專利名稱：：新的人細(xì)胞因子、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人細(xì)胞因子CX1(也稱為“CX1蛋白”)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的與造血有關(guān)的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是動物體內(nèi)一類重要的蛋白。許多細(xì)胞因子都在體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，例如腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素(IL2、IL-8、IL17、IL18等)、HGF、血管生成素、紅細(xì)胞生成素(EPO)、GM-CSF等。近年，開始了人類基因組計劃，以便獲得人類的全部基因組信息，揭示人類生命的奧秘及疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，最終探索出疾病診治的有效方法。隨著分子生物學(xué)和計算機技術(shù)、生物信息學(xué)的發(fā)展，大規(guī)模測序已成為揭示細(xì)胞基因表達(dá)譜和發(fā)現(xiàn)新分子的有效手段(Maoetal.ProcNatlAcadSciUSA.1998；958175)。cDNA文庫的構(gòu)建是大規(guī)模隨機測序的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。cDNA文庫主要有噬菌體文庫和質(zhì)粒文庫兩大類。噬菌體文庫具有滴度高等突出優(yōu)點，但也存在著空斑率較高的缺點，利用IPTG誘導(dǎo)的LacZ互補表達(dá)進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選過程中，部分表達(dá)后生長不穩(wěn)定的克隆可能被抑制，造成克隆的優(yōu)勢選擇；而且部分藍(lán)色菌落中也可能含有插入子。目前，本領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展已使質(zhì)粒文庫的滴度足以滿足大規(guī)模隨機測序的要求。樹突狀細(xì)胞為體內(nèi)重要的專職抗原提呈細(xì)胞，是機體T細(xì)胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動和調(diào)控者。近年來，樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育、抗原加工提呈機理及其在腫瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已經(jīng)成為免疫學(xué)的前沿領(lǐng)域，從樹突狀細(xì)胞中尋找免疫新分子是目前免疫學(xué)領(lǐng)域的一大研究熱點(曹雪濤等，中國免疫學(xué)雜志，1998；3322，Banchereauetal.Nature.1998；392245)。國際上一些知名的生物技術(shù)公司和研究機構(gòu)，如DNAX、HGS、Immunex、Genetech等競相涉足于該領(lǐng)域。樹突狀細(xì)胞新分子的研究對深入闡明其分化發(fā)育、體內(nèi)遷移、生物學(xué)作用及其分子機理具有重大意義，同時也可能為腫瘤、感染(HIV)、移植排斥和自身免疫性疾病的治療提供新的思路和手段。Adema等在人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了能特異趨化初始型T細(xì)胞CC趨化因子DC-CK1，提示其可能與DC對NaiveT細(xì)胞獨特的刺激作用有關(guān)(Ademaetal.Nature.1997；387713)。Anderson等通過EST的同源比較，從人樹突狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TNF受體超家族新成員RANK(ReceptorActivatorofNF-κB)，通過表達(dá)克隆進(jìn)一步克隆到該分子的配體RANKL，并證實RNAK和RANKL的相互作用可以有效維持樹突狀細(xì)胞的活力(Andersonetal.Nature.1997；390175)。Lebecque等從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了溶酶體相關(guān)膜蛋白(DC-LAMP)等免疫新分子(DeSaint-Visetal.Immunity.1998；9326)。由于細(xì)胞因子在維持正常生理功能方面起著重要作用，而且細(xì)胞因子的功能異常也與一些疾病(例如惡性腫瘤、貧血等)密切相關(guān)，因此，為治療目的研究和開發(fā)新的人細(xì)胞因子及其激動劑/抑制劑有重要意義。本發(fā)明的目的是提供一種新的人細(xì)胞因子-CX1蛋白多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的另一目的是提供含CX1蛋白的藥物組合物。在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的CX1蛋白多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、或SEQIDNO5氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人CX1蛋白多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO2或SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO1中45-587位的序列；(b)具有SEQIDNO1中105-587位的序列；(c)具有SEQIDNO1中1-704位的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人CX1蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人CX1蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人CX1蛋白活性的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人CX1蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-704個核苷酸。在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人CX1蛋白多肽活性的化合物，以及抑制人CX1蛋白多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人CX1蛋白多肽的編碼序列或其片段的反義序列。在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CX1蛋白活性的方法，一種方法包括將樣品與CX1反應(yīng)性細(xì)胞接觸，觀察CX1反應(yīng)性細(xì)胞的增殖是否被促進(jìn)，CX1反應(yīng)細(xì)胞的增殖被提高就表示樣品中存在CX1蛋白活性。較佳地，該CX1反應(yīng)性細(xì)胞是TF1細(xì)胞。另一種方法包括將樣品與CX1蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CX1蛋白。