專利名稱：多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用真核或原核細(xì)胞表達(dá)小肽或低分子量多肽(肽鏈長度小于50個氨基酸殘基)生物活性物質(zhì)的基因工程生產(chǎn)方法。包括Leptin(瘦素)片段(Leptin 22-56)、Systemin、生長激素釋放因子GRF(1-40)、粘連蛋白片段(Fibronectin 1954-1959)、賴氨酸胸腺因子(Lys-Thymic Factor)、干細(xì)胞去肉芽肽(Mast Cell Degranalating Peptide)、胸腺肽α1(Thymosin α1)、生長激素釋放因子片段(1-29)(GRF 1-29)、血管生成素片段(Angiogenin 108-123)、血管生成素片段(Angiogenin 108-122)、神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y)、Vasonatrin肽(VNP)、生長激素釋放因子GRF(1-44)、神經(jīng)肽Y片段(Neuropeptide Y 2-36)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、酪氨酸型—促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Tyr-CRF)、Thymopoietin II片段(29-41)、纖維蛋白原結(jié)合抑制肽、β10胸腺肽(Thymosin β10)、粘附抑制肽(I)、Tritrpticin、Leptin片段(116-130)、RGD肽III、β-胸腺肽片段(16-38)(Thymosin 16-38)、Cecropin A、CD36(93-110)cys、緩激肽增效劑C(Bradykinin Potentiator C)、緩激肽增效劑B(Bradykinin Potentiator B)、胸腺化學(xué)激活素(Thymus and Activation Regulated Chemokine)、RGD肽II、BPP 9a、Defensin HNP-I、Backenecin、HIV(gp 120)片段(315-329)、血管緊張肽原酶抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子片段(FGF basic 119-126)、Parasin I、腫瘤壞死因子α片段(159-178)、WP9QY、尿胰蛋白酶抑制劑片段(Urinary Trypsin In-hibitor Fragment)、嗎啡調(diào)節(jié)神經(jīng)肽I、神經(jīng)肽Y片段(22-36)(Neuropeptide Y22-36)、嗎啡調(diào)節(jié)神經(jīng)肽II、Neuropeptide FF(NpFF)、α-?？舅谿I(α-Cono-toxin GI)、Defensin HNP-1、HIV(gp 120)片段(308-331)、細(xì)胞間粘附因子片段(1-23)(Intercellular Adhesion Molecular 1-23)、Tachyplesin I、Polyphemusin II衍生肽(Polyphemusin II-Derived Peptide)、內(nèi)毒素抑制劑(EndotoxinInhibitor)、α-海葵毒素MI(α-Conotoxin MI)、蛙皮抗菌肽I(magainin I)、蛙皮抗菌肽II(Magainin II)、神經(jīng)肽Y片段(22-36)(Neuropeptide Y 22-36)、肝素結(jié)合肽(I)、成纖維細(xì)胞生長因子受體結(jié)合抑制肽、粘連蛋白吸附促進(jìn)肽(FibronectinAdhesion Promoting Peptide)、促腎上腺皮質(zhì)激素片段ACTH(1-24)、CecropinB、促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH(1-17)、CDR-H31C2、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(金槍魚)、C型促尿鈉排泄肽(C-Type Natriuretic Peptide 32-53)、Tachyplesin I、凝血酶受體模擬肽、黃體激素釋放激素(LHRH)、C—反應(yīng)蛋白片段(174-185)(C-Reactive Protein 174-185)、血管緊張素III(Angiotensin III)、血管緊張素II(An-giotensin II)、β-白細(xì)胞介素前體蛋白片段(110-123)、糖蛋白II b片段300-312(Glycoprotein II b Fragment 300-312)、RGD肽、RGD環(huán)肽I、粘連蛋白片段1978-1982(Fibronectin cs-1 Fragment1978-1982)、粘連蛋白片段(1978-1985)(Fi-bronectin cs-1 Fragment 1978-1985)、糖蛋白II b片段(296-306)(Glycoprotein IIb Fragment 296-306)、心房促尿鈉排泄因子(1-28)(Atrial Natriuretic Factor1-28)、水蛭肽Hirullin、粘連蛋白片段(196-203)(Fibronectin Fragment 196-203)、海葵毒素α-Conotoxin IMI、HIV(gp 120)片段(315-329)、HIV(gp41)片段、促紅細(xì)胞生成模擬肽(Erythropoietin Mimetic Peptide Sequence 20)、Laminin片段、β-淀粉樣蛋白片段(25-35)、細(xì)胞腫瘤抗原P53片段(361-382)、α1-胸腺肽。尤其是人B-型促尿鈉排泄肽(BNP)的制備、人α1-胸腺肽的制備、gp120片段315-329的制備、C反應(yīng)蛋白片段174-185的制備、血管加壓素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備。
目前，用基因工程生產(chǎn)低分子量多肽的常用方法是將單個目標(biāo)肽段分子的核酸序列與載體蛋白基因連接，首先表達(dá)融合蛋白，再用酶解法使目標(biāo)肽段分子從融合蛋白中釋放出來。
其缺點(diǎn)是采用融合蛋白方法表達(dá)的目標(biāo)肽段成份在融合蛋白中僅占10％左右，效率低，生產(chǎn)成本較高。
另一種生產(chǎn)低分子量多肽的常用方法是化學(xué)合成法，其缺點(diǎn)是生產(chǎn)過程涉及對功能基因的保護(hù)和去保護(hù)，而且某些氨基酸合成摻入的效率較低，因此當(dāng)合成的多肽分子的片段較長時，往往產(chǎn)率較低。此外，化學(xué)合成法所用的原材料對環(huán)境有害，此微的摻入影響終產(chǎn)品的純度。
