專利名稱：一種由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法。
人體血清白蛋白是人體血液中含量最高的蛋白，這種蛋白的主要功能是維持血液的膠態(tài)滲透壓。同時它還是銅離子，鎳離子，鈣離子，膽紅素，原卟啉，長鏈脂肪酸，前列腺素，類固醇激素，甲狀腺素，三碘甲狀腺素和谷胱甘肽等物質(zhì)的載體。因此血清白蛋白是治療胎兒成紅細(xì)胞癥，血清白蛋白貧血癥，蛋白貧血癥，嚴(yán)重?zé)齻Y和大出血等疾病的主要藥品，在臨床醫(yī)療上有重要價值。另外人體血清白蛋白與鈣片和魚油等組成的補(bǔ)品有促進(jìn)青少年骨質(zhì)生長，維護(hù)成年人和老年人骨質(zhì)健康，幫助產(chǎn)婦身體恢復(fù)和加強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)的功效。
現(xiàn)在市場上的人體血清白蛋白是從人體血液中提取出來的，人體血液供應(yīng)量有限且來源不穩(wěn)定，而且從人體血漿中提取的白蛋白及藥物有攜帶如艾滋病和乙型肝炎等傳染病毒的危險，因此世界各國，尤其是美國和日本等發(fā)達(dá)國家都投入了大量的人力物力來研究和開發(fā)生產(chǎn)人體血清白蛋白的替換方法。
近二十年來，重組基因工程技術(shù)的發(fā)展日新月異，使由替換方法來生產(chǎn)人體血清白蛋白的設(shè)想成為現(xiàn)實。
目前，國外已有用酵母菌來制備人體血清白蛋白的方法。Etcheverry等在發(fā)面酵母菌中生產(chǎn)出人體血清白蛋白(Etcheverry et al.Bio/Technology，Aug 1986，P726，Arijum Singh EPA123,544)。但他們生產(chǎn)的人體血清白蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)，而且產(chǎn)量低(6mg/L)。Sreekrishna等將人體血清白蛋白的編碼基因放入酵母菌(Pichia Pastoris)的AOXI啟動基因和人體血清白蛋白的分泌信號基因中，在酵母菌(Pichia Pastoris)溶液中人體血清白蛋白產(chǎn)量高達(dá)3.4g/L(5,707,828).Okabayashi等應(yīng)用酵母菌(Pichia Pastoris)的AOXII啟動基因，將產(chǎn)量提高到5g/L(JP-A-3-83,595，JP-A-4-293,495).Kobayashi等又通過控制溫度和酸堿度等方法將產(chǎn)量進(jìn)一步提高到7g/L(US 5,759,819)。
但Sreekrishna和Okabayashi等都發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)仍然有一部分分泌信號未裂解的人體血清白蛋白，這可能是由于分泌信號裂解蛋白酶效率低等因素造成的。另外還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵液中存在被部分裂解的人體血清白蛋白產(chǎn)品，這可能是由空隙蛋白酶的裂解作用而造成的。因此，如能改進(jìn)分泌信號和空隙蛋白酶裂解這兩項關(guān)鍵技術(shù)，用酵母菌(Pichia Pastoris)制造人體血清白蛋白的技術(shù)就會得到重大進(jìn)展。
為解決這兩個關(guān)鍵問題，本發(fā)明的目的在于從解決提高分泌信號裂解效率和培養(yǎng)出不含或含極少量的空隙蛋白酶的酵母菌品種入手，達(dá)到提高產(chǎn)量和降低雜質(zhì)為目標(biāo)，而建立一種由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法。
本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容如圖1至圖5所示。
本發(fā)明首先應(yīng)用一段改進(jìn)了的分泌信號基因和其他四段基因組成了一個基因表達(dá)盒子，并采用標(biāo)準(zhǔn)基因處理方法將其放入pPIC9基因媒介體中，得到圖3所示的一種由酵母菌(Pichia pastoris)表達(dá)人體血清白蛋白的基因組合質(zhì)粒(或稱基因媒介體)pPIC9/sH SA。
