專利名稱：人α 1b型干擾素的基因合成、表達質(zhì)粒構(gòu)建及產(chǎn)物的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用基因工程技術(shù)實現(xiàn)大量生產(chǎn)人α1b型干擾素的方法。
人α1b型干擾素作為我國自行研制成功的第一個進入市場的生物高科技產(chǎn)品，是治療乙肝、丙肝等病毒性疾病和惡性腫瘤的重要藥物。在我國，干擾素的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，產(chǎn)量偏低，成本較高，還不能為廣大工薪階層廣泛接受和使用，影響了干擾素的產(chǎn)業(yè)化進程，因此大幅度降低其生產(chǎn)成本是當(dāng)前干擾素開發(fā)中的一項重要任務(wù)。
人α1b型干擾素當(dāng)前存在生產(chǎn)成本高的問題，其主要原因是表達水平偏低，干擾素蛋白的表達只占菌體可溶性蛋白的1-2％；干擾素成品的獲得需經(jīng)歷多重復(fù)雜的純化工藝流程，純化損失大，回收率只有10-20％。
對本發(fā)明通過全基因分段合成和PCR拼接，構(gòu)建了全人工合成的人α1b型干擾素基因，利用原核表達載體pBV220及pWT7在大腸桿菌中以包涵體形式獲得高效表達，并建立了一整套簡便有效的純化人α1b型干擾素的工藝流程，提高了干擾素的表達量和最終得率。人α1b型干擾素的表達量達到菌體可溶性蛋白的20％，干擾素α1b的最終產(chǎn)量可提高數(shù)十倍，大幅度降低了干擾素制劑的成本。全人工合成高產(chǎn)廉價人α1b型干擾素的研制成功，將帶來干擾素產(chǎn)業(yè)的更新?lián)Q代，具有巨大的社會效益和經(jīng)濟效益，造福廣大人民。
以下對本發(fā)明進行詳細(xì)描述。1．人α1b型干擾素基因DNA序列的設(shè)計通常的技術(shù)改進手段，如上游表達載體的優(yōu)化、下游工程中表達與純化工藝的改良等，對干擾素的表達量與最終得率的提高的效果均不明顯。本發(fā)明從影響異源蛋白在大腸桿菌中表達水平的另一重要影響因素一基因的密碼子構(gòu)成入手，對人α1b型干擾素基因進行了全面的設(shè)計與合成。同一種氨基酸乃至蛋白質(zhì)多肽分子，根據(jù)密碼子的簡并性，可由不同的DNA序列來編碼。不同生物種對蛋白質(zhì)的編碼基因的密碼子的喜好性是不同的，現(xiàn)有的人α1b型干擾素基因的DNA序列是由我國學(xué)者侯云德自正常人白細(xì)胞經(jīng)新城疫病毒誘導(dǎo)后克隆而來，其密碼子構(gòu)成體現(xiàn)了人對編碼蛋白質(zhì)的密碼子喜好性，將這種DNA序列通過載體由大腸桿菌來表達，因此得到很低的表達水平。采用大腸桿菌的喜好密碼子來替代天然密碼子，是提高干擾素的可行手段。
本發(fā)明根據(jù)各種密碼子的在大腸桿菌中的使用頻率，保留人α1b型干擾素的氨基酸序列不變，選用在大腸桿菌的喜用密碼子，取代原有人α1b型干擾素基因DNA序列中的非喜用密碼子，設(shè)計全新的人α1b型干擾素基因DNA序列。人α1b型干擾素的氨基酸序列、天然基因及合成基因的序列見附

圖1。2．人α1b型干擾素基因的全人工合成根據(jù)所設(shè)計的DNA序列，采用全基因分段合成和PCR拼接的策略，構(gòu)建人工合成的人α1b型干擾素基因。2．1 在通用的DNA自動合成儀上采用亞磷酸酰胺法化學(xué)合成以下7段長度為90bp左右的DNA片段，編號分別為L1,L2,L3,R1,R2,R3和R4。其中L1的5‘端含EcoR1位點，R4的3’端含BamH1位點，以便向表達載體插入。
序列中的陰影部分，表示該處是兩段DNA片段互補搭接之處。2．．2利用PCR反應(yīng)體系，搭橋法分步延長合成的IFNα1b基因片段。2．2．1 DNA片段L3,R4的鏈延長反應(yīng)根據(jù)設(shè)計，L3與R4的末端有20個堿基互補，這使兩鏈相連，在PCR反應(yīng)體系中，兩鏈未互補部分互為模版發(fā)生鏈延長。反應(yīng)條件L3 5μL(0.10D/μL),R4 5μL(0.10D/μL),10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)16μL,H2O 63μL，反應(yīng)體系共100μL。94℃恒溫5min，55℃恒溫加入TaKaRa LATaq酶1μL后，恒溫5min,72℃,5min.