專利名稱：新的人細胞周期調(diào)控蛋白、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人細胞周期調(diào)控蛋白D-cdc2的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的與細胞增殖、特別是腫瘤細胞和神經(jīng)細胞增殖有關(guān)的細胞內(nèi)蛋白。
維持正常的細胞周期動力學是一切生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，它們的調(diào)控以及調(diào)控障礙與疾病發(fā)生的關(guān)系，是近年來生命科學中非?；钴S的研究領(lǐng)域。細胞周期各生化事件的進行受到系列蛋白的嚴格調(diào)控，各種細胞周期蛋白質(zhì)按時間順序隨特定細胞時相而表達出現(xiàn)。
近年來對細胞周期的調(diào)控研究的突破性進展為為數(shù)眾多的細胞周期素(cyclin)、依賴細胞周期素激酶(cyclin dependent kinases,CDK)和細胞分裂素(septin)等調(diào)控細胞周期蛋白分子和相應(yīng)基因的發(fā)現(xiàn)。細胞周期調(diào)控極其復雜，涉及不同周期素在細胞周期不同關(guān)卡點(check-point)的積累，與不同的細胞周期基因(cell devision cycle,cdc)基因表達產(chǎn)物及其相關(guān)蛋白激酶的相互作用。cyclin-CDKs和septins等分子協(xié)調(diào)周期中諸如DNA復制及分離、中心體的復制和分離，紡錘體的形成等重要事件。(Nurse P,et al.Nat Med 1998；4(10):1103-6)人們運用多種溫度敏感株釀酒酵母(saccharomyces cereislac)首先確定了在細胞分裂周期中一些與細胞周期前進有關(guān)的cdc基因及表達順序和這些基因的可能作用。目前已知的酵母cdc基因有70余種，許多基因已被克隆和測序，現(xiàn)在知道紡錘體的復制被cdc31基因所控制，在細胞周期開始主要控制點起作用的是cdc28，而cdc8作用于染色體周期中的DNA合成，cdc24控制胞質(zhì)周期的出芽。此外某些基因編碼細胞周期次級過程中所需的蛋白質(zhì)或酶類，如DNA連接酶(cdc9)，DNA聚合酶I(cdc17)等，這些基因發(fā)生突變能使細胞出現(xiàn)終止細胞周期的表型。
細胞分裂素(septin)(Cooper JA,et al.J Cell Biol 1996；134(6):1345-8；Field CM,Kellogg D,Trends Cell Biol,1999；9(10):387-94)屬于具有GTPase活性的保守蛋白家族。該家族蛋白包括多個具有GTP酶活性的細胞分裂調(diào)控蛋白H5,NEDD5,CDC10,hCDCrel和AF17q25等。它們參與許多細胞功能，如細胞表面區(qū)域的特化、細胞漿移動(cytokinesis)及細胞形狀的改變，參與形成新型骨架系統(tǒng)或為信號轉(zhuǎn)導復合物的組裝提供支架，從而參與細胞質(zhì)分裂和酵母的出芽(budding)。如它們構(gòu)成了環(huán)繞酵母新生芽頸部的10nm粗細的絲帶。這些蛋白可與構(gòu)成核層板(nuclear lamina)的核層蛋白(nuclear lamin)(磷酸化可能與核膜的破碎有關(guān))、包括組蛋白在內(nèi)的染色體蛋白(與染色體凝聚有關(guān))、微管蛋白(與紡錘體形成有關(guān))、肌動蛋白等。
cdc10基因編碼一種具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的磷蛋白，其調(diào)控靶基因為cdc18。在裂殖酵母中，cdc10基因突變時，細胞生長就被阻止在起始點之前。細胞通過起始點時，cdc10啟動cdc18基因轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物驅(qū)使細胞進入S期，并抑制M期的起始；缺失cdc18的細胞，不能合成DNA，但細胞卻進入不正常的有絲分裂。芽生酵母中啟動配型的兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Swi4與cdc10基因中一段序列同源；芽生酵母CDC6則與cdc18基因中另一段序列同源，CDC6基因與S期的起始有關(guān)。AF17q25 and hCDCrel可能參與11q23相關(guān)的白血病的發(fā)生(Taki T,et al.CancerRes 1999；59:4261)。Nedd5,CDCrel-1可能參與神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和外排的調(diào)控(Beites CL,et al.Nat Neurosci 1999；2:434)。
細胞周期的紊亂可造成細胞的無控制生長增殖。目前對于細胞過度增殖性疾病(如腫瘤，動脈粥樣硬化等)形成機制的研究，正越來越緊密地與細胞周期的調(diào)控結(jié)合起來。對細胞周期的影響可以通過調(diào)控cdc基因或蛋白的表達來產(chǎn)生正/負調(diào)控效應(yīng)。細胞周期正調(diào)控因素包括癌基因產(chǎn)物、激素、細胞生長因子以及細胞周期內(nèi)部組分，其中最重要的是成熟促進因子(MPF)，它為雙聚體(cyclin和激酶)，可使底物磷酸化去磷酸化。負調(diào)控因素中涉及到抑癌基因產(chǎn)物和CDKs抑制劑等。通過干涉細胞周期動力學過程，可能為細胞過度增殖性疾病的預防和治療提供新的分子治療模式。如細胞周期調(diào)控因子p21和p27可抑制細胞由G1期進入S期，從而抑制血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的增殖，在抗腫瘤和抗心血管疾病中具有I臨床應(yīng)用價值。
研究已表明，細胞周期調(diào)控蛋白的異?；蛉笔c許多疾病相關(guān)，因此，為治療目的研究和開發(fā)人細胞周期調(diào)控蛋白有重要意義。