其次，培養(yǎng)出一種不含或含極少量空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA品種(Pichiapastoris中的一種)。
再次，根據(jù)酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的甲醇應(yīng)用表型的不同，采取不同發(fā)酵方法制備人體血清白蛋白溶液，本發(fā)明采取甲醇應(yīng)用表型為Muts菌種，采用發(fā)酵方法制備人體血清白蛋白溶液。
最后，將上述方法制備的人體血清白蛋白發(fā)酵溶液，用切向流過濾，活性炭過濾，正離子交換液相色譜，酒精沉淀提純，這樣制備出來的人體血清白蛋白產(chǎn)量高雜質(zhì)少。上述四個步驟的具體說明如下。
第一步 五段基因組成的基因表達(dá)盒子，包含一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色體中提取的啟動基因，一段改進(jìn)了的分泌信號基因，一段人體血清白蛋白的編碼基因，一段基因轉(zhuǎn)錄終止基因，一段與酵母菌染色體同系的基因。這五段基因表述如下1)一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色體中提取的啟動基因，這段基因是從酵母菌(PichiaPastoris)的1號醇氧化酶(AOXI)的5’控制基因中提取出來的(見圖1)，它是目前用酵母菌(Pichia Pastoris)制造重組蛋白的最佳啟動基因。2)一段改進(jìn)了的分泌信號基因，分泌信號基因?qū)晦D(zhuǎn)化成一段分泌信號蛋白，這可以使攜帶分泌信號的蛋白通過酵母菌(Pichia Pastoris)的分泌系統(tǒng)進(jìn)入溶液中，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的目的。分泌信號蛋白在被排出細(xì)胞前需要被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶裂解，如果裂解效率低，就會導(dǎo)致產(chǎn)量低。pPIC9基因媒介體中的發(fā)面酵母菌α-配偶因素信號包含89個氨基酸，且有三個蛋白酶裂解信號，其中一個是KEX2裂解信號，另外兩個是不明蛋白酶的裂解信號(圖2分別用↑和↓表示)。本發(fā)明在α-配偶因素信號的基礎(chǔ)上將碳端的四個氨基酸EAEA(即GLUALA GLU ALA)的編碼基因切去，得到改進(jìn)了的分泌信號基因，這種改進(jìn)了的分泌信號只需要KEX2蛋白酶即可被裂解，避免了需要另外兩個不明蛋白酶裂解的必要性，從而提高了分泌信號的裂解效率。3)一段人體血清白蛋白的編碼基因，這段基因有多種來源，我們是用RT-PCR的方法從人體基因庫中提取出來的。4)一段基因轉(zhuǎn)錄終止基因。我們用了TAA TAA兩個連續(xù)終止信號。5)一段從酵母菌(Pichia Pastoris)染色體的AOXI的3′提取的與酵母菌同系的基因，這段基因有幫助信息RNA成熟的功能。
用標(biāo)準(zhǔn)基因處理方法，將人體血清白蛋白的編碼基因和基因轉(zhuǎn)錄終止基因放入已包含啟動基因，與酵母菌染色體同系的基因和改進(jìn)了的分泌信號基因的pPIC9基因媒介體中，得到圖3所示的一種由酵母菌(Pichia pastoris)表達(dá)人體血清白蛋白的基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA。
這種基因組合質(zhì)粒的具體組裝步驟為人體血清白蛋白(HSA)編碼基因是用RT-PCR的方法從人體基因庫中提取出來的。這樣得到的雙股基因有一個在5’的XhoI核酸內(nèi)切酶切點和一個在3’的EcoRI核酸內(nèi)切酶切點。并且在XhoI切點(C↑TCGAG)后和HSA編碼基因前有AAAAGA核酸，這個雙股基因還在HSA編碼基因后有TAATAA核酸。將從人體基因庫中提取出來的人體血清白蛋白編碼基因用XhoI和EcoRI切斷后，用瓊脂糖膠電泳分離，切出所要的雙股基因(～2100堿基對)。然后用瓊脂膠基因提純試劑盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提純。
