專利名稱：負(fù)調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)特異性表達(dá)的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制核酸表達(dá)的新方法、構(gòu)建物以及含有這些構(gòu)建物的載體。具體講，本發(fā)明涉及用于獲得轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)或離體神經(jīng)細(xì)胞中靶向表達(dá)的方法、構(gòu)建物和載體。本發(fā)明特別適于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用，例如在科學(xué)研究或治療方法中。
體內(nèi)或離體基因治療是局部有效地轉(zhuǎn)移目標(biāo)因子的編碼基因(轉(zhuǎn)基因)，尤其是在宿主生物的神經(jīng)系統(tǒng)中。為此，已成功地應(yīng)用了各種類型的轉(zhuǎn)基因，用于在體內(nèi)或離體神經(jīng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)移不同類型的轉(zhuǎn)基因。特別可舉出腺病毒、AAV或HSV類型的病毒載體或陽離子聚合物類型的某些非病毒載體(例如聚乙烯亞胺)。例如這些載體可用于在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中有效穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因(WO94／08026，WO93／09239，WO96／02655)。這種基因轉(zhuǎn)移的實(shí)現(xiàn)提供了眾多的應(yīng)用，特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。例如，這些載體可用于體內(nèi)或離體基因治療方法中。對此，現(xiàn)在正在進(jìn)行關(guān)于在神經(jīng)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)移營養(yǎng)因子的多種臨床前研究。這些載體還可用于創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因動物，用于測試化合物或進(jìn)行各種標(biāo)記研究或生物利用度研究。
對于所有這些應(yīng)用，即使今天看來達(dá)到了良好的轉(zhuǎn)移效率和良好的穩(wěn)定性，但轉(zhuǎn)基因表達(dá)的控制還是迫切需要的。對此，已報道了各種系統(tǒng)，試圖將轉(zhuǎn)基因的表達(dá)僅限制在某些組織中，例如使用所謂的“組織特異性”啟動子或復(fù)雜的嵌合系統(tǒng)，這需要使用多個構(gòu)建物和／或調(diào)控因子。作為組織特異性啟動子的實(shí)例，特別可提到膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白啟動子，其主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有活性。但這些現(xiàn)有的或經(jīng)驗(yàn)證的調(diào)控系統(tǒng)都有一些缺點(diǎn)，特別是強(qiáng)度和／或選擇性不總令人滿意。例如，在已知的絕大部分系統(tǒng)中，一般以犧牲啟動子的強(qiáng)度來達(dá)到選擇性，因此難以達(dá)到大量、穩(wěn)定而又特異的表達(dá)。
本發(fā)明提供可以克服現(xiàn)有技術(shù)這些缺陷的方法、構(gòu)建物及含有這些構(gòu)建物的載體。具體講，本發(fā)明公開了一種用于神經(jīng)元靶向表達(dá)的嵌合啟動子。對此，本發(fā)明使用負(fù)調(diào)控元件，阻止基因在非神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)。這種構(gòu)建體與現(xiàn)有技術(shù)的系統(tǒng)相比有許多優(yōu)點(diǎn)。一方面阻遏序列和遍在啟動子常較短并已被很好地鑒定，人們?nèi)菀讓⑵渑c其他調(diào)控元件相連。另一方面，這些調(diào)控元件理論上可與無論何種遍在啟動子相連，因而是一種靈巧的系統(tǒng)，甚至在所用表達(dá)載體在神經(jīng)細(xì)胞中沒有或很少有趨向性時，也可以此容易地做到目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的神經(jīng)特異性表達(dá)。
許多研究組報道了抑制神經(jīng)元基因在非神經(jīng)元細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的順式(cis)序列。具有該特性的一類具體序列由NRSE(神經(jīng)元限制性沉默元件)構(gòu)成，也稱為RE-1(阻遏元件-1)。NRSE是一種短序列，約21bp，已證明存在于許多神經(jīng)元基因的上游例如SCG10[1]、鈉通道Ⅱ[2]和突觸蛋白Ⅰ[3]。另外，還在許多其他神經(jīng)元基因的上游發(fā)現(xiàn)了類似的序列，但它們的功能迄今并沒有被全部闡明[4]。這些NRSE序列通過與僅存在于非神經(jīng)元細(xì)胞中的稱為REST(RE-1沉默轉(zhuǎn)錄因子)的特異轉(zhuǎn)錄因子NRSF蛋白(神經(jīng)元限制性沉默因子)結(jié)合而抑制基因的非神經(jīng)元表達(dá)[5]。該蛋白屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族。它在發(fā)育過程中出現(xiàn)以啟動非神經(jīng)元細(xì)胞中神經(jīng)元基因的抑制，然后在成人時維持這種抑制。
在神經(jīng)元基因上游鑒定出NRSE序列存在的研究組已證明，這些序列在轉(zhuǎn)染到非神經(jīng)元細(xì)胞后能夠降低報道基因的表達(dá)。他們因此將其NRSE序列與最小異源啟動子-即可進(jìn)行基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的啟動子-相連。例如，鈣通道Ⅱ的一拷貝NRSE序列，如置于胸苷激酶啟動子上游，降低了報道基因在非神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)至一半[9]。同樣，兩拷貝的突觸蛋白Ⅰ的NRSE序列與c-fos最小啟動子相連可降低75％非神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)[3]。另外，NRSE序列的存在還可以調(diào)節(jié)非神經(jīng)元細(xì)胞中SV40啟動子的活性[10]。
但NRSE序列從沒有被用于指導(dǎo)強(qiáng)遍在啟動子的表達(dá)，也沒有被預(yù)期用于基因治療。因此，從未表明這種序列是否能夠抑制由強(qiáng)啟動子誘導(dǎo)的表達(dá)。也沒有表明在置于嵌合環(huán)境中時這些序列是否在體內(nèi)總有活性。更一般地講，與異源啟動子組合后這些序列的活性迄今從未在體內(nèi)得到證明。
本發(fā)明涉及用于基因的神經(jīng)特異性表達(dá)的重組核酸。本發(fā)明還涉及含有這些核酸的載體，特別是病毒來源的，以及含有這些核酸和／或載體的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及適于體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)中基因的神經(jīng)特異性表達(dá)的特定嵌合啟動子。本發(fā)明還涉及含有這些元件的組合物及其基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面涉及一種重組核酸，其包含-一個啟動子，-一個或多個NRSE序列，及-一種治療基因。
本發(fā)明的構(gòu)建物因而包含一個抑制區(qū)，其在非神經(jīng)元細(xì)胞中抑制啟動子誘導(dǎo)的治療基因的活性表達(dá)。該抑制區(qū)由一個或多個NRSE基元構(gòu)成。
本發(fā)明中所用的NRSE基元最好包含以下21bp序列的全部或部分TTCAGCACCACGGAGAGTGCC(SEQ ID NO．1)該序列相應(yīng)于SCG10基因的NRSE序列[2]。但應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明所用的NRSE基元與該序列相比可有一些變異，只要保留上述抑制特性即可。例如，在不同的基因中發(fā)現(xiàn)具有一些差異的NRSE型序列，如Schoenherr等的文章[4]中所述，該文獻(xiàn)引入本申請作為參考?；谒l(fā)現(xiàn)的變體，已得出一種共有NRSE序列，相當(dāng)于最常遇到的序列。該序列為TTCAGCACCACGGACAGCGCC(SEQ ID NO．2)。本發(fā)明優(yōu)選的變體在上述SEQ ID NO．2序列的1-5個堿基對上有取代。更優(yōu)選地，它們包含1-3個堿基對上的變異。這些變異優(yōu)選位于上述序列的1、2、10、11、15、18、19和／或20殘基上。所述取代可以是相關(guān)堿基的消除或用任何其他堿基置換。因此，NRSE基元更一般性地可用下述序列的全部或部分代表NNCAGCACCNNGGANAGNNNC(SEQ IDNO．3)，其中N代表選自A、T、C或G的堿基?？捎糜诒景l(fā)明的NRSE基元的具體實(shí)例如下TTCAGCACCACGGACAGCGCC(SEQ ID n°2)TTCAGCACCACGGAGAGTGCC(SEQ ID n°4)TTCAGCACCGCGGACAGTGCC(SEQ ID n°5)TTCAGCACCTCGGACAGCATC(SEQ ID n°6)TTCAGCACCGCGGAGAGCGTC(SEQ ID n°7)TCCAGCACCGTGGACAGAGCC(SEQ ID n°8)TTCAGCACCGAGGACGGCGGA(SEQ ID n°9)ATCAGCACCACGGACAGCGGC(SEQ ID n°10)TTCAGCACCTAGGACAGAGGC(SEQ ID n°11)另外，這些基元還可在一端或另一端或在兩端含有不干擾上述抑制活性的額外堿基。具體講，這些堿基可以是限制位點(diǎn)、中性序列或來自克隆步驟含有如質(zhì)?；虿《緟^(qū)域的序列，或原基因中與NRSE基元鄰接的序列。