本發(fā)明的目的是提供一種新的人細胞周期調(diào)控蛋白-D-cdc2蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的D-cdc2蛋白是一種septin2同源分子。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的D-cdc2多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人D-cdc2多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中127-1680位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-3018位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人D-cdc2蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人D-cdc2蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人D-cdc2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人D-cdc2多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-3018個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人D-cdc2多肽活性的化合物，以及抑制人D-cdc2多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人D-cdc2多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在D-cdc2蛋白的方法，它包括將樣品與D-cdc2蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在D-cdc2蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人D-cdc2多肽異常表達相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人D-cdc2多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人D-cdc2多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人D-cdc2蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人D-cdc2多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明的人D-cdc2的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫字母表示。
圖2是本發(fā)明的人D-cdc2蛋白的全長氨基酸序列。
圖3是本發(fā)明的人D-cdc2蛋白與setpin2(登錄號為P39827)蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人D-cdc2，下方序列是septin2蛋白。相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標出，相似的氨基酸用“”或“.”標出。
圖4是本發(fā)明的人D-cdc2蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲線圖。
在本發(fā)明中，術(shù)語“D-cdc2蛋白”、“D-cdc2多肽”或“細胞周期調(diào)控蛋白D-cdc2”可互換使用，都指具有人細胞周期調(diào)控蛋白D-cdc2氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的細胞周期調(diào)控蛋白D-cdc2。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的D-cdc2蛋白或多肽”是指D-cdc2多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化D-cdc2蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。D-cdc2多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人D-cdc2蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人D-cdc2蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人D-cdc2多肽”指具有人D-cdc2蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人D-cdc2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人D-cdc2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人D-cdc2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人D-cdc2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人D-cdc2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人D-cdc2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人D-cdc2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人D-cdc2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人D-cdc2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人D-cdc2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼D-cdc2蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人D-cdc2核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或D-cdc2蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984；224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的D-cdc2多肽。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人D-cdc2多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3)．