專利名稱：L－古洛糖酸－γ－內(nèi)酯脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以微生物學(xué)手段由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯制造L-抗壞血酸的新方法，制備對L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯之微生物學(xué)氧化作用負(fù)責(zé)的酶的方法，所說的酶是純化形式的L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶。
如上面所指出的，本發(fā)明提供的新的L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶(以下簡稱為GLDH)可催化L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化成L-抗壞血酸。
催化L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯(I)氧化成L-抗壞血酸(II)
的酶是已知的。Nishikimi等人從大鼠肝臟(Arch，Biochem.Biophy，175，427-435，1976)、羊肝臟(Arch，Biochem.Biophy.，175，427-435，1976)和雞腎臟(Biochemistry，21，5076-5082，1982)中分離了L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶。在I氧化成II的過程中，這些酶是以分子氧作為直接電子受體，但本發(fā)明所提供的GLDH則不是。此外，它們都由一個亞基構(gòu)成，而本發(fā)明的GLDH則由三個類型的亞基構(gòu)成。Nishikimi等人由面包酵母中分離了L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(Arch，Biochem.Biophy.，191，479-486，1978)。該酶催化L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯和L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化成L-抗壞血酸。另外，Bleeg等人從啤酒酵母中分離了L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(Eur.J.Biochem.，127，391-396，1982)。據(jù)報導(dǎo)，該酶對L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯有活性，但對L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯沒有活性。本發(fā)明的GLDH則不能使用L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯作為其底物。
因此，本發(fā)明所提供的GLDH在底物特異性上明顯不同于酵母的L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶。另一方面，Shigeoka等人報導(dǎo)了裸藻(Euglena gracilis Z)的粗制L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的特性，(Agric.Biol.Chem.，43，2187-2188，1979)，即該酶可催化L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯和L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯氧化，而且不能使用氧作為電子受體。此外，如眾所周知，由于藻類微生物生長上遇到的問題(如包括脆性、細(xì)胞分裂及生長期長等)，而很難于處理。
本發(fā)明提供的新的GLDH在其底物特異性上與之明顯不同。另外，迄今尚未報導(dǎo)分離裸藻(Euglena gracilis Z)之L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的方法。
迄今還沒有報導(dǎo)利用細(xì)菌由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸。然而，根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯產(chǎn)生L-抗壞血酸。這就是使用細(xì)菌由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯產(chǎn)生L-抗壞血酸的第一個可能性。