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人CX1蛋白多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人CX1蛋白多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人CX1蛋白多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人CX1蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人CX1蛋白多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療免疫疾病、貧血、癌癥等病癥。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1A是本發(fā)明人CX1蛋白的cDNA序列和全長的氨基酸序列。其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫字母表示?！?”表示終止密碼子?！啊睒?biāo)出了信號肽的切割位點。圖1B是本發(fā)明的人CX1蛋白與人白細(xì)胞介素(IL17)蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人CX1蛋白，下方序列是人IL17蛋白。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“”和“.”表示。圖2是對細(xì)胞因子CX1進(jìn)行Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲線圖。圖3是表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-his(-)結(jié)構(gòu)圖。圖4是對重組表達(dá)載體pcDNA-CX1和pCX1-His基因轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞培養(yǎng)上清中CX1和CX1-His表達(dá)情況，進(jìn)行35S代謝標(biāo)記檢測的電泳圖。其中自左向右依次是泳道1，CX1-His；泳道2轉(zhuǎn)染空載體的COS7細(xì)胞對照上清；泳道3，CX1；泳道4轉(zhuǎn)染空載體的COS7細(xì)胞。左側(cè)為分子量大小(kDa)。圖5A是對重組表達(dá)質(zhì)粒pCX1-His基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后培養(yǎng)上清中CX1-His表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行35S代謝標(biāo)記檢測的電泳圖。泳道m(xù)ock為對照；泳道CX1-His為CX1-His表達(dá)產(chǎn)物。左側(cè)為分子量大小(kDa)。圖5B是對重組表達(dá)質(zhì)粒pCX1-His基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后培養(yǎng)上清中CX1-His表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析的電泳圖。泳道1和3為對照，泳道2為CX1-His表達(dá)產(chǎn)物。左側(cè)為分子量大小(kDa)。圖6是對純化的CX1-IgG融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳銀染鑒定的電泳圖。圖中CX1-IgG融合蛋白為單一條帶。左側(cè)泳道為分子量標(biāo)記(kDa)。圖7A顯示了CX1基因轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞培養(yǎng)上清對TF1細(xì)胞的增殖作用。圖7B顯示了CX-His基因轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)上清對TF1細(xì)胞的增殖作用。圖7C顯示了CX1-IgG融合蛋白對TF1細(xì)胞的增殖作用。在本發(fā)明中，術(shù)語“CX1蛋白”、“細(xì)胞因子CX1”可互換使用，都指具有人細(xì)胞因子CX1氨基酸序列的全長形式(SEQIDNO1)或無信號肽的成熟形式(SEQIDNO)的氨基酸序列的人細(xì)胞因子CX1。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的細(xì)胞因子CX1。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的CX1蛋白或多肽”是指CX1蛋白多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化CX1蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。CX1蛋白多肽的純度能用氨基酸序列分析。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括人CX1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人CX1蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“人CX1蛋白多肽”指具有人CX1蛋白活性的SEQIDNO.2或3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人CX1蛋白相同功能的、SEQIDNO.2或3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人CX1蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人CX1DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人CX1蛋白多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人CX1蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人CX1蛋白多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人CX1蛋白多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供人CX1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CX1蛋白多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“人CX1蛋白保守性變異多肽”指與SEQIDNo.2或3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu</table></tables>本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO2或SEQIDNO3的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO2或SEQIDNO3的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼CX1蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的人CX1蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki,etal.