從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人D-cdc2多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人D-cdc2編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；入噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人D-cdc2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療D-cdc2蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或?qū)笵-cdc2蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人D-cdc2蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人D-cdc2蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人D-cdc2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人D-cdc2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人D-cdc2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人D-cdc2蛋白的分子，也包括那些并不影響人D-cdc2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人D-cdc2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人D-cdc2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人D-cdc2蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人D-cdc2蛋白功能的抗體以及不影響人D-cdc2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人D-cdc2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人D-cdc2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人D-cdc2蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的人D-cdc2蛋白。此外，與人D-cdc2蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人D-cdc2蛋白相關(guān)的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人D-cdc2蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人D-cdc2蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人D-cdc2蛋白陽性的細胞(例如淋巴結(jié)細胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人D-cdc2蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與D-cdc2蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病方面的治療。在使用本發(fā)明D-cdc2蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明D-cdc2多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的D-cdc2蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人D-cdc2蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于D-cdc2蛋白的無表達或異常/無活性的D-cdc2蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達變異的D-cdc2蛋白，以抑制內(nèi)源性的D-cdc2蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將D-cdc2基因轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶D-cdc2基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et al.)。另外重組人D-cdc2基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
抑制人D-cdc2 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
能與人D-cdc2蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人D-cdc2蛋白分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人D-cdc2蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人D-cdc2蛋白水平，可以用作解釋人D-cdc2蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷D-cdc2蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在D-cdc2蛋白的方法是利用D-cdc2蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與D-cdc2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在D-cdc2蛋白。
D-cdc2蛋白的多聚核苷酸可用于D-cdc2蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，D-cdc2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測D-cdc2蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下D-cdc2蛋白的異常表達。如D-cdc2 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷D-cdc2蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用D-cdc2蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測D-cdc2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測D-cdc2基因的突變也可用于診斷D-cdc2蛋白相關(guān)的疾病。D-cdc2蛋白突變的形式包括與正常野生型D-cdc2 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明D-cdc2蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,Mendellan Inheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為3018個堿基，其開放讀框位于127-1680位，編碼全長為517個氨基酸的人D-cdc2蛋白(SEQ IDNO:2)。該D-cdc2蛋白屬于細胞周期調(diào)控蛋白家族分子，與cdc10、septin2氨基酸序列高度同源，一致性可高達70％，相似性則可達83％。此外，D-cdc2蛋白也包含GTP結(jié)合基序(GX4GKS-DX2G-KXD)。Northern印跡分析表明在組織中廣泛表達。