如上所述，尚沒有公開一種具有脫氫酶活性的純化的酶，如細(xì)菌來源的酶能夠?qū)-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化成L-抗壞血酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由特異微生物細(xì)菌細(xì)胞的可溶性部分分離出的純化酶，可催化L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化成L-抗壞血酸。已在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如已提出的，本發(fā)明的一個目的是提供可作用于L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯以產(chǎn)生L-抗壞血酸的新的GLDH。本發(fā)明的另一個目的是提供一種微生物，如能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生新的GLDH的，屬于葡糖桿菌屬或其突變體的微生物生產(chǎn)該新的GLDH的方法，經(jīng)破碎細(xì)胞，由已破碎之細(xì)胞的無細(xì)胞提取物中，更好是由微生物的可溶性部分中分離并純化所說的GLDH。本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用所說的酶生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法。再一個目的是提供一種借助細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法。此外，還有一個目的是提供具有所說的酶活性的微生物。從下面的描述中將會進(jìn)一步了解本發(fā)明的上述及其他目的。
對純化的新的GLDH的物理-化學(xué)性質(zhì)，可舉例說明如下1)酶活性本發(fā)明的新的GLDH可在電子受體存在下，按下列反應(yīng)將L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化成L-抗壞血酸L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯+電子受體→L-抗壞血酸+還原的電子受體該酶并不是利用氧作電子受體。這一點可根據(jù)在使用氧作所說的電子受體時，該酶將失去將L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸的催化活性得以證實。此外，用氧探測器檢測時，反應(yīng)混合物中測不出氧的消耗。然而可利用能用作電子受體的任何常規(guī)化合物，連同本發(fā)明的酶。作為這種電子受體，可使用輔酶，或表現(xiàn)有輔酶功能的化合物，如2，6-二氯靛酚(以下稱為DCIP)、甲基硫酸吩嗪、沃斯特氏蘭、氰鐵酸鹽、輔酶Q或細(xì)胞色素C等。
于25℃以分光光度法檢測DCIP在600nm處之吸光率的降低值，以進(jìn)行酶檢測。1單位酶活性定義為每分鐘催化1微摩爾DCIP還原所需的酶量。DCIP在pH7.0條件下的消光系數(shù)為14.5mM-1。1cm光程的比色杯內(nèi)含有0.16mMDCIP、1.6mM甲基硫酸吩嗪、200mM磷酸鉀緩沖液、400mML-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、酶溶液和水，終體積為0.5ml。對照比色杯含有除L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯以外的所有成分。反應(yīng)在加入L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯開始。酶活性是作為DCIP的初始還原速率測得的。
2)底物特異性使用上述的同一酶檢測方法檢測酶的底物特異性，不同的是使用各種不同的底物溶液(400mM)代替L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯。檢測結(jié)果示于表1中。GLDH對L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯和D-木糖有高度活性，并對D-葡糖醛酸-γ-內(nèi)酯、D-葡萄糖和D-甘露糖有微弱活性。
3)最適pH使用上面1)中所述的同一酶檢測方法檢測GLDH的反應(yīng)速率與pH間的相互關(guān)系，不同是使用各種pH的緩沖液。結(jié)果示于表2中。該酶在pH7.0至8.0范圍內(nèi)有最高酶活性。
4)pH穩(wěn)定性4℃下使純化的酶在不同pH的緩沖液中保存192小時。使用上述的同一酶檢測方法檢測殘留的酶活性。檢測結(jié)果示于表3中。純化的酶在pH6.5-9.2之間相當(dāng)穩(wěn)定。
5)熱穩(wěn)定性純化的酶在200mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中于不同溫度下處理5分鐘，然后立即在冰水中冷卻。使用上面1)中所述的同樣酶檢測方法檢測殘留的活性。結(jié)果示于表4中。純化的酶在高達(dá)30℃時是穩(wěn)定的，且在55℃和60℃保溫后，其活性分別丟失大約50％和80％。
6)最適溫度按上面1)中所述的同一酶檢測法檢測GLDH在25℃至55℃之溫度下的酶活性。結(jié)果示于表5中。該酶在所試驗的溫度范圍內(nèi)并沒有獨特的最適溫度。
7)分子量使用預(yù)先用含300mM氯化鈉之100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的大小排阻凝膠柱(TSK gel G3000 SW×L柱，7.8mm×30cm)，以高效液相層析法檢測GLDH的分子量。使用氰鈷胺(MW1350)、肌球蛋白(MW17,000)、卵白蛋白(MW44,000)、γ-球蛋白(MW158,000)和甲狀腺球蛋白(MW670,000)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。測得GLDH的分子量為110,000±2,000。