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提出一種可提高目標(biāo)多肽的產(chǎn)量且生產(chǎn)成本低的多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于它在DNA水平上，將目標(biāo)肽段的DNA序列串聯(lián)為多聚體，并用原核或真核細(xì)胞表達(dá)小肽或低分子量多肽的串聯(lián)重復(fù)多聚體。
本發(fā)明通過將目標(biāo)肽段分子的基因序列重復(fù)串聯(lián)為多聚體，用原核或真核細(xì)胞表達(dá)，并用酶學(xué)或化學(xué)方法將目標(biāo)肽段的多聚體斷裂加工為目標(biāo)肽段單體，該方法能夠使表達(dá)產(chǎn)物幾乎全為目標(biāo)肽段成分，同時，本發(fā)明可以有效表達(dá)5-50個氨基酸長度的目標(biāo)肽段，因此，生產(chǎn)成本較低。
本發(fā)明首先用化學(xué)合成目標(biāo)肽段的單體(對多肽而言)或多體(對小肽而言)核苷酸序列，這使我們可以針對表達(dá)的宿主(真核或原核細(xì)胞)，選擇其優(yōu)先使用的密碼子，從而使產(chǎn)物的表達(dá)效率進(jìn)一步提高。
本發(fā)明可以在目標(biāo)肽段的串聯(lián)重復(fù)基因序列的5′端或3′端插入適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄?，使得表達(dá)的目標(biāo)肽段多聚體能夠進(jìn)行親和層析(如攜帶抗原序列或組氨酸6聚體)，從而使多肽聚合體在加工斷裂前得到高效純化。
本發(fā)明利用同尾酶的特性，可以很方便地使目標(biāo)肽段單體分子定向克隆為多聚體，且多聚體的聚合度可以隨意選擇(2，3，4，5…體)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核酸限制性內(nèi)切酶中存在近百對同尾酶(見附表I)，使得多肽單體分子中間間隔序列的選擇設(shè)計(jì)更加靈活方便。
實(shí)例1 人B-型促尿鈉排泄肽(BNP)的制備人B-型促尿鈉排泄肽(Human b-type Natriuretic Peptide)主要由心肌細(xì)胞產(chǎn)生，可使機(jī)體的血壓下降，臨床可用于治療代償機(jī)能障礙而引起的心率衰竭，并對溶栓藥物治療急性心肌梗塞有輔助療效，可以增加心指數(shù)，提高心輸出量，改善血液動力學(xué)指標(biāo)[4，5]。
BNP的氨基酸序列如下Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-
Val-Leu-Arg-Arg-His根據(jù)BNP氨基酸組成特點(diǎn)，我們在BNP單體分子間插入色氨酸(Trp)作為多聚體表達(dá)產(chǎn)物加工斷裂的位點(diǎn)，我們將核酸內(nèi)切酶Pst I的識別序列
置于BNP核苷酸序列的5′端，將內(nèi)切酶Nsi I的識別序列
置于BNP核苷酸序列的3′端，Pst I和Nsi I是一對同尾酶，它們產(chǎn)生的粘性末端連接后產(chǎn)生的序列
以及
不能被Pst I和Nsi I識別切割，且兩對密碼子ATG、CAG是己coli中使用幾率較高的密碼子(分別編碼Met和Gln)。我們采用E.coli表達(dá)BNP，因此我們根據(jù)E.coli中常用或較常使用的密碼子來合成BNP單體及間隔片段的核苷酸序列
其中帶下劃線的核苷酸序列為插入序列，由小寫字母組成的序列分別為Pst I和Nsi I的識別位點(diǎn)，用于BNP基因多聚體的拼接，接入序列中的TGG編碼色氨酸(Trp)，是BNP多聚體表達(dá)產(chǎn)物加工為BNP單體的斷裂位點(diǎn)。我們在Pst I識別序列之前以及Nsi I識別序列之后分別加上了核酸內(nèi)切酶Nde I和Xho I的識別序列(斜體字母)，目的是為了將串連好的多聚體能方便地裝入表達(dá)載體，在BNP單體及間隔片段的酶切拼接過程中，Nde I或Xho I的識別序列均被去除，因而間隔片段中并不包含Nde I或xho I序列，該序列僅存于BNP單體或重復(fù)串聯(lián)多聚體的5′端或3′端。一、BNP單體基因的構(gòu)建我們采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法將上述合成的DNA片段作為模板，并擴(kuò)增為雙鏈。PCR引物的核苷酸序列如下1．CAT ATG CTG CAG TGG TCC CCG AAA2．CTC GAG ATG CAT CCA GTG ACG ACG擴(kuò)增產(chǎn)物直接連到PCR4-TOPO(TA載體，Invitrogen產(chǎn)品，參見附III第55頁)載體中并轉(zhuǎn)導(dǎo)TOPO-10菌，插入序列經(jīng)測序鑒定，即可得到BNP單體基因質(zhì)粒TOPO-BNP(1)。(注括號內(nèi)1代表單體，2代表雙體，3代表3體，以此類推)。二、BNP多聚體基因的構(gòu)建首先將BNP(1)分別用Nsi I/Not I，以及Pst I/Not I酶切，將Nsi I/Not酶切后純化回收的DNA大片段與Pst I/Not I酶切后純化回收的DNA小片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)至TOPO-10菌中擴(kuò)增DNA，此時可得到BNP基因的二聚體質(zhì)粒TOPO-BNP(2)。將TOPO-BNP(2)分別用Nsi I/Not I，以及Pst I/Not I酶切，將Nsi I/Not I酶切后純化回收的DNA大片段與Pst I/Not I酶切后純化回收的DNA小片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)TOPO-10菌以擴(kuò)增DNA，即可得到BNP基因的四聚體TOPO-BNP(4)。重復(fù)上述方法即可得到BNP基因的八聚體TOPO-BNP(8)。將TOPO-BNP(2)用Nsi I/Not I酶切并回收純化其DNA大片段，將TOPO-BNP(8)用Pst I/Not I酶切并回收純化其DNA小片段，把這兩個片段連接并轉(zhuǎn)導(dǎo)至TOPO-lO菌中擴(kuò)增DNA質(zhì)粒，由此可得到TOPO-BNP(10)。將TOPO-BNP(10)和表達(dá)載體PET22b(Novagen產(chǎn)品，參見附III56頁)均用Nde I/Xho I雙酶切，將TOPO-BNP(10)酶切產(chǎn)生的小片段與PET22b酶切產(chǎn)生的大片段連接并轉(zhuǎn)導(dǎo)至TOPO-10菌以擴(kuò)增BNP十聚體基因表達(dá)質(zhì)粒PET-BNP(10)(BNP+聚體基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程圖見第6-7頁)。三、BNP+聚體基因的表達(dá)及純化將BNP十聚體基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至BL21(DE3)表達(dá)菌中，挑單菌落培養(yǎng)過夜，將過夜菌按2％接種至LB培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)到OD為0.8，加入0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集菌體。