專利名稱：：新的人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D-cdc1(celldivisioncontrolprotein1，簡稱為“D-cdc1”)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的與細(xì)胞增殖、特別是腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白。維持正常的細(xì)胞周期動力學(xué)是一切生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，它們的調(diào)控以及調(diào)控障礙與疾病發(fā)生的關(guān)系，是近年來生命科學(xué)中非?；钴S的研究領(lǐng)域。細(xì)胞周期各生化事件的進(jìn)行受到系列蛋白的嚴(yán)格調(diào)控，各種細(xì)胞周期蛋白質(zhì)按時間順序隨特定細(xì)胞時相而表達(dá)出現(xiàn)。近年來對細(xì)胞周期的調(diào)控研究的突破性進(jìn)展為為數(shù)眾多的細(xì)胞周期素(cyclin)、依賴細(xì)胞周期素激酶(cyclindependentkinases,CDK)和細(xì)胞分裂素(septin)等調(diào)控細(xì)胞周期蛋白分子和相應(yīng)基因的發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞周期調(diào)控極其復(fù)雜，涉及不同周期素在細(xì)胞周期不同關(guān)卡點(diǎn)(check-point)的積累，與不同的細(xì)胞周期基因(celldevisioncycle,cdc)基因表達(dá)產(chǎn)物及其相關(guān)蛋白激酶的相互作用。cyclin-CDKs和septins等分子協(xié)調(diào)周期中諸如DNA復(fù)制及分離、中心體的復(fù)制和分離，紡錘體的形成等重要事件(NurseP,etal.NatMed1998；4(10):1103-6).人們運(yùn)用多種溫度敏感株釀酒酵母(saccharomycescereisiac)首先確定了在細(xì)胞分裂周期中一些與細(xì)胞周期前進(jìn)有關(guān)的cdc基因及表達(dá)順序和這些基因的可能作用。目前已知的酵母cdc基因有70余種，許多基因已被克隆和測序，現(xiàn)在知道紡錘體的復(fù)制被cdc31基因所控制，在細(xì)胞周期開始主要控制點(diǎn)起作用的是cdc28，而cdc8作用于染色體周期中的DNA合成，cdc24控制胞質(zhì)周期的出芽。此外某些基因編碼細(xì)胞周期次級過程中所需的蛋白質(zhì)或酶類，如DNA連接酶(cdc9),DNA聚合酶Ⅰ(cdc17)等，這些基因發(fā)生突變能使細(xì)胞出現(xiàn)終止細(xì)胞周期的表型。細(xì)胞分裂素(septin)(CooperJA,etal.JCellBiol1996；134(6):1345-8；FieldCM,KelloggD,TrendsCellBiol,1999；9(10):387-94)屬于具有GTPase活性的保守蛋白家族。該家族蛋白包括多個具有GTP酶活性的細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白H5,NEDD5,CDC10,hCDCrel和AF17q25等。它們參與許多細(xì)胞功能，如細(xì)胞表面區(qū)域的特化、細(xì)胞漿移動(cytokinesis)及細(xì)胞形狀的改變，參與形成新型骨架系統(tǒng)或?yàn)樾盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的組裝提供支架，從而參與細(xì)胞質(zhì)分裂和酵母的出芽(budding)。如它們構(gòu)成了環(huán)繞酵母新生芽頸部的10nm粗細(xì)的絲帶。這些蛋白可與構(gòu)成核層板(nuclearlamina)的核層蛋白(nucl,earlamin)(磷酸化可能與核膜的破碎有關(guān))、包括組蛋白在內(nèi)的染色體蛋白(與染色體凝聚有關(guān))、微管蛋白(與紡錘體形成有關(guān))、肌動蛋白等。cdc10基因編碼一種具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的磷蛋白，其調(diào)控靶基因?yàn)閏dc18。在裂殖酵母中，cdc10基因突變時，細(xì)胞生長就被阻止在起始點(diǎn)之前。細(xì)胞通過起始點(diǎn)時，cdc10啟動cdc18基因轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入S期，并抑制M期的起始；缺失cdc18的細(xì)胞，不能合成DNA，但細(xì)胞卻進(jìn)入不正常的有絲分裂。芽生酵母中啟動配型的兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Swi4與cdc10基因中一段序列同源；芽生酵母CDC6則與cdc18基因中另一段序列同源，CDC6基因與S期的起始有關(guān)。AF17q25andhCDCrel可能參與11q23相關(guān)的白血病的發(fā)生(TakiT,etal.CancerRes1999；59:4261)。Nedd5,CDCrel-1可能參與神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和外排的調(diào)控(BeitesCL,etal.NatNeurosci1999；2:434)。細(xì)胞周期的紊亂可造成細(xì)胞的無控制生長增殖。目前對于細(xì)胞過度增殖性疾病(如腫瘤，動脈粥樣硬化等)形成機(jī)制的研究，正越來越緊密地與細(xì)胞周期的調(diào)控結(jié)合起來。對細(xì)胞周期的影響可以通過調(diào)控cdc基因或蛋白的表達(dá)來產(chǎn)生正/負(fù)調(diào)控效應(yīng)。細(xì)胞周期正調(diào)控因素包括癌基因產(chǎn)物、激素、細(xì)胞生長因子以及細(xì)胞周期內(nèi)部組分，其中最重要的是成熟促進(jìn)因子(MPF)，它為雙聚體(cyclin和激酶)，可使底物磷酸化去磷酸化。負(fù)調(diào)控因素中涉及到抑癌基因產(chǎn)物和CDKs抑制劑等。通過干涉細(xì)胞周期動力學(xué)過程，可能為細(xì)胞過度增殖性疾病的預(yù)防和治療提供新的分子治療模式。如細(xì)胞周期調(diào)控因子p21和p27可抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，在抗腫瘤和抗心血管疾病中具有臨床應(yīng)用價值。