專利名稱：：脂肪酶變體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及適用于洗滌劑組合物、特別是具有高含量陰離子表面活性劑的洗滌劑中的脂肪酶變體。更具體地講，本發(fā)明涉及來自Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶的變體。
背景技術：
：許多年來，已將脂肪酶用作洗滌劑酶以除去來自衣物和其它紡織物的脂類或脂肪的污物，其中特別是來源于Humicolalanuginosa的(EP258068和EP305216)以商品名立撲萊斯(NovoNordiskA/S的產(chǎn)品)銷售的脂肪酶。WO92/05249,WO94/25577,WO95/22615,WO97/04079與WO97/07202公開了H.lanuginosa脂肪酶的變體，該變體針對洗滌用途而言具有改善的特性。于是，WO97/04079公開了在N-末端具有肽添加部分(延伸部分)的變體。WO97/07202公開了具有“首次洗滌(first-wash)性能”的脂肪酶變體，該變體能夠在一個循環(huán)的洗滌中從被豬油弄臟的樣品(swatch)中除去大量的豬油。目前始終存在著對提供具有改善的特性(特別是在包括具有高含量陰離子表面活性劑的洗滌劑在內(nèi)的商用洗滌劑中具有改善的洗滌特性)的新脂肪酶的需要。本發(fā)明涉及這樣的新的脂肪酶。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有帶電氨基酸的特定分布的立撲萊斯(野生型Humicolalanuginosa的脂肪酶)的變體在具有高的陰離子與非離子表面活性劑之比的洗滌劑溶液中具有特別好的首次洗滌性能。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該作用是通過在N-末端連接一個帶正電的肽延伸部分并且通過對在對應于第90-101位以及第210位上的氨基酸區(qū)域中的電荷分布施加一定的限制來實現(xiàn)的。通過在N-末端連接一個肽延伸部分以及取代90-101區(qū)域中的或者三維結(jié)構(gòu)中緊靠著的環(huán)境中的氨基酸，本發(fā)明人進一步發(fā)明了一種由立撲萊斯開發(fā)具有所述性能的變體的方法。所述脂肪酶可以進一步提供其它的益處，諸如白度的維持和臟物的清洗。因此，本發(fā)明提供了一種脂肪酶，該脂肪酶為具有如下氨基酸序列的多肽a)所述序列與來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶之間具有至少90％的同一性；b)與所說的野生型脂肪酶相比，所述序列包括一個帶正電的與N-末端相連的肽延伸部分；c)所述序列包括一個在所說野生型脂肪酶的E210位置上的帶負電的氨基酸。此外，所述的氨基酸序列可以d)包括一個在對應于所說野生型脂肪酶第90-101位的區(qū)域中的帶負電的氨基酸；e)包括一個在對應于所說野生型脂肪酶之N94的位置上的中性或帶負電的氨基酸和/或在對應于所說野生型脂肪酶第90-101位的區(qū)域中具有負的或中性的凈電荷。另一方面，所述的氨基酸序列可以d)包括在所說野生型脂肪酶的N94、D96和E99位的至少兩個位置上帶有負電或沒有改變電荷的氨基酸。本發(fā)明還提供了一種包括所述脂肪酶的洗滌劑組合物，編碼所述脂肪酶的DNA序列，攜帶所述DNA序列的表達載體，含有所說DNA序列或所說表達載體的轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及通過培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細胞生產(chǎn)所述脂肪酶的方法。此外，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)變體脂肪酶的方法，該方法包括a)選擇具有某一氨基酸序列的親代脂解酶，所述的氨基酸序列與來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶之間具有至少90％的同一性；b)修飾編碼所述親代脂肪酶的核酸序列以產(chǎn)生編碼某一脂肪酶的核酸，所述的脂肪酶包括在N-末端的肽延伸部分以及在如下位置上的氨基酸的取代ⅰ)在對應于所說野生型脂肪酶的第90-101位的區(qū)域中，或ⅱ)在所述第90-101位之任一位置的6埃范圍內(nèi)之三維結(jié)構(gòu)的表面上，c)在宿主細胞中表達所述修飾的核酸以產(chǎn)生變體脂肪酶，d)測試洗滌劑溶液中變體脂肪酶的首次洗滌效果，所述洗滌劑溶液包括其量超過總表面活性劑重量的70％的陰離子表面活性劑，e)可以選擇性地重復步驟b-d，以及f)選擇具有改善的首次洗滌效果的變體。附圖的簡要描述圖1顯示出質(zhì)粒pEVi1163的構(gòu)建。圖2顯示出曲霉屬載體pCaHj483的構(gòu)建。圖3顯示出表達質(zhì)粒pCaHj521的構(gòu)建。發(fā)明詳述Humicolalanuginosa的脂肪酶本發(fā)明中采用的參考脂肪酶為來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶。它在EP258068和EP305216中加以描述并且具有US5,869,438的SEQIDNO:2第1-269位中所示的氨基酸序列。在本說明書中，該參考脂肪酶又被稱作立撲萊斯。在N-末端的肽延伸部分與立撲萊斯相比，本發(fā)明的脂肪酶包括一個與N-末端相連的帶正電的肽延伸部分。肽延伸部分優(yōu)選由1-15個(特別是4-10個)氨基酸殘基組成，并且優(yōu)選包括1,2或3個帶正電的氨基酸，最優(yōu)選為1,2或3R。選擇性地，通過用電中性的或帶正電的氨基酸(例如E1P)取代E1，可以進一步增加N-末端的電荷。一些優(yōu)選的肽延伸部分為SPIRR,RP(-E),SPIRPRP(-E),SPPRRP(-E)和SPIRPRP(-E)。肽延伸部分可以包括通過二硫鍵與所述多肽中的第二個C(或是存在于立撲萊斯中的C或是通過取代引入的C)相連的C(半胱氨酸)，例如與E239C相連的SPPCGRRP(-E),SPCRPR,SPCRPRP(-E),SPPCGRRPRRP(-E),SPPNGSCGRRP(-E),SPPCRRRP(-E)或SCIRR。這樣的變體可能具有改善的穩(wěn)定性。此外，可以使用在WO97/04079和WO97/07202中描述的任何肽延伸部分。在第90-101位和E210上的氨基酸本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于在陰離子洗滌劑中良好的首次洗滌性能而言，氨基酸E210必須是帶負電的。因此，E210可以不改變或者可以進行E210D/C/Y的取代、特別是E210D的取代。