然后檢測純化之GLDH的亞基成分。在β-巰基乙醇存在下，用十二烷基硫酸鈉(以下稱為SDS)處理純化的GLDH，并加到用含有0.1％SDS之100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡過的如上述的同樣層析柱上。使用溶菌酶(MW14,000)、大豆胰蛋白酶抑制劑(MW21,500)、碳酸酐酶(MW31,000)、卵白蛋白(MW45,000)、牛血清白蛋白(MW66,200)和磷酸化酶B(MW92,500)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。該酶由三個分子量分別為61,000、32,500和16,500的亞基組成。這些亞基分子量的總和是110,000，即天然GLDH的總分子量。
最大成分(MW61,000)可能是黃素蛋白，因為在SDS中進(jìn)行凝膠電泳后，當(dāng)未染色的凝膠與紫外光接觸時，其可顯示出很強的熒光?？山?jīng)血紅素染色而著染的第二種成分(MW32,500)是細(xì)胞色素。
第三個成分(MW16,500±500)是一種簡單蛋白質(zhì)，即不攜帶輔基的蛋白質(zhì)。總括起來，各自的分子量是61,000±1,00032,500±1,00016,500±500，已根據(jù)常規(guī)方法，如SDS電泳法確定了標(biāo)準(zhǔn)誤差。
按照P.E.Thomas等人(Analytical Biochemistry75，168-176(1976)所述的方法對上述電泳凝膠進(jìn)行血紅素染色，現(xiàn)概括如下在甲醇中新鮮制備6.3mM3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ)溶液。使用前，直接將3份TMBZ溶液與7份0.25M乙酸鈉(pH5.0)混合。將凝膠浸入該混合物中，置于暗處室溫下斷續(xù)攪拌2小時。加入H2O2至終體積為30mM，以著染包括細(xì)胞色素的第二種蛋白質(zhì)成份。
8)吸收光譜加連二亞硫酸鈉降低純化之GLDH的吸收光譜，顯示出在可見光區(qū)域的416、521和552nm處有最大值，表明存在細(xì)胞色素C成份(見

圖1)。
9)Km值的測定使用上述的同一酶檢測方法，檢測隨著L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯濃度從0.18mM變到90mM所引起的氧化反應(yīng)速度的改變，以確定L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的Km值。發(fā)現(xiàn)在底物濃度為大約71.8mM時出現(xiàn)最大反應(yīng)速度。用DCIP作電子受體時，算得表觀米氏常數(shù)(Km)為34.8mM。
10)金屬離子的影響使用如上述的同一酶檢測方法，檢測各種金屬離子對酶活性的影響。結(jié)果示于表6中。顯示Cu2+和Mn2+對酶有很強的抑制作用。
11)抑制劑的影響使用上述的同一酶檢測方法，檢測各種抑制劑對酶活性的影響。結(jié)果示于表7中。被試的化合物均沒有顯示對GLDH有抑制作用。
12)純化方法可聯(lián)合使用已知純化方法，如離子交換層析、液相層析、吸附層析、凝膠過濾層析、凝膠電泳、鹽析及透析等方法純化L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶。
所用的微生物包括葡糖桿菌屬的所有菌株，當(dāng)在巨大芽孢桿菌存在下共培養(yǎng)時，它們顯示出良好的生長狀態(tài)。所說微生物的突變體和變異體也可用于本發(fā)明。優(yōu)選的菌株是氧化葡糖桿菌。
已參照伯格氏細(xì)菌鑒定手冊(Bergey′s Manual ofDeterminative Bacterioloyy，1974年第8版)，特別是根據(jù)它們所表現(xiàn)的下列特征，將這些菌株定名并分類為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)a)由L-山梨糖產(chǎn)生2-酮-古洛糖酸，b)將乙醇氧化成乙酸，c)將D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸，d)聚醇的生酮作用e)在pH4和5的甘露醇培養(yǎng)液中(24小時培養(yǎng))有菌膜和環(huán)生長，在pH4.5的D-葡萄糖培養(yǎng)液中有菌膜生長。
此外，它們還表現(xiàn)有下列特性f)基本上不能由甘油產(chǎn)生二羥丙酮，g)可由D-山梨醇和D-葡糖二酸，但不能由D-葡萄糖、D-果糖、D-葡糖酸、D-甘露醇或2-酮-D-葡糖酸產(chǎn)生2-酮-D-葡糖二酸，h)有多形性，未觀察到鞭毛，i)由D-果糖產(chǎn)生一種褐色色素，j)當(dāng)在巨大芽孢桿菌或其細(xì)胞提取物存在下共培養(yǎng)時生長良好，k)對鏈霉素敏感。
一個特定的和優(yōu)選的氧化葡糖桿菌已于1987年3月17日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(Goettingen)，保藏登記號為DSM4025。
氧化葡糖桿菌菌株的細(xì)胞呈棒狀，兩端為圓形。細(xì)胞直徑平均大約0.3-0.6μm其長度約0.9-1.6μm，大多為1-1.5μm。
為了制備GLDH，可于有氧條件下在添加適當(dāng)營養(yǎng)素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物。培養(yǎng)可在pH大約4.0至9.0之間，較好在pH6.0至8.0之間進(jìn)行。雖然培養(yǎng)時間可根據(jù)pH、溫度及所用的營養(yǎng)培養(yǎng)基而異，但通常2至5天即可得到良好結(jié)果。培養(yǎng)的優(yōu)選溫度范圍為13至36℃，更好是18至33℃。
