專利名稱：熒光偏振篩選法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選基因表達(dá)系統(tǒng)，如基因文庫或體外表達(dá)系統(tǒng)中編碼生物化合物的核苷酸序列的方法。該方法利用熒光偏振(FP)特征，通過與熒光物質(zhì)反應(yīng)來檢測表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的生物化合物。熒光檢測法十分靈敏，因此適于檢測極少量的生物化合物。然而，使用熒光偏振測定法特別有用是因為該技術(shù)能夠進(jìn)行靈敏的檢測并能強有力地防止信號散射或淬滅。使用熒光偏振還能進(jìn)行均勻的篩選試驗，即不必將生物化合物和熒光物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的熒光物質(zhì)分開。
背景技術(shù)：
熒光偏振(稱為FP)現(xiàn)象是1926年發(fā)現(xiàn)地，當(dāng)時F.Perrin觀察到如果用偏振光激發(fā)熒光分子，則若分子在激發(fā)和發(fā)射之間保持不變的話，隨后發(fā)射的光在固定的平面上也是偏振的(F.Perrin“Polarisation de la lumiere de fluorescence.Vie moyene desmolecules dans L’etatexite”，Le Journal de Physique et leRadium,Tome Ⅶ,Serie Ⅵ,1926,pgs.390-401)。
直至70年代后期，熒光分子的這一特性仍未引起人們足夠的重視，這可能是因為缺乏技術(shù)上足夠精細(xì)的能測定發(fā)射的偏振光和其中的偏振變化的裝置而使其應(yīng)用有限的緣故。
1979年，H.Maeda闡明了使用FP技術(shù)監(jiān)測大的熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的蛋白酶降解過程的試驗(Maeda H.，分析生物化學(xué)，92,222-227(1979))，隨后又有人提供了類似的DNA和RNA降解試驗(Bolger R.＆Checovich W.，生物技術(shù)，17,585-589,1994；Yonemura K.＆Maeda H.，生物化學(xué)雜志，92,1297-1303,1982)。
FP在臨床免疫化學(xué)領(lǐng)域得到最廣泛的使用，在該領(lǐng)域中，已根據(jù)生物化合物與熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致的偏振變化開發(fā)出多種用于檢測特異性生物化合物的不同試驗(Checovich W.,Bolger R.＆Burke T.，熒光偏振-細(xì)胞和分子生物學(xué)的新工具，自然，375,254-256,1995)。該文獻(xiàn)還描述了FP技術(shù)的特征性要素。
EP 194472 B1描述了通過測定因水解酶降解底物導(dǎo)致的熒光偏振的變化而測定水解酶活性的方法。
Schade,S.Z等描述了在螺旋體細(xì)菌上檢測表面相關(guān)蛋白酶的活性，籍此反映細(xì)菌的病理學(xué)潛力的試驗(Schade,S.Z.,Jolley M.,Sarauer B.J.,Simonson L.G.，通過熒光偏振檢測螺旋體蛋白酶，口腔研究雜志，73,p248-248,1994)。
WO93/11249描述了將感興趣的編碼酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞并通過檢測底物瓊脂或凝膠中的清亮區(qū)域鑒定該序列的方法。
WO98/58085(公開于本申請優(yōu)先權(quán)日之后的98年12月23日)描述了通過產(chǎn)生表達(dá)文庫，(通過例如染色)將熒光底物插入細(xì)胞來篩選原核表達(dá)文庫中的生物活性(即酶)的方法。細(xì)胞產(chǎn)生的酶可與底物反應(yīng)并產(chǎn)生熒光信號，其在單細(xì)胞的基礎(chǔ)上可用于在FACS(熒光激活細(xì)胞分選)儀上分離陽性細(xì)胞。為了使該技術(shù)能夠運行，需要將底物限制在細(xì)胞實體內(nèi)，反過來說，意味著底物必須具有能插入細(xì)胞的特性。因此，該文獻(xiàn)僅公開了一種類型底物(C12-FDG)的實施例，該底物可成功插入活細(xì)胞。該文獻(xiàn)中提及的其它潛在底物是經(jīng)設(shè)計后通過與酶反應(yīng)可導(dǎo)致強度變化的合成底物，即測定強度變化是該公開內(nèi)容的基本原理。
通過從核苷酸來源中提取DNA并制備和純化該DNA的特定片斷或其拷貝來制備基因文庫是本領(lǐng)域眾所周知的，將這些片斷或核苷酸序列插入宿主細(xì)胞(例如通過連接至質(zhì)粒中，隨后轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞)并表達(dá)所述片斷的技術(shù)也是眾所周知的。在體外系統(tǒng)中表達(dá)核苷酸序列也是本領(lǐng)域已知的技術(shù)。發(fā)明簡述
篩選編碼所需生物化合物的核苷酸序列經(jīng)常需要將生物化合物與通過與生物化合物反應(yīng)而發(fā)生可測變化的物質(zhì)接觸。通常有很多這種物質(zhì)可供本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇，但必須選擇與在想達(dá)到的真正的工業(yè)應(yīng)用中可與生物化合物反應(yīng)的物質(zhì)相類似的物質(zhì)。當(dāng)生物化合物為酶時，選擇在篩選過程中與感興趣的酶具有高特異性的真正的底物，一個優(yōu)點是在篩選過程中發(fā)現(xiàn)的新酶很可能在想達(dá)到的工業(yè)應(yīng)用中也能較好地發(fā)揮作用。然而，選擇低分子量，低特異性的合成底物可使篩選過程中產(chǎn)生大量假陽性命中，即酶與合成底物能較好地反應(yīng)，但與想達(dá)到的工業(yè)應(yīng)用中真正的底物的反應(yīng)情況卻較差?，F(xiàn)有技術(shù)未曾教導(dǎo)在高物料流通量的核苷酸序列篩選方法中如何獲得上述優(yōu)點。
然而，我們發(fā)現(xiàn)了熒光偏振技術(shù)新的多方面的用途，它可提供快速，靈敏和準(zhǔn)確的工具，從核苷酸來源中篩選編碼適于工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用的生物化合物(如酶或藥物)的核苷酸序列。測定熒光分子的熒光偏振而不是熒光分子發(fā)射強度的變化為選擇模式熒光分子提供了高水平的自由度。相對于現(xiàn)有技術(shù)所述的方法，如肉眼檢測涂布于瓊脂平板上的微生物菌落周圍清亮的區(qū)域而言，使用熒光偏振還可發(fā)現(xiàn)多得多的編碼相關(guān)生物化合物的核苷酸序列。
本發(fā)明的第一方面提供了篩選編碼生物化合物的核苷酸序列的方法，所述方法包括a)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)核苷酸序列以產(chǎn)生生物化合物，b)使生物化合物與能與生物化合物反應(yīng)的熒光物質(zhì)接觸以發(fā)生反應(yīng)，c)測定熒光物質(zhì)的熒光偏振，和d)選擇熒光偏振發(fā)生變化的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明反過來還提供了生產(chǎn)生物化合物的方法，所述方法包括a)鑒定本發(fā)明的生物化合物和編碼該生物化合物的核苷酸序列，b)培養(yǎng)含有經(jīng)鑒定的核苷酸序列的微生物，c)回收生物化合物和d)任選將生物化合物配制成液體或干燥產(chǎn)物。
本發(fā)明的其它方面包括適用于篩選方法的具體熒光偏振測定法。因此，本發(fā)明提供了用于下列目的的具體方法
檢測木聚糖酶活性，所述方法包括通過用所述木聚糖酶水解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的木聚糖的熒光偏振變化。
檢測果膠酶活性，所述方法包括通過用所述果膠酶降解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的果膠的熒光偏振變化。
檢測淀粉酶活性，所述方法包括通過用所述淀粉酶水解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的淀粉，極限糊精，直鏈淀粉或支鏈淀粉的熒光偏振變化。
檢測轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，所述方法包括通過用所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將經(jīng)熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)上的谷氨酸轉(zhuǎn)移至未經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)上而測定所述經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的熒光偏振變化。