脂肪酶可以包括一個在第90-101位(特別是第94-101位)之任一位置上(例如在D96和/或E99的位置上)的帶負電的氨基酸。此外，脂肪酶可以包括一個在N94位置上的電中性的或帶負電的氨基酸，即N94(電中性的或帶負電的)，例如N94N/D/E。而且，脂肪酶可以在90-101(特別是94-101)區(qū)域中具有負的或者中性的凈電荷，即帶負電的氨基酸的數(shù)目等于或大于帶正電的氨基酸的數(shù)目。因此，該區(qū)域可以未從立撲萊斯進行改變，其具有兩個帶負電的氨基酸(D96和E99)和一個帶正電的氨基酸(K98)并且在第94位上具有一個電中性的氨基酸(N94)，或者該區(qū)域可以通過一個或多個取代加以修飾。另一方面，三個氨基酸N94,N96和E99中的兩個可以具有負的或者未改變的電荷。因此，所有的三個氨基酸都可以是沒有改變的或者可以通過保守或帶負電的取代而改變，即N94(電中性的或帶負電的)、D(帶負電的)和E99(帶負電的)。例子為N94D/E和D96E。而且，可以取代三個之中的一個以增加電荷，即N94(帶正電的)、D96(電中性的或帶正電的)或E99(電中性的或帶正電的)。例子為N94K/R,D96I/L/N/S/W或E99N/Q/K/R/H。用帶負電的氨基酸取代電中性的氨基酸(N94D/E)可以改善陰離子洗滌劑的性能。用帶正電的氨基酸取代電中性的氨基酸(N94K/R)可以在陰離子洗滌劑和陰離子/非離子洗滌劑(例如具有占總表面活性劑的40-70％的陰離子表面活性劑的洗滌劑)兩者中提供具有良好性能的變體脂肪酶。其它位置上的氨基酸本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用電中性的或帶負電的氨基酸取代R209(例如R209P/S)可以改善陰離子洗滌劑的性能，并且取代Q249R/K/H可以改善陰離子和陰離子/非離子洗滌劑兩者的性能。G91可以是未改變的或者可以用另一種電中性的氨基酸取代，例如G91G/A/S/T。K98可以是未改變的，或者它可以被電中性的或帶負電的氨基酸取代。N11,D137,E239可以被選擇性地取代，例如N11E/G/K/Q/R/T,D137C/E/G/N/V/Y,E239D/G/V。可以將取代E99N+N101S的組合用于引入一個糖基化位點。取代的組合通過把如上所述的肽延伸部分與下列各組取代之一組合，可以獲得在陰離子洗滌劑中具有良好性能的脂肪酶變體A．G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/YB．G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96D/E/C/Y+E99N+N101SC．G91G/A/S/T+N94R/K/H+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/YD．G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96(電中性或帶正電的)+E99E/D/C/YE．G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96D/E/C/Y+E99(電中性或帶正電的)F．A-E之任一與Q249R的組合G．A-F之任一與R209(電中性或帶負電的)的組合H．A-G之任一與K98(電中性或帶負電的)的組合I．以上組合之任一進一步與前面提到的任一取代的組合。通過把如上所述的肽延伸部分與下列各組取代之一組合，可以獲得在陰離子和陰離子/非離子洗滌劑兩者中具有良好性能的脂肪酶變體G91A+E99R/K/H+Q249R/K/HG91A+N94R/K/H+Q249R/K/HG91A+D96(電中性或帶正電的)+Q249R/K/H。用于氨基酸修飾的命名法本文用于定義突變的命名法基本上如WO92/05249所述。因此，E99N表示用N取代第99位上的E。D96I/L/N/S/W表示用I,L,N,S或W取代第96位上的D。G91G/A/S/T表示G91可以未進行改變(G)或者可以被A,S或T所取代。D96X表示用任意其它的氨基酸取代D96。N94(電中性或帶負電的)表示用任意的帶負電的或帶正電的氨基酸取代N94。SPCRPR表示在N-末端連接了肽延伸部分SPCRPR(即E1)。ElSPPCGRRP或SPPCGRRP(-E)表示E1P的取代以及將肽延伸部分SPPCGRRP連接到取代的N-末端上。氨基酸的分組在本說明書中，根據(jù)其在pH10下所帶的電荷，將氨基酸劃分為帶負電、帶正電或者電中性這幾類，這是本發(fā)明洗滌劑的特征。因此，帶負電的氨基酸為E、D、C和Y，特別是E和D。帶正電的氨基酸為R、K和H，特別是R和K。電中性氨基酸為G、A、V、L、I、P、F、W、S、T、M、N、Q。用同一小組(帶負電的，帶正電的或電中性)中的另一種氨基酸的取代被稱作保守取代?？梢园央娭行园被釀澐譃槭杷?G、A、V、L、I、P、F、W)和親水的(S、T、M、N、Q)。氨基酸的同一性本發(fā)明的脂肪酶變體與立撲萊斯之間具有至少90％(優(yōu)選大于95％或大于98％)的氨基酸同一性。對本發(fā)明而言，N-末端的肽延伸部分在計算氨基酸的同一性時不予考慮。通過本領域中公知的計算機程序，比如GCG程序包中提供的缺口(gap)程序(威斯康星軟件包程序手冊，第8版，1994年8月，遺傳學計算機小組，575科學道，麥迪遜市，威斯康星州，美國53711)(Needleman,S.B.與Wunsch,C.D.,(1970)《分子生物學雜志》48:443-45)，使用具有用于多肽序列比較的下列設置的缺口程序，可以適當?shù)販y定同一性的程度缺口產(chǎn)生罰分(penalty)為3.0且缺口延伸罰分為0.1。本發(fā)明的脂肪酶變體優(yōu)選包括肽的添加部分以及0-10個(特別是2-6個)氨基酸的取代。生產(chǎn)變體脂肪酶的方法正如以上所指出的那樣，本發(fā)明提供了一種由親代脂肪酶生產(chǎn)變體脂肪酶的方法。親代脂肪酶可以是立撲萊斯或其變體，例如具有諸如下列取代的變體E99N+N101S+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，E99K+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，E99N+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)，變體脂肪酶包括一個肽延伸部分和氨基酸的取代。以上描述了N-末端的肽延伸部分(可以選擇性地與E1的取代組合)。將要被取代的氨基酸可以位于對應于第90-101位(優(yōu)選第94-101位)的區(qū)域中。