這些不同的基元可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的制備核酸的技術(shù)制備。例如，可以使用商業(yè)合成儀按核酸自動合成技術(shù)制備。還可以通過例如與特異性探針雜交或通過與NRSF因子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)對DNA文庫篩選而獲得。另外，通過例如同源性搜索可從DNA文庫中找出SEQ ID NO．1序列的任何其它變體。
一旦合成出來，對NRSE型的基元可隨后進(jìn)行功能測定。為此，第一種試驗(yàn)是測定該基元與NRSF因子結(jié)合的能力。還可以在不同的條件下實(shí)現(xiàn)，例如按Mori等[2]或Schoenherr等[5]描述的技術(shù)通過凝膠上遷移的延緩試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)，所述文獻(xiàn)并入本文作為參考。然后，該基元抑制表達(dá)的能力可按如下測定將該基元插入含啟動子控制下的報道基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、LacZ等)的試驗(yàn)質(zhì)粒中，比較所述報道基因在神經(jīng)細(xì)胞和在非神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平。這類方法已由Schoenherr等[4，5]報道過并在將實(shí)施例中描述。優(yōu)選地，當(dāng)在神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞之間產(chǎn)生至少40％的表達(dá)差異時，該基元被認(rèn)為是有功能的。更優(yōu)選地，該差異為至少50％，最好至少60％。
如前所述，本發(fā)明的核酸包含一個或多個如上所定義的NRSE基元。這可以是同一種基元的幾次重復(fù)，或者是幾種不同的基元。優(yōu)選地，本發(fā)明的構(gòu)建物中含有多次重復(fù)的相同基元。這些構(gòu)建物可含有多達(dá)50個基元。最好，該基元重復(fù)2-20次，優(yōu)選3-15次。如在實(shí)施例中所述，利用3、6或12個基元重復(fù)已獲得了有益的結(jié)果，利用6和12個基元重復(fù)獲得了特別好的結(jié)果。
這些NRSE基元可被插入在本發(fā)明構(gòu)建物的任何非轉(zhuǎn)錄或非翻譯區(qū)或內(nèi)含子中。最好將它們置于5’-非編碼區(qū)中，更優(yōu)選與啟動子鄰近的區(qū)域中。另外，這些基元的活性與它們的方向無關(guān)，它們可以以轉(zhuǎn)錄有義方向或以相反的方向插入。最后，當(dāng)利用多個基元時，優(yōu)選將它們并排插入在構(gòu)建物的同一區(qū)域中。但應(yīng)理解，它們也可以插入在不同的區(qū)域中。
本發(fā)明核酸組合物中的第二個元件是啟動子，它使得轉(zhuǎn)基因可以在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)。最好是在神經(jīng)細(xì)胞或組織中有活性的啟動子，特別是真核生物啟動子。對此，例如可以用一種遍在性啟動子，即在大部分細(xì)胞類型中都有功能的啟動子。更優(yōu)選地，這是一種真核遍在性啟動子。該啟動子可以是自體的，即來源于欲進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞的相同來源物種，或者是異種的(來源于其他物種)。作為有利的實(shí)例，可以舉出真核遍在性強(qiáng)啟動子如磷酸甘油酸激酶1(PGK)基因的啟動子。所謂強(qiáng)啟動子指活性與病毒啟動子相當(dāng)?shù)娜魏螁幼印Ｔ谡婧松镏?，PGK是一種參與糖酵解的酶。在小鼠中，該基因的啟動子，約500bp，含有所謂的“增強(qiáng)子”區(qū)(-440／-120)和含有多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動子區(qū)(-120／+80)[6]。該P(yáng)GK啟動子的效力已在以前的體外及體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中得到證明[7，8]。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及含有PGK啟動子和一個或多個NRSE序列的核酸。如在實(shí)施例中所證明的，此類構(gòu)建物可以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的神經(jīng)特異性表達(dá)。為此，本發(fā)明還涉及含有一種強(qiáng)遍在性啟動子和一個或多個NRSE序列的嵌合啟動子。本發(fā)明證明這些NRSE序列可用于有效抑制強(qiáng)啟動子的活性(其含于體內(nèi))。這從而使得可能將這些新啟動子用于眾多的應(yīng)用中。本發(fā)明的一種具體嵌合啟動子由式xNRSE-PGK代表，其中x為1-50優(yōu)選1-20的整數(shù)。
其他可用于本發(fā)明的遍在性真核啟動子例如有指導(dǎo)必需細(xì)胞代謝之基因表達(dá)的啟動子(這些基因被稱為是“家內(nèi)的”或“持家的”，如所有細(xì)胞共同功能所必需的蛋白質(zhì))。例如參與三羧酸循環(huán)、細(xì)胞呼吸或其他基因之復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的基因。此類啟動子的具體實(shí)例有α1-抗胰蛋白酶、β-肌動蛋白、波形蛋白、醛縮酶A或Eflα(延伸因子)基因的啟動子。
本發(fā)明中所用的啟動子還可以是神經(jīng)特異性真核啟動子，從而改善其神經(jīng)特異性。作為實(shí)例可以舉出NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)、NF(神經(jīng)絲)、TH(酪氨酸羥化酶)、DAT(多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、chAT(膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶)、DBH(多巴胺β-羥化酶)、TPH(色氨酸羥化酶)、GAD(谷氨酸脫氫酶)基因的啟動子，更廣義地講，所有合成酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)的啟動子，或任何在給定神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型或亞型中特異表達(dá)的基因的啟動子。
最后，還可以考慮使用病毒啟動子，如CMV(巨細(xì)胞病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)、TK(胸苷激酶)、SV40(猴病毒)及LTR(長末端重復(fù))啟動子。
另外，本發(fā)明的核酸還含有治療基因。本發(fā)明中的治療基因指至少含有一個編碼治療性或疫苗RNA或多肽之開放讀碼框架的任何核酸。這種核酸可以是互補(bǔ)DNA、基因組DNA、合成或半合成DNA。它可以是各種來源的，如來自哺乳動物、植物、病毒、人工等。其轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物具有治療或疫苗特性。具體的例子有酶、生長因子(特別是營養(yǎng)因子)、神經(jīng)遞質(zhì)或其前體、毒性因子(如胸苷激酶)、抗體或抗體片段等。
本發(fā)明的構(gòu)建物可用于指導(dǎo)編碼人們希望定位于神經(jīng)元而在非神經(jīng)元細(xì)胞中不表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)的一種或多種基因的表達(dá)，以便建立動物模型或著眼于病因性、對癥性、替代性或消除性治療。例如可以使用以下蛋白的基因營養(yǎng)因子家族如神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF、BDNF、NT3，NT4-5，GMF…)，生長因子[成纖維細(xì)胞生長因子家族FGF(a和b)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子家族VEGF、表皮生長因子家族EGF、胰島素生長因子家族IGF(Ⅰ和Ⅱ)]、TGFβ超家族如TGFβ家族、GDNF／neurturine家族。
還可以使用編碼細(xì)胞因子如CNTF、LIF、制癌蛋白M、心臟營養(yǎng)因子或白介素家族蛋白的基因。