檢測木葡聚糖(xyloglucan)內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶活性，所述方法包括通過用所述木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶將經(jīng)熒光標(biāo)記的寡木葡聚糖轉(zhuǎn)移至未經(jīng)標(biāo)記的木葡聚糖而測定所述經(jīng)標(biāo)記的寡木葡聚糖的熒光偏振變化。
檢測果膠甲酯酶活性，所述方法包括通過用所述果膠甲酯酶脫甲基化測定經(jīng)熒光標(biāo)記的甲基化果膠的熒光偏振變化。
檢測阿拉伯聚糖酶活性，所述方法包括通過用所述阿拉伯聚糖酶水解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的阿拉伯聚糖的熒光偏振變化。
檢測甘露聚糖酶活性，所述方法包括通過用所述甘露聚糖酶水解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的半乳甘露聚糖的熒光偏振變化。
檢測鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性，所述方法包括通過用所述鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶水解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的熒光偏振變化。
檢測纖維素酶活性，所述方法包括通過用所述纖維素酶水解測定經(jīng)熒光標(biāo)記的纖維素或纖維素衍生物的熒光偏振變化。
本發(fā)明還包括可特別地用于本發(fā)明的篩選方法的新的熒光物質(zhì)，因此，本發(fā)明涉及下列幾個方面
熒光團(tuán)標(biāo)記的纖維素和產(chǎn)生該熒光物質(zhì)的方法。
熒光團(tuán)標(biāo)記的直鏈淀粉和產(chǎn)生該熒光物質(zhì)的方法。
熒光團(tuán)標(biāo)記的支鏈淀粉和產(chǎn)生該熒光物質(zhì)的方法。
熒光團(tuán)標(biāo)記的極限糊精和產(chǎn)生該熒光物質(zhì)的方法。
熒光團(tuán)標(biāo)記的聚半乳糖醛酸和產(chǎn)生該熒光物質(zhì)的方法。
熒光團(tuán)標(biāo)記的甘露聚糖和產(chǎn)生該熒光物質(zhì)的方法。附圖簡述


圖1圖示了篩選方法的步驟(1)=含有基因文庫的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物小瓶；(2)=轉(zhuǎn)化子的預(yù)增殖；(3)=稀釋轉(zhuǎn)化子和/或克隆；(4)=在主培養(yǎng)板的微滴孔中分離和增殖轉(zhuǎn)化子或克隆；(5)=將克隆轉(zhuǎn)移至檢測培養(yǎng)板中，對釋放的生物化合物進(jìn)行熒光偏振分析。
圖2作圖描述了表2的內(nèi)容。
圖3是與實施例3相關(guān)的結(jié)果，顯示了相對于不含淀粉酶的樣品(三角形)而言，用淀粉酶(方塊)水解經(jīng)熒光素標(biāo)記的淀粉的過程中熒光偏振的降低。
圖4是與實施例4相關(guān)的結(jié)果，顯示了相對于不含木聚糖酶的樣品(A)而言，用木聚糖酶(B)水解經(jīng)羅丹明標(biāo)記的木聚糖的過程中熒光偏振的降低。
圖5是與實施例5相關(guān)的結(jié)果，顯示了相對于不含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的樣品(2)而言，用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(1)將經(jīng)羅丹明標(biāo)記的尸胺轉(zhuǎn)移至酪蛋白的過程中熒光偏振的增加。
圖6是與實施例7相關(guān)的結(jié)果，顯示了用果膠甲酯酶(PME)使經(jīng)熒光素標(biāo)記的果膠脫甲基化，隨后在(1)加入PME和2mMCaCl2，(2)加入PME但不加入CaCl2，(3)加入2mMCaCl2，但不加入PME和(4)不加入PME和CaCl2的情況下進(jìn)行交聯(lián)的過程中熒光偏振的增加。
圖7是與實施例9相關(guān)的結(jié)果，顯示了相對于不表達(dá)果膠酶活性的宿主細(xì)胞樣品(三角形)而言，用轉(zhuǎn)化子宿主細(xì)胞表達(dá)的果膠酶(方塊)水解經(jīng)熒光素標(biāo)記的果膠的過程中熒光偏振的降低。發(fā)明詳述定義
如上文所述，本文所用術(shù)語熒光偏振被簡稱為FP。
根據(jù)FP的原理，如果熒光物質(zhì)被一束平面偏振光激發(fā)，它反過來也會發(fā)射平面偏振光。偏振的程度或發(fā)射光平面的角度與熒光分子在激發(fā)和發(fā)射時間之間移動(如旋轉(zhuǎn))多少成反比。將分子旋轉(zhuǎn)約68.5度角所花的時間定義為分子的旋轉(zhuǎn)弛豫時間。小分子的旋轉(zhuǎn)弛豫時間相對較小(約1納秒)，大分子的旋轉(zhuǎn)弛豫時間相對較大(約100納秒)。分子的旋轉(zhuǎn)弛豫時間主要取決于其體積，以致于溶液中該分子發(fā)出的熒光的偏振與分子大小直接相關(guān)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“核苷酸來源”應(yīng)被理解為任何DNA,RNA或cDNA物質(zhì)或含有DNA,RNA或cDNA的物質(zhì)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)被理解為能轉(zhuǎn)錄核苷酸序列并翻譯合成相應(yīng)的生物化合物的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)可以是細(xì)胞或體外系統(tǒng)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語基因文庫應(yīng)被理解為得自核苷酸來源的DNA或cDNA片斷。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”應(yīng)被理解為細(xì)胞，該細(xì)胞可收留和表達(dá)得自基因文庫的插入DNA或cDNA片斷。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化子”或“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”應(yīng)被理解為其中已插入得自基因文庫的DNA或cDNA片斷的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“克隆”應(yīng)被理解為細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的拷貝。核苷酸來源
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，核苷酸來源是細(xì)胞，如原核細(xì)胞，古生物細(xì)胞(archaeal cell)或真核細(xì)胞。可通過基因工程方法進(jìn)一步修飾細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬的細(xì)胞，如地衣芽孢桿菌，而優(yōu)選的真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，如人細(xì)胞，植物細(xì)胞如擬南芥，或真菌如Meribipilus gigantus。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，核苷酸來源是混合細(xì)胞群體。如下文所述，可直接從任何生物或非生物樣品，如土壤樣品，水樣品或瘤胃樣品中進(jìn)一步提取細(xì)胞的DNA或RNA。其它優(yōu)選的核苷酸來源是嗜極端環(huán)境的原核細(xì)菌，如嗜熱菌。
核苷酸來源也可以是經(jīng)常規(guī)誘變的細(xì)胞，所述誘變?nèi)缤ㄟ^UV照射細(xì)胞或如Gerhardt等(1994)所述用化學(xué)誘變劑處理細(xì)胞。
其它核苷酸來源可以是按WO97/07205所述通過體內(nèi)基因改組進(jìn)行基因修飾的細(xì)胞群體。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，核苷酸來源是在體外制備的DNA、RNA、cDNA或人工基因序列制品，所述人工基因序列可通過下列方式得到，如基因改組(如Stemmer(1994)或WO95/17413所述)，隨機誘變(如Eisenstadt E等(1994)所述)或使用PCR技術(shù)構(gòu)建(如Poulsen等(1991)所述)。表達(dá)系統(tǒng)
