專利名稱：：新的人cd20同源分子、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼免疫細(xì)胞膜分子-CD20LM(CD20-likemolecular，簡(jiǎn)稱為“CD20LM”)蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的與B淋巴瘤診斷和治療有關(guān)的細(xì)胞表面分子。免疫細(xì)胞膜分子的研究對(duì)于深入了解免疫應(yīng)答的本質(zhì)以及臨床某些疾病的診斷、預(yù)防和治療都具有十分重要的意義。CD分子在各種生命現(xiàn)象和疾病發(fā)生發(fā)展過程中有著重要意義。CD抗原及其相應(yīng)的單克隆抗體在基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)研究中已得到廣泛的應(yīng)用，CD單克隆抗體可用于1．檢測(cè)機(jī)體免疫功能的狀態(tài)；2．對(duì)白血病、淋巴瘤進(jìn)行診斷和免疫分型，為治療提供依據(jù)；3．制備的免疫毒素可治療腫瘤或用于骨髓移植、移植排斥反應(yīng)的防治等。因此，新的CD分子的發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)和臨床免疫方面均具有深遠(yuǎn)的意義。人CD20分子是一種分子量為33-37KD的細(xì)胞膜糖蛋白，其基因定位于第11號(hào)染色體，長(zhǎng)約為16Kb。CD20特異性地表達(dá)于B細(xì)胞，其主要功能是起到Ca2+通道的作用。針對(duì)CD20特異性地表達(dá)于B細(xì)胞這一現(xiàn)象，人們寄希望于將CD20分子作為治療B淋巴瘤的靶分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人B淋巴瘤確實(shí)高表達(dá)CD20分子。隨后美國(guó)學(xué)者制備了抗CD20單克隆抗體(命名為Rituximab)，并于1997年11月通過FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床治療。Rituximab是用重組技術(shù)將鼠的免疫球蛋白可變區(qū)和人IgG1的恒定區(qū)組合在一起而形成的嵌合抗體，可介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用和抗體依賴的細(xì)胞殺傷。一些抗化療藥物的淋巴瘤細(xì)胞株對(duì)Rituximab敏感，并可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。Rituximab是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于腫瘤的單克隆抗體治療方案，也是第一個(gè)用于淋巴瘤治療的單一藥物治療方案。應(yīng)用該方案對(duì)166名難治性或復(fù)發(fā)的淋巴瘤患者進(jìn)行了治療，總有效率為48％，其中6％達(dá)完全緩解，42％達(dá)部分緩解，中位有效時(shí)間為13.2個(gè)月。治療后血清中Rituximab水平可持續(xù)3-6個(gè)月，有些病人出現(xiàn)幾個(gè)月的延遲性腫瘤縮小的后效應(yīng)。在60名應(yīng)用Rituximab治療有效后又復(fù)發(fā)的病例中，再次使用該藥仍有40％的有效率(Grillo-Lopezetal.SeminOncol.1999,2666)。目前，正在進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用Rituximab與干擾素、化療(CHOP方案)及放療(應(yīng)用放射性131I或90Y標(biāo)記CD20抗體進(jìn)行導(dǎo)向性治療)等治療方法的研究(Press.SeminOncol,1999,2658)，取得了較好的結(jié)果。其中在38名緩慢進(jìn)展型淋巴瘤的治療中，Rutuximab和CHOP方案聯(lián)合應(yīng)用有效率為100％，中位無進(jìn)展生存期超過2.5年。在31名中度惡性淋巴瘤中，和CHOP方案聯(lián)合應(yīng)用有效率為96％。同時(shí)，也有研究者應(yīng)用Rituximab對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病(Vartholomatosetal.ActaHaematol.1999,10294)、毛細(xì)胞白血病(Hagberg.MedOncol.1999,16221)、AIDS相關(guān)淋巴瘤和中樞神經(jīng)淋巴瘤進(jìn)行治療的報(bào)道。Rituximab進(jìn)行臨床治療的耐受性良好，說明這種治療方法和手段具有很大前景。但尚有一些分型的淋巴瘤患者及其他腫瘤對(duì)此種治療療效不佳，這提示對(duì)淋巴瘤細(xì)胞或其他腫瘤細(xì)胞其他表面分子及其抗體的研究尚有很大空間。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的新的細(xì)胞表面分子，尤其是在腫瘤細(xì)胞如淋巴瘤細(xì)胞中高表達(dá)和或特異性表達(dá)的表面分子。本發(fā)明的目的是提供一種新的人CD分子-CD20LM多肽以及其片段、類似物和衍生物。這種新CD分子與CD20同源，且高表達(dá)于B淋巴瘤，因此可作為一種新的B淋巴瘤治療靶分子。針對(duì)CD20LM蛋白的特異性抗體(尤其是單克隆抗體)，可用于B淋巴瘤的診斷和治療，因此CD20LM蛋白是一種具有重要功能和具有很大應(yīng)用前景的免疫分子。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的另一目的是提供含CD20LM蛋白或其拮抗劑的藥物組合物。在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的CD20LM多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人CD20LM多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO1中97-774位的序列；(b)具有SEQIDNO1中1-1289位的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人CD20LM蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人CD20LM蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人CD20LM蛋白活性的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人CD20LM多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-1289個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人CD20LM多肽活性的化合物，以及抑制人CD20LM多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人CD20LM多肽的編碼序列或其片段的反義序列。在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在CD20LM蛋白的方法，它包括將樣品與CD20LM蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CD20LM蛋白。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與人CD20LM多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人CD20LM多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人CD20LM多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人CD20LM蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人CD20LM多肽或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療癌癥如B淋巴瘤等病癥。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1是本發(fā)明的人CD20LM的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫字母表示圖2是本發(fā)明的人CD20LM蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列。圖3是本發(fā)明的人CD20LM蛋白與人CD20蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。下方序列是人CD20LM，上方序列是人CD20蛋白。相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“｜”標(biāo)出，相似的氨基酸用“”或“.”標(biāo)出。圖4是本發(fā)明的人CD20LM的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲線圖。