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或CX1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的CX1蛋白多肽。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人CX1蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3)．從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，人CX1蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg,etal.Gene,1987,56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(LeeandNathans,JBioChem.2633521,1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人CX1蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。重組的人CX1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療CX1蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笴X1蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。例如，抗體可用于激活或抑制人CX1蛋白的功能。用表達(dá)的重組人CX1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人CX1蛋白功能的多肽分子。另一方面，本發(fā)明還包括對人CX1DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CX1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CX1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CX1蛋白的分子，也包括那些并不影響人CX1蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人CX1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人CX1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人CX1蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292,1976；Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CX1蛋白功能的抗體以及不影響人CX1蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CX1基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CX1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。抗人CX1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人CX1蛋白。此外，與人CX1蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人CX1蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人CX1蛋白的產(chǎn)生或活性?？贵w也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人CX1蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人CX1蛋白陽性的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、慢性髓性白血病細(xì)胞K562、前髓白血病細(xì)胞HL-60、Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞Raji、結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480、肺癌細(xì)胞A549和黑色素瘤細(xì)胞等)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用人CX1蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CX1蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，惡性腫瘤、貧血、造血功能低下等。在使用本發(fā)明CX1蛋白時，還可同時使用其他治療劑，例如EPO、GM-CSF、IL-3、G-CSF等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明CX1蛋白多肽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人CX1蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是安全有效量的CX1蛋白施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。人CX1蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CX1蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的CX1蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的CX1蛋白，以抑制內(nèi)源性的CX1蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將CX1基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶CX1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook,etal.)。另外重組人CX1基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。抑制人CX1mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。能與人CX1蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人CX1蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人CX1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人CX1蛋白水平，可以用作解釋人CX1蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷CX1蛋白起作用的疾病。