還可以使用編碼這些不同因子的受體或編碼調(diào)控這些不同因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的基因。還可以使用編碼不同神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽或其前體合成或降解酶、或這種合成或代謝必需的輔助因子、或調(diào)控這些蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的基因；以及編碼神經(jīng)遞質(zhì)／神經(jīng)肽受體(或這些受體的亞單位)及編碼參與轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明中的其他目標(biāo)基因特別有編碼抗氧化劑如SOD(超氧化物歧化酶)、GPX(谷胱甘肽過氧化酶)、過氧化氫酶或細(xì)胞呼吸酶；涉及細(xì)胞周期的酶如p21、或其他依賴性激酶的抑制性蛋白的基因，以及細(xì)胞凋亡基因如ICE、Bcl2、BAX等。
更一般地講，任何表達(dá)異常導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因均可在本發(fā)明構(gòu)建物中表達(dá)，如其突變?yōu)橹苯硬∫虻幕蚧蚱洚a(chǎn)物干預(yù)相同代謝途徑的基因。還可以是用于癌癥治療的毒性基因(如胸苷激酶或胞嘧啶脫胺酶)、反義RNA、核酶、甚至用于發(fā)育、動力學(xué)和／或生物利用度研究的報道基因如β-半乳糖苷酶、螢光素酶或GFP(綠色熒光蛋白)基因。還可能使用在神經(jīng)系統(tǒng)中條件性重組系統(tǒng)中涉及的基因，以便建立動物模型，如包含條件性敲空系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物。
應(yīng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于根據(jù)所尋求的應(yīng)用選擇基因類型。
在本發(fā)明的核酸中，安排各種不同元件使得啟動子控制治療基因的表達(dá)而NRSE序列控制啟動子的活性。一般而言，將基因置于啟動子下游并與之在同一讀框中。另外，調(diào)控區(qū)域一般置于啟動子的上游，盡管(如上所述)這對其活性不是必需的。調(diào)控區(qū)(NRSE序列)和啟動子之間的距離可根據(jù)所用序列的性質(zhì)和NRSE基元的重復(fù)數(shù)目而變化。最好將調(diào)控序列置于距啟動子小于2kb、優(yōu)選小于1kb的位置。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體方案，NRSE序列與調(diào)控系統(tǒng)結(jié)合以便精確地控制細(xì)胞中的核酸表達(dá)。對于調(diào)控系統(tǒng)，可具體地提到使用四環(huán)素控制的tTA反式激活因子和敏感性tPA啟動子的系統(tǒng)，如專利申請F(tuán)R98／140080中所述的那些(此文引入本申請作為參考)。簡單地講，該核酸包含第一區(qū)和第二區(qū)，第一區(qū)含中等啟動子控制下的編碼四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的反式激活因子(tTA)的核酸，第二區(qū)含有tTA敏感性啟動子控制下的目標(biāo)核酸。該敏感性啟動子可以是在所述反式激活因子存在下活性提高的任何啟動子，甚至強(qiáng)啟動子。從結(jié)構(gòu)角度看，該啟動子在其序列中或在距其有效距離內(nèi)含有至少一個tTA因子的結(jié)合位點(diǎn)(或操縱區(qū)Op)。優(yōu)選這兩個區(qū)域是分開的。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，NRSE序列可以置于敏感性tTA啟動子上游，含于上述兩個區(qū)域之間，盡管這對活性不是必需的。
本發(fā)明的該具體方案可有利地同時具有四環(huán)素的核酸表達(dá)調(diào)控以及NRSE序列帶來的表達(dá)的組織特異性，特別是在神經(jīng)細(xì)胞中。另外，這種啟動子的精細(xì)調(diào)控保證了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的顯著有效性和安全性，這在基因治療中是需要的。
本發(fā)明還涉及包含如上所定義核酸的載體。該載體最好能夠轉(zhuǎn)化哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞，特別是人的，而不需要它具有對所述細(xì)胞的特定趨向性。因此，本發(fā)明有利地可以利用任何類型的載體，可以是質(zhì)粒型載體(質(zhì)粒、附加體、人工染色體等)或病毒型載體。對于病毒載體，可優(yōu)先舉出來自腺病毒、AAV和皰疹病毒的載體，其對神經(jīng)細(xì)胞和組織的趨向性已在現(xiàn)有技術(shù)中有大量記載。還可以提到其它病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒或彈狀病毒。對此，以下給出的實(shí)施例證明引入病毒載體中的NRSE序列具有很高的活性。例如令人驚異地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NRSE序列、尤其是6和12個序列被引入病毒載體(腺病毒)中時，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在體外非神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)分別減少91％至98％，在體內(nèi)為90％至96％。這些結(jié)果有利地表明可能利用一種簡單的系統(tǒng)，由于這些序列的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)細(xì)胞中特異性表達(dá)目標(biāo)核酸，而在非神經(jīng)細(xì)胞中不表達(dá)。另外，由于其長度小，這些NRSE序列具有特別適于調(diào)節(jié)插入載體中而其中可供插入調(diào)控序列的空間有限的基因的表達(dá)。另外，現(xiàn)在還可以考慮將這些序列與同一載體中的其他調(diào)控系統(tǒng)結(jié)合。
本發(fā)明的一個具體主題是含有在表達(dá)序列控制下的目標(biāo)核酸的缺陷重組病毒，其特征在于所述表達(dá)序列包含啟動子和一個或多個NRSE序列。
一般而言，本發(fā)明的重組病毒是缺陷性的，即在細(xì)胞中不能自主復(fù)制。缺陷重組病毒的產(chǎn)生是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并由例如Graham F和Prevec(于Methods in Molecular Biology(1991)Murray E．J．(編)，the Humana Press Inc．Clifton，NJ，第11章，109-128頁中)報道過。具體講，每種這樣的病毒可以在具有所述缺陷功能的衣殼化細(xì)胞系中制得。這種細(xì)胞系在文獻(xiàn)中已有報道(如293細(xì)胞及其衍生細(xì)胞)。
根據(jù)本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案，缺陷重組病毒是一種腺病毒。具體講，已鑒定了這種病毒的不同血清型，其結(jié)構(gòu)和特性有些區(qū)別。在這些血清型中，本發(fā)明中優(yōu)選使用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或源自動物的腺病毒(見專利申請WO94／26914)?？捎糜诒景l(fā)明的源自動物的腺病毒可舉出源自狗、牛、鼠(如Mavl，Beard等，病毒學(xué)(Virology)75(1990)81)、羊、豬、禽或猴(如SAV)的腺病毒。優(yōu)選源自動物的腺病菌為狗腺病毒，更優(yōu)選腺病毒CAV2[如manhattan株或A26／61株(ATCC VR-800)]。在本發(fā)明中優(yōu)選使用源自人或狗或混合來源的腺病毒。
優(yōu)選本發(fā)明的缺陷腺病毒包含ITR、衣殼化序列和本發(fā)明的核酸。更優(yōu)選地，在本發(fā)明腺病毒的基因組中至少E1區(qū)是無功能的。所述病毒基因可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)非功能性，特別是通過全部刪除、替代、部分缺失、或在所述基因中增加一個或多個堿基。這種修飾例如可通過遺傳工程技術(shù)或通過用誘變劑處理在體外(在分離的DNA上)或就地獲得。其他區(qū)域也可以被修飾，特別是E3區(qū)(WO95／02697)、E2(WO94／28938)、E4(WO94／28152、WO94／12649、WO95／02697)和L5(WO95／02697)。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的腺病毒在E1和E4區(qū)中有缺失。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方式，在E1區(qū)中有缺失，在該缺失處插入了E4區(qū)和本發(fā)明的核酸(參見FR94 13355)。還可以是一種例如E1和／或E2和／或E4區(qū)缺陷的重組腺病毒。在本發(fā)明的病毒中，E1區(qū)中的缺失優(yōu)選為455-3329位核苷酸(基于腺病毒Ad5的序列)。