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的CD20LM蛋白或多肽”是指CD20LM多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化CD20LM蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。CD20LM多肽的純度能用氨基酸序列分析。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括人CD20LM蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人CD20LM蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“人CD20LM多肽”指具有人CD20LM蛋白活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人CD20LM蛋白相同功能的、SEQIDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人CD20LM蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人CD20LMDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人CD20LM多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人CD20LM多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人CD20LM多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人CD20LM多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供人CD20LM蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CD20LM多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“人CD20LM蛋白保守性變異多肽”指與SEQIDNO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsn</table></tables>本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼CD20LM蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的人CD20LM核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki,etal.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或CD20LM蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的CD20LM多肽。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人CD20LM蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3)．從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，人CD20LM蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg,etal.Gene,1987,56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(LeeandNathans,JBioChem.2633521,1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人CD20LM蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。重組的人CD20LM蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療CD20LM蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笴D20LM蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人CD20LM蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激人CD20LM蛋白功能的多肽分子。另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人CD20LMDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CD20LM基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CD20LM基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CD20LM蛋白的分子，也包括那些并不影響人CD20LM蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人CD20LM基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人CD20LM基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人CD20LM蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292,1976；Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CD20LM蛋白功能的抗體以及不影響人CD20LM蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CD20LM基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CD20LM基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得?？谷薈D20LM蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人CD20LM蛋白。此外，與人CD20LM蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人CD20LM蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人CD20LM蛋白的產(chǎn)生或活性?？贵w也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人CD20LM蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人CD20LM蛋白陽性的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞，如B淋巴瘤細(xì)胞等)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用人CD20LM蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CD20LM蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明的多肽或其抗體可直接用于疾病治療，例如，惡性腫瘤、B淋巴瘤等。在使用本發(fā)明CD20LM蛋白或其抗體時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑，例如干擾素、Rituximab等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明CD20LM多肽或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的CD20LM蛋白或其拮抗劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。人CD20LM蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CD20LM蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的CD20LM蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的CD20LM蛋白，以抑制內(nèi)源性的CD20LM蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將CD20LM基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶CD20LM基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook,etal.)。另外重組人CD20LM基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。抑制人CD20LMmRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。