pPIC9基因媒介體有一個XhoI和一個EcoRI核酸內(nèi)切酶切點(見圖5)，將pPIC9用XhoI和EcoRI切斷后，用瓊脂糖膠電泳分離，切出所要的雙股基因(～9300堿基對)，然后用瓊脂膠基因提純試劑盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提純。
用標(biāo)準(zhǔn)的基因連接方法將上述兩個雙股基因連接起來，之后用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方法把TOP10大腸桿菌用上述的連接混合液轉(zhuǎn)化，然后用含氨必西林的瓊脂板來篩選所要的菌落，共選6個這樣的菌落，再用2ml的含氨必西林的LB肉湯培養(yǎng)液培養(yǎng)這些菌落。8小時后用離心方法獲取菌落，并初步提純基因組合質(zhì)粒，這樣得到的基因組合質(zhì)?？捎煤怂醿?nèi)切酶裂解或基因順序分析儀來測定，并選出一個基因順序正確的菌落，生產(chǎn)并提純50ng基因組合質(zhì)粒，再將其用SacI核酸內(nèi)切酶將其線性化，最后用酒精沉淀提純出基因組合質(zhì)粒。
第二步 改進(jìn)的不含或含極少量空隙蛋白酶的酵母菌品種。目前市場有多種酵母菌(Pichia Pastoris)，例如野生型酵母菌(Pichia Pastoris)GS115(his4)和KM71(aoxlΔSARG4his4.arg4)，但這些酵母菌都產(chǎn)生空隙蛋白酶，其中蛋白酶A最為明顯，這個蛋白酶不但自身有裂解人體血清白蛋白的缺點，而且它還有產(chǎn)生如羥基蛋白酶Y和蛋白酶B等空隙蛋白酶裂解人體血清白蛋白的副作用，因此由這些酵母菌(Pichia Pastoris)制備出的人體血清白蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)液中有很多被部分裂解了，這樣就降低了產(chǎn)量和純度。
酵母菌HXU12(his4，ura3)來源于GS115(his4)，但它的URA3基因被破壞掉了，因此HXU12(his4，ura3)有抵抗5-氟乳清酸能力；PDR421基因媒介體包含一段不完全的PEP4基因(見圖4)。在HXU12(his4，ura3)酵母菌的基礎(chǔ)上，用PDR421基因媒介體將其蛋白酶A的編碼基因(PEP4)打亂，當(dāng)它被插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色體中時，就會得到HX4(his4，pep4)酵母菌，它有兩個不完全而且無裂解功能的PEP4基因，這樣得到的HX4(his4，pep4)酵母菌的空隙蛋白酶裂解功能被大大降低，對我們是有利的。然后，HX4(his4，pep4)酵母菌與在前面獲得的基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA重組后，得到包含人體血清白蛋白基因的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA，它不含或含極少量的空隙蛋白酶，于是在發(fā)酵液中就不含裂解的人體血清白蛋白，從而提高了人體血清白蛋白的產(chǎn)量和純度。
HX4(his4，pep4酵母菌的組裝首先用BglII核酸內(nèi)切酶將PDR421線性化，并用標(biāo)準(zhǔn)的酒精沉淀方法提純這種媒介體，然后用Spheroblast方法(Cregg et al.Pichia Protocol，Methods in Molecular Biology，10327-40)，將PDR421插入HXU12的PEP4基因中，并用含組氨酸的瓊脂板篩選所需的酵母菌菌落，于是得到了HX4(his4，pep4)酵母菌。