通常要求培養(yǎng)基中含有可同化的碳源、可消化的氮源和無機物、維生素、微量元素等營養(yǎng)素以及其他生長促進(jìn)因子。作為可同化的碳源，可使用L-山梨糖、甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿拉伯糖醇等。也可以使用各種有機或無機物質(zhì)作為氮源，如酵母提取物、肉汁、蛋白胨、酪蛋白、玉米漿、尿素、氨基酸、硝酸鹽、銨鹽等。作為無機物質(zhì)，可使用硫酸鎂、磷酸鉀、氯化鐵和氯化亞鐵、碳酸鈣等。
下面簡要描述在培養(yǎng)后由微生物中分離并純化GLDH的實施方案。
(1)用離心或過濾法，從發(fā)酵培養(yǎng)液中收集細(xì)胞。
(2)將細(xì)胞懸浮于緩沖溶液中，并借助勻漿器、超聲波發(fā)生器或用溶菌酶等處理來破碎細(xì)胞，得到被破壞之細(xì)胞的溶液。
(3)由被破壞之細(xì)胞的無細(xì)胞提取物中，更好從微生物的可溶性部分中分離并純化GLDH。
在這些步驟中，最好是能使用柱層析法，如1)DEAE纖維素柱層析，2)Q-Sepharose柱層析，3)羥基磷灰石柱層析，4)Sephacryl S-300柱層析，5)聚丙烯酰胺凝膠電泳等。
本發(fā)明提供的GLDH可用作由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯生產(chǎn)L-抗壞血酸的催化劑。該反應(yīng)應(yīng)在電子受體如DCIP、PMS、Wurster氏蘭、氰鐵酸鹽、輔酶Q、細(xì)胞色素C等的存在下，在McIlvaine緩沖液、磷酸鉀緩沖液、Tris-HCI緩沖液等溶劑中，于大約6.0至9.0的pH值條件下進(jìn)行。
優(yōu)選的反應(yīng)溫度為大約25至55℃。當(dāng)反應(yīng)的pH和溫度分別定在大約7.0-8.0和30-50℃時，反應(yīng)通?？色@得最好的結(jié)果。作為溶劑中的底物，L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的濃度可依據(jù)其他反應(yīng)條件而異，但一般可在大約10-150g/l，更好是大約10-100g/l。
為完成這一反應(yīng)，也可以使用帶有適當(dāng)載體的呈固相化狀態(tài)的酶?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何一種固定酶的方法。例如，可將酶直接結(jié)合到膜、顆?；蛴泄δ苄曰鶊F(tuán)的樹脂上，或者通過有雙功能基團(tuán)的橋接化合物，如戊二醛結(jié)合到樹脂上。
就發(fā)酵方法而論，可按照下列程序分別選用下列參數(shù)并適當(dāng)?shù)赝瓿稍摲椒稍诨衔颕的存在下，在營養(yǎng)素水溶液中培養(yǎng)有產(chǎn)生II之能力的微生物；或者在微生物生長后，使之在緩沖液中與I接觸，然后繼續(xù)保溫。
所用微生物可以是細(xì)菌，如醋酸桿菌屬細(xì)菌，如弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter suboxydans)(DSM 5935)氧化醋酸桿菌(Acetobacter Oxydans)(DSM5936)黑色醋酸桿菌(Acetobacter melanogenus)(NDIMB8086)葡糖桿菌屬，如氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)(ATCC621)氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)(DSM4025)。其他適用的細(xì)菌是放線菌屬，鏈霉菌屬等，如抗生素鏈霉菌(Streptomyces antibioticus)(ATCC8633)優(yōu)洛釘菌鏈霉菌(Streptomyces eurocidicus)(ATCC19551)淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)(DSM5926)橄欖色鏈霉菌(Streptomyces olivaceus)(ATCC3335)紡綞鏈霉菌(Streptomycesnetropsis)(NRRL2268)〔NRRL＝Northern Utilization Research and DevelopmentDivision of U.S.D.A.，Peoria，Illinois.USA；ATCC＝American Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA；NCIMB＝National Collection of Industrial+MarineBacteria，Torry Research Station，Aberdeen AB98DG，Scotland〕該反應(yīng)選用的是醋酸桿菌屬和葡糖桿菌屬的特定菌種，特別是弱氧化醋酸桿菌和氧化葡糖桿菌菌株。已為保護(hù)該方法的目的保藏了這些菌株。
應(yīng)明確的是，用于本發(fā)明的每種微生物最好都生長于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后用于本發(fā)明的發(fā)酵過程。菌株有可能在液體培養(yǎng)基中生長。
可將有微生物生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基直接用于發(fā)酵反應(yīng)。