能與人CD20LM蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)人CD20LM蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人CD20LM蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人CD20LM蛋白水平，可以用作解釋人CD20LM蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷CD20LM蛋白起作用的疾病。一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在CD20LM蛋白的方法是利用CD20LM蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與CD20LM蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CD20LM蛋白。CD20LM蛋白的多聚核苷酸可用于CD20LM蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，CD20LM蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)CD20LM蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下CD20LM蛋白的異常表達(dá)。如CD20LMDNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷CD20LM蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用CD20LM蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)CD20LM蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測(cè)CD20LM基因的突變也可用于診斷CD20LM蛋白相關(guān)的疾病。CD20LM蛋白突變的形式包括與正常野生型CD20LMDNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明CD20LM蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,MendelianInheritanceinMan(可通過與JohnsHopkinsUniversityWelchMedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的成熟多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQIDNO1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1289個(gè)堿基，其開放讀框位于97-774位，編碼全長(zhǎng)180個(gè)氨基酸的人CD20LM蛋白(SEQIDNO2)。本發(fā)明的CD20LM蛋白在氨基酸水平與人CD20蛋白有一定同源性(有28％的一致性，37％的相似性)。更重要的是，CD20LM蛋白在Raji、Daudi等B淋巴瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因此它可作為攻擊或殺滅B淋巴瘤細(xì)胞等癌細(xì)胞的靶分子，因而具有巨大的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1人CD20LMcDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測(cè)定隨機(jī)挑選克隆的5′末端的序列。將測(cè)定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)cDNA克隆的DNA序列為新的全長(zhǎng)cDNA。通過合成一系列引物對(duì)新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測(cè)定。計(jì)算機(jī)分析表明，克隆所含的全長(zhǎng)cDNA是一個(gè)新的cDNA序列(如SEQIDNO1所示)，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如SEQIDNO2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人CD20LM，其編碼基因命名為人CD20LM基因。序列SEQIDNO1全長(zhǎng)為1289bp，包括96bp的5′端非編碼區(qū)和514bp的3′端非編碼區(qū)。編碼區(qū)為97-774位，編碼含225個(gè)氨基酸的多肽。理論上計(jì)算未糖基化的成熟分子的分子量為24kD。BLAST分析表明其與已知基因不同，在蛋白水平與人CD20有一定程度同源(圖3)，推測(cè)可能是新的類CD20分子，命名為CD20LM。實(shí)施例2用RT-PCR方法克隆人CD20LM的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞總RNA，取6μg細(xì)胞總RNA與0.5μgOligo-dT12-18混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μlddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴(kuò)增所用的引物如下有義引物5′-AGAAACCGTTGATGGGACTGAGAAACCAGA-3′(SEQIDNO3)，反義引物5′GATTCAACAATACATTTTTAATATAGCTTT-3′(SEQIDNO4)。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4μM引物、0.2μMdNTP和1UExTaqDNA聚合酶(TakaraInc.)，擴(kuò)增參數(shù)為94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25個(gè)循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。檢測(cè)到約1300bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。DNA序列分析結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQIDNO1所示的1-1274位完全相同。對(duì)CD20LM蛋白進(jìn)行Kyte-doolitte疏水性分析(圖4)，表明它是一個(gè)膜蛋白。實(shí)施例3CD20LM的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進(jìn)行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時(shí)。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時(shí)。Northern印跡雜交結(jié)果顯示在肝、脾、外周血中有一定表達(dá)，尤其是在Raji、Daudi等B淋巴瘤細(xì)胞株有很高水平的高表達(dá)。實(shí)施例4人CD20LM重組表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人CD20LMDNA作為插入片段。PCR反應(yīng)中使用的5′端寡核苷酸引物序列為5’-cgggatccATGACATCACAACCTGTtcc-3’(SEQIDNO5)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的編碼序列的部分核苷酸；3′端引物序列為5’-cgggatccTTAAGTGAAGCCGGCCA-3’(SEQIDNO.6)，該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人CD20LM的部分編碼序列。CD20LMcDNAPCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHⅠ酶切再與質(zhì)粒pUC18按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測(cè)序(ABI公司的377型測(cè)序儀，BigDyeTerminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的CD20LMcDNABamHⅠ酶切片段克隆至表達(dá)載體pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成載體pGEX-2T-CD20LM并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。陽性克隆用EcoRⅠ酶切鑒定插入方向，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，已插入了完整的CD20LM編碼序列。挑表達(dá)CD20LM的陽性DH5α克隆接種于100ml2×YTA培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr,1∶10稀釋于預(yù)熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃誘導(dǎo)2-6hr,5,000g4℃離心10min去上清，置冰上用50ml1×PBS(0.14MNaCl,2.7mMKCl,10.1mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)重懸，超聲(B.BraunLabsonicU)破碎后再加入20％TritonX-100至1％輕搖30min，然后12,000g4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml50％谷胱甘肽Sepharose4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mMTris-HCl,pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到N端含GST的人CD20LM融合蛋白，經(jīng)thrombin(Sigma)酶切去除GST后得到CD20LM蛋白，分子量約為24kD。