另一方面，將要被取代的氨基酸可以位于第90-101位之任一位置的6埃范圍內(nèi)之脂肪酶三維結(jié)構(gòu)的表面上，例如在第83,85-115,118,147,154,174,176-178,181,202-203,206-208,211-213,255或258位上的氨基酸。優(yōu)選的氨基酸為那些位于90-101區(qū)域中的氨基酸或者緊鄰這些氨基酸的氨基酸，即與所述區(qū)域中的氨基酸直接接觸的氨基酸。這樣的氨基酸為D102,S105,S115,D111,G112,G106,C107,R108,N178,G212,F211,P208,P207,L206,I202。特別感興趣的氨基酸為R108,D111,S115,N178,F211,G212,G112，尤其是R108和D111。特別感興趣的是用帶有不同電荷的氨基酸進行取代，例如用E、D、Y或C取代電中性的或帶正電的氨基酸；用R、K或H取代電中性或帶負電的氨基酸；或者用L、I、V、A、N或Q取代帶正電的或帶負電的氨基酸。通過本領域中公知的方法、例如定點誘變或者局部隨機誘變，可以進行DNA序列的修飾。DNA序列通過在編碼親代脂肪酶的cDNA或基因組DNA序列中引入有關的突變，可以適當?shù)刂苽涑鼍幋a脂肪酶變體的DNA序列。根據(jù)眾所周知的技術、比如那些由Sambrook等人公開的技術，可以引入突變。DNA構(gòu)建體可以進一步包括為實現(xiàn)修飾的DNA序列的表達所必須的控制序列?？刂菩蛄锌梢允且环N合適的啟動子序列，即一種由用于表達所述核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導首次洗滌脂解酶表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任意的核酸序列，并且可以從編碼與宿主細胞或同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得?？刂菩蛄幸部梢允且环N合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即一種由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作地連接到編碼脂肪酶變體的核酸序列的3’端。終止子序列可以是編碼脂肪酶變體的核酸序列的天然序列或者可以從外源來源獲得。控制序列也可以是一種合適的前導序列、一種聚腺苷酸化序列、一種信號肽編碼序列或是任意其它的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列。此外，DNA構(gòu)建體可以包括一種編碼生產(chǎn)呈活性形式的脂肪酶變體所必須的因子的DNA序列，即所謂的脂肪酶調(diào)制子或陪伴分子(參見WO91/00908,WO93/13200和EP331376)。表達載體本發(fā)明的表達載體可以包括用于正確表達編碼本發(fā)明脂肪酶變體的DNA序列所必須的如上所述的控制序列。表達載體的選擇將取決于例如在生產(chǎn)所述脂肪酶中打算采用的宿主細胞。例如在WO91/00908,WO93/13200,EP331376和WO95/14783中公開了合適的表達載體。宿主細胞宿主細胞可以是單細胞微生物或是非單細胞微生物。宿主細胞可以是真核生物并且優(yōu)選真菌，即酵母細胞或絲狀真菌細胞。真菌宿主細胞優(yōu)選是絲狀真菌細胞，諸如支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬、草根霉屬、Tolypocladium和木霉屬的細胞，特別是曲霉屬或鐮孢屬的細胞，例如米曲霉、黑色曲霉、臭曲霉、日本曲霉、尖孢鐮孢或禾谷鐮孢的細胞。真菌細胞可以通過涉及原生質(zhì)體的形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和細胞壁的再生的方法以本身公知的方式進行轉(zhuǎn)化。這樣的方法在本領域中是眾所周知的。宿主細胞優(yōu)選在一個或多個蛋白酶或者其它酶處理方式方面是缺陷的。蛋白酶缺陷型宿主細胞是本領域中眾所周知的。宿主細胞優(yōu)選用包括本發(fā)明核酸序列的載體進行轉(zhuǎn)化，接下來將所述載體整合到宿主染色體中。轉(zhuǎn)化起到將載體引入宿主細胞中的作用，從而保持載體為染色體的整合體或者為自我復制的染色體外的載體。整合可以有一個優(yōu)點，這是因為所述核酸序列可以穩(wěn)定地保持在細胞中。將載體整合到宿主染色體中可以通過同源或者非同源重組來進行。脂肪酶的生產(chǎn)本發(fā)明的變體脂肪酶以及本發(fā)明的DNA序列、本發(fā)明的表達載體、本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以通過本領域眾所周知的方法來制備，這些方法例如為在WO97/04079和WO97/07202或在本說明書實施例中所述的方法。采用本領域公知的方法，可以在適合于生產(chǎn)脂肪酶變體的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞。例如，可以通過在合適的培養(yǎng)基中以及在使得脂肪酶變體表達和/或分離的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)、在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。采用本領域公知的步驟(參見例如針對細菌和酵母的參考文獻；Bennett,J.W.與LaSure,L.編輯，《真菌中更多的基因操作》學術出版社，CA,1991)，在包括碳和氮源以及無機鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應商那里得到或者可以根據(jù)出版的組成來制備(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中記載的)。如果脂肪酶變體被分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中的話，那么所述變體可以從培養(yǎng)基中直接回收。如果變體不被分泌的話，則從細胞裂解物中回收它。得到的脂肪酶變體可以通過本領域公知的方法回收。例如，變體可以通過常規(guī)的步驟從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，其中包括但卻不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可以通過多種層析步驟進一步純化回收的變體，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。