如上文所定義，表達(dá)系統(tǒng)是能轉(zhuǎn)錄核苷酸序列并翻譯合成相應(yīng)的生物化合物的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)可以是細(xì)胞或體外系統(tǒng)。有關(guān)體外偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的描述可參見Ohuchi等(1998)或Ellman等(1991)，它能表達(dá)核苷酸序列，如得自核苷酸來源的基因文庫。對細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)而言，細(xì)胞可以是核苷酸來源自身，如野生型細(xì)胞，或者是得自轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞群體或其克隆的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有根據(jù)本領(lǐng)域已知方法(如下文所述)制備自核苷酸來源的基因文庫。宿主細(xì)胞
根據(jù)定義的宿主細(xì)胞可以是能收留和表達(dá)得自基因文庫的核苷酸片斷的任何細(xì)胞。
優(yōu)選的宿主細(xì)胞自身不含有或表達(dá)編碼會干擾FP篩選法的生物化合物的核苷酸序列(即未經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不能顯著表達(dá)生物化合物)。該細(xì)胞特征可以是細(xì)胞的天然特征，或者通過如Christiansen等(1997)或Stoss等(1997)所述缺失所述核苷酸序列來獲得。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或真核細(xì)胞。另外，優(yōu)選的細(xì)菌細(xì)胞是ElectroMAX DH1OB(GibcoBRL/Lifetechnologies,UK)細(xì)胞或大腸桿菌種的細(xì)胞，如Diderichsen等(1990)所述的SJ2大腸桿菌。其它優(yōu)選的宿主細(xì)胞可以是芽孢桿菌菌株，如枯草芽孢桿菌或芽孢桿菌的種。優(yōu)選的真核細(xì)胞是酵母，如釀酒酵母。制備基因文庫
可使用已知方法制備基因文庫。
從細(xì)胞核苷酸來源提取DNA并制備基因文庫的方法描述于例如Pitcher等(1989),Dretzen,G等(1981),WO94/19454,3969,Diderichsen等(1990)。
由體外制備的合成核苷酸來源制備基因文庫的方法描述于Stemmer(1994)或WO 95/17413。將基因文庫插入宿主細(xì)胞
通過插入含有得自基因文庫的DNA或cDNA片斷的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例見Sambrook等，1989,Ausubel等，1995和Harwood和Cutting,1990。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，被插入宿主細(xì)胞的質(zhì)粒還含有能使轉(zhuǎn)化子對抗細(xì)菌或抗真菌劑，如抗生素具有抗性的核苷酸序列(被稱為抗生素標(biāo)記)。優(yōu)選的抗性針對的是氯霉素，四環(huán)素，卡那霉素，氨芐青霉素，紅霉素或zeocin。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，可使用WO94/19454,3969和Diderichsen等(1990)所述的賦予氯霉素抗性的pSJ1678質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化SJ2大腸桿菌宿主細(xì)胞?；蛘?，也可使用質(zhì)粒pZEro-2(Invitrogen,CA,USA)。篩選方法
如上文所述，本發(fā)明提供了篩選編碼生物化合物的核苷酸序列的方法，所述方法包括a)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)核苷酸序列以產(chǎn)生生物化合物，b)使生物化合物與能與該生物化合物反應(yīng)的熒光物質(zhì)接觸以發(fā)生反應(yīng)，c)測定熒光物質(zhì)的熒光偏振，和d)選擇熒光偏振發(fā)生變化的細(xì)胞或表達(dá)系統(tǒng)。
當(dāng)本發(fā)明的具體實施方案為體外表達(dá)系統(tǒng)(如上文所述)時，篩選方法優(yōu)選包括a)由核苷酸來源制備基因文庫，b)將文庫的基因片斷分開放在不同的容器中。c)擴增分離的基因片斷，d)體外偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯擴增的基因片斷以表達(dá)生物化合物。e)將各個獨立容器中的生物化合物或其次生樣品與熒光物質(zhì)接觸，f)將生物化合物與熒光物質(zhì)一起保溫，g)通過與生物化合物反應(yīng)以檢測熒光物質(zhì)的FP變化。
使用商購的標(biāo)準(zhǔn)裝置，如移液管或自動化的移液裝置，燒瓶，微滴板，搖床，恒溫培養(yǎng)箱等可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行可由圖1表示的步驟a-g((1)+(2)+(3)=制備基因文庫；(4)=分離，擴增和轉(zhuǎn)錄/翻譯；(5)=與熒光物質(zhì)一起保溫并檢測FP)。
通過與生物化合物反應(yīng)而發(fā)生的熒光物質(zhì)大小的變化使FP也發(fā)生了變化，通過商購的FP裝置可檢測這種變化。因此，只有在含有并表達(dá)編碼可與熒光物質(zhì)反應(yīng)的生物化合物的基因片斷或核苷酸序列的容器中才會發(fā)生FP變化(此處和下文中將稱之為“陽性命中”)。
優(yōu)選通過將文庫稀釋至能取出含有基因片斷的等分試樣的程度，優(yōu)選平均為每份樣品中含有一個基因片斷，然后將樣品轉(zhuǎn)移至不同的容器，如微滴板的孔中，即可分離文庫中的基因片斷。通過常規(guī)的PCR技術(shù)以及體外偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯擴增的基因片斷即可擴增分離的基因片斷(例見Ohuchi等(1998)p4340或Ellman等(1991)，列入本文作為參考)。進(jìn)行步驟e),f)和g)的其它優(yōu)選條件在下文細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的名下描述。
當(dāng)本發(fā)明的具體實施方案為細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(如上文所述)時，篩選方法優(yōu)選包括a)預(yù)增殖和稀釋含有核苷酸序列的細(xì)胞，b)將細(xì)胞分開放在不同的容器中，c)增殖分離的細(xì)胞以增加各個獨立的容器中每個細(xì)胞的克隆數(shù)目，d)將各個獨立容器中的細(xì)胞與熒光物質(zhì)接觸，e)將細(xì)胞與熒光物質(zhì)一起保溫，f)通過與細(xì)胞釋放的生物化合物反應(yīng)以檢測熒光物質(zhì)的FP變化。
使用商購的標(biāo)準(zhǔn)裝置，如移液管或自動化的移液裝置，燒瓶，微滴板，搖床，恒溫培養(yǎng)箱等可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行可由圖1表示的步驟a-f((1)+(2)+(3)=預(yù)增殖和稀釋；(4)=分離；(5)=與熒光物質(zhì)一起保溫并檢測FP)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，細(xì)胞的預(yù)增殖和稀釋被設(shè)計成每個體積的細(xì)胞濃度適于取出含有最佳數(shù)目的分離細(xì)胞的等分試樣。每份等分試樣中的適當(dāng)?shù)募?xì)胞平均數(shù)目為0.3-10，優(yōu)選為0.3-5，如0.3-1。
在優(yōu)選的含水培養(yǎng)基中進(jìn)行的細(xì)胞預(yù)增殖(圖1中的第一幅圖)使細(xì)胞克隆的數(shù)目增加了2至5倍。適當(dāng)?shù)谋販囟确秶鸀?0-60℃，優(yōu)選為30-50℃，如37℃，而pH維持在4-10之間，優(yōu)選為6-8。保溫時間應(yīng)能調(diào)節(jié)以滿足所需轉(zhuǎn)化子和克隆濃度的需求，優(yōu)選保溫時間為15-60分鐘，如40分鐘。
當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)為宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中的轉(zhuǎn)化子含有得自核苷酸來源的基因文庫時，也可進(jìn)行預(yù)增殖以確保可能包含在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的插入質(zhì)粒中的抗生素標(biāo)記的表達(dá)，使宿主細(xì)胞對培養(yǎng)基中的抗生素具有抗性。因此，通過在有利于表達(dá)選定類型的抗生素標(biāo)記以及確保轉(zhuǎn)化子的生存能力的條件下進(jìn)行保溫即可預(yù)增殖宿主培養(yǎng)物。
通過加入培養(yǎng)基可進(jìn)行稀釋(圖1中的第二幅圖)以確保所有細(xì)胞及其克隆都存在于稀釋的溶液中。
通過將預(yù)定的特定體積的等分試樣轉(zhuǎn)移至不同的容器，如商購微滴板的孔中即可分離細(xì)胞(圖1中的第三幅圖)。