已進行的研究提示，D-cdc2可能為干涉細胞周期的靶蛋白，可通過分子模建等技術(shù)，競爭性阻斷其促細胞分裂作用，具潛在的抗腫瘤和抗心血管疾病的作用。因此，D-cdc2蛋白或其相關(guān)的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1人D-cdc2 cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α細菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID No:1所示)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO:2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人細胞周期調(diào)控蛋白D-cdc2，其編碼基因命名為人細胞周期調(diào)控蛋白D-cdc2基因。
序列SEQ ID NO:1全長為3018bp，包括126bp的5′端非編碼區(qū)和1338bp的3′端非編碼區(qū)，編碼含517個氨基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為60kD。
BLAST分析表明其與已知基因不同，與人septin2氨基酸序列高度同源，一致性達70％，相似性達83％(圖3)，屬于細胞周期調(diào)控蛋白家族分子。此外，在D-cdc2蛋白中也包含一個GTP結(jié)合基序(GX4GKS-DX2G-KXD)，這也進一步提示它可能參與細胞周期的調(diào)控。疏水性分析表明，D-cdc2是一胞內(nèi)蛋白(圖4)。實施例2用RT-PCR方法克隆人D-cdc2的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對數(shù)生長期B淋巴瘤細胞株Raji細胞總RNA，取6mg細胞總RNA與0.5μg Oligo-dT12-18混合，進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增所用的引物如下有義引物5′-cggaggcagcctagcctcgcgccccgcccg-3’(SEQ ID NO:3)，反義引物5′-gtgctatgcaaggttttatttacaactt-3’(SEQ ID NO:4)。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，擴增參數(shù)為94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒，25個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。DNA序列分析結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO:1所示的1-3001位完全相同。實施例3 D-cdc2的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預雜交30分鐘；將標記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結(jié)果顯示在肝、脾、外周血、腦等許多正常組織中均有表達，這表明D-cdc2蛋白是一種廣泛表達的蛋白。實施例4人D-cdc2重組表達在該實施例中，以實施例2中的PCR擴增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人D-cdc2 DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′端寡核苷酸引物序列為5′-cgggatccATGGCCTCCTCCGAGGTGG-3′(SEQ ID NO:5)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3′端引物序列為5′-ggaattctcattcactctggcttatg-3′(SEQ ID NO:6)該引物含有EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和人D-cdc2的部分編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ酶切再與質(zhì)粒pUC18按常規(guī)方法組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人D-cdc2cDNA BamHⅠ/EcoRⅠ酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成形成載體pGEX-2T-D-cdc2，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。
挑表達D-cdc2的陽性DH5α克隆接種于100ml 2×YTA培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl,2.7 mM KCl,10.1mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10 mM谷胱甘肽，50 mM Tris-HCl,pH 8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復洗脫2-3次，得到N端含GST的人D-cdc2融合蛋白，經(jīng)thrombin(Sigma)酶切去除GST后得到D-cdc2蛋白，分子量約為60kD。