一種檢測樣品中是否存在CX1蛋白活性的方法是利用CX1反應(yīng)性細(xì)胞進(jìn)行檢測，它包括將樣品與CX1反應(yīng)性細(xì)胞接觸，觀察CX1反應(yīng)性細(xì)胞的增殖是否被促進(jìn)，CX1反應(yīng)細(xì)胞的增殖被提高就表示樣品中存在CX1蛋白活性。在本發(fā)明中，“CX1(蛋白)反應(yīng)性細(xì)胞”指會對CX1蛋白的存在作出反應(yīng)，從而導(dǎo)致增殖增加的細(xì)胞，例如紅白血病細(xì)胞，如TF1細(xì)胞。另一種檢測檢測樣品中是否存在CX1蛋白的方法是利用CX1蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與CX1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CX1蛋白。CX1蛋白的多聚核苷酸可用于CX1蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，CX1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測CX1蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下CX1蛋白的異常表達(dá)。如CX1蛋白DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷CX1蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用CX1蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測CX1蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測CX1基因的突變也可用于診斷CX1蛋白相關(guān)的疾病。CX1蛋白突變的形式包括與正常野生型CX1DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明CX1蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,MendelianInheritanceinMan(可通過與JohnsHopkinsUniversityWelchMedicalLibrary聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的成熟多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQIDNO1所示tccaggcgggcagcagctgcaggctgaccttgcagcttggcggaATGGACTGGCCTCACAACCTGCTGTTT71CTTCTTACCATTTCCATCTTCCTGGGGCTGGGCCAGCCCAGGAGCCCCAAAAGCAAGAGG131AAGGGGCAAGGGCGGCCTGGGCCCCTGGCCCCTGGCCCTCACCAGGTGCCACTGGACCTG191GTGTCACGGATGAAACCGTATGCCCGCATGGAGGAGTATGAGAGGAACATCGAGGAGATG251GTGGCCCAGCTGAGGAACAGCTCAGAGCTGGCCCAGAGAAAGTGTGAGGTCAACTTGCAG311CTGTGGATGTCCAACAAGAGGAGCCTGTCTCCCTGGGGCTACAGCATCAACCACGACCCC371AGCCGTATCCCCGTGGACCTGCCGGAGGCACGGTGCCTGTGTCTGGGCTGTGTGAACCCC431TTCACCATGCAGGAGGACCGCAGCATGGTGAGCGTGCCGGTGTTCAGCCAGGTTCCTGTG491CGCCGCCGCCTCTGCCCGCCACCGCCCCGCACAGGGCCTTGCCGCCAGCGCGCAGTCATG551GAGACCATCGCTGTGGGCTGCACCTGCATCTTCTGAattacctggcccagaagccaggccagcagccc619gagaccatcctccttgcacctttgtgccaagaaaggcctatgaaaagtaaacactgacttttgaaagcaaaaaaaaaaaa699aaaaa704其中包含的多核苷酸序列全長為704個堿基，其開放讀框位于45-587位，編碼全長180個氨基酸的人CX1蛋白(SEQIDNO2)。MDWPHNLLFLLTISIFLGLGQPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLV50SRMKPYARMEEYERNIEEMVAQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSP100WGYSINHDPSRIPVDLPEARCLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVR150RRLCPPPPRTGPCRQRAVMETIAVGCTCIF180其中，氨基酸1-20位為信號肽。去除了信號肽后的成熟的CX1蛋白含160個氨基酸，序列如SEQIDNO3所示。QPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMV50AQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEAR100CLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVME150TIAVGCTCIF160CX1蛋白在氨基酸水平與人、大鼠和小鼠IL-17、HSV早期基因13蛋白有一定同源性(16-18％)。通過PCR克隆出含全長編碼區(qū)的CX1cDNA，插入pcDNA3.1真核表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)以下蛋白的不同表達(dá)質(zhì)粒(1)天然CX1、(2)CX1C端與myc/His融合在一起的融合蛋白CX1-His；以及(3)CX1C端與IgGFc段融合的融合蛋白CX1-IgG。在真核細(xì)胞中進(jìn)行不同形式(融合與非融合)的蛋白表達(dá)，并在非洲綠猴腎細(xì)胞株COS7中進(jìn)行瞬時表達(dá)，在轉(zhuǎn)染后48小時后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測和35S代謝分析，表明細(xì)胞因子CX1基因能在真核細(xì)胞中得到表達(dá)，并分泌至胞外。應(yīng)用CX1C端與myc/His融合以及CX1C端與IgGFc段融合得到不同表達(dá)質(zhì)粒，CX1重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞，均得到有效表達(dá)。用抗myc抗體或抗6His抗體均能從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清中檢測到C端含有myc表位和6His的CX1融合蛋白(CX1-His)，用ProteinG親和層析法從轉(zhuǎn)染CX1-IgG基因的CHO穩(wěn)定表達(dá)克隆株的無血清培養(yǎng)上清中純化到50kD左右的CX1-IgG融合蛋白。為了探討CX1的潛在功能，選擇了紅白血病細(xì)胞株TF1細(xì)胞來檢測CX1的造血調(diào)控作用。TF1對GM-CSF、IL-3和EPO均有增殖反應(yīng)(Murateetal.ExpCellRes.20835)。