研究已表明，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的異常或缺失與許多疾病相關(guān)，因此，為治療目的研究和開發(fā)人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白有重要意義。本發(fā)明的目的是提供一種新的人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白-D-cdc1蛋白以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的D-cdc1蛋白是一種septin2同源受體。在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的D-cdc1多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人D-cdc1多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:1中473-2179位的序列；(b)具有SEQIDNO:1中1-4150位的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人D-cdc1蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人D-cdc1蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人D-cdc1蛋白活性的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人D-cdc1多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-4150個核苷酸。在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人D-cdc1多肽活性的化合物，以及抑制人D-cdc1多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人D-cdc1多肽的編碼序列或其片段的反義序列。在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在D-cdc1蛋白的方法，它包括將樣品與D-cdc1蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在D-cdc1蛋白。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人D-cdc1多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人D-cdc1多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人D-cdc1多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人D-cdc1蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人D-cdc1多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等病癥。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1是本發(fā)明的人D-cdc1的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫字母表示。圖2是本發(fā)明的人D-cdc1蛋白的全長氨基酸序列。圖3是本發(fā)明的人D-cdc1蛋白與setpin2(登錄號P39827)蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人D-cdc1，下方序列是septin2蛋白。相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標(biāo)出，相似的氨基酸用“”或“.”標(biāo)出。圖4是本發(fā)明的人D-cdc1蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲線圖。在本發(fā)明中，術(shù)語“D-cdc1蛋白”、“D-cdc1多肽”或“細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D-cdc1”可互換使用，都指具有人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D-cdc1氨基酸序列(SEQIDNO:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D-cdc1。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的D-cdc1蛋白或多肽”是指D-cdc1多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化D-cdc1蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。D-cdc1多肽的純度能用氨基酸序列分析。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括人D-cdc1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人D-cdc1蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“人D-cdc1多肽”指具有人D-cdc1蛋白活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人D-cdc1蛋白相同功能的、SEQIDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人D-cdc1蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人D-cdc1DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人D-cdc1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人D-cdc1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人D-cdc1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人D-cdc1多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供人D-cdc1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