本發(fā)明的缺陷重組腺病毒可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195，EP 185573；Graham，EMBO J．3(1984)2917)。具體講，可通過腺病毒和含本發(fā)明核酸或表達(dá)序列(其含啟動子和一個或多個NRSE序列)控制下之目標(biāo)核酸的質(zhì)粒間的重源重組制備這些缺陷重組病毒。這種同源重組在所述腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中之后發(fā)生。所用的細(xì)胞系優(yōu)選應(yīng)(ⅰ)可被所述元件轉(zhuǎn)化，及(ⅱ)帶有能夠補(bǔ)充腺病毒基因組缺陷部分的序列，優(yōu)選呈整合形式以避免重組危險。作為細(xì)胞系的實(shí)例，可提及人胚腎細(xì)胞系293(Graham等，J．Gen．Virol．36(1997)59)，它在其基因組中特別含有腺病毒Ad5基因組的左側(cè)部分(12％)，或能夠補(bǔ)充E1和E4功能的細(xì)胞系，如特別是在專利申請WO94／26914和WO95／02697或在Yeh等，J．Virol．70(1996)559中描述的那些。然后，按分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)復(fù)制、回收并純化這些腺病毒。
根據(jù)本發(fā)明的另一種具體實(shí)施方案，這種缺陷重組病毒是一種AAV。腺相關(guān)病毒(AAV)是一種長度較小的DNA病毒，它以穩(wěn)定和位點(diǎn)特異性方式整合在其感染細(xì)胞的基因組中。它們能夠感染大范圍的細(xì)胞，而不對細(xì)胞生長、形態(tài)或分化產(chǎn)生影響。另外，它們看來不會在人體中引起疾病。AAV的基因組已被克隆、測序和鑒定。該基因組包含約4700個堿基，在每個末端含有一個約145個堿基的反向重復(fù)區(qū)(ITR)，作為病毒復(fù)制的起點(diǎn)?；蚪M的其余部分被分為2個帶來衣殼化功能的必需區(qū)基因組左側(cè)部分，其含有參與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因；基因組右側(cè)部分，其含有編碼病毒衣殼蛋白cap基因。
文獻(xiàn)中已報道了AAV衍生載體在體外及體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用(已如WO91／18088；WO93／09239；US4797368；US5139941；EP488528)。這些申請描述了各種衍生自AAV的構(gòu)建物，其中rep和／或cap基因被刪除并用目標(biāo)基因替代，以及它們在體外(對培養(yǎng)細(xì)胞)或體內(nèi)(直接在生物體中)轉(zhuǎn)移所述目標(biāo)基因的應(yīng)用。本發(fā)明的重組缺陷AAV是Rep和／或Cap區(qū)全部或部分缺陷的。它們通過如下兩種質(zhì)粒在被一種人輔助病毒(如腺病毒)感染的細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染而制備含有以AAV兩個反向重復(fù)區(qū)(ITR)為邊界的本發(fā)明核酸序列或序列組合的質(zhì)粒，和帶有AAV的衣殼化基因的質(zhì)粒。適用的細(xì)胞系例如為293細(xì)胞系。其他生產(chǎn)系統(tǒng)在例如專利申請WO95／14771、WO95／13365、WO95／13392或WO95／06743中有述。然后按常規(guī)方法純化AAV重組產(chǎn)物。
按照本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案，缺陷重組病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒或HSV。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒，重組載體的構(gòu)建在文獻(xiàn)中已有大量的報道特別見Breakfield等，New Biologist3(1991)203；EP453242、EP178220、Bernstein等，遺傳工程(Genet．Eng．)7(1985)235；McCormick，生物技術(shù)(BioTechnology)3(1985)689等。具體講，逆轉(zhuǎn)錄病毒是整合性病毒，選擇性感染分裂中的細(xì)胞。因而它們構(gòu)成了可用于癌癥的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組主要含有兩個LTR、一個衣殼化序列和三個編碼區(qū)(gag，pol和env)。在逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的重組載體中，gag、poi和env基因一般被全部或部分缺失，并由目標(biāo)外源核酸序列所替代。這些載體可從各種類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒制得，特別如MoMuLV(莫洛尼鼠類白血病病毒，也稱為MoMLV)、MSV(莫洛尼鼠類肉瘤病毒)、HaSV(Harvey肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)或弗羅德(Friend)病毒。為了構(gòu)建含有本發(fā)明核酸或表達(dá)序列(含啟動子和一個或多個NRSE序列)控制下的目標(biāo)核酸的本發(fā)明重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，先構(gòu)建含有LTR、衣殼化序列和所述核酸的質(zhì)粒，然后用于轉(zhuǎn)染所謂衣殼化細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠反式帶來質(zhì)粒中缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒功能。一般而言，衣殼化細(xì)胞能夠表達(dá)gag、pol和env基因。這種衣殼化細(xì)胞系已在現(xiàn)有技術(shù)中有報道，特別是PA317細(xì)胞系(US4861719)、PsiCRIP細(xì)胞系(WO90／02806)和GP+envAm-12細(xì)胞系(WO89／07150)。另外，這些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可以在LTR中有修飾以消除轉(zhuǎn)錄活性，以及帶有擴(kuò)展的衣殼化序列，包括gag基因的一部分(Bender等，病毒學(xué)雜志(J．Virol．)61(1987)1639)。然后按常規(guī)技術(shù)純化產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。
本申請證明可能利用NRSE序列調(diào)節(jié)基因的體內(nèi)表達(dá)。實(shí)際上，在以下實(shí)施例中給出的結(jié)果表明這些序列在體內(nèi)總是有活性的，允許轉(zhuǎn)基因在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)而在非神經(jīng)細(xì)胞中無表達(dá)。
本申請還表明NRSE序列根據(jù)其配置(拷貝數(shù))能夠有效調(diào)節(jié)強(qiáng)啟動子的活性，這使得其具有眾多且特別有利的應(yīng)用。實(shí)際上，所得結(jié)果表明，在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)不僅是特異性的，而且水平可與用強(qiáng)啟動子獲得的水平相比。本發(fā)明另外令人驚異地證明NRSE序列的活性看來在被插入病毒來源載體中時被增強(qiáng)。這后一類型的構(gòu)建物結(jié)合了一些特別誘人的特性，如轉(zhuǎn)移的有效性和表達(dá)的選擇性。
本發(fā)明還涉及還有如上定義的核酸或載體或病毒的任何細(xì)胞。最好這種細(xì)胞是一種哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞。這特別可以是來自已建細(xì)胞系的細(xì)胞或來自初級培養(yǎng)細(xì)胞。這些細(xì)胞可以用于生產(chǎn)例如多肽或用于檢測基因的活性。這些細(xì)胞還可以用于細(xì)胞治療方法中，即植入或注入體內(nèi)。
為此，本發(fā)明還涉及包含如上所定義核酸或載體或病毒或細(xì)胞以及賦形劑的組合物，最好是一種藥物組合物。為了本發(fā)明的應(yīng)用，這些核酸、載體或細(xì)胞優(yōu)選與一種或多種藥用載體配合，以配制成適于局部(特別是趨實(shí)性)、口服、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、透皮等途徑給藥的制劑。優(yōu)選核酸、載體或細(xì)胞以可注射的形式使用。這特別可以是無菌等滲鹽溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或?yàn)楦山M合物，特別是凍干品，根據(jù)情況加入無菌水或生理鹽水可以構(gòu)成可注射溶液。
根據(jù)一種優(yōu)選方案，本發(fā)明的組合物通過肌肉內(nèi)途徑、優(yōu)選以注射方式給藥。實(shí)際上，選擇的肌內(nèi)途徑可以獲得出人意外的好的治療效果，這是由于治療基因衍生產(chǎn)物和肌肉中產(chǎn)物的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)際上，相應(yīng)于本發(fā)明的核酸或來自本發(fā)明載體的這些產(chǎn)物，被吸附在神經(jīng)肌肉節(jié)(運(yùn)動終板)并沿著運(yùn)動神經(jīng)軸突通過逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)細(xì)胞體。這種給藥方式還具有防止由于神經(jīng)疾病治療中治療基因異位表達(dá)產(chǎn)生的付作用的優(yōu)點(diǎn)。按此方法易于特異性地感染神經(jīng)元細(xì)胞，而不在注射的肌肉中促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)或在血液循環(huán)中分泌其產(chǎn)物。實(shí)際上，本發(fā)明無可爭辯地克服了迄今在基因治療中遇到的由于神經(jīng)營養(yǎng)因子與運(yùn)動神經(jīng)元的接近有限、由于這些蛋白的半壽期短以及當(dāng)這些產(chǎn)品系統(tǒng)給藥時產(chǎn)生的毒性效應(yīng)而引起的缺點(diǎn)。另外，由于易于接近注射部位，該方法可有利地用于無論何種類型的神經(jīng)元或運(yùn)動神經(jīng)元疾病。