試驗表明，不同稀釋度含CX1和CX1-His培養(yǎng)上清和純化的融合蛋白CX1-IgG對TF1細(xì)胞均有一定的增殖促進(jìn)作用。這表明CX1蛋白是一種新的細(xì)胞因子。此外，TF1作為CX1反應(yīng)性細(xì)胞，可用于CX1生物學(xué)活性檢測。試驗還表明，單獨應(yīng)用CX1-IgG對CD34+骨髓干細(xì)胞的增殖分化無明顯促進(jìn)作用，但能促進(jìn)GM-CSF/G-CSF/IL-3誘導(dǎo)的粒系分化和IL-3/EPO誘導(dǎo)的紅系分化。還初步觀察到CX1促進(jìn)單核細(xì)胞分泌NO、TNF和IL-6。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1人CX1蛋白cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆SBBI30的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQIDNO1所示)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQIDNO2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人CX1蛋白，其編碼基因命名為人CX1基因。序列SEQIDNO1全長為704bp，包括42bp的5′端非編碼區(qū)和117bp的3′端非編碼區(qū)，編碼含180個氨基酸的多肽。根據(jù)Kyte-Doolitte疏水性分析和GCG軟件預(yù)測N端含由20個氨基酸組成的信號肽，這表明CX1蛋白是分泌蛋白。成熟的CX1蛋白由160個氨基酸組成，含有8個半胱氨酸，可能參與分子內(nèi)和/或分子間二硫鍵的形成；55位Asn符合糖基化共有序列NXS/T，為潛在的糖基化位點。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量為18.1kD。BLAST分析表明其與已知基因不同，蛋白水平與人、大鼠和小鼠IL-17、HSV早期基因13蛋白有同源性(16-18％)，推測可能是一新的細(xì)胞因子，命名為細(xì)胞因子CX1。實施例2用RT-PCR方法克隆人CX1蛋白的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞總RNA，取6μg細(xì)胞總RNA與0.5μgOligo-dT12-18]]>混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μlddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴(kuò)增CX1所用的引物如下引物#2615′-ggaattcgccaccatggactggcctcacaac-3‘(SEQIDNO6)，引物#3545′-ggggtacctcagaagatgcaggtgcagccc-3’(SEQIDNO7)。引物#261在起始密碼子ATG前引入gccacc利于提高表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4μM引物、0.2μMdNTP和1UExTaqDNA聚合酶(TakaraInc.)，擴(kuò)增參數(shù)為94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。DNA序列分析結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQIDNO1所示的45-587bp編碼區(qū)完全相同。實施例3CX1蛋白的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進(jìn)行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。Northern印跡雜交顯示細(xì)胞因子CX1在腎、腎上腺、心臟、骨骼肌、肝和胰腺等組織中的表達(dá)水平較高，在胎盤、睪丸、卵巢、外周血白細(xì)胞、結(jié)腸和肺等組織中呈低水平表達(dá)，在腦、脾、胸腺、小腸和前列腺中未檢測到明顯的陽性信號；在腫瘤細(xì)胞如人淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞Molt-4、慢性髓性白血病細(xì)胞K562、前髓白血病細(xì)胞HL-60、Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞Raji、結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480、肺癌細(xì)胞A549和黑色素瘤細(xì)胞G361均有不同程度的mRNA表達(dá)。此外，細(xì)胞因子CX1在腫瘤組織中廣泛表達(dá)，提示其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用，但也可能是腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控紊亂的繼發(fā)表現(xiàn)。實施例4細(xì)胞因子CX1重組表達(dá)載體pcDNA-CX1,pCX1-His和pCX1-Fc的構(gòu)建構(gòu)建中所用的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/neo(Invitrogen公司)結(jié)構(gòu)如圖3所示。它含CMV啟動子、SV40復(fù)制起始點、新霉素抗性基因，可進(jìn)行目的基因的短暫表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。在其外源基因克隆位點的下游，含有myc表位和6個連續(xù)組氨酸(6his)編碼序列和該讀框的終止密碼子，因此可根據(jù)需要表達(dá)C端連有myc表位和6His的融合蛋白，利用6His進(jìn)行蛋白純化，利用myc表位檢測表達(dá)的融合蛋白。此外，外源基因克隆位點的兩端分別是含有T7啟動子和牛生長激素BGH的polyA信號，可用T7和BGH通用引物對主的外源基因進(jìn)行直接測序。(1)構(gòu)建表達(dá)天然的細(xì)胞因子CX1的表達(dá)載體pcDNA-CX1以實施例2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，行PCR擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增CX1引物如表2所示，其中pcDNA-CX1反義鏈引物中包括CX1的終止密碼子，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物記為CX1-CQ，大小為564bp；由于編碼CX1蛋白的開放讀框中含有CX1本身的終止密碼子，其下游的myc表位和6His無法翻譯，因此所表達(dá)的CX1重組蛋白氨基酸序列與天然CX1理論上完全一致，不含myc表位和6His。用于CX1瞬時表達(dá)的研究PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，直接連入同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重組載體記為pcDNA-CX1。其CX1的基因序列經(jīng)T7和BGH引物測序確證。