BNP十聚體基因在通過Xho I酶切位點(diǎn)插入PET22b表達(dá)載體時，引入了PET22b表達(dá)載體上的6個組氨酸(His)密碼子和終止密碼子(即BNP十聚體基因和PET22b載體的6個組氨酸及終止密碼子均在同一閱讀框架內(nèi)，參見PET22b的基因圖譜)，所以表達(dá)產(chǎn)物可以用Ni-Sepharose親和層析純化，純化產(chǎn)物的純度在SDS凝膠電泳上可達(dá)90％以上。四、BNP多聚體的裂解、加工及BNP單體純化1.BNP多聚體的裂解將BNP多聚體用8M的尿素溶液(內(nèi)含10mM β-巰基乙醇，pH7.8)稀釋至濃度為1mg/ml，取2000ml該BNP溶液與6000ml色氨酸裂解試劑，BNPS-Skatole(2-(2′-nitrophenylsulfonyl)-3-methy1-3-bromoindolenine)混合，將該混合液避光置45℃反應(yīng)15小時。此時BNP多聚體被裂解為BNP單體(斷裂位點(diǎn)在Trp的羧基端)。
裂解反應(yīng)完畢，反應(yīng)液用等體積的8M尿素溶液稀釋，離心去除BNPS-Ska-tole沉淀物，將上清液的pH調(diào)節(jié)為4.0，并直接上樣至SP-Sepharose陽離子柱，用8M尿素+10mM β-巰基乙醇為柱平衡及起始洗脫緩沖液，用8M尿素+100mM β-巰基乙醇+0.5M NaCl為終極洗脫緩沖液，梯度洗脫并收集BNP單體吸收峰。超濾濃縮BNP濃度至5mg/ml左右。
2.BNP單體中二硫鏈的氧化將經(jīng)SP-Sepharose陽離子交換色譜初步純化并濃縮的BNP單體用pH7.550mM的Tris-HCl緩沖液稀釋25倍，并加入3mM氧化型谷胱甘肽及2mM還原型谷胱甘肽。將上述溶液在室溫放置20小時，此時BNP單體的二個半胱氨酸將被氧化生成一對二硫鏈。氧化反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液對1mM的醋酸溶液透析凍干。
3.BNP單體C-末端色氨酸(Trp)的去除及純化將凍干的BNP單體溶解于100mM的N-ethylmorpholine pH6.0溶液中，使BNP單體的濃度為5mg/ml，加入終濃度為25μg/ml的羧肽酶Y(酶∶底物＝1∶200)，將酶反應(yīng)液置室溫12小時，加入0.1％的三氟醋酸終止反應(yīng)。該反應(yīng)物直接用高效液相色譜C18柱分離純化，起始緩沖液為0.1％的三氟醋酸，終極緩沖液為0.1％的三氟醋酸+80％的乙腈。收集BNP單體的吸收峰，此時所得到的BNP單體的氨基酸序列與天然BNP的序列完全一致。
BNP多聚體基因以及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
實(shí)施例4反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的是步驟1所用的樹脂為Link樹脂，堿為4.0當(dāng)量的碳酸銫，溫度為60℃；步驟2有機(jī)溶劑為THF，3.0當(dāng)量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為10mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為70℃；Lewis酸為0.2當(dāng)量的SnCl4產(chǎn)物為
5-正己基-4-(4’-羥基羰基苯)-3-甲基-2(5氫)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
實(shí)施例5反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的步驟1所加入的鹵化物為鄰碘苯甲酸，堿為6.0當(dāng)量的叔丁醇鈉，溫度為80℃；步驟2有機(jī)溶劑為甲苯，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為30mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為60℃；Lewis酸為0.6當(dāng)量的TiCl4，產(chǎn)物為<p>1.CAT ATG ATC GAT ATG TCC GAC GCT GC2.CTC GAG TTC GAA ACC GTT TTC CGCPCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接到PCR2.1-TOPO(TA載體Invitrogen產(chǎn)品，參見附III55頁)，插入序列經(jīng)測序鑒定后，即可得THY單體基因的質(zhì)粒TOPO-THY(1)(括號內(nèi)的1代表THY的單體，2代表雙體，以此類推)。二、THY多聚體基因的構(gòu)建將TOPO-THY(1)分別用BstB I/Xba I以及Cla I/Xba I酶切，將BstB I/Xba I酶切回收的大片段與Cla I/Xba I酶切回收的小片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)至TOPO-10菌中擴(kuò)增DNA，此時可得到THY基因的二聚體質(zhì)粒TOPO-THY(2)。將TOPO-THY(2)分別用BstB I/Xba I和Cla I/Xba I酶切，將BstBI/Xba I酶切回收的大片段與Cla I/Xba I酶切回收的小片段連接并轉(zhuǎn)導(dǎo)至TOPO-10菌中擴(kuò)增DNA質(zhì)粒即可得到THY四聚體基因質(zhì)粒TOPO-THY(4)。重復(fù)上述步驟，即可得到THY八聚體基因質(zhì)粒TOPO-THY(8)。將TOPO-THY(4)用Bst B I/Xba I酶切并純化其大片段，將TOPO-THY(8)用Cla I/Xba I酶切并純化回收其小片段，把這兩個基因片段連接后轉(zhuǎn)導(dǎo)至TOPO-10菌并擴(kuò)增DNA，由此可得到THY的十二聚體基因質(zhì)粒TOPO-THY(12)。用Nde I/Xho I酶切TOPO-THY(12)并回收純化DNA小片段(THY的12聚體基因)，并將該基因片段連接到PET29a(Novagen產(chǎn)品，參見附III，見57頁)表達(dá)載體上，從而完成α1-胸腺肽表達(dá)質(zhì)粒PET-THY(12)的構(gòu)建。三、α1-胸腺肽十二聚體的表達(dá)及純化將PET-THY(12)基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至BL21(DE3)表達(dá)菌中。挑單菌落培養(yǎng)過夜，將過夜菌按2％，接種至LB培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)到OD為0.8，加入0.5mM，IPTG誘導(dǎo)THY(12)的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時離心收集菌體。與PET22b表達(dá)載體一樣，α1-胸腺肽多聚體基因在通過Nde I/Xho I酶切位點(diǎn)插入到PET29a表達(dá)載體時，其表達(dá)產(chǎn)物在C末端也帶有6個組氨酸(His)，因此可用Ni-Sepharose親和層析純化，產(chǎn)物經(jīng)SDS電泳鑒定，純度在90％以上。四、α1-胸腺肽多聚體的化學(xué)降解以及單體純化將純化后的α1-胸腺肽多聚體按1mg/ml的濃度溶于溴化氰溶液中(溴化氰溶液用70％的甲酸配制，濃度為5mg/ml)。將該反應(yīng)溶液在室溫置通風(fēng)櫥中反應(yīng)24小時，以斷裂甲硫氨酸的羧基參與形成的肽鍵。(本例中，溴化氰裂解