本發(fā)明的脂肪酶變體可以通過多種本領域公知的步驟純化，其中包括但卻不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排阻)、電泳步驟(例如制備等電聚焦(IEF))、差別溶解度(例如硫酸銨沉淀)或萃取(例如參見《蛋白質(zhì)純化》J.-C.Janson與LarsRyden編輯，VCH出版社，紐約，1989)。洗滌劑添加劑根據(jù)本發(fā)明，所述的脂肪酶通?？梢杂米飨礈靹┙M合物中的添加劑。將這種添加劑常規(guī)地配制成無粉塵的顆粒、穩(wěn)定化的液體、漿液或被護的酶。無粉塵的顆粒例如可以如US4,106,991與4,661,452(兩者均屬于NovoIndustriA/S)中公開的那樣生產(chǎn)，并且可以選擇性地通過本領域公知的方法進行涂覆。蠟狀表面涂覆材料的例子為具有1000-20000平均分子量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化的壬基酚；其中醇含有12-20個碳原子并且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化的脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯。在GB1483591中給出了適合于通過流化床技術應用的成膜表面涂覆材料的例子。根據(jù)已確立的方法，例如可以通過添加如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸之類的多元醇來穩(wěn)定液態(tài)酶制劑。其它的酶穩(wěn)定劑是本領域眾所周知的。根據(jù)EP238,216中公開的方法可以制備被護的酶。對于含有本發(fā)明脂解酶的洗滌劑添加劑而言，合適的活性范圍為每克添加劑有0.01-100毫克純的酶蛋白。洗滌劑組合物本發(fā)明的洗滌劑組合物例如可以配制成包括洗衣添加劑組合物在內(nèi)的手洗和機洗洗滌劑組合物和適用于預處理臟污的織物的組合物、漂洗時添加的織物柔軟劑組合物、以及通常用于家庭堅硬表面清潔操作和洗碗操作的組合物。本發(fā)明的洗滌劑組合物包括本發(fā)明的脂肪酶和表面活性劑。此外，它可以選擇性地包括助洗劑、另一種酶、抑泡劑、柔軟劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑以及其它在洗滌劑中常規(guī)采用的組分，比如污垢懸浮劑、污垢釋放劑、熒光增白劑、研磨劑、殺菌劑、晦暗抑制劑、著色劑、和/或包膠的或者未包膠的香料。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或顆粒的形式。pH(在使用濃度下的水溶液中測量的)通常為中性或堿性，例如在7-11的范圍內(nèi)，特別是9-11。本發(fā)明的顆粒組合物也可以呈“壓縮的形式”，即它們可以比常規(guī)的顆粒洗滌劑具有高出很多的密度，即為550-950g/l。在洗滌劑組合物中，本發(fā)明的脂肪酶或者任選摻入洗滌劑組合物中的另一種酶通常以占組合物重量的0.00001％-2％的酶蛋白的水平摻入，優(yōu)選以占組合物重量的0.0001％-1％的酶蛋白的水平摻入、更優(yōu)選以占組合物重量的0.001％-0.5％的酶蛋白的水平摻入、甚至更優(yōu)選以占組合物重量的0.01％-0.2％的酶蛋白的水平摻入。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以包括對應于每克洗滌劑為10-50,000LU的量的脂肪酶，優(yōu)選20-5,000LU/g，例如100-1000LU/g?？梢詫⑾礈靹┤芙庠谒幸员惝a(chǎn)生含有脂解酶的洗液，其中所述脂解酶的量相當于每升洗液為25-15,000LU，特別是100-5000LU/1，例如為300-2000LU/1。脂肪酶蛋白的量可以為0.001-10mg/g洗滌劑或者為0.001-100mg/l洗液。更具體地講，可以把本發(fā)明的脂肪酶摻入在WO97/04079,WO97/07202,W097/41212,PCT/DKWO98/08939以及WO97/43375中所述的洗滌劑組合物中。表面活性劑體系表面活性劑體系可以包括非離子、陰離子、陽離子、兩性和/或兩性離子表面活性劑。如上所述，本發(fā)明的脂肪酶變體特別適合于包括陰離子與非離子表面活性劑之組合的洗滌劑，其中陰離子表面活性劑按重量計占70-100％而非離子表面活性劑按重量計占0-30％，特別是占80-100％的陰離子表面活性劑和占0-20％的非離子表面活性劑。正如進一步描述的那樣，本發(fā)明一些優(yōu)選的脂肪酶也適用于包括40-70％陰離子表面活性劑和30-60％非離子表面活性劑的洗滌劑。表面活性劑通常以0.1％-60％(重量)的水平存在，例如1％-40％，特別是10-40％，優(yōu)選約3％-約20％(重量)。下面描述了表面活性劑的一些例子。陰離子表面活性劑優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽、烷基乙氧基硫酸鹽、線性烷基苯磺酸鹽以及這些物質(zhì)的混合物。烷基硫酸鹽表面活性劑為通式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選為具有C10-C20烷基成分的烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基，并且M為氫或陽離子，例如堿金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰)，或者為銨或取代的銨。烷基苯磺酸鹽是適合的，尤其是其中所述的烷基優(yōu)選含有10-18個碳原子的線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)。合適的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化的硫酸鹽，其為通式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R為未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基成分的羥烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥烷基；A為乙氧基或丙氧基單元；m大于0，通常介于大約0.5與大約6之間，更優(yōu)選介于大約0.5與大約3之間；并且M為氫或陽離子，所述陽離子例如可以為金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代的銨陽離子。在本文中考慮采用烷基乙氧基化的硫酸鹽以及烷基丙氧基化的硫酸鹽。