HX4/pPIC9/sHSA酵母菌的組裝用標(biāo)準(zhǔn)的Spheroblast的方法，將pPIC9/sHSA插入HX4(his4，pep4)酵母菌的染色體中，就組裝成HX4/pPIC9/sHSA酵母菌，然后用MGY瓊脂板篩選所需的酵母菌菌落，將約100個長成的菌落用MM瓊脂板鑒別其甲醇應(yīng)用表型，這樣就得到Mut+(長得快)和Muts(長得慢)兩個甲醇應(yīng)用表型的酵母菌，之后冷凍保存。
第三步由甲醇應(yīng)用表型為Muts酵母菌HX4/pPIC9/sHSA發(fā)酵制備人體血清白蛋白溶液。
在酵母菌(Pichia pastoris)族中，HX4/pPIC9/sHSA酵母菌比GS115(his4)酵母菌脆弱，本發(fā)明在酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的發(fā)酵溶液中加入適量的(1M)山梨醇和(10g/L)酪蛋白氨基酸，適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度和酸堿度等條件，使酵母菌得以健康生長。酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的甲醇應(yīng)用表型的不同，其發(fā)酵方法也不同，對應(yīng)的人體血清白蛋白產(chǎn)量也不同，如下表所示。
菌落甲醇應(yīng)用表型 發(fā)酵時間(h)產(chǎn)量(g/L)蛋白雜質(zhì)％57 Mut+751.21 1763 Mut+820.98 2267 Muts188 10.5 4.572 Muts204 9.7 5.2從表中看出，這樣發(fā)酵處理后，菌落67甲醇應(yīng)用表型為Muts的發(fā)酵液中人體血清白蛋白含量高達(dá)10.5g/L，雜質(zhì)低到4.5％選出甲醇應(yīng)用表型為Muts菌種進(jìn)行發(fā)酵，其方法如下1)把冷凍的含1/3丙三醇(體積)的HX4/pPIC9/sHSA在冰上解凍，然后將1ml上述酵母菌懸浮液加入含50ml的MGY培養(yǎng)液的容量為250ml的搖瓶中。2)在30℃和250c/min搖速的條件下，培養(yǎng)酵母菌20至40小時。3)將這50ml培養(yǎng)液加入含4％丙三醇的500ml基本鹽和微量元素混合溶液的發(fā)酵罐中，溫度控制在25℃，攪拌速度控制在800c/min，酸堿度用氨水(30％)控制在pH5.8，含氧度控制在35％，氣壓控制在1.2個大氣壓。4)當(dāng)丙三醇被用盡后，含氧量應(yīng)快速增加(1分鐘內(nèi)提高到90％以上)，這時將丙三醇溶液以15ml/h的速度加入發(fā)酵罐中，維持4小時。5)停止丙三醇泵，待丙三醇被用光后立刻以1ml/h的速度加入甲醇溶液。6)用甲醇控制儀將甲醇濃度控制在0.5％，維持約200小時。
第四步 對上述方法制備的人體血清白蛋白溶液進(jìn)行提純，就可獲得產(chǎn)量高雜質(zhì)低的人體血清白蛋白，提純步驟簡單易行，具體如下1)用切向流過濾的方法過濾并濃縮第三步發(fā)酵制備的人體血清白蛋白溶液至原體積的1/8。2)將提純步驟1)的溶液加熱至55℃，恒溫30分鐘。3)將提純步驟2)的溶液用活性炭過濾。4)將提純步驟3)的溶液用正離子交換液相色譜提純。5)將提純步驟4)中得到的溶液用酒精沉淀。6)過濾并用空氣干燥提純步驟5)中的沉淀物。經(jīng)過這些提純操作步驟后，獲得的人體血清白蛋白，就是本發(fā)明方法所得到的人體血清白蛋白。
本發(fā)明的積極效果本發(fā)明方法由酵母菌(Pichia pastoris)制備的人體血清白蛋白，具有產(chǎn)量高，雜質(zhì)低，不含內(nèi)毒素，不含傳染病毒等特點，因此，由酵母菌(Pichia pastoris)來制造人體血清白蛋白，在醫(yī)療方面有重大的實用價值。所用原料價格低，制備方法簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益明顯。


圖1從酵母菌(pichia Pastoris)1號醇氧化酶(AOXI)的5’控制基因中提取啟動基因。