或者，分離還包括通過按WO98/58085(列入本文作為參考)所述使用FACS儀進(jìn)行預(yù)篩選，因此，步驟b)包括下列步驟1)將熒光物質(zhì)插入細(xì)胞，所述細(xì)胞的特征在于通過與細(xì)胞內(nèi)部的生物化合物反應(yīng)而改變發(fā)射光強度，2)利用FACS儀篩選，選擇和分離發(fā)射光強度發(fā)生變化的細(xì)胞。
增殖分離的細(xì)胞以增加各個容器中的克隆數(shù)目，優(yōu)選增加至107-108個克隆/ml。如果使用的是微滴板，可將這些板稱為“主平板”。為了篩選細(xì)菌基因文庫，一般需要使用50-100塊各有96孔的主平板。使用主平板的一個優(yōu)點是可以提供活的細(xì)胞樣品供篩選，使得即使隨后的篩選條件導(dǎo)致篩選細(xì)胞死亡，也可以回過頭來找到與篩選結(jié)果相對應(yīng)的篩選細(xì)胞的活樣品。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，適當(dāng)?shù)谋販囟确秶鸀?0-60℃，優(yōu)選為30-50℃，如37℃，而pH維持在4-10之間，優(yōu)選為6-8。保溫培養(yǎng)基應(yīng)滿足細(xì)胞和克隆的營養(yǎng)需求以確保充足的生長。
當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)為宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中的轉(zhuǎn)化子含有得自核苷酸來源的基因文庫和抗生素標(biāo)記時，可適當(dāng)選擇能殺死或抑制未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。
保溫時間應(yīng)能調(diào)節(jié)以確保生長產(chǎn)生足夠數(shù)目的細(xì)胞/克隆，以適于取出含有適當(dāng)數(shù)目供篩選的克隆的等分試樣，同時在主平板中保留大量活的克隆。優(yōu)選的增殖時間為40-90小時，如48小時，具體時間取決于微生物宿主細(xì)胞的類型和增殖的條件。
當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)為含有基因文庫的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中包含抗生素標(biāo)記時，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，應(yīng)在能選擇性殺死或抑制未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)增殖，稀釋和/或增殖。優(yōu)選通過在培養(yǎng)基中加入對未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞而言為有效量的而轉(zhuǎn)化子或其克隆卻能抵抗的抗生素來達(dá)到上述目的。
通過例如移液管將細(xì)胞的等分試樣轉(zhuǎn)移至適于測定FP的微滴檢測板(圖1中的第四幅圖)中，如Bibby Sterilin有限公司，UK或DynexTechnologies,VA,USA的黑色微滴板。通過例如在每個孔中加入物質(zhì)混合物而使細(xì)胞/克隆與一種或多種具有FP特性的熒光物質(zhì)接觸。熒光物質(zhì)應(yīng)適于與所需類型的生物化合物反應(yīng)(如適于與細(xì)胞釋放的果膠酶反應(yīng)的經(jīng)熒光標(biāo)記的果膠)。生物化合物與熒光物質(zhì)之間的接觸通常發(fā)生在細(xì)胞外培養(yǎng)基中，所需條件是為了得到充足的FP反應(yīng)。當(dāng)生物化合物被限制在細(xì)胞內(nèi)部時，可裂解細(xì)胞或要不然破壞其完整性以將生物化合物釋放至培養(yǎng)基中。
將細(xì)胞、培養(yǎng)基和熒光物質(zhì)的混合物保溫以使生物化合物與熒光物質(zhì)反應(yīng)。
通過與生物化合物反應(yīng)而發(fā)生的熒光物質(zhì)大小的變化使FP也發(fā)生了變化，通過商購的FP裝置可檢測這種變化。因此，只有在含有并表達(dá)編碼可與熒光物質(zhì)反應(yīng)的生物化合物的核苷酸序列的細(xì)胞中才會發(fā)生FP變化(此處和下文中將稱之為“陽性命中”)。
可在有利于生物化合物和熒光物質(zhì)之間發(fā)生反應(yīng)的條件下進(jìn)行保溫。在優(yōu)選的實施方案中，從pH和溫度著手使熒光物質(zhì)和生物化合物之間的反應(yīng)最優(yōu)化。保溫也可在導(dǎo)致細(xì)胞死亡的極端條件下進(jìn)行(如很低的溫度(如30℃以下或20℃以下)或高溫(如60℃以上或70℃以上)，低pH(如5以下或4以下)或高pH(如9以上或10以上)，低或高離子強度，有害化合物如去污劑的存在)，這取決于需檢測何種生物化合物。例如，如果想尋找的生物化合物是熱穩(wěn)定性的化合物，即可在高溫下進(jìn)行保溫，需滿足的前提條件是只有在高溫下保持活性的生物化合物才能與熒光物質(zhì)反應(yīng)。
優(yōu)選將陽性命中鑒定為產(chǎn)生FP變化的細(xì)胞/克隆或體外表達(dá)系統(tǒng)，基于選定條件下選定熒光物質(zhì)FP背景值方差，上述陽性命中的標(biāo)準(zhǔn)偏差大于3.5。盡管存在正在克隆的宿主細(xì)胞，但由于微滴板每個孔中的內(nèi)容物非常均一，因此孔與孔之間的差異非常小(見實施例27和28)。當(dāng)使用可溶性的熒光標(biāo)記底物(如可溶性淀粉)時，每個96孔板的標(biāo)準(zhǔn)偏差一般為2至3％。然而，一些不溶于孔中的底物(如熒光標(biāo)記的直鏈淀粉和PASC)卻產(chǎn)生了較高的差異，一般為5至7％標(biāo)準(zhǔn)偏差。由于使用熒光偏振可以高度準(zhǔn)確地篩選基因文庫，此檢測法變得非常靈敏，即使在所用的檢測條件下表達(dá)水平低或比活性低，也可檢測到酶活性。
因此，可篩選細(xì)胞核苷酸來源的DNA或得自核苷酸來源并在體外表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)或通過轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的基因文庫，從中得到編碼與選定范圍的熒光物質(zhì)反應(yīng)的生物化合物的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過將檢測板置于FP裝置中并測定保溫過程中FP的變化即可實時檢測熒光物質(zhì)與生物化合物之間的反應(yīng)。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，通過測定與熒光物質(zhì)自身的背景值相比，保溫預(yù)定的一段時間之后FP的變化來檢測熒光物質(zhì)與生物化合物之間的反應(yīng)(終點測定)。
商購的裝置中附有FP檢測技術(shù)和有關(guān)新式裝置的描述，例如Jolley Consulting and Research公司，IL,USA。其它參考文獻(xiàn)例見Checovich等(1995)。
當(dāng)鑒定出陽性命中時，通過利用常規(guī)的篩選技術(shù)或重復(fù)本發(fā)明的方法可以證實發(fā)現(xiàn)的生物化合物來自單個細(xì)胞的克隆。通過在適當(dāng)?shù)沫傊桨迳蠈寺∵M(jìn)行重新劃線接種并檢測所得單菌落中的所述生物化合物即可達(dá)到上述目的。生物化合物
本發(fā)明上下文中的生物化合物可以是能在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并具有工業(yè)實用性的任何化合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，生物化合物可以是蛋白質(zhì)，多肽或肽。
優(yōu)選的生物化合物是酶，根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合學(xué)會命名委員會的推薦(1992),Academic出版社公司，1992，可將酶分為下列幾類，如氧化還原酶(EC 1.-.-.-)，轉(zhuǎn)移酶(EC 2.-.-.)，水解酶(EC 3.-.-.-)，裂合酶(EC 4.-.-.-)，異構(gòu)酶(EC 5.-.-.-)，連接酶(EC 6.-.-.-)。
所述水解酶可以是內(nèi)切-，外切-，羧基-或氨基肽酶，內(nèi)切-或外切葡聚糖酶，內(nèi)切-或外切淀粉酶，脂肪酶或酯酶。
另外，生物化合物對人或動物體還具有醫(yī)療效果，如激素或其它蛋白質(zhì)，多肽或肽，它們對人或動物的受體起作用。
其它優(yōu)選的生物化合物是細(xì)胞外的化合物，如胞外酶，即由細(xì)胞分泌或要不然輸出至細(xì)胞周圍介質(zhì)的化合物。在某些情況下，生物化合物必須是細(xì)胞外的化合物，因為當(dāng)化合物被限制在細(xì)胞內(nèi)時即不具有活性。例如，如某些蛋白酶的一些酶以無活性的前體形式被合成，例如只要位于細(xì)胞內(nèi)，即與信號肽或前肽結(jié)合使酶沒有活性。通過從細(xì)胞中輸出，進(jìn)入周圍的細(xì)胞外介質(zhì)時，信號肽被裂解下來，使酶變得有活性(Simonen和Palva(1993))。一些支鏈淀粉酶和脂肪酶在胞質(zhì)中也缺乏活性或活性降低，分泌后可被激活(Gotz等(1998)和Pugsley等(1990))。熒光物質(zhì)