反應(yīng)完畢，加入8倍體積的10M NaOH以中和溴化氰，將降解產(chǎn)物超濾、脫鹽凍干。
將經(jīng)溴化氰降解處理的α1-胸腺肽溶于1.8M的羥胺中，使肽段的濃度為0.25mg/ml，將反應(yīng)液置45℃反應(yīng)3小時以水解天冬酰胺與甘氨酸間的肽鍵Asn↓Gly，反應(yīng)完畢，待反應(yīng)液的溫度降至室溫后，加入三氟醋酸至終濃度為0.1％以終止反應(yīng)。該反應(yīng)物直接進(jìn)行高效液相色譜，以0.1％的三氟醋酸為起始緩沖液，以0.1％三氟醋酸+75％的乙腈為終極緩沖液，用C18反相色譜柱純化α1-胸腺肽，收集α1-胸腺肽單體吸收峰，此時即可得到與天然序列一致的單體α1-胸腺肽。
此外由于α1-胸腺肽的氨基酸組成中沒有色氨酸(Trp)，所以該多肽在用串連重復(fù)多聚方法生產(chǎn)時，可用Trp作為多聚體加工時的斷裂位點(diǎn)，此時只要將上述α1-胸腺肽單體核苷酸序列中的甲硫氨酸(Met)密碼子ATG變?yōu)門rp的密碼子TGG，并在PCR引物序列中作相應(yīng)調(diào)整即可。色氨酸羧基形成的肽鍵斷裂方法參考BNP的制備。附THY二聚體基因結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的氨基酸序列，其中箭頭表示了化學(xué)斷裂的加工位點(diǎn)，其中方框代表了真正的THY的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分。
實(shí)例3 gp120片段315～329的制備gp120是HIV-1病毒的外殼蛋白，肽段315～329位于gp120分子的重要功能區(qū)一V3環(huán)狀區(qū)(V3loop)，HIV-1病毒感染起始于外殼蛋白gp120與正常細(xì)胞的CD4受體結(jié)合并使HIV-1病毒與被感染的細(xì)胞融合。人工合成的gp120(315～329)片段(以下簡稱gpfg)可以抑制HIV-1病毒對人T淋巴細(xì)胞的感染并抑制合包體的形成。該肽段對防止HIV-1病毒感染或減緩病毒在患者體內(nèi)傳播速度等方面具有潛在的應(yīng)用價值[9]。
gpfg的氨基酸序列如下Arg-lle-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-lle-Gly-Lys根據(jù)gPfg的氨基酸組成及序列特點(diǎn)，我們選用其羧基端的賴氨酸(Lys)作為多聚體表達(dá)產(chǎn)物加工斷裂的一個位點(diǎn)，此外在單體分子的氨基端插入谷氨酸作為1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
實(shí)施例4反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的是步驟1所用的樹脂為Link樹脂，堿為4.0當(dāng)量的碳酸銫，溫度為60℃；步驟2有機(jī)溶劑為THF，3.0當(dāng)量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為10mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為70℃；Lewis酸為0.2當(dāng)量的SnCl4產(chǎn)物為
5-正己基-4-(4’-羥基羰基苯)-3-甲基-2(5氫)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
實(shí)施例5反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的步驟1所加入的鹵化物為鄰碘苯甲酸，堿為6.0當(dāng)量的叔丁醇鈉，溫度為80℃；步驟2有機(jī)溶劑為甲苯，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為30mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為60℃；Lewis酸為0.6當(dāng)量的TiCl4，產(chǎn)物為5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集菌體。gpfg單體基因在引入PET25b載體中時，與載體上的HSV抗原序列以及6個連續(xù)排列的組氨酸序列置于同一閱讀框架內(nèi)，因此gpfg十六聚體表達(dá)產(chǎn)物可用HSV抗體親和層析以及Ni-Sepharose親和層析純化，產(chǎn)物的純度在95％以上。四、gpfg十六聚體的酶切降解及單體純化將純化后的gpfg十六聚體按1mg/ml的濃度溶于pH7.5 50mM的磷酸緩沖液中，加入賴氨酸內(nèi)肽酶和谷氨酸內(nèi)肽酶，使其濃度分別為10μg/ml和20μg/ml，置37℃反應(yīng)20小時。加入0.1％的三氟醋酸終止反應(yīng)。該反應(yīng)物直接用反相高效液相色譜C18柱純化，用乙腈梯度洗脫，起始緩沖液為0.1％的三氟醋酸，終極緩沖液為0.1％的三氟醋酸+70％的乙腈。附gpfg二聚體基因結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的氨基酸序列，其中箭頭表示了酶切的加工位點(diǎn)，其中方框代表了真正的gpfg的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分。
實(shí)例4 C反應(yīng)蛋白片段174～185的制備C反應(yīng)蛋白(CRP)主要由肝細(xì)胞合成。組織損傷和炎癥反應(yīng)可以觸發(fā)機(jī)體內(nèi)C反應(yīng)蛋白的水平急劇升高。CRP可以增強(qiáng)體內(nèi)的免疫功能，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。CRP肽段174～185(以下簡稱CRPfg)具有類似完整C反應(yīng)蛋白的部分功能，它可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[10，11，12]。