這些不同元件的量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)設(shè)計(jì)的應(yīng)用和各種參數(shù)和考慮的注射位點(diǎn)、注射次數(shù)、待表達(dá)基因或?qū)で笾委煹某掷m(xù)時間等來調(diào)節(jié)。
本發(fā)明還涉及一種構(gòu)建物在制備用于在神經(jīng)組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)移及表達(dá)目標(biāo)核酸的組合物中的應(yīng)用，所述構(gòu)建物含有-啟動子，-一個或多個NRSE序列，及-所述核酸，安排這些元件使所述核酸的表達(dá)受所述啟動子控制，而所述啟動子的活性受所述序列控制。
本發(fā)明核酸的體內(nèi)或離體基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用(如在基因治療中)使得可以限制目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的異位表達(dá)并將所希望的治療效果靶向于神經(jīng)元群。這就防止了由于轉(zhuǎn)基因在機(jī)體中的擴(kuò)散而產(chǎn)生的可能的有害作用?？梢钥紤]將此系統(tǒng)用于脊髓的各種疾病(變性或創(chuàng)傷)以及任何其他中樞、外周神經(jīng)疾病或特異性損害神經(jīng)元群的精神病。在基礎(chǔ)神經(jīng)學(xué)中，該系統(tǒng)應(yīng)還能精確找到所觀察到的體外和體內(nèi)效應(yīng)的根源(神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。
本發(fā)明還涉及一種構(gòu)建物在制備用于目標(biāo)核酸經(jīng)肌內(nèi)途徑給藥于神經(jīng)組織或細(xì)胞治療運(yùn)動神經(jīng)元疾病的組合物中的應(yīng)用，該構(gòu)建物包含-啟動子，
-一個或多個NRSE序列，及-所述核酸，安排這些元件使得所述核酸的表達(dá)受所述啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
本發(fā)明還涉及如上所定義并含有表達(dá)序列控制下的目標(biāo)核酸的載體的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)序列包含啟動子和一個或多個NRSE序列。
病毒載體的應(yīng)用乃基于病毒轉(zhuǎn)染的天然特性。這些載體已證明在轉(zhuǎn)染方面性能特別良好。因而可能利用本發(fā)明的這些載體用于在體外、體內(nèi)或離體在神經(jīng)元細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和表達(dá)目標(biāo)基因，特別是用于基因治療。在神經(jīng)細(xì)胞中特異性獲得了特別在一個或多個NRSE序列控制下的目標(biāo)核酸的表達(dá)，而異位表達(dá)受到了限制。這些載體因而可用于治療和／或預(yù)防各種中樞、外周神經(jīng)疾病或損害神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)精神疾病，特別是神經(jīng)變性性疾病和各種脊髓疾病。作為實(shí)例，可以特別舉出阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌肉脊髓性共濟(jì)失調(diào)、杭廷頓舞蹈病。
這些載體特別可用于治療和／或防止運(yùn)動神經(jīng)元疾病，如肌萎縮性側(cè)索硬化、Ⅰ型脊髓性肌萎縮(Werding Hoflman病)、Ⅱ型或Ⅲ型脊髓性肌萎縮(Kugelberg-Welander病)、延髓脊髓性肌萎縮(如Kennedy病)。
這些載體特別適于通過肌內(nèi)途徑治療和／或預(yù)防這些疾病。如前文所闡明的，這種治療途徑由于逆向轉(zhuǎn)運(yùn)可以達(dá)到運(yùn)動神經(jīng)元。
更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及如前所定義并包含如下構(gòu)建物的載體在制備用于在神經(jīng)組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)移并表達(dá)目標(biāo)核酸的組合物中的應(yīng)用，在所述構(gòu)建物中安排-啟動子，-一個或多個NRSE序列，和-所述核酸，以便所述核酸的表達(dá)受所述啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
本發(fā)明還涉及如上所定義并含有如下構(gòu)建物的載體在制備用于目標(biāo)核酸肌內(nèi)給藥于神經(jīng)組織或細(xì)胞用于治療運(yùn)動神經(jīng)元疾病的組合物中的應(yīng)用，在所述構(gòu)建物中安排-啟動子，-一個或多個NRSE序列，和-所述核酸，以便所述核酸的表達(dá)受所述啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
本發(fā)明還涉及體內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的方法，包括在所述基因的上游插入NRSE序列并體內(nèi)給予生成的構(gòu)建物和／或含所述構(gòu)建物的載體。
借助于下述實(shí)施例將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例應(yīng)視為說明性質(zhì)的而非限制性的。這些實(shí)施例首先描述了在含螢光素酶基因的質(zhì)粒中PGK啟動子上游克隆入遞增數(shù)目的NRSE序列，并選擇能夠在轉(zhuǎn)染非神經(jīng)元細(xì)胞后螢光素酶表達(dá)減弱的構(gòu)建物。然后相應(yīng)的腺病毒構(gòu)建體通過感染細(xì)胞系和初級培養(yǎng)物體外被產(chǎn)生并檢測，然后給小鼠肌內(nèi)注射重組腺病毒后體內(nèi)產(chǎn)生并檢測。給出的結(jié)果表明了本發(fā)明核酸的優(yōu)點(diǎn)。
圖2通過轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞(PC12)(圖2B)和非神經(jīng)細(xì)胞(3T3)(圖2A)然后測定螢光素酶活性研究質(zhì)粒的功能。
圖3通過感染以下細(xì)胞后測定螢光素酶活性體外研究缺陷重組病毒的功能-非神經(jīng)細(xì)胞(大鼠成纖維細(xì)胞3T3)(圖3A)-神經(jīng)細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞PC12)(圖3B)-非神經(jīng)初級細(xì)胞培養(yǎng)物，感染新生大鼠腎的初級培養(yǎng)物(圖3C)-神經(jīng)初級細(xì)胞培養(yǎng)物，感染新生大鼠頸上神經(jīng)節(jié)的初級培養(yǎng)物(圖3D)-非神經(jīng)初級細(xì)胞培養(yǎng)物，感染大鼠胚胎的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(圖3E)-神經(jīng)初級細(xì)胞培養(yǎng)物，感染大鼠胚胎的皮層神經(jīng)元細(xì)胞的初級培養(yǎng)物(圖3F)。
圖4通過肌內(nèi)注射小鼠并測定螢光素酶活性研究缺陷重組病毒的功能。
圖5通過小鼠舌肌內(nèi)注射并測定螢光素酶活性研究缺陷重組病毒的功能。
圖5A在第8天和第35天測定舌肌細(xì)胞中的螢光素酶活性。
圖5B在第8天和第35天測定神經(jīng)系統(tǒng)(延髓)細(xì)胞中的螢光素酶活性。
材料和方法細(xì)胞系和初級培養(yǎng)物將來自大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞(PC12)培養(yǎng)在含15％胎牛血清(Boehringer)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)中。將來自大鼠成纖維細(xì)胞的3T3細(xì)胞保持在含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。頸上神經(jīng)節(jié)的初級培養(yǎng)物按如下方法獲得解剖取出1天或2天齡的新生Winstar大鼠(Iffa-Credo)的頸上神經(jīng)節(jié)并用3mg／ml的分散酶解離，然后置于預(yù)先用來自大鼠尾巴的膠原包被的板上。細(xì)胞培養(yǎng)在0．5ml用碳酸氫鈉緩沖并含有多種因子(其中有70ng／mlNGF(神經(jīng)生長因子)、5％成年大鼠血清和10μM胞嘧啶阿拉伯呋喃糖苷)的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基(Gibco)中。