(2)構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞因子CX1的C末端與myc/His融合的融合蛋白CX1-His的表達(dá)載體pCX1-His的構(gòu)建按類似的方法構(gòu)建表達(dá)載體pCX1-His，不同點在于pCX1-His反義鏈引物(表2)中去除CX1的終止密碼子，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物記為CX1-BN，預(yù)計大小為563bp，所表達(dá)的重組蛋白CX1-HisC端含有myc表位和6His，成熟蛋白的理論分子量為22kD。用于CX1穩(wěn)定表達(dá)的研究。PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，直接連入同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重組載體記為pCX1-His?；蛐蛄薪?jīng)T7和BGH引物測序確證。(3)構(gòu)建表達(dá)細(xì)胞因子CX1的C末端與IgG-Fc片段融合的融合蛋白CX1-IgG的表達(dá)載體pCX1-Fc的構(gòu)建pCX1-Fc的構(gòu)建需從B淋巴瘤細(xì)胞株Raji中通過RT-PCR克隆編碼人IgG1CH2和CH3的cDNA，其中下游引物含有IgG的終止密碼子，擴(kuò)增Fc引物如表2所示。擴(kuò)增產(chǎn)物記為IgG1Fc，預(yù)計為740bp。CX1與Fc在同一讀框中融合，CX1的cDNA位于Fc上游，所表達(dá)的融合蛋白前體為414個氨基酸，其中含由20個氨基酸的CX1信號肽，因此在真核細(xì)胞中表達(dá)時，分泌至胞外的成熟融合蛋白理論上為395個氨基酸(SEQIDNO5)，分子量為46.8kD。將上述Fc的PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切。然后與EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后CX1-His擴(kuò)增產(chǎn)物、以及EcoRⅠ和KnpⅠ酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)大片段混合，連接后形成的重組載體記為pCX1-Fc?；蛐蛄薪?jīng)T7和BGH引物測序確證。表2用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物序列<tablesid="table2"num="002"><table>產(chǎn)物寡核苷酸(5’-3′)酶切位點產(chǎn)物大小CX1-CQ有義ggaattcgccaccatggactggcctcacaac(SEQIDNO6)EcoRⅠ564bp反義GGGGTACCTCAGAAGATGCAGGTGCAGCCC(SEQIDNO7)KpnⅠCX1-BN有義ggaattcgccaccatggactggcctcacaac(SEQIDNO6)EcoRⅠ563bp反義ggatccGGGAAGATGCAGGTGCA(SEQIDNO8)BamHⅠIgG1Fc有義CGGGATCCGCCCAAATCTTCTGACAAAC(SEQIDNO9)BamHⅠ740bp反義GGGGTACCTCATTTACCCGGAGACAG(SEQIDNO10)KpnⅠ</table></tables>注下劃線表示酶切位點。實施例5細(xì)胞因子CX1的真核重組表達(dá)將重組質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體按一定比例混合，室溫作用45分鐘；等轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗兩遍后與DNA混合。瞬時表達(dá)時，于轉(zhuǎn)染48-72小時收集培養(yǎng)上清；穩(wěn)定表達(dá)時，于轉(zhuǎn)染后72小時加G418進(jìn)行篩選，得到陽性克隆株，擴(kuò)增后收集培養(yǎng)上清。進(jìn)行CX1真核細(xì)胞重組表達(dá)的35S代謝標(biāo)記時，轉(zhuǎn)染后收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞代謝的35S摻入標(biāo)記，摻入4小時收集培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳和放射自顯影分析。轉(zhuǎn)染pCX1-His或?qū)φ召|(zhì)粒的293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)克隆株的培養(yǎng)上清，經(jīng)centricon(截留分子量10kD)超濾濃縮后行15％的SDS-PAGE電泳。先將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7進(jìn)行瞬時表達(dá)，并對CX1和CX1-His的表達(dá)進(jìn)行35S的代謝標(biāo)記。轉(zhuǎn)染后48小時，通過35S標(biāo)記在COS7培養(yǎng)上清中檢測到了預(yù)計的表達(dá)產(chǎn)物，其中主帶CX1蛋白的大小約為20kD，CX1-His有23kD和26kD兩種不同大小的表達(dá)產(chǎn)物(圖4)。將pCX1-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)克隆細(xì)胞株，檢測到相同的結(jié)果見圖5A和5B。圖5A是對重組表達(dá)質(zhì)粒pCX1-His基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后培養(yǎng)上清中CX1-His表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行35S代謝標(biāo)記檢測的電泳圖。泳道m(xù)ock為轉(zhuǎn)染空白載體的293細(xì)胞對照上清；泳道CX1-His為CX1-His表達(dá)產(chǎn)物。圖5B是對重組表達(dá)質(zhì)粒pCX1-His基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后培養(yǎng)上清中CX1-His表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析的電泳圖。電泳結(jié)果都顯示，出現(xiàn)了融合蛋白CX1-His的主帶。實施例6細(xì)胞因子CX1融合蛋白CX1-IgG的純化融合表達(dá)質(zhì)粒pCX1Fc轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，得到的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株在HyQCCM無血清培養(yǎng)基(HycloneInc.)中擴(kuò)增培養(yǎng)。收集其培養(yǎng)上清，用ProteinG親和層析柱HiTrap(Pharmacia)純化，經(jīng)檸檬酸(pH3.0)洗脫后迅速調(diào)pH值至7.6，行15％SDS-PAGE電泳和銀染檢測其表觀分子量和蛋白純度(圖6)，為單一條帶。分析鑒定的CX1-IgG重組蛋白過濾后-20℃保存。實施例7細(xì)胞因子CX1對紅白血病細(xì)胞TF1的增殖作用待測細(xì)胞因子CX1重組表達(dá)上清、CX1-His融合蛋白的重組表達(dá)上清、純化的融合蛋白CX1-IgG(500ng/ml)和人GM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品在96孔培養(yǎng)板中行1∶2倍比稀釋，每個稀釋度設(shè)3個復(fù)孔，每孔50μl；加對數(shù)生長期的TF1細(xì)胞，最終的培養(yǎng)體系中含10％FCS。