取代的銨陽離子的具體例子包括甲基銨陽離子、二甲基銨陽離子、三甲基銨陽離子和季銨陽離子(諸如四甲基銨陽離子和二甲基哌啶鎓陽離子)以及來源于烷基胺的那些物質(zhì)(諸如乙胺、二乙胺、三乙胺)，其混合物等。其它的陰離子表面活性劑包括肥皂的鹽(包括例如鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和取代的銨鹽，諸如單乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的鹽)，C8-C22伯鏈烷磺酸鹽或仲鏈烷磺酸鹽，C8-C24烯烴磺酸鹽，以及通過堿土金屬檸檬酸鹽之熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化多羧酸。非離子表面活性劑所述表面活性劑可以包括烷基酚的聚亞烷基氧化物(polyalkyleneoxide)(例如聚環(huán)氧乙烷)的縮合物。所述的烷基可以含有大約6個至大約14個碳原子，所述烷基為直鏈或支鏈的。環(huán)氧乙烷可以以等于每摩爾烷基酚為大約2至大約25摩爾的量存在。所述表面活性劑也可以包括伯脂肪醇和仲脂肪醇與大約1至大約25摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。脂肪醇的烷基鏈可以是直鏈的或是支鏈的，并且通常含有大約8個至大約22個碳原子。此外，非離子表面活性劑可以包括烷基酚的聚環(huán)氧乙烷的縮合物、伯脂肪醇和仲脂肪醇與大約1至大約25摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖及其混合物。最優(yōu)選的是具有3-15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個乙氧基的C8-C18醇的乙氧基化物(優(yōu)選平均為C10)及其混合物。優(yōu)選的非離子表面活性劑為醇乙氧基化物、醇酚乙氧基化物、多羥基脂肪酸酰胺、烷基多聚葡糖苷以及這些物質(zhì)的混合物。助洗劑體系本發(fā)明的組合物可以進一步包括一種助洗劑體系。任何常規(guī)的助洗劑體系都適用于本文，其中包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、聚羧酸酯和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸(EDTA)這樣的材料、諸如氨基多膦酸鹽(aminopolyphosphonate)這樣的金屬離子螯合劑。在本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。合適的助洗劑可以是無機離子交換材料，通常為無機水合的硅鋁酸鹽材料，更具體地為水合的合成沸石，比如水合沸石A、X、B、HS或MAP。洗滌助洗劑鹽通常以占組合物重量的5％-80％的量包含在組合物中。對液態(tài)洗滌劑而言，助洗劑的優(yōu)選水平為5％-30％。其它酶除了本發(fā)明的脂肪酶之外，洗滌劑組合物還可以包括其它提供清潔效果和/或織物護理益處的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。合適的蛋白酶包括那些動物、植物或微生物來源的酶。微生物來源是優(yōu)選的。也包括經(jīng)化學或基因修飾的變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶類蛋白酶。堿性蛋白酶的例子為枯草蛋白酶，尤其是那些來源于芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279中進行了描述)及其變體。漂白劑洗滌劑組合物(尤其是在粒狀洗滌劑的情況下)也可以包括漂白劑，例如氧漂白劑或鹵素漂白劑。氧漂白劑可以是如過硼酸鹽(例如PB1或PB4)或過碳酸鹽之類的過氧化氫釋放劑，或者例如可以是過羧酸。顆粒大小可以為400-800微米。當存在時，氧漂白化合物通常以大約1％至大約25％的水平存在?？梢詫⑦^氧化氫釋放劑與漂白活化劑結(jié)合使用，所述活化劑如四-乙?；叶?TAED)、壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS)、3,5-三甲基-hexsanol氧基苯磺酸鹽(ISONOBS)或五乙酰基葡萄糖(PAG)。鹵素漂白劑例如可以為次鹵酸鹽(hypohalite)漂白劑，例如三氯異氰脲酸、二氯異氰脲酸的鈉鹽和鉀鹽以及N-氯代和N-溴代鏈烷基磺酰胺。常常以占最終產(chǎn)品重量的0.5-10％的量加入這類材料，優(yōu)選為1-5％(重量)。洗滌劑類型陰離子型洗滌劑A通過混合下列成分(％重量)來制備A型粒狀洗滌劑(陰離子占總表面活性劑的90％，溶液中的pH為10.2)8.7％的陰離子表面活性劑LAS(C10-C13)7.4％的陰離子表面活性劑AS(C12)1.8％的非離子表面活性劑脂肪醇乙氧基化物(C12-C15,7EO)30％的沸石P(WessaliteP)18％的碳酸鈉5％的檸檬酸鈉17％的硫酸鈉0.3％的羧甲基纖維素6.5％的過碳酸鈉一水合物2.1％的NOBS陰離子型洗滌劑B通過混合下列成分(％重量)來制備第二種型式的粒狀洗滌劑(陰離子占總表面活性劑的79％，溶液中的pH為10.2)27％的陰離子表面活性劑AS(C12)7％的非離子表面活性劑(C12-C15,7EO)60％的沸石P(WessaliteP)5％的碳酸鈉0.6％的SokalanCP51.5％的羧甲基纖維素陰離子/非離子型洗滌劑通過把下列成分添加到溶于純水中的3.2mMCa2+/Mg2+(5:1)中，制備一種型式的洗滌劑溶液(陰離子占總表面活性劑的32％,pH10.2)0.300g/l的烷基硫酸鹽(AS；C14-16)；0.650g/l的醇乙氧基化物(AEO；C12-14,6EO)；1.750g/l的沸石P0.145g/l的Na2CO30.020g/l的SokalanCP50.050g/l的CMC(羧甲基纖維素)材料與方法方法脂肪酶的活性(LU)通過采用阿拉伯樹膠作乳化劑乳化甘油三丁酸酯來制備脂肪酶的底物。使用pH靜態(tài)法在pH值為7時測定脂肪酶的活性。將1個單位的脂肪酶活性(LU)定義為每分鐘釋放出1微摩爾脂肪酸所需的量。定點誘變?yōu)榱藰?gòu)建立撲萊斯酶的變體，可以根據(jù)制造商的說明使用商業(yè)試劑盒、Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒。編碼所述立撲萊斯酶的基因位于pAHL上。根據(jù)制造商的說明，通過使用引物7258(SEQIDNO:1)將pAHL的氨芐青霉素基因的ScaI位點改變成MluI位點，從而改變了在氨芐青霉素抗性基因中發(fā)現(xiàn)的并用于切入到MluI位點的ScaI位點。