本發(fā)明上下文中的熒光物質(zhì)可以是自身具有熒光特性或被熒光標(biāo)記物標(biāo)記的任何有機或生物化合物。在本發(fā)明的上下文中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從多種可能的熒光物質(zhì)中進(jìn)行選擇，因為該方法基于測定恒定熒光強度之樣品的FP，即恒定強度的發(fā)射光的偏振變化。相對于基于測定熒光物質(zhì)強度變化的方法而言，該方法具有幾個優(yōu)點ⅰ)生物化合物和熒光物質(zhì)的產(chǎn)熒光部分(熒光團(tuán))之間不必反應(yīng)，因為無需改變熒光團(tuán)的特性來改變發(fā)射光的強度，因此，在本發(fā)明的上下文中，有用的熒光物質(zhì)不限于經(jīng)設(shè)計后可通過與生物化合物反應(yīng)而改變強度的物質(zhì)(這種熒光物質(zhì)經(jīng)常含有熒光團(tuán)和淬滅組分，它們在空間上必須相隔一定的距離)。ⅱ)通過例如標(biāo)記技術(shù)依次可設(shè)計適當(dāng)?shù)臒晒馕镔|(zhì)并制備熒光物質(zhì)，所述熒光物質(zhì)與在想達(dá)到的真正的工業(yè)應(yīng)用中可與生物化合物反應(yīng)的物質(zhì)非常類似。因此，對熒光物質(zhì)被設(shè)計成例如在篩選過程中穿透細(xì)胞和留在細(xì)胞內(nèi)部沒有限制。ⅲ)熒光物質(zhì)與在想達(dá)到的真正的工業(yè)應(yīng)用中可與生物化合物反應(yīng)的物質(zhì)之間的高度相似性使得篩選方法具有特異性和多用性，即適用于多種類型的不同生物化合物。ⅳ)相對于基于測定發(fā)射光強度的方法而言，F(xiàn)P原理是提供較好的信號與噪聲比的比例測定，即干擾檢測的背景噪聲較少。ⅴ)FP檢測法是真正的均勻檢測法，也就是說無需洗滌或分離例如未反應(yīng)的熒光物質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，熒光物質(zhì)是被熒光標(biāo)記物(熒光團(tuán))標(biāo)記的有機分子。有機分子可以是多聚體、寡聚體或單體，并可進(jìn)一步被一個以上的熒光標(biāo)記物標(biāo)記。有機分子上的標(biāo)記物可以結(jié)合至有機分子上0.01-10％可供結(jié)合的位點(標(biāo)記程度)。優(yōu)選范圍為0.5-5％，如2％。熒光標(biāo)記物可通過共價鍵、離子鍵或氫鍵與有機分子結(jié)合。
有機分子優(yōu)選為蛋白質(zhì)，肽，糖蛋白，脂蛋白，單糖，多糖或寡糖，甘油三酯或核苷酸。有機分子還可用作由從細(xì)胞或基因文庫中欲篩選的核苷酸序列編碼的生物化合物的底物或抑制劑，人或動物受體，單或多克隆抗體。優(yōu)選有機分子可溶于或可分散在含水介質(zhì)中。
優(yōu)選的蛋白質(zhì)是酪蛋白，酪蛋白的衍生物，明膠，白蛋白，大豆蛋白，多克隆抗體，單克隆抗體，人受體或動物受體，如國家專利DK/97/0879或WO99/03498所述的組織因子。優(yōu)選的肽是尸胺。
優(yōu)選的多糖可以是葡聚糖，如淀粉葡聚糖(如直鏈淀粉和/或支鏈淀粉)，糊精(如極限糊精)，果膠/多聚半乳糖醛酸，纖維素(如Schulein(1997)所述的用磷酸溶脹的纖維素)或其衍生物或半纖維素。優(yōu)選的半纖維素是木葡聚糖，木聚糖，阿拉伯葡聚糖或阿拉伯聚糖。甘露聚糖(如半乳甘露聚糖)和聚半乳糖醛酸(如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖)也是有用的。
其它有用的有機分子是酚類分子，如可通過用氧化還原酶氧化而被聚合化的酚類多糖。
有機分子可被化學(xué)合成或酶促合成?；蛘呖傻米詣游铮?，植物或微生物來源，還可隨后被化學(xué)或酶促修飾和/或純化。
標(biāo)記物在350-700nm的范圍內(nèi)，如400-600nm處具有激發(fā)最大值比較合適，而發(fā)射最大值的適當(dāng)范圍為450-800nm，如500-700nm。
優(yōu)選標(biāo)記物與有機分子綴合或結(jié)合以使標(biāo)記物與有機分子和其它熒光標(biāo)記物之間的距離保持為20-50埃，不易使標(biāo)記物淬滅。標(biāo)記物和有機分子之間的鍵優(yōu)選為剛性鍵，該鍵限制標(biāo)記物自身圍繞鍵軸轉(zhuǎn)動，而不受有機分子的移動影響，從而使標(biāo)記物的移動主要或?qū)嵸|(zhì)上受有機分子轉(zhuǎn)動(圍繞有機分子的旋轉(zhuǎn)軸)的控制。
標(biāo)記物的熒光弛豫時間為1-7納秒，優(yōu)選為3-5納秒。
優(yōu)選的標(biāo)記物是BODIPY衍生物，熒光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹磺酰及其衍生物(如丹磺酰尸胺)，德克薩斯紅(皆可得自Molecular Probes,OR,USA)以及花菁染料(可得自Amersham,Buckinghamshire,UK)。
熒光物質(zhì)(有機分子和熒光標(biāo)記物的聯(lián)合)應(yīng)具有的偏振值范圍為50-500mP(毫偏振單位)，優(yōu)選為100-300mP，如200mP。
本發(fā)明還包括對上述篩選方法特別有用的新的熒光物質(zhì)。一種優(yōu)選的熒光物質(zhì)是熒光團(tuán)標(biāo)記的纖維素，例如用磷酸溶脹的纖維素(PASC)或羧甲基纖維素(CMC)可被如6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)的熒光團(tuán)標(biāo)記。產(chǎn)生熒光纖維素的方法包括ⅰ)將纖維素或其衍生物懸浮或溶解于含水堿性反應(yīng)介質(zhì)中；ⅱ)使懸浮或溶解的纖維素或其衍生物與熒光團(tuán)保溫/反應(yīng)；ⅲ)從堿性反應(yīng)介質(zhì)中分離經(jīng)標(biāo)記的纖維素或其衍生物并洗滌經(jīng)標(biāo)記的纖維素和ⅳ)中和經(jīng)標(biāo)記的纖維素或其衍生物。
另一個優(yōu)選的熒光物質(zhì)是用熒光團(tuán)標(biāo)記的聚半乳糖醛酸。例如，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖可被如6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)的熒光團(tuán)標(biāo)記。產(chǎn)生熒光鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的方法包括ⅰ)將鼠李糖半乳糖醛酸聚糖懸浮和/或溶解于堿性含水介質(zhì)中；ⅱ)使懸浮或溶解的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖與熒光團(tuán)保溫/反應(yīng)；ⅲ)中和堿性反應(yīng)介質(zhì)；ⅳ)從中和的反應(yīng)介質(zhì)中分離經(jīng)標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖并洗滌經(jīng)標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖。
另一個優(yōu)選的熒光物質(zhì)是用熒光團(tuán)標(biāo)記的甘露聚糖。例如，半乳甘露聚糖可被如6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)的熒光團(tuán)標(biāo)記。產(chǎn)生熒光半乳甘露聚糖的方法包括ⅰ)將半乳甘露聚糖懸浮和/或溶解于堿性含水介質(zhì)中；ⅱ)使懸浮或溶解的半乳甘露聚糖與熒光團(tuán)保溫/反應(yīng)；ⅲ)從堿性反應(yīng)介質(zhì)中分離經(jīng)標(biāo)記的半乳甘露聚糖并洗滌經(jīng)標(biāo)記的半乳甘露聚糖。
另一個優(yōu)選的熒光物質(zhì)是用熒光團(tuán)標(biāo)記的木聚糖。例如，木聚糖可被如麗絲胺羅丹明磺酰氯的熒光團(tuán)標(biāo)記。產(chǎn)生熒光木聚糖的方法包括ⅰ)將木聚糖懸浮和/或溶解于堿性含水介質(zhì)中；ⅱ)使木聚糖酰胺化；ⅲ)使酰胺化的木聚糖與熒光團(tuán)保溫/反應(yīng)；ⅳ)分離并洗滌/純化經(jīng)標(biāo)記的木聚糖。
另一個優(yōu)選的熒光物質(zhì)是用熒光團(tuán)標(biāo)記的木葡聚糖。例如，木葡聚糖可被如熒光素-5-氨基硫脲的熒光團(tuán)標(biāo)記。產(chǎn)生熒光木葡聚糖的方法包括ⅰ)將木葡聚糖懸浮和/或溶解于含有氧化劑的水介質(zhì)中；ⅱ)分離/純化所需的部分氧化的木葡聚糖組分；ⅲ)使氧化的木葡聚糖與熒光團(tuán)保溫/反應(yīng)；ⅳ)分離并洗滌/純化經(jīng)標(biāo)記的木葡聚糖。