于37℃培養(yǎng)72小時后，MTT法檢測對TF1的增殖作用。結(jié)果如圖7A-C所示，圖7A顯示了CX1基因轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞培養(yǎng)上清對TFl細(xì)胞的增殖作用。圖7B顯示了CX-His基因轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)上清對TF1細(xì)胞的增殖作用。圖7C顯示了CX1-IgG融合蛋白對TF1細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)不同稀釋度含CX1和CX1-His培養(yǎng)上清對TF1均有一定的增殖作用(圖7A和B)。純化的CX1-IgG能有效刺激TF1細(xì)胞增殖，有效劑量約＞2ng/ml，而CTLA-IgG對照融合蛋白對TF1的增殖無明顯作用(圖7C)。實施例8細(xì)胞因子CX1對骨髓CD34+造血干細(xì)胞的增殖作用從患者取下的胸骨沖洗出骨髓細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，懸浮于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時以去除其中的基質(zhì)細(xì)胞；加入MACS標(biāo)記液，非特異性阻斷抗體液(A1)、生物素標(biāo)記抗CD34單抗液(A2)和磁珠交聯(lián)的抗生物素懸液(B)200μl經(jīng)磁性細(xì)胞分離柱分選，收集陽性細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀(FACScalibur)檢測細(xì)胞表面CD34的表達(dá)以鑒定細(xì)胞。用IMDM配成1×104/ml，在24孔板(1ml/孔)中培養(yǎng)，分別進(jìn)行粒系和紅系的體外誘導(dǎo)分化。粒系誘導(dǎo)體系為IL-3+GM-CSF+G-CSF；紅系誘導(dǎo)體系為IL-3+EPO；生長因子的終濃度為IL-3和GM-CSF20ng/ml,G-CSF為100U/ml,EPO2U/ml。于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)3天。在上述粒系和紅系的體誘導(dǎo)體系中加入100ng/ml的CX1-IgG融合蛋白，觀察其對CD34+骨髓干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的作用，同時用CTLA-IgG(100ng/ml)作為其對照。第3天，采用甲基纖維素法進(jìn)行粒單細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFU-GM)和紅系細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFU-E)培養(yǎng)。加入20％胎牛血清、20％細(xì)胞IMDM培養(yǎng)液(含經(jīng)誘導(dǎo)的CD34+細(xì)胞)、10％GM-CSF(100U/ml)和50％甲基纖維素(27g/L)。將混合物加入96孔培養(yǎng)板，100μl/孔，每組設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)后第7天，在倒置顯微鏡下計數(shù)集落，每個集落至少含40個細(xì)胞。FACS檢測CD34+細(xì)胞純度＞88％。CX1單獨對CD34+骨髓干細(xì)胞的體外增殖和分化無明顯促進(jìn)作用，但能促進(jìn)GM-CSF/G-CSF/IL-3對CD34+骨髓干細(xì)胞的粒系誘導(dǎo)分化作用，見下表3。對照組CTLA-IgG融合蛋白無明顯促進(jìn)作用，見表4。CX1-IgG對IL-3/EPO誘導(dǎo)的紅系分化具有顯著的促進(jìn)作用。表1CX1-IgG促進(jìn)GM-CSF/G-CSF/IL-3誘導(dǎo)的CD34+骨髓干細(xì)胞粒系分化*p＜0.01，與對照相比實施例9抗人CX1蛋白抗體的產(chǎn)生將實施例7中獲得的重組蛋白CX1-IgG用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人CXl基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的人細(xì)胞因子、其編碼序列及用途(ⅲ)序列數(shù)目10(2)SEQIDNO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度704bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO1tccaggcgggcagcagctgcaggctgaccttgcagcttggcggaATGGACTGGCCTCACA60ACCTGCTGTTTCTTCTTACCATTTCCATCTTCCTGGGGCTGGGCCAGCCCAGGAGCCCCA120AAAGCAAGAGGAAGGGGCAAGGGCGGCCTGGGCCCCTGGCCCCTGGCCCTCACCAGGTGC180CACTGGACCTGGTGTCACGGATGAAACCGTATGCCCGCATGGAGGAGTATGAGAGGAACA240TCGAGGAGATGGTGGCCCAGCTGAGGAACAGCTCAGAGCTGGCCCAGAGAAAGTGTGAGG300TCAACTTGCAGCTGTGGATGTCCAACAAGAGGAGCCTGTCTCCCTGGGGCTACAGCATCA360ACCACGACCCCAGCCGTATCCCCGTGGACCTGCCGGAGGCACGGTGCCTGTGTCTGGGCT420GTGTGAACCCCTTCACCATGCAGGAGGACCGCAGCATGGTGAGCGTGCCGGTGTTCAGCC480AGGTTCCTGTGCGCCGCCGCCTCTGCCCGCCACCGCCCCGCACAGGGCCTTGCCGCCAGC540GCGCAGTCATGGAGACCATCGCTGTGGGCTGCACCTGCATCTTCTGAattacctggccca600gaagccaggccagcagcccgagaccatcctccttgcacctttgtgccaagaaaggcctat660gaaaagtaaacactgacttttgaaagcaaaaaaaaaaaaaaaaa704(2)SEQIDNO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度180個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO2MDWPHNLLFLLTISIFLGLGQPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLV50SRMKPYARMEEYERNIEEMVAQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSP100WGYSINHDPSRIPVDLPEARCLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVR150RRLCPPPPRTGPCRQRAVMETIAVGCTCIF180(2)SEQIDNO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度160