腎初級培養(yǎng)物通過1或2天齡新生Winstar大鼠(Iffa-Credo)腎組織用胰蛋白酶解離制備。然后將細(xì)胞置于板上10％胎牛血清中，以便細(xì)胞分裂直到被感染時。
皮層培養(yǎng)物來自E17 Sprague-Dawley大鼠(Iffa-Credo)的胚胎。通過解剖和機(jī)械解離獲得細(xì)胞，并培養(yǎng)在含100μg／ml運(yùn)鐵蛋白、25μg／ml胰島素、10μg／ml腐胺、5ng／ml亞硒酸鈉、6．3ng／ml孕酮和2ml谷胺酰胺(Sigma)的DMEM培養(yǎng)基中。
星形膠質(zhì)細(xì)胞初級培養(yǎng)物來自大鼠(E17 Spraghe-Dawley)的胚胎皮層組織，并培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中及10％CO2和90％空氣的氣氛下。體外試驗(yàn)為了進(jìn)行暫時轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，1百萬細(xì)胞用一種Bio-Rad系統(tǒng)以960μF和190V(對PC12細(xì)胞)或250V(對3T3細(xì)胞)電穿孔，轉(zhuǎn)染6μg每種試驗(yàn)質(zhì)粒、7μg Blue Script質(zhì)粒(Stratagene)和2μg pCAT3-控制載體(Promega)，后者是一種編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)并可控制轉(zhuǎn)染效率的質(zhì)粒。
通過用含MOI為約200pfu的病毒懸液的無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基并保溫45分鐘進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物的感染。對于每種構(gòu)建物(質(zhì)?；蛳俨《?，在3個不同的孔中測得3個螢光素酶活性值。每種病毒構(gòu)建物用不同的病毒原液重復(fù)2次感染實(shí)驗(yàn)。
電穿孔或感染后48小時收集細(xì)胞于含25mM Tris磷酸pH7．8、0．08mM螢光素、0．1mM ATP、8mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇、1mMEDTA、15％甘油和1％Trition的200μl溶胞緩沖液中。用LUMATLB9501型熒光計(jì)(Berthold)測定螢光素酶活性。對于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在溶胞緩沖液中加入1％牛血清白蛋白，基于液體閃爍計(jì)數(shù)法測得的CAT活性對酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。對于重組腺病毒，根據(jù)Bio-Rad系統(tǒng)(Bio-Rad試驗(yàn)室)測定的細(xì)胞提取物的蛋白濃度對螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。體內(nèi)試驗(yàn)將6月齡的C57B16雄性小鼠(Charles River)用一種Rompun(Bayer)／Ketamine(UVA)混合物麻醉，然后在舌中慢慢(2．5μl／ml)注射構(gòu)建物Ad PGK-luc和Ad-NRSE-PGK-luc(109pfu／4×2．5μl)和／或在腓腸肌中以2×109pfu／肌肉(30μl)的劑量注射。感染7-35天后用戊巴比妥(Sanofi)處死小鼠。取下延髓、舌和肌肉以測定螢光素酶活性。將延髓在200μl溶胞緩沖液中機(jī)械解離。用DIAX 900 polytron型系統(tǒng)(Heidolph)分別在1ml和2ml溶胞緩沖液中解離肌肉和舌。
質(zhì)粒pPGK-Luc包含遍在性真核啟動子PGK控制下的Luc基因。為了獲得質(zhì)粒pPGK-Luc，將500bp的鼠PGK啟動子插入在市購質(zhì)粒pUT103(法國CAYLA)中，該質(zhì)粒帶有與zeocine融合的螢光素酶報道基因和呈“早期”構(gòu)型的SV-40多腺苷酸化序列(poly A)。
然后在PGK啟動子上游以反向平行形式插入一、二、三、六和十二個拷貝的SCG 10基因NRSE序列(TTCAGCACCACGGAGAGTGCC，SEQ ID NO．1)[2]。為此，通過用2個相應(yīng)的合成寡核苷酸雜交構(gòu)建了兩端為2個MluⅠ位點(diǎn)的含上述NRSE序列的26bp片段。將此片段以一個或多個拷貝插入在pPGK-Luc的MluI位點(diǎn)上，得到含1、2和3個拷貝NRSE的質(zhì)粒。按如下方法從含3拷貝NRSE的質(zhì)粒(pNRSE3-PGK-Luc)獲得了帶6個拷貝NRSE的質(zhì)粒從pNRSE3-PGK-Luc切下含3拷貝NRSE的BamHI／XhoI片段，并引入pNRSE3-PGK-Luc的XhoI位點(diǎn)上，產(chǎn)生p6NRSE-PGK-Luc。同樣，在p6NRSE-PGK-Luc中引入雙拷貝的BamHI／XhoI片段，從6拷貝NRSE的質(zhì)粒(p6NRSE-PGK-Luc)獲得了含12拷貝NRSE的質(zhì)粒。
最后，將上述不同質(zhì)粒的PGK(有或無NRSE)-Luc-Poly A表達(dá)盒引入一種可用于構(gòu)建缺陷重組病毒的穿梭質(zhì)粒中，即腺病毒左側(cè)ITR序列(反向末端重復(fù)，復(fù)制起點(diǎn))和多肽Ⅸ編碼序列(病毒衣殼的蛋白)之間(

圖1)。
可以理解，按相同方法可構(gòu)建含與PGK之外的真核遍在型啟動子結(jié)合的1-50拷貝NRSE基元的任何其它質(zhì)粒，其中在所述嵌合啟動子控制下可插入任何目標(biāo)轉(zhuǎn)基因。2．通過細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的功能分析本實(shí)施例的目的是證明帶有含NRSE序列之嵌合啟動子的質(zhì)粒構(gòu)建物是有功能的并能夠在細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因。
通過神經(jīng)元細(xì)胞系PC12(大鼠嗜鉻細(xì)胞)和非神經(jīng)元細(xì)胞3T3(大鼠成纖維細(xì)胞)的暫時轉(zhuǎn)染(電穿孔)檢驗(yàn)實(shí)施例1中所述質(zhì)粒構(gòu)建物。相對于在含125mM Tris磷酸pH7．8，125μM氯霉素和0．12μM放射標(biāo)記的乙酰輔酶A的溶液中測得的CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)活性對所得螢光素酶活性的值標(biāo)準(zhǔn)化。在37℃保溫1小時后用KONTRON計(jì)算機(jī)在Econofluor閃爍液存在下定量測定。對每個質(zhì)粒構(gòu)建物，測得了3個螢光素酶活性值，所得平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤示于圖2中。
所得結(jié)果表明，含有6和12拷貝NRSE的構(gòu)建物能夠在非神經(jīng)細(xì)胞(3T3)中分別降低螢光素酶的表達(dá)66％和82％，即與pPGK-Luc相比表達(dá)損失了近一個數(shù)量級。這些結(jié)果還表明神經(jīng)細(xì)胞PC12中NRSE基元的存在不會降低螢光素酶的表達(dá)，甚至可能提高。在p12NRSE-PGK-Luc和pPGK-Luc之間發(fā)現(xiàn)了25％的統(tǒng)計(jì)顯著性提高。
因此，所得結(jié)果證明帶有含NRSE序列之嵌合啟動子的質(zhì)粒構(gòu)建物是有功能的，能夠只在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因，而特別顯著地抑制該基因在非神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)。3．缺陷重組病毒的構(gòu)建本發(fā)明的目的是描述嵌合啟動子的獲得以及帶此特別啟動子之病毒載體的構(gòu)建。
為了完成該體外和體內(nèi)研究，制得了三種腺病毒構(gòu)建體Ad-PGK-Luc、Ad-6NRSE-PGK-Luc和Ad-12NRSE-PGK-Luc。這些重組病毒是按照已知的生物技術(shù)構(gòu)建的，即實(shí)施例1所述的穿梭質(zhì)粒和5型缺陷腺病毒基因組在衣殼化細(xì)胞系(293細(xì)胞)中的共轉(zhuǎn)染。首先在FspⅠ位點(diǎn)酶切將該穿梭質(zhì)粒線性化，通過磷酸鈣DNA沉淀技術(shù)與腺病毒的ClaⅠ片段一起轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。
然后將衣殼化的重組基因組按常規(guī)技術(shù)純化，特別是通過噬斑純化技術(shù)。再經(jīng)限制酶片段分析和PCR驗(yàn)證整合片段。通過重組腺病毒在293細(xì)胞中增殖、然后超速離心(尤其是在氯化絕梯度上)并在SephadexG25M(Pharmacia)型純化柱上純化，制備了病毒原種儲液。通過光密度讀數(shù)測定病毒滴度，另外經(jīng)噬斑法驗(yàn)證。所有儲液的滴度均在2×108pfu／μl左右。4．體外功能分析本實(shí)施例的目的是證明實(shí)施例3中描述的帶有含NRSE序列之嵌合啟動子的病毒構(gòu)建體有功能并能控制不同細(xì)胞類型中的啟動子。