C反應(yīng)蛋白174～185片段的氨基酸序列如下Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Pro-Phe-Ser-Pro-Asn-Val-Leu由于CRPfg僅含12個氨基酸，對其單體基因片段操作時效率較低。所以我們先用化學(xué)合成方法合成CRPfg的二聚體基因，并在兩個單體基因片段間插入Asp-Lys序列，以此二聚體基因作為一個獨(dú)立單元進(jìn)行多聚體基因的串連重復(fù)，根據(jù)CRPfg的氨基酸組成的特點(diǎn)，我們選用天冬氨酸(Asp)和賴氨酸(Lys)作為該肽段C末端和N末端的斷裂、加工位點(diǎn)。我們將同尾酶Nhe I(切點(diǎn)為1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
實(shí)施例4反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的是步驟1所用的樹脂為Link樹脂，堿為4.0當(dāng)量的碳酸銫，溫度為60℃；步驟2有機(jī)溶劑為THF，3.0當(dāng)量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為10mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為70℃；Lewis酸為0.2當(dāng)量的SnCl4產(chǎn)物為
5-正己基-4-(4’-羥基羰基苯)-3-甲基-2(5氫)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
實(shí)施例5反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的步驟1所加入的鹵化物為鄰碘苯甲酸，堿為6.0當(dāng)量的叔丁醇鈉，溫度為80℃；步驟2有機(jī)溶劑為甲苯，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為30mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為60℃；Lewis酸為0.6當(dāng)量的TiCl4，產(chǎn)物為<p>將PET-CRPfg(16)基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至BL 21(DE3)表達(dá)菌中，挑單菌落過夜培養(yǎng)，將過夜菌按2％的接種量接種至LB培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)至OD為0.8，加入0.5mM IPTG誘導(dǎo)CRPfg(16)的基因表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集菌體，表達(dá)產(chǎn)物用Ni-Sepharose進(jìn)行分離純化。四、CRPfg多聚體的斷裂加工和單體肽段分離純化將純化后的CRPfg十六聚體按1mg/ml的濃度溶于0.1M pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，加入天冬氨酸內(nèi)肽酶使其終濃度為10μg/ml，置37℃反應(yīng)20小時，再加入終濃度為5μg/ml的胰蛋白酶，置37℃反應(yīng)15小時，反應(yīng)完畢，加入0.1％的三氟醋酸終止反應(yīng)。用反相高效液相色譜分離純化CRPfg單體肽段(方法同例3)。
下圖為CRPfg四聚體基因結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的氨基酸序列，箭頭表示了酶切加工位點(diǎn)，其中方框帶陰影的部分代表了真正的CRPfg的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分
實(shí)例5 血管加壓素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備血管加壓素轉(zhuǎn)化酶對調(diào)節(jié)機(jī)體血壓具有重要作用。它可使血管緊張素I轉(zhuǎn)化為活性較強(qiáng)的血管緊張素II，并抑制緩激肽的功能。血管加壓素轉(zhuǎn)化酶抑制肽是血管加壓素轉(zhuǎn)化酶的非競爭性抑制劑，臨床上用于治療高血壓[13，14]。
血管加壓素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(以下簡稱ACEIP)的氨基酸組成如下Pro-Ala-Asn-lle-Lys-Trp-Gly-Asp由于ACEIP分子僅有8個氨基酸殘基，因此我們選用化學(xué)方法合成ACEIP的二聚體基因，以此二聚體基因片段作為一個獨(dú)立單元，進(jìn)行多聚體基因的重復(fù)串連。根據(jù)ACEIP肽段的氨基酸組成及序列特點(diǎn)，即ACEIP的羧基端為Asp(天冬氨酸)，氨基端為Pro(脯氨酸)，我們選用
作為串連重復(fù)多聚體基因表達(dá)產(chǎn)物的斷裂加工位點(diǎn)。此外我們分別將Cla I(切點(diǎn)為
)和Nar I
的識別序列置于ACEIP二聚體基因單元的5′端和3′端，選用同尾酶Cla I和Nar I作為二聚體基因單元間的連接位點(diǎn)，主要是因?yàn)槎呙盖挟a(chǎn)生的粘性末端在連接后產(chǎn)生的序列能夠編碼Gly-Asp，而該氨基酸序列恰好與ACEIP羧基端的兩個氨基酸相同。由于該多肽的二聚體基因單元及插入序列的總長度僅為54堿基，所以我們用化學(xué)合成該多肽二聚體基因的兩條互補(bǔ)鏈(包括間隔序列)，并在該基因片段的5′端和3′端分別設(shè)置Nde I和Xho I的粘性末端。
ACEIP二聚體基因及間隔片段的序列如下TATGATCGATCCGGCTAACATCAAATGGGGTGACCCGGCAAACATCAAATGGGGCGCCCACTAGCTAGGCCGATTGTAGTTTACCCCACT GGGCCGTTTGTAGTTTACCCCGCGGGAGCT帶下劃線的核苷酸序列分別為同尾酶Cla I和Nar I的識別位點(diǎn)，用于A-CEIP多聚體基因的拼接。一、ACEIP二聚體基因的構(gòu)建將化學(xué)合成的ACEIP二聚體基因的兩條核苷酸鏈分別進(jìn)行5′端磷酸化，然后將兩種核苷酸混合、變性、退火，形成帶有Nde I和Xho I粘性末端的ACEIP二聚體基因的雙鏈核酸片段，將此片段連接到經(jīng)Nde I和Xho I酶切處理過的PET20b載體上(Novagen公司產(chǎn)品，見附III 57頁)，并轉(zhuǎn)導(dǎo)JM109菌以擴(kuò)增A-CEIP二聚體基因質(zhì)粒PET-ACEIP(2)。二、ACEIP多聚體基因的構(gòu)建將ACEIP(2)分別用Cla I/Bpu1102 I和Nar I/Bpu1102 I酶切，將Cla I/Bpu1102 I酶切、純化回收的DNA小片段與Nar I/Bpu1102 I酶切、純化回收的DNA大片段連接，并轉(zhuǎn)導(dǎo)至JM109菌中擴(kuò)增DNA質(zhì)粒，由此可得到ACEIP四聚體基因片段PET-ACEIP(4)，將PET-ACEIP(4)DNA質(zhì)粒分別用Cla I/Bpu1102 I和Nar I/Bpu1102 I酶切，并將Cla I/Bpu1102 I酶切回收的DNA小片段與Nar I/Bpu1102 I酶切回收的DNA大片段連接并轉(zhuǎn)導(dǎo)至JM109菌中擴(kuò)增DNA，即可得到ACEIP的8聚體基因質(zhì)粒PET-ACEIP(8)，重復(fù)上述步驟可得到PET-ACEIP(16)和PET-ACEIP(32)。