另一個優(yōu)選的熒光物質(zhì)是用熒光團(tuán)標(biāo)記的阿拉伯聚糖。例如，阿拉伯聚糖可被如熒光素-5-氨基硫脲的熒光團(tuán)標(biāo)記。產(chǎn)生熒光阿拉伯聚糖的方法包括ⅰ)將阿拉伯聚糖懸浮和/或溶解于含有氧化劑的水性介質(zhì)中；ⅱ)分離/純化所需的部分氧化的阿拉伯聚糖組分；ⅲ)使氧化的阿拉伯聚糖與熒光團(tuán)保溫/反應(yīng)；ⅳ)分離并洗滌/純化經(jīng)標(biāo)記的阿拉伯聚糖。
另一個優(yōu)選的熒光物質(zhì)是用熒光團(tuán)標(biāo)記的果膠/多聚半乳糖醛酸。例如，可使用如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的中介劑，用如熒光素-5-氨基硫脲的熒光團(tuán)標(biāo)記果膠的羧酸基團(tuán)。產(chǎn)生熒光果膠的方法包括ⅰ)將果膠懸浮和/或溶解于含水介質(zhì)中；ⅱ)使果膠與熒光團(tuán)和中介劑保溫/反應(yīng)；ⅳ)分離并洗滌/純化經(jīng)標(biāo)記的果膠。其它用途
上文所述的FP法還可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的生物化合物之工業(yè)化生產(chǎn)中的質(zhì)量或發(fā)酵控制。材料和方法保藏的微生物
根據(jù)有關(guān)國際公認(rèn)的用于專利方法的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，申請人將下列微生物保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH
1999-02-03；芽孢桿菌RCS 242B；DSM保藏號為12663，
1999-02-03；芽孢桿菌RCS 245B；DSM保藏號為12664，
1999-02-15；枯草芽孢桿菌MB208；DSM保藏號為12682，
1999-02-26；芽孢桿菌的種；DSM保藏號為12708，
1999-02-26；芽孢桿菌的種；DSM保藏號為12709。構(gòu)建基因文庫
在液體LB培養(yǎng)基中增殖從中提取DNA用于構(gòu)建文庫的細(xì)菌菌株。收集細(xì)胞，通過Pitcher等，1989所述的方法分離基因組DNA。
在實施例25和26中，用限制性酶Sau3A部分消化基因組DNA，通過在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行大小分級分離。通過在DEAE-纖維素紙上電泳(Dretzen,G等，1981)分離大小為2至7kb的片斷。
將分離的DNA片斷連接至經(jīng)BamHI消化的pSJl678(見WO94/19454,3969)質(zhì)粒DNA，使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株SJ2(Diderichsen等(1990))。
制備大腸桿菌SJ2細(xì)胞，按廠商所述的方法，使用購自BIO-RAD的Gene PulserTM電穿孔儀通過電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。按Sambrook等，1989,Ausubel等，1995和Harwood和Cutting,1990所述進(jìn)行所有的分子生物學(xué)工作。
在實施例27-29中，按下述在pZEr0-2(Invitrogen,CA,USA)中制備文庫用限制性酶Sau3A部分消化染色體DNA，隨后通過凝膠電泳進(jìn)行大小分級分離。純化2至8kb的片斷并連接至用BamHI消化的pZEr0-2中。通過按銷售商所述的方法進(jìn)行電穿孔，用連接混合物轉(zhuǎn)化ElectroMAX DH10B(GibcoBRL/Life technologies,UK)。在不含抗生素的LB培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)60分鐘，加入甘油至濃度為15％，將等分試樣凍干。通過涂布于含有10μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上來測定每份等分試樣中的轉(zhuǎn)化子數(shù)目。操縱微滴板并在微滴板中增殖大腸桿菌SJ2
為了操縱主平板，使用裝配有S20移液槍(stacker)的TitertekMicrodrop裝置(Life Technologies,MD,USA)自動地將轉(zhuǎn)化的文庫充入孔中。為了將主平板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至檢測板中，使用了Platemate自動移液器(Matrix Technologies,MA,USA)裝置。
在LB肉湯培養(yǎng)基(5g/l NaCl,5g/l酵母提取物(Difco,MI,USA)，10g/l胰蛋白胨(Difco,MI,USA))中增殖大腸桿菌SJ2轉(zhuǎn)化子及其克隆。于37℃，在Nunclon MicroWell 96F平板(NUNC，丹麥)上增殖大腸桿菌轉(zhuǎn)化子及其克隆，并以200rpm的速度振蕩3天，然后進(jìn)行篩選。進(jìn)行FP檢測之前，通過使50μl轉(zhuǎn)化子或其克隆與150μl含有熒光物質(zhì)的溶液混合而使轉(zhuǎn)化子或其克隆與熒光物質(zhì)混合。測定熒光偏振
為了檢測樣品池中的熒光偏振，使用了為快速偏振而裝配的LS50B(Perkin Elmer,CT,USA)，為了檢測微滴板中的熒光偏振，使用了FPM-2(Jolley Consulting and Research公司，IL,USA)。對相同孔和幾個孔中的相同樣品進(jìn)行重復(fù)檢測的差異表明標(biāo)準(zhǔn)差為2％至4％。使用了兩種類型的黑微滴板Sterilin平底孔板(Bibby Sterilin有限公司，UK)和Microfluor U-底板(Dynex Technologies,VA,USA)。
為了檢測微滴板中的熒光素，插入激發(fā)濾光器，使485nm的光可以通過，帶通為22nm。插入發(fā)射濾光器，使520nm的光可以通過，帶通為30nm。
為了檢測微滴板中的羅丹明，插入激發(fā)濾光器，使546nm的光可以通過，帶通為12nm。再插入發(fā)射濾光器，使590nm的光可以通過，帶通為35nm。
根據(jù)儀器操作手冊計算光柵系數(shù)。
高物料流通量的熒光偏振檢測所用的儀器是基于流動池的儀器，如經(jīng)改良的LS50B(Perkin-Elmer公司，CT,USA)，基于微滴板的讀數(shù)儀，如Polarstar(BMG，德國)或裝配用于熒光偏振的FACS(流式激活細(xì)胞分選儀)(Arndt D.J等(1976)和Lindmo,T和H.B.Steen,1977)。試驗中所用的酶和底物
經(jīng)丹磺酰，四甲基羅丹明，BODIPY_-TR和德克薩斯紅標(biāo)記的尸胺得自Molecular Probes,OR,USA。由牛奶而來的去磷酸化的α-酪蛋白和經(jīng)熒光素標(biāo)記的土豆淀粉得自Sigma,MO,USA。酯化程度較低(3％)的柑桔果膠得自Copenhagen Pectin,Lille Skensved，丹麥。酯化程度為77.4％的蘋果果膠得自Herbstreith KG，德國。木聚糖酶實驗所用的樺木木聚糖得自Sigma,MO,USA。得自糖甜菜的阿拉伯聚糖和得自tamaring種子的木葡聚糖(淀粉樣)都購自Megazyme(悉尼，澳大利亞)。得自土豆的直鏈淀粉(Ⅲ型)和得自玉米的支鏈淀粉都可購自Sigma,MO,USA。得自Locus豆膠的半乳甘露聚糖可購自Sigma,MO,USA。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖可得自Copenhagen Pectin,LilleSkensved，丹麥?？砂碨chulein(1997)所述制備用磷酸溶脹的纖維素。通過按Tada等(1989)所述，用得自米曲霉的淀粉酶水解玉米淀粉可得到極限糊精。
還使用了下列酶，它們是WO9414952中所述的聚半乳糖醛酸酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；如WO94/21786所述可得自棘孢曲霉的果膠裂合酶；如國家專利申請?zhí)朌K/97/1344所述可得自地衣芽孢桿菌的果膠酸裂合酶；如WO94/20611所述可得自棘孢曲霉的阿拉伯聚糖酶；如WO94/14953所述可得自棘孢曲霉的木葡聚糖酶(內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ)；可得自NovoNordisk A/S，丹麥的淀粉酶(Termamyl_)；如Christgau等，1996所述可得自棘孢曲霉的果膠甲酯酶；如WO96/23366所述可得自惡疫霉(Phytophthora cactorum)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；如Fry等，1992所述可純化自土豆的部分純化的土豆木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶；可得自NovoNordisk A/S，丹麥的木聚糖酶(BioFeed_Wheat)；如WO94/25576所述可得自棘孢曲霉的甘露聚糖酶；得自Novo Nordisk A/S的淀粉酶Novamyl；按Shen等(1988)所述可得到的C.thermosulfurogenes β-淀粉酶；如WO94/20612所述可得自棘孢曲霉的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶；如WO96/29397所述可得自Humicola insolens的Cel45纖維素酶。BP-X培養(yǎng)基