通過分別以20和200pfu／細(xì)胞的劑量感染細(xì)胞系和初級培養(yǎng)物，體外檢驗(yàn)了上述實(shí)施例3中構(gòu)建的三種腺病毒。如上文所述的那樣對50μl上清液進(jìn)行酶活性測定，相對于以Bio Rad蛋白檢測試劑盒(Bio-Rad)獲得的總蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于每種腺病毒，在不同的孔中測定了3個螢光素酶活性值。所得平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤示于圖3(細(xì)胞系)和圖4(初級培養(yǎng)物)中。
重組腺病毒Ad-6NRSE-PGK-Luc和Ad-12NRSE-PGK-Luc在非神經(jīng)元細(xì)胞系3T3中，螢光素酶報道基因的表達(dá)分別降低了97％和99％。
在神經(jīng)元細(xì)胞系PC12中，帶有NRSE序列的兩種腺病毒的熒光素酶活性大于腺病毒Ad-PGK-Luc的表達(dá)水平。
同樣，在感染新生大鼠頸上神經(jīng)節(jié)(GCS)初級培養(yǎng)物后，3種腺病毒構(gòu)建物的螢光素酶活性相似(單因素ANOVA的總差異分析沒有顯示三組間有顯著差異)。相反，在用重組腺病毒Ad-6NRSE-PGK-Luc和Ad-12NRSE-PGK-Luc感染新生大鼠腎初級培養(yǎng)物后，螢光素酶的表達(dá)降低了91％和98％，即在12拷貝NRSE存在下PGK的表達(dá)損失了2個數(shù)量級。
與前述結(jié)果相符，3種構(gòu)建物對來自17天齡大鼠胚胎的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元皮層細(xì)胞的感染，如同預(yù)期的那樣，在含6或12個NRSE序列的構(gòu)建物感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞中螢光素酶非常顯著地降低(10倍)(圖3E)。同樣如所預(yù)料，在皮層細(xì)胞中，上述三種病毒構(gòu)建物所得螢光素酶活性是相當(dāng)?shù)?圖3F)。
這些結(jié)果是特別令人驚異和引人注目的，因?yàn)樗鼈儽砻?ⅰ)本發(fā)明的嵌合啟動子對初級培養(yǎng)物是有功能的，(ⅱ)這些啟動子在病毒的情形下是有功能的，及(ⅲ)在腺病毒中抑制活性大于在相應(yīng)的質(zhì)粒載體中(參見圖2和3)。
因此，本實(shí)施例得以證明，帶有含NRSE序列的嵌合啟動子的病毒構(gòu)建體是有功能的，并允許目標(biāo)基因只在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，而非常顯著地抑制所述基因在非神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)。5．體內(nèi)功能分析本實(shí)施例的目的是證明在實(shí)施例3中描述的帶有含NRSE序列之嵌合啟動子的病毒構(gòu)建物是有功能的并能夠體內(nèi)控制該啟動子。
考慮到實(shí)施例4中所述很令人鼓舞的結(jié)果，在體內(nèi)試驗(yàn)了本發(fā)明構(gòu)建物的活性，給小鼠肌內(nèi)注射(腓腸肌和舌肌)這三種重組腺病毒后測定螢光素酶的表達(dá)。5．1腓腸肌注射以30μl的體積2×109pfu／塊肌肉的劑量給7只小鼠的右側(cè)腓腸肌上3個點(diǎn)注射每種腺病毒構(gòu)建物。注射后7天取下被注射的肌肉，在1ml緩沖液中解離，以在150μl上清液中測定螢光素酶活性。所得7個螢光素酶活性值的平均值和其標(biāo)準(zhǔn)誤(相對于總蛋白量)示于圖5中。
這些結(jié)果證明，注射重組腺病毒Ad-6NRSE-PGK-Luc和Ad-12NRSE-PGK-Luc后一周時，螢光素酶的表達(dá)降低了90％和96％。
在小鼠中以更長的時間比較了肌內(nèi)注射Ad-12NRSE-PGK-Luc和Ad-PGK-Luc后螢光素酶的表達(dá)?？偰芸吹阶⑸銩d-12NRSE-PGK-Luc螢光素酶活性降低，在注射后一個月降低95％和三個月降低91％。5．2舌肌的注射為了比較給小鼠舌肌注射后兩種構(gòu)建物Ad-PGK-Luc和Ad-12NRSE-PGK-Luc在延髓和舌肌中的表達(dá)，使用了逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。
與已獲得的結(jié)果相符，給藥后一周時，兩種構(gòu)建物的螢光素酶活性在神經(jīng)系統(tǒng)中相似(圖5B)。而在注射構(gòu)建物Ad-12NRSE-PGK-Luc的肌肉中與注射Ad-PGK-Luc的肌肉相比，螢光素酶活性降低90％(圖5A)。這種抑制作用在注射后的至少35天中一直保持。有意思的是，雖然第35天的表達(dá)水平低于注射后第8天的，但上述兩種病毒構(gòu)建物間的表達(dá)差異仍然非常顯著。
這些結(jié)果再一次證實(shí)了本發(fā)明構(gòu)建物的體內(nèi)功能性，而且顯示抑制作用比體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非神經(jīng)元細(xì)胞后觀察到的抑制還高1倍。
這些結(jié)果還表明了本發(fā)明構(gòu)建物體內(nèi)在神經(jīng)元細(xì)胞中靶向表達(dá)目標(biāo)基因的高效性。將這一途徑用于基因治療可以限制目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的異位表達(dá)，并防止由轉(zhuǎn)基因在機(jī)體中擴(kuò)散引起的可能的有害作用。
文獻(xiàn)[1]Mori NStein RSigmund O．和Anderson D．J．神經(jīng)元(Neuron)，4583-594(1990)[2]Mori NvSchoenherr CVandenbergh D．J．和Anderson D．J．神經(jīng)元945-54(1992)[3]Li LSuzuki TMori N．和Greencard P．PNAS USA，901460-1464(1993)[4]Schoenherr C．JPaquette A．J．和Anderson D．J．PNAS USA，939981-9886(1996)[5]Schoenherr C．J．和Anderson D．J．科學(xué)(Science)，2671360-1363(1995)[6]McBurney，Sutherland，Adra，Leclair，Rudnicki，Jardine核酸研究(Nucleic Acids Research)，Vol．19，N°205755-5761(1991)[7]Moullier PMarechal VDanos O．和Heard J．M．移植(Transplantation)，56427-432(1993)[8]McDonald R．JLukason M．JRaabe O．GCanfield D．RBurr E．AKaplan J．MWadsworth S．C．和St George J．A．人類基因治療(Hum．Gene Ther．)，8411-422(1997)[9]Maue R．AKraner S．DGoodman R．H．和Mandel G．神經(jīng)元4223-231(1990)[10]Bessis AChamptiaux NChatelin L．和Changeux J．P．PNAS USA，945906-5911(1997)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱RHONE-POULENC RORER(B)待道RAYMOND ARON大街20號(C)城市安東尼(E)國家法國(F)郵編92165(G)電話33155716922(H)電傳33155717291(ⅱ)發(fā)明名稱負(fù)調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)特異性表達(dá)的應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)11(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容PC(C)操作系統(tǒng)PatentIn Release#1．0，#1．30版(EPO)(2)SEQ ID NO．1的信息NRSE基元序列(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21(2)SEQ ID NO．2的信息NRSE基元序列(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．2TTCAGCACCA CGGACAGCGC C 21(3)SEQ ID NO．3的信息NRSE基元序列(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．3
NNCAGCACCN NGGANAGNNN C 21(2)SEQ ID NO．4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅲ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．4TTCAGCACCA CGGAGAGTGC C 21(2)SEQ ID NO．5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．5TTCAGCACCG CGGACAGTGC C 21(2)SEQ ID NO．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．6TTCAGCACCT CGGACAGCAT C21(2)SEQ ID NO．7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．7TTCAGCACCG CGGAGAGCGT C21(2)SEQ ID NO．8的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．8TCCAGCACCG TGGACAGAGC C 21(2)SEQ ID NO．9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．9TTCAGCACCG AGGACGGCGG A 21(2)SEQ ID NO．10的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．10ATCAGCACCA CGGACAGCGG C 21(2)SEQ ID NO．11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱／關(guān)鍵詞-(B)位置1．．21(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．11TTCAGCACCT AGGACAGAGG C 2權(quán)利要求