三、ACEIP32聚體基因的表達(dá)純化將PET-ACEIP(32)基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至BL 21(DE3)表達(dá)菌中，挑單菌落培養(yǎng)過夜，將過夜菌按2％的接種量接種至LB培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)到OD為0.8，加入0.5mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集菌體，表達(dá)產(chǎn)物用Ni-Sepharose親和層析純化，其純度達(dá)90％。四、ACEIP32聚體的化學(xué)降解及單體純化將純化后的ACEIP32聚體按1mg/ml溶于70％的甲酸中置37℃保溫反應(yīng)48小時，加入3倍體積的水，混勻冷凍干燥。將凍干物溶于0.1％的三氟醋酸，用HPLC反相色譜分離純化ACEIP單體肽段。(注ACEIP32聚體多肽中直接與羧基端6個組氨酸(poly His.tag)相連的單體分子在用甲酸水解時，其羧基端的6個組氨酸殘基不能被去除，該ACEIP片段因?yàn)榕c6個組氨酸殘基相連，故可用Ni-Sepharose吸附去除，或直接用C18反相HPLC柱將該肽段與正常的ACEIP分子分開。)附ACEIP四聚體基因結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的氨基酸序列，其中箭頭表示了酶切加工位點(diǎn)，方框代表了真正的CRPfg的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分。
實(shí)例6 其它30類生物活性肽的制備方法附表I說明以30種生物活性肽為例，簡要說明了利用核酸內(nèi)切酶中的同尾酶的特性(即一對同尾酶可以識別、酶切不同的核苷酸序列，但產(chǎn)生相同的粘性末端，且當(dāng)這兩種粘性末端連接后，其核苷酸序列不再能被這對同尾酶中的任何一個酶識別和酶切)，構(gòu)建目標(biāo)肽段的重復(fù)串連基因的方法。附表I的各子表“a”中列出了各生物活性肽的氨基酸序列及間隔序列、核酸序列及間隔序列、同尾酶識別序列，肽段多聚體間隔區(qū)的氨基酸序列，肽段多聚體間隔區(qū)的核酸序列，以及肽段多聚體的斷裂加工方法。與這30種生物活性肽相比，一些多肽的氨基酸組成或序列具有類似的特點(diǎn)，它們可以用完全相同的方法進(jìn)行多肽基因的串連重復(fù)以及多聚體表達(dá)產(chǎn)物的斷裂、加工。我們將這些活性肽列入了與各子表“a”相對應(yīng)的“b”表中(子表“b”中的活性肽可以用與之對應(yīng)的子表“a”中的方法制備)。由附表I可以看出，同一肽段可以選用不同的同尾酶串連多肽基因，也可以選擇不同的斷裂、加工方法。
附表I中的簡寫說明Trp↓ 表示用BNPs-Skatole試劑斷裂由色氨酸的羧基形成的肽鍵Met↓ 表示用溴化氰斷裂由甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
實(shí)施例4反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的是步驟1所用的樹脂為Link樹脂，堿為4.0當(dāng)量的碳酸銫，溫度為60℃；步驟2有機(jī)溶劑為THF，3.0當(dāng)量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為10mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為70℃；Lewis酸為0.2當(dāng)量的SnCl4產(chǎn)物為
5-正己基-4-(4’-羥基羰基苯)-3-甲基-2(5氫)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
實(shí)施例5反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的步驟1所加入的鹵化物為鄰碘苯甲酸，堿為6.0當(dāng)量的叔丁醇鈉，溫度為80℃；步驟2有機(jī)溶劑為甲苯，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為30mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為60℃；Lewis酸為0.6當(dāng)量的TiCl4，產(chǎn)物為1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
實(shí)施例4反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的是步驟1所用的樹脂為Link樹脂，堿為4.0當(dāng)量的碳酸銫，溫度為60℃；步驟2有機(jī)溶劑為THF，3.0當(dāng)量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為10mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為70℃；Lewis酸為0.2當(dāng)量的SnCl4產(chǎn)物為
5-正己基-4-(4’-羥基羰基苯)-3-甲基-2(5氫)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
實(shí)施例5反應(yīng)步驟同實(shí)施例2，所不同的步驟1所加入的鹵化物為鄰碘苯甲酸，堿為6.0當(dāng)量的叔丁醇鈉，溫度為80℃；步驟2有機(jī)溶劑為甲苯，6.0當(dāng)量的三乙胺，鈀催化劑為30mol％d的PdCl2/PPh3，反應(yīng)溫度為60℃；Lewis酸為0.6當(dāng)量的TiCl4，產(chǎn)物為<p>表2a
表2b
表3a
表3b(1)
表3b(2)
表4a
表4b
<p>表5a
表5b
表6a
表7a
表8a
表9a
表9b
表10a
表10b
表11a
表11b
表12a
表12b
<p>表13a
表13b
表14a
表14b
<p>表15a
表15b
表16a
表16b
表17a
表17b
<p>表18a
表18b(1)
表18b(2)
表19a
表20a
表21a
表21b
表22a
表23a
表23b
<p>表24a
表24b
表25a
表26a
表27a
表27b
表28a
表29a
表30a
附表II核酸內(nèi)切酶中的部分同尾酶
續(xù)附表II
附III本文所用及的克隆載體及表達(dá)載體基因圖譜
附III
附III
附III續(xù)載體基因圖譜
參考文獻(xiàn)1.Current Protocols in Protein Science Chapter 11，Published by John Wiley &amp; SonsInc.