人D-cdc1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“人D-cdc1蛋白保守性變異多肽”指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu</table></tables>本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼D-cdc1蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的人D-cdc1核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki,etal.Science1985；230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或D-cdc1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984；224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的D-cdc1多肽。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人D-cdc1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3)．從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，人D-cdc1多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg,etal.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(LeeandNathans,JBioChem.263:3521,1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人D-cdc1編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。重組的人D-cdc1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療D-cdc1蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笵-cdc1蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人D-cdc1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人D-cdc1蛋白功能的多肽分子。另一方面，本發(fā)明還包括對人D-cdc1DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人D-cdc1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人D-cdc1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人D-cdc1蛋白的分子，也包括那些并不影響人D-cdc1蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人D-cdc1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人D-cdc1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人D-cdc1蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人D-cdc1蛋白功能的抗體以及不影響人D-cdc1蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人D-cdc1基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人D-cdc1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得?？谷薉-cdc1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人D-cdc1蛋白。此外，與人D-cdc1蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人D-cdc1蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人D-cdc1蛋白的產(chǎn)生或活性。抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人D-cdc1蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人D-cdc1蛋白陽性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。多克隆抗體的生產(chǎn)可用人D-cdc1蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與D-cdc1蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病方面的治療。在使用本發(fā)明D-cdc1蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明D-cdc1多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的D-cdc1蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。人D-cdc1蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于D-cdc1蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的D-cdc1蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的D-cdc1蛋白，以抑制內(nèi)源性的D-cdc1蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將D-cdc1基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶D-cdc1基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook,etal.)。