1．包含以下元件的重組核酸-啟動子-一個或多個NRSE序列，及-治療基因，安排這些元件使得所述治療基因的表達(dá)受這啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸，其特征在于啟動子是一種在神經(jīng)細(xì)胞或組織中有活性的真核或病毒啟動子。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的重組核酸，其特征在于啟動子是一種神經(jīng)特異性的或?qū)σ环N神經(jīng)元類型特異的遍在性真核啟動子。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的重組核酸，其特征在于啟動子是一種持家啟動子。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的重組核酸，其特征在于啟動子選自PGK、Eflα、β肌動蛋白、波形蛋白、醛縮酶A或α1-抗胰蛋白酶基因的啟動子。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸，其特征在于啟動子是一種強(qiáng)啟動子。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸，其特征在于它含有1-20個NRSE序列，優(yōu)選3-15個。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的重組核酸，其特征在于它含有3、6或12個NRSE序列。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的重組核酸，其特征在于所述NRSE序列包含SEQ ID NO．3序列的全部或部分，其中N代表A、G、C或T。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的重組核酸，其特征在于所述NRSE序列選自序列SEQ ID NO．1、2、4-11或其變體的全部或部分。
11．根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組核酸，其特征在于它包含重復(fù)多次的同一基元或權(quán)利要求9或10定義的不同基元。
12．根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的重組核酸，其特征在于所述NRSE序列被置于啟動子的上游。
13．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸，其特征在于所述治療基因包含一個編碼治療性或疫苗RNA或多肽的開放讀碼框架。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的重組核酸，其特征在于所述治療基因是一種包含編碼一種營養(yǎng)因子的開放讀碼框架的核酸。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的重組核酸，其特征在于所述治療基因是一種包含編一種抗氧化劑的開放讀碼框架的核酸。
16．根據(jù)權(quán)利要求1的重組核酸，其特征在于它還包含NRSE序列以外的調(diào)控元件。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的調(diào)控元件，其特征在于它是一種四環(huán)素操縱子／阻遏蛋白系統(tǒng)。
18．含有權(quán)利要求1-16之一的核酸的載體。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的載體，其特征在于它是一種病毒載體。
20．含有表達(dá)序列控制下的目標(biāo)核酸的缺陷重組病毒，其特征在于所述表達(dá)序列包含一個啟動子和一個或多個NRSE序列。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的病毒，其特征在于它是一種腺病毒。
22．根據(jù)權(quán)利要求20的病毒，其特征在于它是一種腺相關(guān)病毒。
23．根據(jù)權(quán)利要求20的病毒，其特征在于它是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。
24．根據(jù)權(quán)利要求20的病毒，其特征在于它是一種彈狀病毒。
25．含有權(quán)利要求1的核酸或權(quán)利要求18的載體或權(quán)利要求20的病毒的細(xì)胞。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的細(xì)胞，其特征在于它是一種哺乳動物神經(jīng)細(xì)胞。
27．一種構(gòu)建物在制備用于在神經(jīng)組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)移及表達(dá)目標(biāo)核酸的組合物中的應(yīng)用，所述構(gòu)建物含有-啟動子，-一個或多個NRSE序列，及-所述核酸，安排這些元件使所述核酸的表達(dá)受所述啟動子控制，而所述啟動子的活性受所述序列控制。
28．一種構(gòu)建物在制備用于目標(biāo)核酸經(jīng)肌內(nèi)途徑給藥于神經(jīng)組織或細(xì)胞治療運(yùn)動神經(jīng)元疾病的組合物中的應(yīng)用，該構(gòu)建物包含-啟動子，-一個或多個NRSE序列，及-所述核酸，安排這些元件使得所述核酸的表達(dá)受所述啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
29．包含表達(dá)序列控制下的目標(biāo)核酸的缺陷重組病毒的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)序列含有一個啟動子和一個或多個NRSE序列。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的應(yīng)用，其為在體內(nèi)、體外或離體神經(jīng)元細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和表達(dá)目標(biāo)基因的應(yīng)用。
31．包含如下構(gòu)建物的載體在制備用于在神經(jīng)組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)移并表達(dá)目標(biāo)核酸的組合物中的應(yīng)用，在所述構(gòu)建物中安排-啟動子，-一個或多個NRSE序列，和-所述核酸，以便所述核酸的表達(dá)受所述啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
32．含有如下構(gòu)建物的載體在制備經(jīng)肌內(nèi)給藥用于治療運(yùn)動神經(jīng)元疾病的組合物中的應(yīng)用，在所述構(gòu)建物中安排-啟動子，-一個或多個NRSE序列，和-所述核酸，以便所述核酸的表達(dá)受所述啟動子的控制，而所述啟動子的活性受所述序列的控制。
33．根據(jù)權(quán)利要求31或32的應(yīng)用，其特征在于所述載體是一種病毒。
34．含有權(quán)利要求1的核酸或權(quán)利要求18的載體或權(quán)利要求20的病毒的組合物。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，其特征在于它被配制成適于肌內(nèi)途徑優(yōu)選注射給藥的形式。
36．含有一種遍在性啟動子和一個或多個NRSE序列的嵌合啟動子。
37．嵌合啟動子xNRSE-PGK，其中x為1-50的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于控制核酸表達(dá)的新的方法和構(gòu)建物。更具體地講,本發(fā)明涉及可能獲得轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)或離體神經(jīng)細(xì)胞中靶向表達(dá)的利用NRSE序列的方法和構(gòu)建物。本發(fā)明特別適用于基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移,例如治療或科研方法中。
文檔編號C12N15/86GK1290303SQ9980281
公開日2001年4月4日 申請日期1999年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月12日
發(fā)明者H·吉菲爾, J·馬勒特, S·米勒卡普斯 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司