即可得到由L3和R4拼接而成的兩條互補長鏈，名為L3R4，為下一步PCR反應(yīng)的模版。2．2．2 DNA片段L2,R3的鏈延長反應(yīng)與前一步同理，依據(jù)設(shè)計，L2與L3有20bp的互補序列，R3與R4有20bp的互補序列。利用引物L(fēng)2和R3進行如下的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件L2(0.01 OD/μL)1μL,R3(0.01 OD/μL)1μL,模板L3R4 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)10μL,TaKaRa LA Taq酶1μL,H2O 76μL，反應(yīng)體系共100μL，94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循環(huán)。產(chǎn)物名為L2L3R4R3，為下一步PCR反應(yīng)的模版。2．2．3 DNA片段L1,R2和R1的鏈延長反應(yīng)依據(jù)設(shè)計，L1與L2有20bp的互補序列，R2與R3有20bp的互補序列，R1與R2有20bp的互補序列。利用引物L(fēng)1,R2和R1進行如下的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件L1(0.01 OD/μL)1μL,R2(0.01 OD/μL)1μL,R1(0.01 OD/μL)1μL，模板L2L3R4R3 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmolμL)10μL,TaKaRaLA Taq酶1μL,H2O 75μL，反應(yīng)體系共100μL,94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循環(huán)。產(chǎn)物名為L1L2L3R4R3R2R1，即為合成的全長的人IFNα1b基因(命名為sIFNα1b)。3．全人工合成的人α1b型干擾素基因的克隆和表達3．1 全人工合成的人α1b型干擾素的表達載體pSI9901的構(gòu)建及表達(實例說明)用EcoR1和8amH1完全酶切全長的人IFNα1b基因，插入經(jīng)EcoRⅠ,BamHⅡ雙切的pBV220原核表達載體中，獲得重組質(zhì)粒pSI9901，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，所選轉(zhuǎn)化克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定和DNA序列測定證明克隆正確。陽性克隆37℃過夜活化后，按1∶100比例轉(zhuǎn)接共5ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD=1，轉(zhuǎn)42℃繼續(xù)培養(yǎng)6小時，離心收集菌體，加入100ul 2X上樣緩沖液，100℃煮沸5min,12％SDS-PAGE電泳檢測干擾素表達，經(jīng)凝膠掃描分析，干擾素表達量達到菌體蛋白的30％，比原有菌種的表達水平提高了10倍以上。附圖2為pSI9901的質(zhì)粒構(gòu)建圖。附圖3為表達菌體的12％SDS-PAGE電泳圖。3．2 全人工合成的人α1b型干擾素的表達載體pSI9902的構(gòu)建及表達設(shè)計一對兩端具NdeⅠ與BamHⅠ酶切位點的PCR引物，利用PCR反應(yīng)自pSI9901中得到人α1b型干擾素基因，用Ndel和BamH1完全酶切PCR產(chǎn)物，插入經(jīng)NdeⅠ,BamH Ⅰ雙切的pWT7原核表達載體中，獲得重組質(zhì)粒pSI9902，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，所選轉(zhuǎn)化克隆經(jīng)PCR、酶切鑒定和DNA序列測定證明克隆正確。陽性克隆37℃過夜活化后，按1∶100比例轉(zhuǎn)接共5ml含Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=1，加入IPTG至終濃度為4mM 25℃繼續(xù)培養(yǎng)6小時，離心收集菌體，加入100ul 2X上樣緩沖液，100℃煮沸5min，12％SDS-PAGE電泳檢測干擾素表達，經(jīng)凝膠掃描分析，干擾素表達量達到菌體蛋白的30％，比原有菌種的表達水平提高了10倍以上。