然后，將包括所述立撲萊斯基因的pAHL載體用作DNA聚合酶以及寡核苷酸7258和7770(SEQIDNO:2)的模板，從而改變了在立撲萊斯基因中發(fā)現(xiàn)的ScaI位點并且沒有改變所述氨基酸序列的位點。通過添加包括所需突變的合適的寡核苷酸，將所需的突變(例如引入半胱氨酸殘基)引入到所述的立撲萊斯基因中。實施例實施例1脂肪酶變體的構(gòu)建將如上所述的定點誘變用于構(gòu)建攜帶有編碼立撲萊斯變體1S、E239C、Q249R的基因的質(zhì)粒。使用了下列引物。將引物106659(SEQIDNO:3)用于引入E99N,N101S。將引物101782(SEQIDNO:4)用于引入SPPCGRRP(-E)。將引物9639(SEQIDNO:5)用于引入E239C。將引物8829(SEQIDNO:6)用于引入Q249R。通過測定整個基因的序列驗證了突變。將得到的質(zhì)粒命名為pEVi1163，并且在圖1中顯示出限制圖。曲霉屬載體pCaHj483的構(gòu)建由下列片段構(gòu)建出圖2中所示的曲霉屬載體pCaHj483a)用EcoRI和XbaI切割的載體pToC65(WO91/17243)。b)來自攜帶amdS基因的構(gòu)巢曲霉的2.7kbXbaI片段(C.M.Corrick等人《基因》53(1987),63-71)。把amdS基因用作真菌轉(zhuǎn)化中的選擇標記。已經(jīng)修飾了amdS基因，以便破壞掉在該基因中正常存在的BamHI位點。通過使用SEQIDNO:7中所示的引物引入沉默點突變，已經(jīng)實現(xiàn)了這一過程。c)攜帶黑色曲霉NA2啟動子的0.6kbEcoRI/BamHI片段，所述啟動子融合到編碼構(gòu)巢曲霉tpi基因的mRNA5’非翻譯端的序列的60bpDNA片段上。通過PCR，從融合到60bptpi序列上的質(zhì)粒pNA2(EP-B-O383779)中分離出NA2啟動子。編碼60bptpi序列的引物具有SEQIDNO:8中所示的序列。d)攜帶黑色曲霉葡糖淀粉酶轉(zhuǎn)錄終止子的675bp的XbaI片段。該片段是從質(zhì)粒pICAMG/Term中分離出來的(EP238023，申請?zhí)枮镋P87103806.3的申請)。將片段c的BamHI位點通過pIC19R接頭與位于片段d上轉(zhuǎn)錄終止子之前的XbaI位點相連(BamHI至XbaI)。表達質(zhì)粒pCaHj521的構(gòu)建用BamHI和SalI消化脂肪酶變體質(zhì)粒pEVi1163，并且分離出所得的編碼脂肪酶變體的片段。用BamHI和XhoI消化pCaHj483，并將大的載體片段(6757)連接到脂肪酶片段上。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細胞，并且分離出攜帶有預期質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。將該質(zhì)粒命名為pCaHj521。pCaHj521轉(zhuǎn)化到JaL228中米曲霉JaL228(PCT/DK97/00037)為缺失了堿性蛋白酶和中性金屬蛋白酶I的米曲霉IFO4177。采用如在專利EP0531372B1中所述的在乙酰胺上的選擇，用pCaHj521轉(zhuǎn)化該菌株。轉(zhuǎn)化體經(jīng)孢子再分離兩次。測試來自各轉(zhuǎn)化體第二次再分離的孢子用于小規(guī)模發(fā)酵(搖瓶和微量滴定皿)中的脂肪酶的生產(chǎn)。實施例2陰離子洗滌劑中的首次洗滌性能在陰離子洗滌劑中測試本發(fā)明的多種變體。實驗條件如下設備恒溫滌垢儀(Terg-O-tometer)方法1個循環(huán)的洗滌，接下來為系列干燥洗液1000ml/燒杯樣品7個(棉織品類型#400)樣品(9*9cm)/燒杯污物用蘇丹紅染色的豬油(0.75mg蘇丹紅/g豬油)將加熱到70℃的50ml豬油/蘇丹紅涂到每個樣品的中心。在涂了污物后，在烘箱中于75℃下將樣品加熱25分鐘。在洗滌前在室溫下儲存過夜。水1.07mMCa2+/Mg2+(5:1)～6°dH洗滌劑1.4g/l市售的Tidew.Bleach脂肪酶濃度0.1000LU/l洗滌時間12分鐘溫度25℃漂洗在流動的自來水中漂洗15分鐘干燥在室溫下(～20℃,30-40％RH)過夜評價在MachbethColoreye7000反射計中在460nm下測量反射度。以△R的形式給出結(jié)果，△R(△反射度)=在含有脂肪酶的洗滌劑中洗滌的樣品的反射度-在不含脂肪酶的洗滌劑中洗滌的樣品的反射度。<tablesid="table1"num="001"><table>突變N-末端△RN94KSPPRRP(-E)3N94K+Q249RSPPRRP(-E)4G91A+D96N+E99K+Q249RSPIRPRP(-E)3G91A+D96E+E99K+Q249RSPIRPRP(-E)3G91A+D96W+Q249RSPIRPRP(-E)3G91A+E99K+Q249RSPIRPRP(-E)4E239CSPPCGRRP(-E)3S83T+N94K+D96L+E239C+Q249RSPCRPRP(-E)3E99N+N101S+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)4E99K+Q249RSPIRPRP(-E)2G91A+Q249RSPIRPRP(-E)4G91A+E99KSPIRPRP(-E)4E99N+N101S+E239CSPPCGRRP(-E)4G91A+E99N+N101S+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)3S83T+E99N+N101S+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)5E99N+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)3N101S+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)2D96S+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E),3N94S+D96L+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)3E99K+E239C+Q249RSPPCGRRP(-E)3Q249RSPIRPRP(-E)3K98D+E99K+Q249RSPIRPRP(-E)3E99K+D137E+Q249RSPIRPRP(-E)4*)E99K,R209P,Q249RSPIRPRP(-E)2E99K,R209S,Q249RSPIRPRP(-E)3***)</table></tables>*特殊的洗滌條件1250LU/l**特殊的洗滌條件30℃，20分鐘的洗滌***特殊的洗滌條件500LU/l為了進行比較，在相同的條件下測試下列根據(jù)WO97/07202的脂肪酶變體現(xiàn)有技術用E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R修飾的立撲萊斯結(jié)果顯示出在1000LU/l的現(xiàn)有技術脂肪酶變體中△R=1.3。