圖2 從發(fā)面酵母菌中提取出來的α-配偶因素信號的氨基酸順序。其中用↑符號表示KEX2蛋白酶裂解處，用↓符號表示不明蛋白酶的裂解處，，碳端的四個氨基酸EAEA(即GLUALA GLU ALA)的編碼基因被切去，就得到改進(jìn)的分泌信號基因。
圖3 由pPIC9基因媒介體組裝的pPIC9/sHSA基因組合質(zhì)粒。其中1--5’AOX1啟動基因2--α-配偶因素信號基因(pPIC9/sHSA中為改進(jìn)的)3--3’AOX1TT基因4--HIS4基因5--3’AOX1基因(與酵母菌染色體同系基因)6--ColE1基因7--氨咔青霉素抗性基因8--人體血清白蛋白的編碼基因和基因轉(zhuǎn)錄終止基因。
圖4 PDR421基因媒介體，其中1--URA3基因 2--氨咔青霉素抗性基因 3--部分PEP4基因。當(dāng)PDR421基因媒介體被插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色體中時，就會得到兩個不完全而且無裂解功能的PEP4基因。這樣得到的HX4(his4，pep4)酵母菌的空隙蛋白酶裂解功能被大大降低。它與基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA組裝得到酵母菌HX4/pPIC9/sHSA不含或含少量的空隙蛋白酶。
圖5插入人體血清白蛋白編碼基因的pPIC9的核酸內(nèi)切酶切點。其中↑--Xho1的核酸內(nèi)切酶切點 ↓-EcoR1的核酸內(nèi)切酶切點。
最佳實施例從發(fā)面酵母菌中提取出來的α-配偶因素信號的氨基酸順序中，切去碳端四個氨基酸EAEA(即GLU ALA GLU ALA)的編碼基因，得到改進(jìn)的分泌信號基因及用標(biāo)準(zhǔn)基因處理方法，將人體血清白蛋白的編碼基因和基因轉(zhuǎn)錄終止基因放入已包含啟動基因，與酵母菌染色體同系的基因和改進(jìn)了的分泌信號基因的pPIC9基因媒介體中，得到圖3所示的一種由酵母菌(Pichia pastoris)表達(dá)人體血清白蛋白的基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA。
把PDR421插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色體中時，得到HX4(his4，pep4)酵母菌，與基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA組裝得到不含或含少量的空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA。
選擇甲醇應(yīng)用表型為Muts的菌種制備人體血清白蛋白發(fā)酵溶液。
采取切向流過濾，正離子交換液相色譜等提純方法制備人體血清白蛋白。
權(quán)利要求
1.一種由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法，是通過培養(yǎng)酵母菌溶液實現(xiàn)的，其特征在于首先應(yīng)用一段改進(jìn)了的分泌信號基因和其他四段基因組成一個基因表達(dá)盒子，采用標(biāo)準(zhǔn)基因處理方法將其放入pPIC9基因媒介體中，得到一種由酵母菌(Pichiapastoris)表達(dá)人體血清白蛋白的基因組合質(zhì)粒(或稱基因媒介體)pPIC9/sHSA，其次培養(yǎng)出一種不含或含極少量空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA品種(Pichia pastoris中的一種)，再次取酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的甲醇應(yīng)用表型為Muts菌種，采用發(fā)酵方法制備人體血清白蛋白溶液，最后將上述方法制備的人體血清白蛋白發(fā)酵溶液，用切向流過濾，活性炭過濾，正離子交換液相色譜，酒精沉淀提純，制備出產(chǎn)量高雜質(zhì)少的人體血清白蛋白。