2.Zhu，L.G.，Qin，L.et al.J Am Chem Soc 1994，Vol.116，52183.Ziyong Sun，Song Zhou，et al.Research on Protein Specific Cleavage ReagentsProgress in Biochemistry and Biophysics 1995，Vol.22312-3174.Jarkko Magga，Olli Vuolteenaho，et al.B-type natriuretic peptidea myocyte-specific marker for characterizing load-induced alterations in cardiac geneexpression Ann Med 1998，Vol.30，Suppl 139-455.Roger M.Mills，Thierry H.Lejemtel，et al.Sustained Hemodynamic Effects of anInfusion of Nesiritide(Human b-Type Natriuretic Peptide)in Heart FailureJournal of the American College of Cardiology 1999，Vol.34，No.1155-1626.Enrico Garaci，F(xiàn)rancesca Pica，et al.Antitumor Effect of Thymosinα1/Interleukin-2 or Thymosin α1/Interferon α，β Following Cyclophosphamide inMice Injected with Highly Metastatic Friend Erythroleukemia Cells J Immunother1993，Vol.13，No.17-177.Katherine M.Malinda，Gurmel S.Sidhu，et al.Thymosin α1 Stimulates EndothelialCell Migration，Angiogenesis，and Wound Healing the Journal of Immunology 1998，1601001-10068.Kenneth E.Sherman，Maria Sjogren，et al.Combination Therapy with Thymosinα1 and Interferon for the Treatment of Chronic Hepatitis C InfectionArandomized，Placebo-Controlled Double-Blind Trial Hepatology l998，Vol.27，No.41128-11359.Pramod N.Nehete，Ralph B.Arlinghaus，et al.Inhibition of HumanImmunodeficiency Virus Type 1 Infection and Syncytium Formation in HumanCells by V3 Loop Synthetic Peptides from gp120 Journal of Virology Nov.1993，6841-684610.Barbara P.Barna，Mary Jane Thomassen，et al.Combination therapy with asynthetic peptide of C-reactive protein and interleukin 2augmented survival anderadication of pulmonary metastases Cancer Immunol Immunother 1994，3838-4211.Barbara P.Barna，Deborah A Eppstein，et al.Therapeutic effects of a syntheticpeptide of C-reactive protein in pre-clinical tumor models Cancer ImmunolImmunother 1993 36171-176
12.Mary Jane Thomassen，David P.Meeker，et al.Activation of Human Monocytesand Alveolar Macrophages by a Synthetic Peptide of C-Reactive Protein Journal oflmmunotherapy 1993，Vol.13，No.11-613.Yasuhiro Kohama，Shigeru Matsumoto，et al.Isolation of Angiotensin-ConvertingEnzyme Inhibitor from Tuna Muscle Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 1988，Vol.155，No.1332-33714.Yasuhiro Kohama，Hiroaki Oka，et al.Induction of Angiotensin-ConvertingEnzyme Inhibitory Activity by Acid-Limited Proteolysis of Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase Biochemical and Biophysical Research Communications1989，Vol.161，No.2456-460
權(quán)利要求
1.一種多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于它在DNA水平上，將目標(biāo)肽段的DNA序列串聯(lián)為多聚體，并用原核或真核細(xì)胞表達(dá)小肽或低分子量多肽的串聯(lián)重復(fù)多聚體。
2.按權(quán)利要求1所述的多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于在基因水平上，利用DNA限制性內(nèi)切酶中的同尾酶具有識別水解不同核苷酸序列，但產(chǎn)生相同的粘性末端，且當(dāng)二者的粘性末端相連后，該片段不能再被同尾酶識別切割的特點(diǎn)，在表達(dá)小肽或低分子量多肽的核酸的5′端及3′端分別加上同尾酶的識別序列，通過用同尾酶水解、連接反應(yīng)等步驟的重復(fù)，構(gòu)建目標(biāo)肽段基因的串聯(lián)重復(fù)多聚體。