另外重組人D-cdc1基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。抑制人D-cdc1mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。能與人D-cdc1蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，必須對人D-cdc1蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人D-cdc1蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的人D-cdc1蛋白水平，可以用作解釋人D-cdc1蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷D-cdc1蛋白起作用的疾病。一種檢測檢測樣品中是否存在D-cdc1蛋白的方法是利用D-cdc1蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與D-cdc1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在D-cdc1蛋白。D-cdc1蛋白的多聚核苷酸可用于D-cdc1蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，D-cdc1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測D-cdc1蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下D-cdc1蛋白的異常表達(dá)。如D-cdc1DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷D-cdc1蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用D-cdc1蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測D-cdc1蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測D-cdc1基因的突變也可用于診斷D-cdc1蛋白相關(guān)的疾病。D-cdc1蛋白突變的形式包括與正常野生型D-cdc1DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明D-cdc1蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,MendellanInheritanceinMan(可通過與JohnsHopkinsUniversityWelchMedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。在本發(fā)明的一個實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQIDNO:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為4150個堿基，其開放讀框位于473-2179位，編碼全長為568個氨基酸的人D-cdc1蛋白(SEQIDNO:2)。該D-cdc1蛋白屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白家族分子，與cdc10、septin2氨基酸序列高度同源，一致性可高達(dá)50％，相似性則可達(dá)70％。此外，D-cdc1蛋白也包含GTP結(jié)合基序(GX4GKS-DX2G-KXD)。Northern印跡分析表明在組織中廣泛表達(dá)。已進(jìn)行的研究提示，D-cdc1可能為干涉細(xì)胞周期的靶蛋白，可通過分子模建等技術(shù)，競爭性阻斷其促細(xì)胞分裂作用，具潛在的抗腫瘤和抗心血管疾病的作用。因此，D-cdc1蛋白或其相關(guān)的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管病等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1人D-cdc1cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機(jī)挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測定。計算機(jī)分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQIDNO:1所示)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQIDNO:2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D-cdc1，其編碼基因命名為人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白D-cdc1基因。序列SEQIDNO:1全長為4150bp，其ORF位于473-2179位，編碼含568個氨基酸的多肽。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為61kD。BLAST分析表明其與已知基因不同，與人septin2氨基酸序列高度同源，一致性達(dá)50％，相似性達(dá)70％(圖3)，屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白家族分子。此外，在D-cdc1蛋白中也包含一個GTP結(jié)合基序(GX4GKS-DX2G-KXD)，這也進(jìn)一步提示它可能參與細(xì)胞周期的調(diào)控。疏水性分析表明，D-cdc1是一胞內(nèi)蛋白(圖4)。實(shí)施例2用RT-PCR方法克隆人D-cdc1的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對數(shù)生長期B淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞總RNA，取6mg細(xì)胞總RNA與0.5μgO1igo-dT12-18混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μlddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴(kuò)增所用的引物如下有義引物5′gcggccgccgactagtgagctcgtcgaccc(SEQIDNO:3)，反義引物5′gggtttctgcatttgaaacatttattt(SEQIDNO:4)。