2.按權(quán)利要求1所述的一種由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法，其特征在于一段改進(jìn)了的分泌信號基因和其他四段基因組成一個基因表達(dá)盒子，包含一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色體中提取的啟動基因，一段改進(jìn)了的分泌信號基因，一段人體血清白蛋白的編碼基因，一段基因轉(zhuǎn)錄終止基因，一段與酵母菌染色體同系的基因，這五段基因表述如下；一段由酵母菌(Pichia Pastoris)的染色體中提取的啟動基因，這段基因是從酵母菌(PichiaPastoris)的1號醇氧化酶(AOXI)的5’控制基因中提取出來的；一段改進(jìn)了的分泌信號基因，是在pPIC9基因媒介體中的α-配偶因素信號的基礎(chǔ)上將碳端的四個氨基酸EAEA(即GLU ALA GLU ALA)的編碼基因切去，得到改進(jìn)了的分泌信號基因；一段人體血清白蛋白的編碼基因，這段基因有多種來源，我們是用RT-PCR的方法從人體基因庫中提取出來的；一段基因轉(zhuǎn)錄終止基因，用了TAA TAA兩個連續(xù)終止信號；一段從酵母菌(Pichia Pastoris)的AOXI的3′提取的與該酵母菌染色體同系的基因；用標(biāo)準(zhǔn)基因處理方法，將人體血清白蛋白的編碼基因和基因轉(zhuǎn)錄終止基因放入已包含啟動基因，與酵母菌染色體同系的基因和改進(jìn)了的分泌信號基因的pPIC9基因媒介體中，得到一種由酵母菌(Pichia pastoris)表達(dá)的人體血清白蛋白的基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA這種基因組合質(zhì)粒的具體組裝步驟為人體血清白蛋白(HSA)編碼基因是用RT-PCR的方法從人體基因庫中提取出來的，這樣得到的雙股基因有一個在5’的XhoI核酸內(nèi)切酶切點和一個在3’的EcoRI核酸內(nèi)切酶切點，并且在XhoI切點(C↑TCGAG)后和HSA編碼基因前有AAAAGA核酸，這個雙股基因還在HSA編碼基因后有TAATAA核酸，將從人體基因庫中提取出來的人體血清白蛋白編碼基因用XhoI和EcoRI切斷后，用瓊脂糖膠電泳分離，切出所要的雙股基因(～2100堿基對)，然后用瓊脂膠基因提純試劑盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提純；pPIC9基因媒介體有一個XhoI和一個EcoRI核酸內(nèi)切酶切點，將pPIC9用XhoI和EcoRI切斷后，用瓊脂糖膠電泳分離，切出所要的雙股基因(～9300堿基對)，然后用瓊脂膠基因提純試劑盒(Qiagen，Gel Purification Kit)提純；用標(biāo)準(zhǔn)的基因連接方法將上述兩個雙股基因連接起來，再用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化方法把TOP10大腸桿菌用上述的連接混合液轉(zhuǎn)化，然后用含氨必西林的瓊脂板來篩選所要的菌落，再用2ml的含氨必西林的LB肉湯培養(yǎng)液培養(yǎng)這些菌落，8小時后用離心方法獲取菌體，并初步提純基因組合質(zhì)粒，再用基因順序分析儀選出一個基因順序正確的菌落，生產(chǎn)并提純50ng基因組合質(zhì)粒，再將其用SacI核酸內(nèi)切酶將其線性化，最后用酒精沉淀提純基因組合質(zhì)粒。
3.按權(quán)利要求1所述的一種由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法，其特征在于改進(jìn)的不含或含極少量空隙蛋白酶的酵母菌HX4/pPIC9/sHSA品種，是在HXU12(his4，ura3)酵母菌的基礎(chǔ)上，用PDR421基因媒介體將其蛋白酶A的編碼基因(PEP4)打亂，PDR421基因媒介體包含一段不完全的PEP4基因，當(dāng)它被插入HXU12(his4，ura3)酵母菌染色體中時，就會得到有兩個不完全而且無裂解功能的PEP4基因的HX4(his4，pep4)酵母菌，然后，HX4(his4，pep4)酵母菌與在前面獲得的基因組合質(zhì)粒pPIC9/sHSA組裝后，得到所需要的不含或含極少量的空隙蛋白酶酵母菌HX4/pPIC9/sHSA；HX4(his4，pep4)酵母菌的組裝首先用BglII核酸內(nèi)切酶將PDR421線性化，并用標(biāo)準(zhǔn)的酒精沉淀方法提純這種媒介體，然后用Spheroblast方法(Cregg