按下述制備BP-X培養(yǎng)基將100g土豆粉，50g大麥片和800mg BAN淀粉酶(可得自Novo Nordisk A/S，丹麥)混合于800ml水中，加熱溶液至約70℃，保溫30分鐘。在冷卻的過程中加入10g酪蛋白酸鈉(MD-Food，丹麥)。冷卻至室溫時加入20g豆粉，9g磷酸氫二鈉(MERCK)，0.1g pluronic PE 6100(BASF)以及1000ml水。TY培養(yǎng)基
按Ausubel等(1995)所述制備TY培養(yǎng)基。實施例
通過下列非限制性的實施例來闡明本發(fā)明實施例1標(biāo)記寡木葡聚糖
按Fry等(1997)所述用磺基羅丹明末端標(biāo)記寡木葡聚糖。實施例2通過部分化學(xué)氧化標(biāo)記木葡聚糖
攪拌7小時，將木葡聚糖(0.50g)溶解于60℃的水(60ml)中。使溶液冷卻至室溫，加入含有偏高碘酸鈉(15mg)(Merck，德國)的水溶液(10ml)。將混合物在黑暗中放置過夜，然后對脫礦質(zhì)水透析(截留分子量為12,000-14,000)并頻繁更換接受溶液。將25mg熒光素-5-氨基硫脲(Molecular Probes,OR,USA)溶解于1ml DMF(Sigma,MO,USA)中，將此橙色溶液加入經(jīng)透析的聚合物中(約60ml溶液)。黑暗中攪拌該溶液18小時，通過加入96％的乙醇(20ml)來沉淀聚合物，在Miracloth(Calbiochem，德國)上過濾以收集濕的聚合物，用水和乙醇的混合物(1∶1)洗滌直至得到無色的濾過液。最后，用無水乙醇洗滌經(jīng)標(biāo)記的黃色的木葡聚糖并風(fēng)干。據(jù)估計，標(biāo)記程度為0.6％(由492nm處的吸收值來計算)。實施例3通過部分化學(xué)氧化標(biāo)記阿拉伯聚糖
將阿拉伯聚糖(0.50g)溶解于水(10ml)中，加入含有偏高碘酸鈉(15mg)的水溶液(5ml)。將混合物在黑暗中放置過夜，然后用水(15ml)稀釋，將溶液對水透析(截留分子量為12,000-14,000)并頻繁更換接受溶液。將25mg熒光素-5-氨基硫脲(Molecular Probes,OR,USA)溶解于1ml DMF中，將此橙色溶液加入經(jīng)透析的聚合物中。黑暗中攪拌該溶液36小時，然后將溶液分成兩份，將其中的一份濃縮為較小的體積，通過加入90％的乙醇來沉淀聚合物，據(jù)估計，標(biāo)記程度為0.7％(由492nm處的吸收值來計算)。實施例4標(biāo)記多聚半乳糖醛酸
標(biāo)記策略包括使用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(FLUKA，瑞士)為中介劑，使肼或胺激活的探針(如熒光素-5-氨基硫脲)與羧酸偶聯(lián)以標(biāo)記果膠/多聚半乳糖醛酸的羧酸基團(tuán)。
將酯化程度為3％,35％或77％的多聚半乳糖醛酸(1g)溶解于25ml脫礦質(zhì)水中(溶解酯化程度為35％和77％的果膠時還需要加熱和加水)，隨后邊攪拌邊加入20mg熒光素-5-氨基硫脲(Molecular Probes,OR,USA)，用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至5.9，在1小時內(nèi)邊攪拌邊加入(1g)1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，將溶液在黑暗中保溫過夜，在溶液中加入10％醋酸(v/v)，接著加入甲醇至終濃度為75％(v/v)甲醇。將溶液在黑暗中放置1小時，在2層Miracloth(Calbiochem，德國)上過濾以收集沉淀的果膠，用醋酸∶乙醇(1∶19v/v)，乙醇(96％)和丙酮洗滌。將經(jīng)標(biāo)記的果膠置于黑暗中干燥，標(biāo)記程度為0.3至0.7％。實施例5標(biāo)記木聚糖
將2.0g木聚糖懸浮于50ml 90℃的水中，隨后冷卻至30℃。溶解17.5g固體乙二胺二鹽酸鹽(FLUKA，瑞士)，于25℃加入10M NaOH將pH調(diào)節(jié)至5.9。緩慢加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(5g)，25℃下攪拌混合物過夜。用125ml水稀釋溶液，隨后加入12.5ml醋酸和375ml甲醇。在12cm漏斗中的2層Miracloth(Calbiochem，德國)上過濾以收集木聚糖沉淀物。將潮濕的木聚糖重新溶解于吡啶/醋酸/水(體積比為1∶1∶18)至終體積為125ml。在混合物中加入375ml甲醇并保溫1小時。按上述在Miracloth上收集木聚糖沉淀物。用1升甲醇/吡啶/醋酸/水(體積比為60∶1∶1∶18)沖洗木聚糖，接著再用1升乙醇洗滌，最后用0.5升丙酮洗滌。收集并干燥酰胺化多糖。將1.40g酰胺化木聚糖溶解于35ml熱的200mM焦磷酸鈉溶液中。當(dāng)酰胺化的木聚糖溶解之后，將溶液冷卻至室溫，pH調(diào)節(jié)至9.5。在3小時內(nèi)，在木聚糖中緩慢加入溶于無水二甲基甲酰胺中的1％(w/v)麗絲胺羅丹明磺酰氯(Molecular Probes,OR,USA)。將溶液對3×1升含有0.5％1,1,1-三氯-2-甲基丙二醇的脫礦質(zhì)水進(jìn)行透析(截留分子量為10,000-12,000)。回收內(nèi)容物，加入2ml醋酸和2ml吡啶，接著加入150ml甲醇以沉淀木聚糖。將沉淀的木聚糖重新溶解于50ml吡啶/醋酸/水(體積比為1∶1∶18)，并通過加入150ml甲醇重新沉淀木聚糖。重復(fù)洗滌步驟直至上清液不含任何染料。用200ml丙酮將沉淀的木聚糖洗滌2次并干燥。實施例6標(biāo)記經(jīng)磷酸溶脹的纖維素(phosphoric acid swollencellulose,PASC)
用0.5M NaOH將250ml 10％的PASC水溶液(約含2.5g纖維素)的pH調(diào)節(jié)至10.5，在黑暗中與6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)保溫過夜。離心反應(yīng)混合物，除去上清液。使用100ml 0.1M NaOH溶液將經(jīng)標(biāo)記的聚合物洗滌5次。每次洗滌后需離心并除去上清液。用2×250ml水中和洗滌的經(jīng)標(biāo)記的聚合物并重新懸浮于250ml水中。實施例7標(biāo)記直鏈淀粉
于100℃，在水(30ml)中將直鏈淀粉(250mg)回流10分鐘，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至11。將渾濁的溶液冷卻至室溫，并用11mg 6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)進(jìn)行處理。用EtOH/MeOH/AcOH(15∶2∶1,20ml)的混合物沉淀經(jīng)標(biāo)記的聚合物，在Miracloth上收集所述聚合物并用EtOH(96％,30ml)和丙酮(140ml)洗滌，最后將聚合物溶解于水中并凍干。實施例8標(biāo)記支鏈淀粉
于100℃，在水(30ml)中將支鏈淀粉(250mg)回流10分鐘，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至11。將渾濁的溶液冷卻至室溫，并用11mg 6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)進(jìn)行處理。用EtOH/MeOH/AcOH(15∶2∶1,15ml)的混合物沉淀經(jīng)標(biāo)記的聚合物并用EtOH(96％，30ml)洗滌，在Miracloth上收集所述聚合物并用EtOH(96％,70ml)洗滌，最后將聚合物溶解于水中并凍干。實施例9標(biāo)記極限糊精
在pH4.5，50℃下，用得自米曲霉的淀粉酶(Tada等(1989))將玉米淀粉水解120小時。在Bio-gel P-2柱上純化極限糊精。收集含有DP 15-33的級分并凍干。將508mg糊精重新溶解于20ml水中，加入溶于1ml DMF中的75mg 5-氨基熒光素，黑暗中攪拌2小時。使用76.2mgNaCNBH3還原所得亞胺鍵。在SEC柱上純化經(jīng)標(biāo)記的糊精。實施例10標(biāo)記鼠李糖半乳糖醛酸聚糖
在pH值被1M NaOH調(diào)節(jié)至11的1.5％鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(Copenhagen Pectin,Lille Skensved，丹麥)水溶液(約225mg/15ml)中加入12mg 6-DTAF(6-熒光素二氯三嗪)，黑暗中將溶液攪拌過夜，用0.5M HCl中和，加入EtOH(30ml)，在Miracloth上收集聚合物并先用EtOH/水(2∶1,150ml)，然后用EtOH(400ml)洗滌，將聚合物溶解于水(25ml)中并凍干。實施例11標(biāo)記半乳甘露聚糖