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4mM引物、0.2mMdNTP和1UExTaqDNA聚合酶(TakaraInc.)，擴(kuò)增參數(shù)為94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。DNA序列分析結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQIDNO:1所示的1-4115位完全相同。實(shí)施例3D-cdc1的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進(jìn)行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。Northern印跡雜交結(jié)果顯示在肝、脾、外周血、腦等許多正常組織中均有表達(dá)，這表明D-cdc1蛋白是一種廣泛表達(dá)的蛋白。實(shí)施例4人D-cdc1重組表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人D-cdc1DNA作為插入片段。PCR反應(yīng)中使用的5′端寡核苷酸引物序列為5′-agcccgggaATGGAGAGGGACCGGAT-3′(SEQIDNO:5)該引物含有SmaⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3′端引物序列為5′-cgcccgggctacatctccgggcttctg-3′(SEQIDNO:6)該引物含有SmaⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人D-cdc1的部分編碼序列。將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)SmaⅠ酶切再與質(zhì)粒pUC18按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDyeTerminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人D-cdc1cDNASmaⅠ酶切片段克隆至表達(dá)載體pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成形成載體pGEX-2T-D-cdc1，然后轉(zhuǎn)化人DH5α。陽性克隆用BamHⅠ酶切鑒定插入方向，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。挑表達(dá)D-cdc1的陽性DH5α克隆接種于100ml2×YTA培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預(yù)熱的2×YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃誘導(dǎo)2-6hr，5,000g4℃離心10min去上清，置冰上用50ml1×PBS(0.14MNaCl,2.7mMKCl,10.1mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)重懸，超聲(B.BraunLabsonicU)破碎后再加入20％TritonX-100至1％輕搖30min，然后12,000g4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml50％谷胱甘肽Sepharose4B層析柱，1×PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽,50mMTris-HCl,pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到N端含GST的人D-cdc1融合蛋白，經(jīng)thrombin(Sigma)酶切去除GST后得到D-cdc1蛋白，分子量約為61kD。用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，證實(shí)其N端序列與SEQIDNO2所示的N端序列相符。實(shí)施例5抗人D-cdc1抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例4中獲得的重組蛋白人D-cdc1用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人D-cdc1基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、其編碼序列及用途(ⅲ)序列數(shù)目6(2)SEQIDNO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4150bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1:GCGGCCGCCGACTAGTGAGCTCGTCGACCCGGGAATCGCGGCCGCGTCGACGGAGGCTGC60CGGAAGCCGCACTCGGGACCTCTGCAGCCACCGACCAGACCGGGCGGCCGGGACTCTGGG120ACTCTCGCAGGCAGACCCGGTGGTCTGCCGGACTCCTCGGGGCCCACTTCGGGCCCTCTC180TCCTGCCTCCTATTTTTGGATTTCTCTCCTTTGCTCCCTTTTTCCTCCCGTTTTGAAGAG240ACAATGCTACTTCAGTTTGGAGCACAAACATATGATCAGCACATGGAAATGTGGTAATTC300GGATGCATTCGTGATTGCAACAGATTGAAGAAATTAGACCAGACAAAGAGTGTTTTTAGA360GGARGARGAGGAGGAGGAGGAGGCTGAGAGAGGGAGGGCGACGGGGGTGAGAAAGGGGAG420GCCGCCTCTGAGCGGGACGCCGGGACTCCCGCCGCTGCTAAATATATCCGTAGAATGGAG480AGGGACCGGATCTCAGCCTTGAAAAGATCTTTTGAGGTCGAGGAGGTCGAGACACCCAAC540TCCACCCCACCCCGGAGGGTCCAGACTCCCCTACTCCGAGCCACTGTGGCCAGCTCCACC600CAGAAATTCCAGGACCTGGGCGTGAAGAACTCAGAACCCTCGGCCCGCCATGTGGACTCC660CTAAGCCAACGCTCCCCCAAGGCGTCCCTGCGGAGGGTGGAGCTCTCGGGCCCCAAGGCG720GCCGAGCCGGTGTCCCGGCGCACTGAGCTGTCCATTGACATCTCGTCCAAGCAGGTGGAG780AACGCCGGGGCCATCGGCCCGTCCCGGTTCGGGCTCAAGAGGGCCGAGGTGTTGGGCCAC840AAGACGCCAGAACCGGCCCCTCGGAGGACGGAGATCACCATCGTCAAACCCCAGGAGTCA900GCCCACCGGAGGATGGAGCCCCCTGCCTCCAAGGTCCCCGAGGTGCCCACTGCCCCTGCC960ACCGACGCAGCCCCCAAGAGGGTGGAGATCCAGATGCCCAAGCCTGCTGAGGCGCCCACC1020GCCCCCAGCCCAGCCCAGACCTTGGAGAATTCAGAGCCTGCCCCTGTGTCTCAGCTGCAG1080AGCAGGCTGGAGCCCAAGCCCCAGCCCCCTGTGGCTGAGGCTACACCCCGGAGCCAGGAG1140GCCACTGAGGCGGCTCCCAGCTGCGTTGGCGACATGGCCGACACCCCCAGAGATGCCGGG1200CTCAAGCAGGCGCCTGCATCACGGAACGAGAAGGCCCCGGTGGACTTCGGCTACGTGGGG1260ATTGACTCCATCCTGGAGCAGATGCGCCGGAAGGCCATGAAGGAGGGCTTCGAGTTCAAC1320ATCATGGTGGTCGGGCAGAGCGGCTTGGGTAAATCCACCTTAATCAACACCCTCTTCAAA1380TCCAAAATCAGCCGGAAGTCGGTGCAGCCCACCTCAGAGGAGCGCATCCCCAAGACCATC1440GAGATCAAGTCCATCACGCACGATATTGAGGAGAAAGGCGTCCGGATGAAGCTGACAGTG1500ATTGACACACCAGGGTTCGGGGACCACATCAACAACGAGAACTGCTGGCAGCCCATCATG1560AAGTTCATCAATGACCAGTACGAGAAATACCTGCAGGAGGAGGTCAACATCAACCGCAAG1620AAGCGCATCCCGGACACCCGCGTCCACTGCTGCCTCTACTTCATCCCCGCCACCGGCCAC1680TCCCTCAGGCCCCTGGACATCGAGTTTATGAAACGCCTGAGCAAGGTGGTCAACATCGTC1740CCTGTCATCGCCAAGGCGGACACACTCACCCTGGAGGAGAGGGTCCACTTCAAACAGCGG1800ATCACCGCAGACCTGCTGTCCAACGGCATCGACGTGTACCCCCAGAAGGAATTTGATGAG1860GACTCGGAGGACCGGCTGGTGAACGAGAAGTTCCGGGAGATGATCCCATTTGCTGTGGTG1920GGCAGTGACCACGAGTACCAGGTCAACGGCAAGAGGATCCTTGGGAGGAAGACCAAGTGG1980GGTACCATCGAAGTTGAAAACACCACACACTGTGAGTTTGCCTACCTGCGGGACCTTCTC2040ATCAGGACGCACATGCAGAACATCAAGGACATCACCAGCAGCATCCACTTCGAGGCGTAC2100CGTGTGAAGCGCCTCAACGAGGGCAGCAGCGCCATGGCCAACGGCGTGGAGGAGAAGGAG2160CCAGAAGCCCCGGAGATGTAGACGCCRCCCTGCCCACCCCCGGGATCCTGCCCCCAAGTC2220ATTTCCGTCCCCCCCCCAGGCCCTCCCACCACCCCATTTTATTTTATATGATTTTCTCCA2280TTTGTCATCGTTCCCCACCCCTTCGACATGCTGCCAGGAAACAAGGGAAGGGGCCTCCCT2340CCGAGTGAGTCAGTGATGAGGCCGCGGCCTCCCCGAGGTTGTGGGGAGGCTGCACTGGAG2400CCACAGGCAGGGGTGAGAGCACCCACTGAATTGACATGACCCTCTGTCCCCAGGCCTGGC2460TCCCCGAGGGCTCAGAAGAGCAGCTTCGGTGTGCAGATCATCCGTCYGTGTGGGGTTCTC2520AGTGCCGGAGCYTTGGGGTGGGGGCCAGGCCTCGCACTTGCAGAGGAGCCCAGTGGGCTG2580CACGCTCCCCTCCATCCCCATCGGCCCTGTCCCCTGGAGTGTGTCAGAGCCCAGGGGAGA2640ATGCAGCCCACCAGGAGCACCTGGACCCCCTGCCCGCCACATGGTGTGGCCATCACTCAG2700CCCCTACCCCTGCCCTGCTCCTAAGGGTAGAAAACTCCAGGGTCCCCTGCCACCGACTGC2760CCAGCCACTCCAAGCCCCCTGGCAGCTGCCCCTCCTGGAGCAGAAAGTGCCTTTATCTCA2820GCCATCCGCAGACTGCTYGGCCAGATGCGGGGACAGGCTGGAATGAGGGAGGCGTCTTCA2880TCTCCCTGCCATCCCCCTCTCACGCCACCCCCGCCCCCACCGGGCTGCAGGTGCTGCTGA2940TGCGCTGGGATCTGATTGAGGATAAAAAGGAAGGAGAGATGACCCCTACCCCCTCATCCC3000CCAGTTTTGAAAAGGTCTAAGCAAGTGAGTCTGGTGGAGGAGCTGAGGGAGGGAGCCATG3060GAAGGTGCCAGAAGGAAGGTTGGCGGGGGCACGTGTGGGCCGTGGCTTGGGCTGGTCAGA3120GTGGCGTGAGCTGCCCGGCGCCTGCCCTGCCCAAGTGACCAGGGAAGTGTGTGTGTGTCC3180ATGTGTATGCGTGTCCGTCTGTCTGTCTAGTGTCTGGGTTTGGCCCAAGACTGGGCTGTA3240GTTACATTAATGCCCAGCCAGCCACCCCTGCCACTCACCCCTCCTGGCCCAGGCCTTGCT3300GACTCTCTGAGCTGGGGAGGTGGGAGGCCAGGCGAGCCTGACTCTGTTGATCTACCCGTG3360CCTGGGCCCCTCCCCTCAGAGCCCATGGTAACGAACCCCTAGAAAGGAGAGAACGGGCGT3420CAGGGGTGCACAGTCCACAGCTGAAGAGCAAGGTTTCGTGGCAGCACGGCCCGGCCCCTC3480ACCCTCTGTCCCCACGAGGGGACCCATGGGGGCTGTCTTTGCAGGGCACAGATGACCAAA3540GTCCCTTCCTGCTTCCTGTTACCTGTCTTGCTCCTGGGGAGAAAGAGGGGCCTGATGAGA3600CTCCACTCAGGTGCACACATCACCAGGTGCATCTGCAGGCACCGGGCTGGCTGCTTGCAG3660CCAGGAGAAGGTCAGCGAGAAGGAGTGTATGAGTGTGAGTGTGTGTGCATGGAAGTTGGG3720GCACTGGGCGTCTGACTCCCTCCCCACCCAAGAGAGGAAGGACCCCTCACCACCCCCACT3780GGCGAGACAGTTTACTTTGCCGACTTGCCATGTTTTTGCCAAAACCAAGATTTTGAAGGA3840AATGAGTGGCCAGCGCCAGGGCCCAGGCCATGTGGCCTGCCCAGCCTCAATGTCACTTGG3900CGGCGGGGTGGGGTGGGGGTGGGCAGCAGCATCCCAGCCTTGAGATGCTTCACTTTCCTT3960CTCTGTAACCAGACTTTGAAAAATTGTTCGTTTCATCAGGCTCTGTTCCTCAATGGCCTT4020TTGCTACGTGCCTCCCGAGAAATTTGTCTTTTTGTATAAATGACAAAGTGTTGAAAATGT4080ATTTCCTGAAATAAATGTTTCAAATGCAGAAACCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA4140AAAAAAAAAA4150(2)SEQIDNO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度568個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2MERDRISALKRSFEVEEVETPNSTPPRRVQTPLLRATVASSTQKFQDLGV50KNSEPSARHVDSLSQRSPKASLRRVELSGPKAAEPVSRRTELSIDISSKQ100VENAGAIGPSRFGLKRAEVLGHKTPEPAPRRTEITIVKPQESAHRRMEPP150ASKVPEVPTAPATDAAPKRVEIQMPKPAEAPTAPSPAQTLENSEPAPVSQ200LQSRLEPKPQPPVAEATPRSQEATEAAPSCVGDMADTPRDAGLKQAPASR250NEKAPVDFGYVGIDSILEQMRRKAMKQGFEFNIMVVGQSGLGKSTLINTL300FKSKISRKSVQPTSEERIPKTIEIKSITHDIEEKGVRMKLTVIDTPGFGD350HINNENCWQPIMKFINDQYEKYLQEEVNINRKKRIPDTRVHCCLYFIPAT400GHSLRPLDIEFMKRLSKVVNIVPVIAKADTLTLEERVHFKQRITADLLSN450GIDVYPQKEFDEDSEDRLVNEKFREMIPFAVVGSDHEYQVNGKRILGRKT500KWGTIEVENTTHCEFAYLRDLLIRTHMQNIKDITSSIHFEAYRVKRLNEG550SSAMANGVEEKEPEAPEM568(2)SEQIDNO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3GCGGCCGCCGACTAGTGAGCTCGTCGACCC30(2)SEQIDNO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4GGGTTTCTGCATTTGAAACATTTATTT27(2)SEQIDNO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5:AGCCCGGGAATGGAGAGGGACCGGAT26(2)SEQIDNO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:6:CGCCCGGGCTACATCTCCGGGCTTCTG權(quán)利要求1．一種分離的人D-cdc1多肽，其特征在于，它包含具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽。3．一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。4．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。5．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:1中473-2179位的序列；(b)具有SEQIDNO:1中1-4150位的序列。6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。7．一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。8．一種具有人D-cdc1蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人D-cdc1蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人D-cdc1蛋白活性的多肽。9．一種能與權(quán)利要求1所述的人D-cdc1蛋白特異性結(jié)合的抗體。10．一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-4150個核苷酸。11．一種檢測樣品中是否存在D-cdc1蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在D-cdc1蛋白。12．如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于篩選促進(jìn)人D-cdc1蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制人D-cdc1蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。13．一種如權(quán)利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。14．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及了一種新型細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(D－cdcl)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種新型細(xì)胞周期調(diào)控蛋白分子的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略,特別是可用于腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病的診斷和治療。文檔編號C12N15/64GK1299832SQ9912427公開日2001年6月20日申請日期1999年12月16日優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日發(fā)明者曹雪濤,章衛(wèi)平,萬濤,何龍,李楠,袁正隆,于益芝申請人:上海華晨生物技術(shù)研究所