附圖4為pSI9902的質(zhì)粒構(gòu)建圖。附圖5為表達菌體的12％SDS-PAGE電泳圖。4．全人工合成的人α1b型干擾素的大量表達及純化(實例說明)將工程菌單菌落挑入5mL含50μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)至500mL含50μL/mL氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至其進入對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)入5升發(fā)酵罐中，37℃2培養(yǎng)至其OD=1，快速升溫至42℃，誘導(dǎo)6小時，離心收菌。菌體濕重可達50g。
離心收集發(fā)酵的菌體經(jīng)TE緩沖液洗滌后，溶菌酶、8M鹽酸胍處理后，超聲破菌，3500g離心得到包涵體，以7M尿素在4℃懸浮包涵體，繼以8M鹽酸胍裂解包涵體，PBS復(fù)性。透析去除鹽酸胍后，離心取上清，過單抗柱，得到電泳純的半成品，加入穩(wěn)定劑后分裝為成品。5．結(jié)果及產(chǎn)物活性測定由于工程菌種的成功改造，在同樣的成本投入條件下，人α1b型干擾素的產(chǎn)量是原有菌種的十倍以上；換而言之，獲得同樣產(chǎn)量的人α1b型干擾素，由于更換新菌種，其成本降為原來的十分之一以下。
經(jīng)蛋白質(zhì)N端測序，結(jié)果證實純化蛋白為人α1b型干擾素。將純化的人α1b型干擾素半成品經(jīng)蛋白定量后，以國際上通用的WISH/VSV系統(tǒng)測定比活為1×107IU/mg，與標(biāo)準(zhǔn)的人α1b型干擾素比活一致。
權(quán)利要求
1．一種重組人α1b型干擾素的全人工合成的基因，其特征在于DNA序列如下ATG TGT GAT CTG CCG GAA ACC CAC TCT CTA GAC AAC CGT CGT ACC CTG ATG CTG CTG GCT CAG ATG TCT CGT ATCTCT CCG TCT TCT TGC CTG ATG GAC CGT CAC GAC TTC GGT TTC CCG CAG GAA GAA TTT GAC GGT AAC CAG TTC CAGAAA GCT CCG GCT ATC TCT GTT CTG CAC GAA CTG ATC CAG CAG ATC TTC AAC CTG TTC ACC ACC AAA GAC TCT TCTGCT GCT TGG GAC GAA GAC CTG CTG GAC AAA TTC TGC ACC GAA CTG TAC CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCT TGTGCT ATG CAG GAA GAA CGT GTT GGT GAA ACC CCG CTG ATG AAC GCT GAC TCT ATC CTG GCT GTT AAG AAA TAC TTCCGT CGT ATC ACC CTG TAC CTG ACC GAA AAG AAA TAC TCT CCG TGT GCT TGG GAA GTT GTT CGT GCT GAA ATC ATGCGT TCT CTG TCT CTG TCT ACC AAC CTG CAG GAA CGT CTG CGT CGT AAA GAA TAA。
2．根據(jù)與權(quán)利要求1的人α1b型干擾素的全人工合成的基因DNA序列有90％以上的同源性的DNA序列，含有與所述DNA序列有90％以上的同源性的DNA序列的相應(yīng)的表達載體質(zhì)粒，含有與所述DNA序列有90％以上的同源性的DNA序列的相應(yīng)的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲以及哺乳動物細(xì)胞。