因此，結(jié)果清楚地表明脂肪酶變體在主要含陰離子表面活性劑(占總表面活性劑的80％以上)的洗滌劑中具有改善的首次洗滌效果。實施例3首次洗滌效果的比較試驗如下所述，將本發(fā)明的脂肪酶變體與WO97/07202中現(xiàn)有技術的脂肪酶變體進行比較本發(fā)明用E1SPPCGRRP+E99N+N101S+E239C+Q249R修飾的立撲萊斯現(xiàn)有技術用E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R修飾的立撲萊斯。使用1250或12,500LU/l，以與實施例2相同的方式在市售的美國洗滌劑(Tide)中測試所述的兩種變體。結(jié)果如下結(jié)果表明在各種情況下，本發(fā)明的變體都比現(xiàn)有技術的變體具有更好的在陰離子洗滌劑中的首次洗滌效果。實施例4各種洗滌劑中的首次洗滌性能所述的脂肪酶變體為在實施例1中制備的具有E1SPPCGRRP+E99N+N101S+E239C+Q249R修飾的立撲萊斯。在與實施例2相同的條件下測試下列的兩種洗滌劑陰離子洗滌劑水1.07mMCa2+/Mg2+(5:1)～6°dH洗滌劑1.4g/l市售的Tidew.Bleach立撲萊斯的濃度0,800,1600,3200,6400,12800LU/l洗滌時間12分鐘溫度30℃陰離子/非離子洗滌劑水3.2mMCa2+/Mg2+(5:1)～18°dH洗滌劑3.6g/l市售的ArielFutur.立撲萊斯的濃度0,800,1600,3200,6400,12800LU/l洗滌時間20分鐘溫度30℃以上的結(jié)果表明所述的脂肪酶變體在含有80％以上的陰離子表面活性劑的洗滌劑與含有大約等量的陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑的洗滌劑兩者中都具有良好的首次洗滌性能。實施例5洗滌劑溶液中的穩(wěn)定性為了評價所述脂肪酶變體在洗滌劑溶液中的穩(wěn)定性，測定在培養(yǎng)后的剩余活度。測試了具有高含量(＞80％)的陰離子表面活性劑的兩種洗滌劑一種市售的美國洗滌劑(1.4g/l的Tidew.BleachHDP)和一種日本洗滌劑(0.5g/l的SuperCompactTop)。還測試了含有幾乎等量的陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑的洗滌劑一種市售的歐洲洗滌劑(5g/l的ArielFuturHDP)。將各種洗滌劑的溶液加熱到85℃5分鐘，以滅活所述的酶。將洗滌劑溶液冷卻到室溫并調(diào)節(jié)pH至pH10.0。在5ml的體積中添加純化的脂肪酶至濃度約為10LU/ml，并將該溶液分成兩個部分a)一部分用于立即測定活度(參照)，以及b)一部分用于在30℃下培養(yǎng)30分鐘(樣品)。從溶液a)和b)中取出100μl的樣品(在迅速冷卻的過程中)用于通過上述LU方法重復測定活度。將培養(yǎng)后的剩余活性計算為樣品中的活性表面活性劑洗滌劑剩余活度主要為陰離子美國65％主要為陰離子日本＞90％陰離子+非離子歐洲91％b)相當于樣品a)中的活度。結(jié)果如下在40℃下采用歐洲洗滌劑溶液的類似實驗顯示出在20分鐘后有61％的剩余活度。結(jié)果表明所述的脂肪酶變體在主要含陰離子表面活性劑的洗滌劑溶液與含有幾乎等量的陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑的洗滌劑溶液兩者中都是相當穩(wěn)定的。序列表<110>NovoNordiskA/S<120>脂肪酶變體<130>5469-WO<140><141><160>8<170>PatentIn2.0版<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物7258<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>p<400>1ngaatgacttggttgacgcgtcaccagtcac31<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物7770<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>p<400>2ntctagcccagaatactggatcaaate27<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物106659<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>p<400>3ncttaactttgacttgaaaaacatatctgacatttgctcc40<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物101782<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>p<400>4nggacggccttggctagccctccgtgcggccgccggccggtctcgcaggatctgtttaac60<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物9639<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>p<400>5natatcgtgaagatatgcggcattgatgccacc33<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述P8829<220><221>修飾的堿基<222>(1)<223>p<400>6nggcggcaataaccggccgaacattccggatatccc36<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7agaaatcgggtatcctttcag21<210>8<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>8gctcctcatggtggatccccagttgtgtatatagaggattgaggaaggaagagaagtgtg60gatagaggtaaattgagttggaaactccaagcatggcatccttgc10權利要求1.