用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，證實了其N端序列與SEQ ID NO:2所示的N端序列相符。實施例5抗人D-cdc2抗體的產(chǎn)生將實施例4中獲得的重組蛋白人D-cdc2用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100 μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100 μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人D-cdc2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的人細胞周期調(diào)控蛋白、其編碼序列及用途(ⅲ)序列數(shù)目6(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3018bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CGGAGGCAGC CTAGCCTCGC GCCCCGCCCG TTGCTTCTGC CCTCCGGCCT TCCCGCCGCC60GTCGCCGGGA CCAGCCGCTC GGGGCCGGGC TGATACAGCC GCTTCACCGT GCCCCTGCCC120GCGACCATGG CCTCCTCCGA GGTGGCGCGG CACCTGCTCT TTCAGTCTCA CATGGCAACG180AAAACAACTT GTATGTCTTC ACAAGGATCA GATGATGAAC AGATAAAAAG AGAAAACATT240CGTTCGTTGA CTATGTCTGG CCATGTTGGT TTTGAGAGTT TGCCTGATCA GCTGGTGAAC300AGATCCATTC AGCAAGGTTT CTGCTTTAAT ATTCTCTGTG TGGGGGAAAC TGGAATTGGA360AAATCAACAC TGATTGACAC ATTGTTTAAT ACTAATTTTG AAGACTATGA ATCCTCACAT420TTTTGCCCAA ATGTTAAACT TAAAGCTCAG ACATATGAAC TCCAGGAAAG TAATGTTCAA480TTGAAATTGA CCATTGTGAA TACAGTGGGA TTTGGTGACC AAATAAATAA AGAAGAGAGC540TACCAACCAA TAGTTGACTA CATAGATGCT CAGTTTGAGG CCTATCTCCA AGAAGAACTG600AAGATTAAGC GTTCTCTCTT TACCTACCAT GATTCTCGCA TCCATGTGTG TCTCTACTTC660ATTTCACCGA CAGGCCACTC TCTGAAGACA CTTGATCTCT TAACCATGAA GAACCTTGAC720AGCAAGGTAA ACATTATACC AGTGATTGCC AAAGCAGATA CGGTTTCTAA AACTGAATTA780CAGAAGTTTA AGATCAAGCT CATGAGTGAA TTGGTCAGCA ATGGCGTCCA GATATACCAG840TTCCCAACGG ATGATGACAC TATTGCTAAG GTCAACGCTG CAATGAATGG ACAGTTGCCG900TTTGCTGTTG TGGGAAGTAT GGATGAGGTA AAAGTCGGAA ACAAGATGGT CAAAGCTCGC960CAGTACCCTT GGGGTGTTGT ACAAGTGGAA AATGAAAACC ACTGTGACTT TGTAAAGCTG1020CGGGAAATGC TCATTTGTAC AAATATGGAG GACCTGCGAG AGCAGACCCA TACCAGGCAC1080TATGAGCTTT ACAGGCGCTG CAAACTGGAG GAAATGGGCT TTACAGATGT GGGCCCAGAA1140AACAAGCCAG TCAGTGTTCA AGAGACCTAT GAAGCCAAAA GACATGAGTT CCATGGTGAA 1200CGTCAGAGGA AGGAAGAAGA AATGAAACAG ATGTTTGTGC AGCGAGTAAA GGAGAAAGAA 1260GCCATATTGA AAGAAGCTGA GAGAGAGCTA CAGGCCAAAT TTGAGCACCT TAAGAGACTT 1320CACCAAGAAG AGAGAATGAA GCTTGAAGAA AAGAGAAGAC TTTTGGAAGA AGAAATAATT 1380GCTTTCTCTA AAAAGAAAGC TACCTCCGAG ATATTTCACA GCCAGTCCTT TCTGGCAACA 1440GGCAGCAACC TGAGGAAGAG GACAAGGACC GTAAGAACTC CAATTTTTTG TAAAACAGAA 1500GTTCCAGAGC ACAGAAGGTC ATCATCACAA GCAAACTTTA TTAAAAAAAA ACTAGAAGTG 1560TGCTTTGATT TTGCTGTTAT TTGTTTTATC ACTTCTATAT TTGGTGAACA GCCACAGTTA 1620CTGATATTTA TGGAAAAGTA CTTTCAAGTA CAAGGTCAAT ACATAAGCCA GAGTGAATGA 1680TACTACAAGT TGAGCATCTC TAATTCAAAA ATCTGAAATC CAGAAGCTTC AAAATCTGAA 1740TCTTTTTGAG CACTGACTTG ACCCCACAAG TGGAAAATTC CCCACCCGAC ACCTTTGCTT 1800TCTGATGGTT CAGTTTAAAC AGATTTTGTT TCTTGCACAA AATTTTTGTA TAAATTACTT 1860TCAGGCTATA TGTATAAGGT GGATGTGAAA CATGAATTAT GTAATTAGAG TCGGGTCCCG 1920TTGTGTATAT GCAGATATTC CAAACCTGAA ATCCAAAACA CTTCTGGTCC CTAGCATTTT 1980GGATAAGGGA TACTCAGCTT GTACCTATAT ATTCATATAT ATTCACTGTT GTTAGAAATG 2040TTTAAGTTGC TGTTCTGTGA TGAATCTAAA TCTTTTCTCT TGCTACCAAG CTATTGTCAC 2100TGCAGTGCAT TATACCAAAG AGCGAAGTCA GTGCCACTGA AAATACAGAA CCCATTAATA 2160TCGTGGCTAT CTGATTACAT TTATATTCCA AGATGAACCT TTTTTATATA TGCTAAAAAT 2220TTTGGGGAAT ATGTTTTGGG ATGTATTATG GAGCTAAAAC TCTAACCTCT TAATAGTTTT 2280ATAGAACTTA AAAATTTTTT ATACAATTAC CCAATTGGTG ATATGATCTT AAGCTTTTGT 2340GTCAGATTAT TTAATATGAT GACTTCATGC TTTATTATGC CTTATTATGG CTGACGTATT 2400ACTGTGGTGA AACAAAATAT CTTTAAAAGT TAAAACATCC AGATATATAA GCTATTTTTT 2460CCTAAGGATA AAGTACCTTT GAGCATGAGT GTATCACAGC TTTCATTAGG AAAACTTTTC 2520ATTACATACT TGTTTAAACT CTGTCTTCCA GGGTAAAAAT AATAAGGTTG AATCATTTTA 