本發(fā)明反應(yīng)培養(yǎng)基的組成可以很簡單，例如可以是合并有在緩沖液中單獨生長的微生物，而沒有任何其他成分的析出物I的溶液。
培養(yǎng)基的pH可在2至9之間，較好是大約4至7。必要時可用緩沖系統(tǒng)調(diào)節(jié)pH值。
為得到最佳產(chǎn)率，最好使用濃度約為1-10％(重量)的析出物。
發(fā)酵時間較好在2至100小時，特別是在4至72小時之間，添加析出物I可延長發(fā)酵時間。
應(yīng)指出的是，氧化作用代表了一個需氧過程。在空氣或另外通氣下進(jìn)行強烈振蕩或攪拌反應(yīng)介質(zhì)即可滿足這些條件。
下列實施例將進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實施例1L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的制備
(1)氧化葡糖桿菌DSM4025的培養(yǎng)氧化葡糖桿菌DSM4025在含有5.0％甘露醇、0.25％MgSO47H2O、1.75％玉米漿、5.0％面包酵母、0.5％尿素、0.5％CaCO3和2.0％瓊脂的瓊脂斜面培養(yǎng)基上27℃生長4天。取1菌環(huán)氧化葡糖桿菌DSM4025的瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于加在500ml培養(yǎng)瓶中的50ml含有8.0％山梨糖、0.05％甘油、0.5％尿素、0.25％MgSO47H2O、1.75％玉米漿、5.0％面包酵母和1.5％CaCO3的種子菌培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)振蕩器(180rpm)上30℃培養(yǎng)1天。取5ml該培養(yǎng)物移入加在500ml培養(yǎng)瓶中的50ml同一培養(yǎng)基中，并按上述的同樣方法培養(yǎng)。用如此制得的2升種子培養(yǎng)物接種含有20升培養(yǎng)基的30升小型發(fā)酵罐，所說的培養(yǎng)基含有8.0％L-山梨糖、0.05％甘油、1.2％尿素、0.25％MgSO47H2O、1.75％玉米漿、5.0％面包酵母和1.5％CaCO3。該小型發(fā)酵罐在30℃、400rpm攪拌及0.5vvm(空氣體積/培養(yǎng)基體積/分鐘)通氣條件下進(jìn)行工作。發(fā)酵40小時后，發(fā)酵液以1,500rpm離心10分鐘，除去碳酸鈣；然后以8,000rpm(10,000×g)離心，沉淀出細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞團(tuán)塊用0.85％NaCl溶液洗一次。從20升發(fā)酵液中約得到100g(凈重)細(xì)胞。
(2)可溶性部分的制備由上述步驟(1)得到的氧化葡糖桿菌DSM4025(凈重95g)細(xì)胞用0.85％NaCl溶液洗兩次。將洗過的細(xì)胞懸浮于380ml 10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，并用French擠壓勻漿器以1,500kg/cm2的壓力將細(xì)胞懸浮液制成勻漿。以1,800×g離心10分鐘除去細(xì)胞碎片，然后將上清液(以下稱為無細(xì)胞提取物)以100,000×g離心60分鐘。作為氧化葡糖桿菌DSM4025細(xì)胞的可溶性部分，收集所得上清液(450ml)。
(3)二乙氨乙基(以下稱為DEAE)纖維素柱層析將上述步驟中得到的可溶性部分(450ml)對10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析。將透析液(500ml)加到用10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡過的DEAE纖維素柱(2.5×120cm)上。用同樣緩沖液，然后再用含有0.25M NaCl的同樣緩沖液洗柱。用含有0.5MNaCl的同樣緩沖液洗脫GLDH。
(4)Q-Sepharose柱層析將得自前述步驟的合并的活性部分(200ml)對兩批各2升的10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，并將透析液加到用同樣緩沖液平衡過的Q-Sepharose柱(2.5×50cm)上。用同樣緩沖液洗柱后，用0.3至0.5M的NaCl線性梯度洗脫GLDH。
(5)羥基磷灰石(Bio-gel HTP)柱層析將前述步驟中得到的合并的活性部分210ml)對兩批各2升的10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，并將透析液加到預(yù)先用同樣緩沖液平衡過的羥基磷灰石柱(2.5×25cm)上。用同樣緩沖液洗柱，并用10mM至40mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性梯度洗脫GLDH。合并有酶活性的各管并用超濾器(pM10，Amicon)將其超濾濃縮至大約20ml。
(6)Sephacryl S-300柱層析將上述步驟得到的含酶部分(2ml)加于預(yù)先用含有50mMNaCl之50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡過的Sephacryl S-300柱(1.0×100cm)，并用同樣緩沖液展開。合并含有電泳純GLDH的各管并于-80℃下儲存。
使用上述純化步驟，可使GLDH純化約900倍。表8中總結(jié)了GLDH的各純化步驟。