個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO3QPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMV50AQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEAR100CLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVME150TIAVGCTCIF160(2)SEQID.NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度191個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO4QPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMV50AQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEAR100CLCLGCVNPETMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVME150TIAVGCTCIFPDPSSVPSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH191(2)SEQDNO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度395個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO5QPRSPKSKRKGQGRPGPLAPGPHQVPLDLVSRMKPYARMEEYERNIEEMV50AQLRNSSELAQRKCEVNLQLWMSNKRSLSPWGYSINHDPSRIPVDLPEAR100CLCLGCVNPFTMQEDRSMVSVPVFSQVPVRRRLCPPPPRTGPCRQRAVME150TIAVGCTCIFPDPEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM200ISRTLEVTCVVVDVSHEDLEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV250VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP300PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG350SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK395(2)SEQIDNO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO6GGAATTCGCCACCATGGACTGGCCTCACAAC31(2)SEQIDNO7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO7GGGGTACCTCAGAAGATGCAGGTGCAGCCC30(2)SEQIDNO8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO8GGATCCGGGAAGATGCAGGTGCA23(2)SEQIDNO9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO9CGGGATCCGCCCAAATCTTCTGACAAAC28(2)SEQIDNO10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO10GGGGTACCTCATTTACCCGGAGACAG2權(quán)利要求1．一種分離的人CX1蛋白多肽，其特征在于，它包含具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有選自下組氨基酸序列的多肽SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。3．一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。4．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO2或SEQIDNO3所示氨基酸序列的多肽。5．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQIDNO1中45-587位的序列；(b)具有SEQIDNO1中105-587位的序列；(c)具有SEQIDNO1中1-704位的序列。6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。7．一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。8．一種具有人CX1蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人CX1蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人CX1蛋白活性的多肽。9．一種能與權(quán)利要求1所述的人CX1蛋白特異性結(jié)合的抗體。10．一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-704個核苷酸。11．一種檢測CX1蛋白生物學(xué)活性的方法，其特征在于，包括將樣品與CX1反應(yīng)性細(xì)胞接觸，觀察CX1反應(yīng)性細(xì)胞的增殖是否被促進(jìn)，CX1反應(yīng)細(xì)胞的增殖被提高就表示樣品中存在CX1蛋白活性。12．如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，該CX1反應(yīng)性細(xì)胞是TF1細(xì)胞。13．一種檢測樣品中是否存在CX1蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CX1蛋白。14．如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于篩選促進(jìn)人CX1蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制人CX1蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。15．一種如權(quán)利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。16．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的人細(xì)胞因子－CX1蛋白,編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法,如貧血、造血功能低下等。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人CX1蛋白的多核苷酸的用途。本發(fā)明還提供了含CX1蛋白的藥物組合物。文檔編號C12N15/64GK1299823SQ9912423公開日2001年6月20日申請日期1999年12月10日優(yōu)先權(quán)日1999年12月10日發(fā)明者章衛(wèi)平,曹雪濤,陳國友,萬濤,鞠佃文,陶群,雷虹申請人:上海華晨生物技術(shù)研究所