2580TTAAAAATAC TTTTTAAGAA AATAACTATG AACATCTGAA TATTAAAGAT ATAAAAATGC 2640ACATAATTCA TATTTCAGGT GGTATTTGCA TTCAGTGCCT TACTGGTATT CTCAGAACAT 2700TTTAATGATT TCTAACATTT CTTAACAGTC ATAGATATAT ACATTTTCAT TTTTTGTACT 2760TGAATATTCT AAATAAAACT GACATTTACT CTTGACAAAT AAAACATATA TTTACTAAAA 2820TGTGTTTAAT TTTCCTTTCT GAAAACTCTC ATTTTAAAAA CGTTCATTTA ATTATGTATT 2880TGAATTATTT TGGAGATGAG GTATTTTATG AGTATTTTCA GACAATGAAA CTTATTAGTC 2940TGTGTCAGAT TCTGAGCAAT CATAGAGTCA TCTAAGTTGT AAATAAAACC TTGCATAGCA 3000CAAAAAAAAA AAAAAAAA 3018(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度517個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:MASSEVARHL LFQSHMATKT TCMSSQGSDD EQIKRENIRS LTMSGHVGFE 50SLPDQLVNRS IQQGFCFNIL CVGETGIGKS TLIDTLFNTN FEDYESSHFC100PNVKLKAQTY ELQESNVQLK LTIVNTVGFG DQINKEESYQ PIVDYIDAQF150EAYLQEELKI KRSLFTYHDS RIHVCLYFIS PTGHSLKTLD LLTMKNLDSK200VNIIPVIAKA DTVSKTELQK FKIKLMSELV SNGVQIYQFP TDDDTIAKVN250AAMNGQLPFA VVGSMDEVKV GNKMVKARQY PWGVVQVENE NHCDFVKLRE300MLICTNMEDL REQTHTRHYE LYRRCKLEEM GFTDVGPENK PVSVQETYEA350KRHEFHGERQ RKEEEMKQMF VQRVKEKEAI LKEAERELQA KFEHLKRLHQ400EERMKLEEKR RLLEEEIIAF SKKKATSEIF HSQSFLATGS NLRKRTRTVR450TPIFCKTEVP EHRRSSSQAN FIKKKLEVCF DFAVICFITS IFGEQPQLLI500FMEKYFQVQG QYISQSE 517(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CGGAGGCAGC CTAGCCTCGC GCCCCGCCCG 30(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ⅱ )分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4GTGCTATGCA AGGTTTTATT TACAACTT28(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CGGGATCCAT GGCCTCCTGC GAGGTGG 27(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GGAATTCTCA TTCACTCTGG CTTATG 2權(quán)利要求
1．一種分離的人D-cdc2多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
3．一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。
5．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中127-1680位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-3018位的序列。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7．一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8．一種具有人D-cdc2蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達人D-cdc2蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人D-cdc2蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求1所述的人D-cdc2蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10．一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-3018個核苷酸。
11．一種檢測樣品中是否存在D-cdc2蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在D-cdc2蛋白。
12．如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于篩選促進人D-cdc2蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制人D-cdc2蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。
13．一種如權(quán)利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
14．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型細胞周期調(diào)控蛋白(celldivision control protein 2,簡稱為“D－cdc2”)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種新型細胞周期調(diào)控蛋白分子的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略,特別是可用于腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病的診斷和治療。
文檔編號C12N15/11GK1299829SQ99124270
公開日2001年6月20日 申請日期1999年12月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日
發(fā)明者曹雪濤, 章衛(wèi)平, 萬濤, 何龍, 袁正隆, 李楠, 鞠佃文 申請人:上海華晨生物技術(shù)研究所