(7)分離的酶的純度用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(分離膠10％聚丙烯酰胺；電泳條件4℃，20mA，6小時)，估測分離的GLDH的純度。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，酶顯示出一條單一的帶。當(dāng)未染色的凝膠在含有50mML-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、20μg/ml氮藍(lán)四唑和40μg/ml甲基硫酸吩嗪的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中浸漬20分鐘時，該蛋白帶顯示出GLDH活性。
(8)反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定將含有0.5ml純化的GLDH(7.5μg，469單位/mg蛋白質(zhì))、1.0ml 0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、0.1gL-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯、0.1ml 10mM甲基硫酸吩嗪并加水至終體積為2.0ml的反應(yīng)混合物于30℃下保溫2小時。用薄層層析法和高效液相層析法分析反應(yīng)產(chǎn)物。薄層層析按下述方法進(jìn)行樣品(1ul)點在硅膠板(Merck，USA)上，用正丙烷-水-1％磷酸-甲酸(400∶100∶10∶1)的溶劑系統(tǒng)在室溫下展層2小時。然后干燥層析板并在紫外燈下觀察。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物即是Rf值為大約0.7處的UV吸收點，其相當(dāng)于L-抗壞血酸的實際樣品。按下述方法進(jìn)行高效液相層析將樣品加于預(yù)先用乙腈∶水∶乙酸(87∶11∶2)溶劑系統(tǒng)平衡過的LichrosorbNH2柱(Merck，USA，0.4×25cm)上，流速定為3.0ml/分鐘，并經(jīng)測254nm吸光率來檢測產(chǎn)物。結(jié)果可見，在同一滯留時間洗脫的產(chǎn)物即相當(dāng)于L-抗壞血酸的真實樣品。
最后該產(chǎn)物被鑒定為L-抗壞血酸。
L-抗壞血酸的產(chǎn)率為0.71g/L/小時。
實施例2經(jīng)發(fā)酵(生長細(xì)胞)由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯生產(chǎn)L-抗壞血酸在3升小型發(fā)酵罐內(nèi)，用200ml按實施例1-(1)中所述方法制備的氧化葡糖桿菌DSM4025的種子菌培養(yǎng)物接種2升含有L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯(8％)、甘油(0.05％)、面包酵母(5.0％)、MgSO47H2O(0.25％)、玉米漿(1.75％)、尿素(0.5％)和CaCO3(1.5％)(初始pH定在7.0)的培養(yǎng)基中。在30℃、700rpm攪拌及0.5vvm，通氣量條件下進(jìn)行發(fā)酵。如表9所示，發(fā)酵66小時產(chǎn)生了8.6g/lL-抗壞血酸。
實施例3使用靜止細(xì)胞系統(tǒng)由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯生產(chǎn)L-抗壞血酸將0.1g至0.67g按實施例1-(1)所述方法制備的氧化葡糖桿菌DSM4025的細(xì)胞加到總體積為3ml，含有47.6mg/ml或89.3mg/lL-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。反應(yīng)混合物于30℃振蕩(280rpm)保溫6小時。結(jié)果示于表10中。L-抗壞血酸的最高產(chǎn)率為20mg/小時/克細(xì)胞，最高收率為13.92g/l。
實施例4使用氧化葡糖桿菌DSM4025的無細(xì)胞提取物由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯生產(chǎn)L-抗壞血酸將含有1.0ml實施例1-(1)和(2)所述方法制備的氧化葡糖桿菌DSM4025的無細(xì)胞提取物(蛋白質(zhì)含量10.3mg/ml)、1ml 0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和0.5ml 17.8％L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯的反應(yīng)混合物于30℃保溫17.5小時。結(jié)果產(chǎn)生2.19g/lL-抗壞血酸。
實施例5(生長細(xì)胞系統(tǒng))弱氧化醋酸桿菌(DSM5935)生長于培養(yǎng)基1(組成50％酵母水、50％甘露醇，加自來水調(diào)到pH6.5)中的瓊脂斜面上。30℃保溫2天后，用1菌環(huán)細(xì)胞接種5ml液體培養(yǎng)基1(組成同上，但沒有瓊脂)。試管于30℃下振蕩(220rpm)保溫3天。取1ml預(yù)培養(yǎng)物接種100ml加有1g析出物I的培養(yǎng)基1。于30℃下振蕩(220rpm)培養(yǎng)。72小時后終止培養(yǎng)。分析檢測結(jié)果表明，3％的析出物I轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物II。