一種脂肪酶，所述的脂肪酶為具有如下氨基酸序列的多肽a)所述序列與來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶之間具有至少90％的同一性；b)與所說的野生型脂肪酶相比，所述序列包括一個帶正電的與N-末端相連的肽延伸部分；c)所述序列包括一個在所說野生型脂肪酶的E210位置上的帶負電的氨基酸；以及d)所述序列包括一個在對應于所說野生型脂肪酶第90-101位的區(qū)域中的帶負電的氨基酸；以及e)所述序列包括一個在對應于所說野生型脂肪酶之N94的位置上的電中性的或帶負電的氨基酸和/或在對應于所說野生型脂肪酶第90-101位的區(qū)域中具有負的或中性的凈電荷。2.一種脂肪酶，所述的脂肪酶為具有如下氨基酸序列的多肽a)所述序列與來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶之間具有至少90％的同一性；b)與所說的野生型脂肪酶相比，所述序列包括一個帶正電的與N-末端相連的肽延伸部分；c)所述序列包括一個在所說野生型脂肪酶的E210位置上的帶負電的氨基酸；以及d)所述序列包括在所說野生型脂肪酶第N94、D96和E99位的至少兩個位置上的帶有負電或者沒有改變的電荷的氨基酸。3.權利要求1或2的脂肪酶，其中所述的肽延伸部分由1-15個氨基酸殘基(優(yōu)選4-10個)組成，并且優(yōu)選包括1,2或3個帶正電的氨基酸，優(yōu)選為1,2或3R。4.權利要求3的脂肪酶，其中所述的延伸部分為SPIRR,RP(-E),SPIRPRP(-E),SPPRRP(-E)或SPIRPRP(-E)。5.權利要求1-3之任一的脂肪酶，其中所述的延伸部分包括與所述多肽中的第二個C相連的C，優(yōu)選與E239C相連的SPPCGRRP(-E),SPCRPR,SPCRPRP(-E),SPPCGRRPRRP(-E),SPPNGSCGRRP(-E),SPPCRRRP(-E)或SCIRR。6.前述權利要求中任一的脂肪酶，所述的酶包括取代G91A,N94D/E/K/R,D96E/I/L/N/S/W,E99N/Q/K/R/H,N101S,R209P/S或Q249R/K/H。7.前述權利要求中任一的脂肪酶，所述的脂肪酶包括下列各組取代之一，所述取代可以選擇性地與Q249R/K/H和/或K98X組合a)G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y，b)G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96D/E/C/Y+E99N+N101S，c)G91G/A/S/T+N94R/K/H+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y，d)G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96(電中性或帶正電的)+E99E/D/C/Y，或e)G91G/A/S/T+N94(電中性或帶負電的)+D96D/E/C/Y+E99(電中性或帶正電的)。8.權利要求1-6之任一的脂肪酶，所述的脂肪酶包括下列各組取代之一，所述取代可以選擇性地與Q249R和/或R209(電中性或帶負電的)組合a)E99R/K/H+Q249R/K/H，b)N94R/K/H+Q249R/K/H，或c)D96(電中性或帶正電的)+Q249R/K/H。9.一種脂肪酶，所述的脂肪酶為具有下列修飾的來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的親代脂肪酶的變體a)E99N+N101S+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，b)E99K+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，或c)E99N+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)。10.一種洗滌劑組合物，所述的洗滌劑組合物包括表面活性劑和權利要求1-9之任一的脂肪酶。11.前述權利要求的洗滌劑組合物，其中所述的表面活性劑包括占總表面活性劑重量的70％以上的量的陰離子表面活性劑。12.權利要求10的洗滌劑組合物，其中所述的表面活性劑包括占總表面活性劑重量的40-70％的量的陰離子表面活性劑和占總表面活性劑重量的30-60％的量的非離子表面活性劑，所述的脂肪酶為權利要求8或9的脂肪酶。13.權利要求10-12之任一的洗滌劑組合物，所述的洗滌劑組合物包括10-40％(重量)的表面活性劑，優(yōu)選包括40-70％的助洗劑，并且當以0.5-5g/l溶解于水中時優(yōu)選具有9-11的pH值。14.編碼權利要求1-9之任一的脂肪酶的DNA序列。15.攜帶前述權利要求的DNA序列的表達載體。16.含有權利要求14的DNA序列或權利要求15的表達載體的轉(zhuǎn)化的宿主細胞。17.一種生產(chǎn)脂肪酶的方法，該方法包括在有助于生產(chǎn)所述脂肪酶的條件下培養(yǎng)權利要求16的轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及從得到的肉湯中回收所述的脂肪酶。18.一種生產(chǎn)變體脂肪酶的方法，該方法包括a)選擇具有某一氨基酸序列的親代脂解酶，所述的氨基酸序列與來源于Humicolalanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶之間具有至少90％的同一性；b)修飾編碼所述親代脂肪酶的核酸序列以產(chǎn)生編碼變體脂肪酶的核酸，所述的變體脂肪酶包括在N-末端的肽延伸部分以及在如下位置上的氨基酸的取代ⅰ)在對應于所說野生型脂肪酶第90-101位的區(qū)域中，或ⅱ)在所述第90-101位之任一位置的6埃范圍內(nèi)之三維結(jié)構(gòu)的表面上，c)在宿主細胞中表達所述修飾的核酸以產(chǎn)生所述的變體脂肪酶，d)測試洗滌劑溶液中所述變體脂肪酶的首次洗滌效果，所述洗滌劑溶液包括其量超過總表面活性劑重量的70％的陰離子表面活性劑，e)可以選擇性地重復步驟b-d，以及f)選擇具有改善的首次洗滌效果的變體。全文摘要具有帶電氨基酸的特定分布的立撲萊斯文檔編號C12N9/18GK1300319SQ99803019公開日2001年6月20日申請日期1999年2月17日優(yōu)先權日1998年2月17日發(fā)明者金·博爾奇,賈斯珀·文德,阿倫·斯文德森,多爾特·A·彼得森,沙姆坎特·A·帕特卡,柯爾斯滕·博杰森申請人:諾維信公司