菌純化，將球形體勻漿破碎，按入含有0．5％蔗糖，100ug／L氨芐青霉素，0．1％酵母提取物的培養(yǎng)液中，置黑暗條件下，在30-35℃培養(yǎng)24小時，離心，無菌培養(yǎng)液洗滌，獲得球形體；第三是藻殖段制種，將分離的藻種接種于培養(yǎng)液，在玻璃培養(yǎng)器中通氣培養(yǎng)，收集球形體用無菌蒸餾水洗滌，置于光照培養(yǎng)箱，在25-30℃，5-10μE．m-2．s-1光強下誘導(dǎo)2-3天，將藻殖段轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中靜止或通氣培養(yǎng)，制備藻種；第四是擴大制種，將球形體勻漿，接入培養(yǎng)液，通氣培養(yǎng)，制備藻種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)葛仙米的方法，其特征是制備接種物，將球形體逐級培養(yǎng)，首先原種制備；其次是將原種破碎物或藻殖段接入培養(yǎng)液，在玻璃培養(yǎng)器中以1-10L／分鐘通氣培養(yǎng)，并施以光照，強度在10-800μE．m-2．s-1之間，10-30天后收集小球形體，無菌培養(yǎng)液洗滌，獲得一級培養(yǎng)物；第三是將一級培養(yǎng)物按第二步再培養(yǎng)一次，10-30天后，球形體長大到直徑1mm，為二級培養(yǎng)物，洗滌后的二級培養(yǎng)物作為培養(yǎng)的接種物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)葛仙米的方法，其特征是提高篩上球形體的機械強度，在培養(yǎng)液中加入1．5g／L的Na2CO3，將球形體轉(zhuǎn)移到含有Na2CO3的培養(yǎng)液中，以培養(yǎng)時的同樣條件通氣培養(yǎng)3-5天收獲或?qū)⑶蛐误w靜置于原培養(yǎng)液中，于低溫下(1-10℃)靜置10-15天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)葛仙米的方法,1.培養(yǎng)液配制將配制好的貯藏液加入水中的順序是,硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬鐵銨、乙二酸四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉、土壤浸出液、微量元素A5、磷酸氫二鉀按比例配制。2.藻種制備,首先將葛仙米球形體用乙醇溶液洗滌;其次是藻種無菌純化;第三是藻殖段制種;第四是擴大制種。3.制備接種物。4.培養(yǎng)。5.實時監(jiān)控。6.篩選收獲。7.提高篩上球形體的機械強度。8.干燥。本發(fā)明方法易行,操作方便,無污染,安全性高,生長過程短,效率高,營養(yǎng)好,廣泛適用于城鄉(xiāng)規(guī)?；囵B(yǎng)。
文檔編號C12N1/12GK1294190SQ9912000
公開日2001年5月9日 申請日期1999年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月22日
發(fā)明者劉永定, 李敦海, 宋立榮, 黃澤波, 胡春香, 吳天福, 沈銀武 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所