et al.Pichia Protocol，Methods in Molecular Biology，10327-40)，將PDR421插入HXU12的PEP4基因中，并用含組氨酸的瓊脂板來篩選所需的酵母菌菌落，得到HX4(his4，pep4)酵母菌；HX4/pPIC9/sHSA酵母菌的組裝用標(biāo)準(zhǔn)的Spheroblast的方法，將pPIC9/sHSA插入HX4(his4，pep4)酵母菌的染色體中，就完成了HX4/pPIC9/sHSA酵母菌的組裝，然后用MGY瓊脂板來篩選所需的酵母菌菌落，將約100個長成的菌落用MM瓊脂板來鑒別其甲醇應(yīng)用表型，這樣就得到Mut+(長得快)和Muts(長得慢)兩個甲醇應(yīng)用表型的酵母菌，之后冷凍保存。
4.按權(quán)利要求1所述的一種由酵母菌(Pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法，其特征在于由酵母菌(Pichia pastoris)的甲醇應(yīng)用表型為Muts菌種發(fā)酵的方法制備人體血清白蛋白溶液，是在酵母菌HX4/pPIC9/sHSA的發(fā)酵溶液中加入適量的(1M)山梨醇和(10g/L)酪蛋白氨基酸，適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度和酸堿度等條件，使酵母菌得以健康生長；甲醇應(yīng)用表型為Muts菌種發(fā)酵方法如下1)把冷凍的含1/3丙三醇(體積)的HX4/pPIC9/sHSA在冰上解凍，然后將1ml上述酵母菌懸浮液加入一個含50ml的MGY培養(yǎng)液的容量為250ml的搖瓶中；2)在30℃和250c/min搖速的條件下，培養(yǎng)酵母菌20至40小時；3)將這50ml培養(yǎng)液加入含丙三醇濃度為4％的500ml基本鹽和微量元素混合溶液的發(fā)酵罐中，溫度控制在25℃，攪拌速度控制在800c/min，酸堿度用氨水(30％)控制在pH5.8，含氧度控制在35％，氣壓控制在1.2個大氣壓；4)當(dāng)丙三醇被用盡后，含氧量應(yīng)快速增加(1分鐘內(nèi)提高到90％以上)，這時將丙三醇溶液以15ml/h的速度加入發(fā)酵罐中，維持4小時；5)停止丙三醇泵，待丙三醇被用光后立刻以1ml/h的速度加入甲醇溶液；6)用甲醇控制儀將甲醇濃度控制在0.5％，維持約200小時。
5.按權(quán)利要求1和權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于如下的提純方法1)用切向流過濾的方法過濾并濃縮發(fā)酵制備的人體血清白蛋白溶液至原體積的1/8；2)將提純步驟1)的溶液加熱至55℃，恒溫30分鐘；3)將提純步驟2)的溶液用活性炭過濾；4)將提純步驟3)的溶液用正離子交換液相色譜提純；5)將提純步驟4)中得到的溶液用酒精沉淀；6)過濾并用空氣干燥提純步驟5)中的沉淀物經(jīng)過這六個步驟提純后，獲得本發(fā)明方法所制備的人體血清白蛋白。
全文摘要
一種由酵母菌(pichia pastoris)制備人體血清白蛋白的方法,是重組基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域中通過酵母菌發(fā)酵制備人體血清白蛋白的方法之一。首先把改進(jìn)的分泌信號基因和其它四種基因,用基因處理方法得到基因組合質(zhì)粒,其次培養(yǎng)出一種不含或含極少量空隙蛋白酶的酵母菌,并取其甲醇應(yīng)用表型為Mut
文檔編號C12P21/00GK1298949SQ9912678
公開日2001年6月13日 申請日期1999年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月7日
發(fā)明者劉宏宇, 謝巖生 申請人:劉宏宇