3．七種重組人α1b型干擾素的全人工合成的基因片段，其特征在于DNA序列如下L1, CGGAATTCATGTGTGATCTGCCGGAAACCCACTCTCTAGACAACCGTCGTACCCTGATGCTGCTGGCTCAGATGTCTCGTATCTCTCCGTCTL2, GTCTCGTATCTCTCCGTCTTCTTGCCTGATGGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAATTTGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTCCL3, AACCAGTTCCAGAAAGCTCCGGCTATCTCTGTTCTGCACGAACTGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCACCACCAAAGACTCTTCTGCTGCTTGGR1, CGGGATCCTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTAGACAGAGACAGAGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCR2, CAGCACGAACAACTTCCCAAGCACACGGAGAGTATTTCTTTTCGGTCAGGTACAGGGTGATACGACGGAAGTATTTCTTAACAGCCAGGATAR3, ATTTCTTAACAGCCAGGATAGAGTCAGCGTTCATCAGCGGGGTTTCACCAACACGTTCTTCCTGCATAGCACAAGCTTCCAGGTCGR4, AGCACAAGCACAAGCTTCCAGGTCGTTCAGCTGGTACAGTTCGGTGCAGAATTTGTCCAGCAGGTCTTCGTCCCAAGCAGCAGAAGAGTCTT
4．根據(jù)與權(quán)利要求3的人α1b型干擾素的全人工合成的基因片段90％以上的同源性的DNA序列，含有與權(quán)利要求3的人α1b型干擾素的全人工合成的基因片段有90％以上的同源性的DNA序列的相應(yīng)的表達載體質(zhì)粒，含有與所述基因片段有90％以上的同源性的DNA序列的相應(yīng)的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲以及哺乳動物細(xì)胞。
5．含有權(quán)利要求1的人α1b型干擾素的全人工合成基因的表達質(zhì)粒pSI9901。其特征為將權(quán)利要求1的人α1b型干擾素的全人工合成基因克隆入帶有pLpR啟動子Cits857溫控阻遏蛋白的基因、核糖體5SrRNA基因中止信號t1t2及MCS區(qū)的基因載體pBV220中，構(gòu)建成人α1b型干擾素的表達質(zhì)粒pSI9901，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得高效表達；轉(zhuǎn)化后的工程菌為大腸桿菌Escherichia coli(DH5α)，保藏編號CGMCC NO.0427.1(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)。
6．含有權(quán)利要求1的人α1b型干擾素的全人工合成基因的表達質(zhì)粒pSI9902。其特征為將權(quán)利要求1的人α1b型干擾素的全人工合成基因克隆入帶有T7啟動子，T7中止子的及MCS區(qū)的基因載體pWT7中，構(gòu)建成人α1b型干擾素的表達質(zhì)粒pSI9902，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達；轉(zhuǎn)化后的工程菌為大腸桿菌Escherichia coli(BL21/DE3)，保藏編號CGMCC NO.0427.2(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)。
全文摘要
人a 1b型干擾素是由我國學(xué)者發(fā)明的我國首批基因工程新藥,是目前臨床上用于治療病毒性疾病和惡性腫瘤的重要藥物,具有很高的市場價值和向國際市場進軍的廣闊前景。本發(fā)明基于提高人a 1b型干擾素產(chǎn)量的降低市場價格的目的,設(shè)計合成了由大腸桿菌喜用密碼子組成的人a 1b型干擾素基因,并構(gòu)建了帶有該基因的表達質(zhì)粒,在大腸桿菌中高效表達,表達量達菌體總蛋白的30%。這為大量生產(chǎn)人a 1b型干擾素,造福人民創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。
文檔編號C12N15/21GK1299873SQ9912596
公開日2001年6月20日 申請日期1999年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月10日
發(fā)明者魏開坤, 馬學(xué)軍, 張麗蘭, 侯斌, 侯云德 申請人:病毒生物技術(shù)國家工程研究中心