用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，證實(shí)其N端序列與SEQIDNO2所示的N端序列相符。實(shí)施例5抗人CD20LM抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例4中獲得的重組蛋白CD20LM用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人CD20LM基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的人CD20同源分子、其編碼序列及用途(ⅲ)序列數(shù)目6(2)SEQIDNO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1289bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO1AGAAACCGTTGATGGGACTGAGAAACCAGAGTTAAAACCTCTTTGGAGCTTCTGAGGACT60CAGCTGGAACCAACGGGCACAGTTGGCAACACCATCATGACATCACAACCTGTTCCCAAT120GAGACCATCATAGTGCTCCCATCAAATGTCATCAACTTCTCCCAAGCAGAGAAACCCGAA180CCCACCAACCAGGGGCAGGATAGCCTGAAGAAACATCTACACGCAGAAATCAAAGTTATT240GGGACTATCCAGATCTTGTGTGGCATGATGGTATTGAGCTTGGGGATCATTTTGGCATCT300GCTTCCTTCTCTCCAAATTTTACCCAAGTGACTTCTACACTGTTGAACTCTGCTTACCCA360TTCATAGGACCCTTTTTTTTTATCATCTCTGGCTCTCTATCAATCGCCACAGAGAAAAGG420TTGACCAAGCTTTTGGTGCATAGCAGCCTGGTTGGAAGCATTCTGAGTGCTCTGTCTGCC480CTGGTGGGTTTCATTATCCTGTCTGTCAAACAGGCCACCTTAAATCCTGCCTCACTGCAG540TGTGAGTTGGACAAAAATAATATACCAACAAGAAGTTATGTTTCTTACTTTTATCATGAT600TCACTTTATACCACGGACTGCTATACAGCCAAAGCCAGTCTGGCTGGATCTCTCTCTCTG660ATGCTGATTTGCACTCTGCTGGAATTCTGCCTAGCTGTGCTCACTGCTGTGCTGCGGTGG720AAACAGGCTTACTCTGACTTCCCTGGGGTGAGTGTGCTGGCCGGCTTCACTTAACCTTGC780CTAGTGTATCTTATCCCTGCACTGTGTTGAGTATGTCACCAAGAGTGGTAGAAGGAACAA840CCAGCCAATCACGAGATCACATGGGAGGGCATTTGCATTGTGATGGAAGACAGAGAAGAA900AAGCAGATGGCAATTGAGTAGCTGATAAGCTGAAAATTCACTGGATATGAAAATAGTTAA960TCATGAGAAATCAACTGATTCAATCTTCCTATTTTGTCAGCGAAGGGAATGAGACTCTGG1020GAAGTTAAATGACTGGCCTGGCATTATGCTATGAGTTTGTGCCTTTGCTGAGGACACTAG1080AACCTGGCTTGCCTCCCTTATAAGCAGAAACAATTTCTGCCACAACCACTAGTCTCTTTA1140ATAGTATTGACTTGGTAAAGGGCATTTACACACGTAACTGGATCCAGTGAATGTCTTATG1200CTCTGCATTTGCCCCTGGTGATCTTAAAATTCGTTTGCCTTTTTAAAGCTATATTAAAAA1260TGTATTGTTGAATCAAAAAAAAAAAAAAA1289(2)SEQIDNO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度225個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO2MTSQPVPNETIIVLPSNVINFSQAEKPEPTNQGQDSLKKHLHAEIKVIGTIQILCGMMVL60SLGIILASASFSPNFTQVTSTLLNSAYPFIGPFFFIISGSLSIATEKRLTKLLVHSSLVG120SILSALSALVGFIILSVKQATLNPASLQCELDKNNIPTRSYVSYFYHDSLYTTDCYTAKA180SLAGSLSLMLICTLLEFCLAVLTAVLRWKQAYSDFPGVSVLAGFT225(2)SEQIDNO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO3AGAAACCGTTGATGGGACTGAGAAACCAGA30(2)SEQIDNO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO4GATTCAACAATACATTTTTAATATAGCTTT30(2)SEQIDNO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO5CGGGATCCATGACATCACAACCTGTTCC28(2)SEQIDNO6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO6CGGATCCTTAAGTGAAGCCGGCCA2權(quán)利要求1．一種分離的人CD20LM多肽，其特征在于，它包含具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽。3．一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。4．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽。5．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQIDNO1中97-774位的序列；(b)具有SEQIDNO1中1-1289位的序列。6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。7．一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。8．一種具有人CD20LM蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人CD20LM蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人CD20LM蛋白活性的多肽。9．一種能與權(quán)利要求1所述的人CD20LM蛋白特異性結(jié)合的抗體。10．一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-1289個(gè)核苷酸。11．一種檢測(cè)樣品中是否存在CD20LM蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CD20LM蛋白。12．如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于篩選促進(jìn)人CD20LM蛋白活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人CD20LM蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。13．一種如權(quán)利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。14．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽或權(quán)利要求9所述的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及了一種新的人細(xì)胞表面蛋白分子－CD20LM蛋白,它與人CD20有同源性。本發(fā)明提供編碼此蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人CD20LM的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了此種蛋白在B淋巴瘤表面高表達(dá)的特征。本發(fā)明還公開了抗此蛋白分子的拮抗劑及其治療作用,特別是可用于B淋巴瘤的診斷和治療。文檔編號(hào)C12N15/11GK1299827SQ9912426公開日2001年6月20日申請(qǐng)日期1999年12月16日優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日發(fā)明者章衛(wèi)平,曹雪濤,萬濤,袁正隆,李楠,何龍,王全興,于敏申請(qǐng)人:上海華晨生物技術(shù)研究所