實施例6(靜止細(xì)胞系統(tǒng))按上述方法培養(yǎng)弱氧化醋酸桿菌(DSM5935)。離心(10,000rpm，10分鐘)收集100ml培養(yǎng)物并加在塑料瓶內(nèi)用液氮冷凍。在含有培養(yǎng)基1的100ml培養(yǎng)瓶內(nèi)接種0.5ml取自各小瓶的培養(yǎng)物，30℃振蕩(220rpm)保溫并在同一時間加入1g析出物I。根據(jù)分析檢測結(jié)果，表明在72小時內(nèi)有10％的析出物I被轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物II。
實施例7(靜止細(xì)胞系統(tǒng))按實施例6中所述培養(yǎng)弱氧化醋酸桿菌(DSM5935)。以接種了-0.5ml取自小瓶之預(yù)培養(yǎng)物的100ml培養(yǎng)物作為同一培養(yǎng)基中的另一生長培養(yǎng)物。這些含100ml培養(yǎng)基1的培養(yǎng)瓶各接種5ml預(yù)培養(yǎng)物并于30℃下振蕩(220rpm)培養(yǎng)24小時。離心(10,000rpm，10分鐘)收集生長的細(xì)胞，將3g濕細(xì)胞(相當(dāng)于一個培養(yǎng)瓶的細(xì)胞)懸浮于總體積為120ml、加有0.1g析出物I(作為粉末加入)的緩沖溶液(pH6.0，0.05M磷酸鹽緩沖液)中。結(jié)果48小時內(nèi)有30％的析出物I轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物II。
實施例8(靜止細(xì)胞系統(tǒng))在實施例1中所述的瓊脂斜面上培養(yǎng)弱氧化醋酸桿菌(DSM5935)。將生長的細(xì)胞層懸浮于10ml生理鹽水(0.9％)中。用該懸液接種10個搖瓶(100ml培養(yǎng)基1)(各接種1ml)。培養(yǎng)瓶于30℃下振蕩(220rpm)保溫4天。用這10份培養(yǎng)物接種10升葉片攪拌的生物反應(yīng)器(含9,000ml培養(yǎng)基1)。生長條件是溫度30℃，通氣量0.4vvm，攪拌速度500rpm。生長44小時后離心(以12,000rpm連續(xù)離心)收獲細(xì)胞。收率為每升21g濕細(xì)胞。將細(xì)胞分成幾部分深凍。在本實施例中，將1g冷凍的細(xì)胞迅速融化并連同0.4g析出物I一起加到0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。該分析混合物的總體積為5ml。分析檢測結(jié)果表明有19％的析出物I被轉(zhuǎn)化成了產(chǎn)物II。
表1L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的底物特異性底物相對活性(％)L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯 100L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯 0D-葡糖醛酸-γ-內(nèi)酯 6.38D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯0D-葡糖醛酸 0D-葡糖酸0D-葡萄糖23.4D-甘露糖7.23D-半乳糖0L-古洛糖0D-木糖 110.6
表2L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的最適pH相對活性(％)pH值緩沖液MCIlvain 磷酸鉀Tris-HCl4.00 - -4.50 - -5.08.2- -5.518.2 - -6.058.5 - -6.577.8 56.4 -7.010083.6 45.97.5105.8 102.3 58.28.0109.3 - 61.78.5- - 60.0(-未測)
表3L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的PH穩(wěn)定性相對活性(％)pH值緩沖液McIlvaine 磷酸鉀 Tris-HCl NH4OH-NH4Cl4.0 0 - - -4.5 0 - - -5.0 0 - - -5.5 9.38 - - -6.0 48.4 62.5 - -6.5 75.0 50.3 - -7.0 79.7 71.9 84.4 -7.5 100 95.3 75.0 -8.0 84.4 - 62.5 -8.3 - - 53.2 57.88.85 - - - 115.69.2 - - - 1009.7 - - - 68.8
表4L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的溫度穩(wěn)定性溫度(℃) 相對活性(％)0 10025 10030 10035 89.640 87.545 72.950 70.855 53.160 18.865 070 075 0
表5L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的最適溫度溫度(℃) 相對活性(％)25 10030 103.235 101.840 106.645 101.450 115.155 102.7