3.按權(quán)利要求1所述的多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于它根據(jù)小肽或低分子量多肽的氨基酸序列或組成特點(diǎn)，在構(gòu)建目標(biāo)肽段基因的串聯(lián)重復(fù)多聚體時，利用同尾酶本身的識別序列，或在同尾酶識別序列的5′端或3′端加入適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄校瑥亩勾?lián)重復(fù)的各單個目標(biāo)多肽基因間存在特定的間隔序列，這些間隔核苷酸序列在翻譯為氨基酸后，成為目標(biāo)肽段多聚體的斷裂、加工位點(diǎn)。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于用上述方法，將兩種或兩種以上不同的目標(biāo)多肽基因串聯(lián)或串聯(lián)重復(fù)，從而使表達(dá)產(chǎn)物中存在幾種不同的目標(biāo)多肽。
5.按權(quán)利要求1所述的多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于用化學(xué)或酶學(xué)方法[1]將上述表達(dá)的目標(biāo)肽段多聚體斷裂、切割加工為目標(biāo)肽段的單體分子?；瘜W(xué)裂解方法通常包括用溴化氰裂解甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵，用甲酸水解斷裂天冬氨酸的羧基與脯氨酸的亞氨基形成的肽鍵
，用羥胺水解斷裂天冬酰胺的羧基與甘氨酸的氨基形成的肽鍵
，用BNPS-Skatole(2-(2′-nitrophenylsulfonyl)-3 methyl-3 bromindolenine)裂解色氨酸的羧基形成的肽鍵。此外也可用一些金屬或非金屬配合物催化斷裂目標(biāo)多肽單體間隔序列中的特定肽鍵[2，3]。蛋白酶水解方法通常包括用胰蛋白酶水解精氨酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵，用賴氨酸內(nèi)肽酶水解賴氨酸的羧基形成的肽鍵，用谷氨酸內(nèi)肽酶水解谷氨酸的羧基形成的肽鍵，用天冬氨酸內(nèi)肽酶水解天冬氨酸的氨基形成的肽鍵。此外還可用序列識別酶，如內(nèi)激酶(Endokinase)、凝血酶、凝血因子Xa等催化目標(biāo)多肽與間隔序列間的特定肽鍵水解。在完成串聯(lián)重復(fù)多聚體的裂解后，還可用羧肽酶(A、B、P、Y)或氨肽酶對裂解生成的多肽單體分子進(jìn)行加工，以去除間隔區(qū)的氨基酸殘基。
6.按權(quán)利要求1或2或3所述的多肽藥物的高效基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于(1)若目標(biāo)肽段不含甲硫氨酸(Met)或僅其羧基端為Met，則可選用met作為間隔序列成份，并用溴化氰裂解目標(biāo)肽段多聚體。(2)若目標(biāo)肽段不含有色氨酸(Trp)或僅其羧基端為Trp，則可選用Trp作為間隔序列成份，并用BNPS-Ska-tole化學(xué)裂解目標(biāo)肽段的多聚體。(3)若目標(biāo)肽段不含有賴氨酸(Lys)或僅其羧基端為Lys，則可選用Lys作為間隔序列成份，并用賴氨酸內(nèi)肽酶降解目標(biāo)肽段的多聚體。(4)若目標(biāo)肽段不含有谷氨酸(Glu)或僅其羧基末端為Glu，則可選用Glu作為間隔序列成份，并用谷氨酸內(nèi)肽酶降解目標(biāo)肽段的多聚體。(5)若目標(biāo)肽段不含有天冬氨酸(Asp)或僅其N-端氨基酸為Asp，則可選用Asp作為間隔序列成份，并用天冬氨酸內(nèi)肽酶降解目標(biāo)肽段多聚體。(6)若目標(biāo)多肽中不含有精氨酸和賴氨酸，或僅多肽的羧基端是精氨酸或賴氨酸，則可選用賴氨酸或精氨酸作為間隔序列成份，并用胰蛋白酶(Trypsin)降解目標(biāo)肽段多聚體。(7)若目標(biāo)肽段中不含有Asp-pro肽鍵，則可選用Asp-pro作為間隔序列成份，并且用甲酸裂解目標(biāo)肽段的多聚體。(當(dāng)目標(biāo)肽段的羧基端為天冬氨酸或N-端為脯氨酸時，選用Asp-pro為斷裂位點(diǎn)可減少羧肽酶的加工處理)。(8)若目標(biāo)肽段中不含有Asn-Gly肽鍵，則可選用Asn-Gly作為間隔序列成份，并且用羥受裂解目標(biāo)肽段的多聚體(當(dāng)目標(biāo)肽段的羧基端為天冬酰受或N端為甘氨酸時，選用Asn-Gly為斷裂位點(diǎn)，可減少羧肽酶的加工處理)。(9)若目標(biāo)肽段中不含有Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser序列，則可選用該序列作為間隔序列成份，并且用凝血酶裂解目標(biāo)肽段的多聚體(當(dāng)目標(biāo)肽段的羧基端序列為Leu-Val-Pro-Arg，或其氨基端序列為Gly-Ser時，選用序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser作為間隔序列成份可減少羧肽酶的加工處理。(10)若目標(biāo)肽段中不含有Ile-Glu-Gly-Arg序列，或該序列僅存在于目標(biāo)肽段的羧基端，則可選用凝血因子Xa酶解目標(biāo)肽段的多聚體。(11)若目標(biāo)太段中不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列，或該序列僅存在于肽段的羧基端，則選用該序列作為插入序列成份，并用內(nèi)激酶裂解目標(biāo)肽段的多聚體。(12)以上的各酶解或化學(xué)裂解方法可組合使用，即采用兩種或兩種以上的裂解方法將目標(biāo)肽段多聚體裂解為單體。(13)若用以上方法裂解得到的多聚體與天然序列有差別，可以選用適當(dāng)?shù)聂入拿富虬彪拿讣庸る逆湹聂然嘶虬被?詳見實(shí)例6)。
全文摘要
本發(fā)明用真核或原核細(xì)胞表達(dá)低分子量多肽活性物質(zhì)。在核酸水平上,利用DNA限制性內(nèi)切酶中的同尾酶具有識別水解不同DNA序列,但產(chǎn)生相同的粘性末端,且當(dāng)二者的粘性末端連接后,該位點(diǎn)不再能被同尾酶識別的特性,將編碼目標(biāo)肽段的DNA分子串聯(lián)重復(fù),構(gòu)成多聚體,并根據(jù)目標(biāo)肽段的氨基酸組成及序列特點(diǎn),在各DNA單體分子間插入適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄?這些特定的核苷酸序列在翻譯為氨基酸后,成為使串聯(lián)重復(fù)目標(biāo)肽段的多聚體斷裂為單體的加工位點(diǎn)。
文檔編號C12N15/11GK1273248SQ9912061
公開日2000年11月15日 申請日期1999年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月24日
發(fā)明者孫自勇, 劉建寧 申請人:劉建寧