表6各種金屬對L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶活性的影響金屬濃度 相對活性 金屬 濃度 相對活性(mM) (％) (mM) (％)Ca(NO3)2·4H2O 0.19 100 MgSO4·7H2O 0.19 920.38 100 0.38 960.89 960.89 92CaCl20.19 96 MgCl2·6H2O 0.19 960.38 104 0.38 960.89 960.89 96CoCl2·6H2O 0.19 102 MnCl2·4H2O0.19 1000.38 110 0.38 00.89 100 0.89 0CoSO4·7H2O 0.19 96 MnSO4·4-6H2O 0.19 1000.38 108 0.38 00.89 880.89 0CuSO40.19 92 Na2MoO4·2H2O 0.19 1040.38 240.38 960.89 120.89 88CuSO4·5H2O 0.19 80 TiCl 0.19 880.38 200.38 920.89 0 0.89 80Cu(NO3)2·3H2O 0.19 88 ZnCl20.19 880.38 240.38 880.89 0 0.89 80CuCl2·2H2O 0.19 84 ZnSO4·7H2O0.19 880.38 8 0.38 880.89 0 0.89 76Fe(SO4)3·xH2O 0.19 104 NiSO4·7H2O 0.19 960.38 920.38 960.89 760.89 88K4Fe(CN)6·3H2O 0.10 0無 100
表7各種抑制劑對L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶活性的影響抑制劑 濃度 相對活性(mM) (％)EDTA 0.96 95.2-1.89 100N-乙基- 4.46 90.5順丁烯二酰亞胺 0.96 95.21.89 1004.46 100疊氮化鈉 0.96 1001.89 97.64.46 97.6一碘乙酸 0.96 104.81.89 1004.46 92.9PCMB(對位氯- 0.96 90.5苯甲酸汞)1.89 102.44.46 100No2HAsO4·7H2O 0.96 95.21.89 104.84.46 97.6氟化鈉 0.96 107.11.89 114.34.46 97.6KCN 0.96 96.01.89 96.04.46 96.0鹽酸胲 1.0 1002.0 100一水合肼 1.0 100無100
表8L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶的純化步驟步驟 總活性 總蛋白質(zhì) 比活性 回收率(單位) (mg) (單位/mg)(％)可溶性部分 1179.9 2289.5 0.52 100DEAE纖維素 766.966.44 11.5465.0Q Sepharose761.88.65 88.1064.6羥基磷灰石 473.13.24 146.040.1Sephacryl S-30037.8 0.0806 469.0-
表9由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯發(fā)酵生產(chǎn)L-抗壞血酸培養(yǎng)時間(小時) 產(chǎn)生的L-抗壞血酸(g/l)00.071518.5 3.5427 5.1242 6.9651 7.8866 8.5775 8.4690 7.72
表10使用靜止細(xì)胞系統(tǒng)由L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯生產(chǎn)L-抗壞血酸初始L-古洛糖酸 細(xì)胞濃度 所產(chǎn)生的L-抗壞血酸-γ內(nèi)酯濃度(克細(xì)胞濕重/ml)(mg/ml)(mg/ml) 3小時6小時00.10047.6 0.15.98 7.220.17 6.46 7.820.33 7.83 9.650.67 9.51 11.2889.3 0.15.88 7.620.17 6.88 9.500.33 8.37 13.920.67 8.67 13.5權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，包括在L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶和電子受體存在下氧化L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯，所說的L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶具有下列物理化學(xué)性質(zhì)a)底物特異性對L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯和D-木糖有高度活性；b)最適pH7-8；c)分子量110,000±2,000(由三個亞基組成，包括分子量分別為61,000±1,000、32,500±1,000和16,5000±500的黃素蛋白、細(xì)胞色素C及一種簡單蛋白質(zhì))；d)輔基黃素；e)金屬離子的影響Cu2+和Mn2+對該酶有強抑制作用；f)電子受體不同于氧。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用微生物由L－古洛糖酸－γ－內(nèi)酯制造L－抗壞血酸的新方法、制備對L－古洛糖酸－γ－內(nèi)酯的微生物學(xué)氧化作用負(fù)責(zé)之酶的方法,所說的酶是純化形式的L－古洛糖酸－γ－內(nèi)酯脫氫酶。
文檔編號C12R1/01GK1274756SQ9912487
公開日2000年11月29日 申請日期1999年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月17日
發(fā)明者星野·達(dá)雄, 彼得·卡爾·馬茨革, 尾島·節(jié)子, 衫沢·輝秀 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司