將2.695g半乳甘露聚糖溶解于250ml水中并用0.5M NaOH調(diào)節(jié)pH至10，加入0.127g DTAF(6-熒光素二氯三嗪)，在黑暗中將溶液攪拌24小時。用500ml EtOH沉淀產(chǎn)物，隨后用250ml EtOH將產(chǎn)物洗滌3次，用250ml丙酮將產(chǎn)物洗滌1次。蒸發(fā)除去溶劑，將經(jīng)標(biāo)記的聚合物重新溶解于400ml水中。實施例12通過熒光偏振檢測淀粉酶活性
檢測淀粉酶活性的方法包括使淀粉酶(Termamyl_)與實施例7中經(jīng)熒光素標(biāo)記的土豆淀粉一起保溫，并測定熒光偏振的變化。如表1所示，觀察到熒光淀粉經(jīng)淀粉酶水解后熒光偏振有所降低。表1
室溫下，在體積為200μl的pH6.8 BR-緩沖液(23mM H3PO4,23mMCH3COOH,23mM H3BO3)中，將Termamyl_與每孔中的33μg經(jīng)熒光素標(biāo)記的土豆淀粉一起保溫180分鐘進(jìn)行水解反應(yīng)。180分鐘的反應(yīng)時間過后，熒光偏振大約降低了20％。
圖3顯示了整個過程中的FP變化，闡明了淀粉酶水解淀粉的速率。方塊和三角形分別表示加或不加Termamyl_時熒光淀粉的FP檢測結(jié)果。
通過熒光偏振也可檢測由克隆的大腸桿菌SJ2轉(zhuǎn)化子表達(dá)的淀粉酶。從37℃振蕩過夜培養(yǎng)的主平板中取出約50μl等分試樣，將等分試樣混合于含有150μl pH6.8的檢測緩沖液(23mM H3PO4,23mM CH3COOH,23mM H3BO3)的微滴板孔中，所述緩沖液中還含有33μg用熒光素痕量標(biāo)記的淀粉。室溫下保溫3小時之后，F(xiàn)P有所降低，結(jié)果示于表2。表2實施例13通過熒光偏振檢測木聚糖酶活性
檢測木聚糖酶活性的方法包括使BioFeed_Wheat木聚糖酶與經(jīng)羅丹明標(biāo)記的木聚糖一起保溫，并測定熒光偏振的變化。觀察到熒光底物經(jīng)木聚糖酶水解后熒光偏振有所降低。圖4的B柱表示相對于不含木聚糖酶的A柱而言，由于經(jīng)標(biāo)記的木聚糖被木聚糖酶水解而使熒光偏振有所降低。通過在40℃，pH6.0的磷酸鈉緩沖液(100mM磷酸鹽)中將木聚糖酶與0.001％(w/v)經(jīng)羅丹明標(biāo)記的樺木木聚糖保溫30分鐘而進(jìn)行水解反應(yīng)。實施例14通過熒光偏振測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性
檢測轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的方法包括將得自惡疫霉的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與經(jīng)熒光標(biāo)記的尸胺(供體)和(去磷酸化的)酪蛋白(受體)一起保溫并測定熒光偏振的變化。檢測了多個熒光標(biāo)記物，它們是熒光素，丹磺酰，羅丹明和BODIPY-TR。表3
表3的結(jié)果顯示出由于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將經(jīng)不同標(biāo)記物標(biāo)記的尸胺轉(zhuǎn)移至更大的酪蛋白分子上，熒光偏振有所增加。
在42℃，pH7.6的Tris緩沖液(10mM Tris,20mM CaCl2,100mMNaCl和4.5mM二硫蘇糖醇)中，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與16μM經(jīng)標(biāo)記的尸胺和20.8μM酪蛋白一起保溫3小時進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。然而，F(xiàn)P檢測在室溫下進(jìn)行。對經(jīng)丹磺酰標(biāo)記的尸胺而言，激發(fā)和發(fā)射波長分別為385nm和520nm。對經(jīng)熒光素標(biāo)記的尸胺而言，激發(fā)和發(fā)射波長分別為485nm和525nm。對經(jīng)羅丹明標(biāo)記的尸胺而言，激發(fā)和發(fā)射波長分別為545nm和578nm。對經(jīng)BODIPY_-TR標(biāo)記的尸胺而言，激發(fā)和發(fā)射波長分別為588nm和615nm?？墒褂媒?jīng)裝配可快速偏振的Perkin Elmer LS50B進(jìn)行檢測，整合時間為1秒。
也可通過監(jiān)測整個過程中熒光偏振的增加來測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。圖5顯示出相對于不存在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的反應(yīng)(曲線2)而言，得自惡疫霉的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在0-300分鐘的時間內(nèi)將經(jīng)羅丹明標(biāo)記的尸胺(16μM)轉(zhuǎn)移至酪蛋白(20.8μM)的情況(曲線1)。反應(yīng)在室溫下，pH7.6的Tris緩沖液(10mM Tris,20mM CaCl2,100mM NaCl和4.5mM二硫蘇糖醇)中進(jìn)行。實施例15通過熒光偏振測定木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶活性
檢測木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)活性的方法包括將木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶與經(jīng)磺基羅丹明標(biāo)記的寡木葡聚糖(供體)和木葡聚糖(受體)保溫并測定熒光偏振的變化。表4
表4的結(jié)果顯示出相對于不存在XET的反應(yīng)而言，由于XET酶將經(jīng)標(biāo)記的寡木葡聚糖轉(zhuǎn)移至更大的木葡聚糖分子上，熒光偏振有所增加。
在室溫下，pH5.5的琥珀酸鹽緩沖液(133mM琥珀酸鈉，3.8mMCaCl2,1.9mML-半胱氨酸)中，將XET與2.25μM經(jīng)磺基羅丹明標(biāo)記的寡木葡聚糖和2g/l木葡聚糖保溫過夜，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
通過將寡木葡聚糖的濃度降低至0.45μM，在2-3小時內(nèi)即可得到陽性反應(yīng)(未顯示)。實施例16通過熒光偏振檢測果膠甲酯酶活性
檢測果膠甲酯酶(Pectin Methyl Esterase,PME)活性的方法包括將PME與經(jīng)熒光素標(biāo)記的果膠(羧酸基團(tuán)的甲基酯化程度為77％)一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到PME所致的去甲基化和隨后進(jìn)行的去甲基化果膠的交聯(lián)作用使得熒光偏振有所增加。表5
表5的結(jié)果顯示出相對于不存在PME的反應(yīng)而言，由于PME導(dǎo)致去甲基化之后經(jīng)標(biāo)記果膠的交聯(lián)作用使得熒光偏振增加。在室溫下，200μl的pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉和2mM CaCl2)中將純化的PME與70μg經(jīng)標(biāo)記的果膠保溫180分鐘即可進(jìn)行去甲基化反應(yīng)。
Ca2+對反應(yīng)動力學(xué)影響的實驗結(jié)果示于圖6。當(dāng)加入Ca2+時，在30分鐘內(nèi)即可檢測到熒光偏振的變化(曲線1)。然而，如果不加Ca2+，反應(yīng)動力學(xué)就有所不同，需保溫2.5小時方可觀察到顯著變化(曲線2)。為了進(jìn)行比較，重復(fù)不加PME的實驗，圖6的曲線3顯示了加Ca2+的結(jié)果，而曲線4顯示了不加Ca2+的結(jié)果。所有反應(yīng)都在室溫下，200μl含或不含2mM CaCl2的pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉)中進(jìn)行，所述緩沖液中含有70μg DE=77％的果膠。實施例17通過熒光偏振檢測阿拉伯聚糖酶活性
檢測阿拉伯聚糖酶活性的方法包括將得自棘孢曲霉的阿拉伯聚糖酶與經(jīng)熒光素標(biāo)記的得自糖甜菜的(0.7％)非脫支阿拉伯聚糖一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因阿拉伯聚糖酶所致的水解或解聚而使經(jīng)標(biāo)記的阿拉伯聚糖的熒光偏振降低。表6
表6的結(jié)果顯示出相對于未加阿拉伯聚糖酶的反應(yīng)而言，由于經(jīng)標(biāo)記的阿拉伯聚糖分別被添加的0.5μl和5μl阿拉伯聚糖酶水解而使熒光偏振降低。在50℃下，pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉和7mM NaCl)中將阿拉伯聚糖酶與170μg/ml經(jīng)標(biāo)記的阿拉伯聚糖保溫16小時即可進(jìn)行水解反應(yīng)。反應(yīng)體積為200μl。FP檢測在室溫下進(jìn)行。實施例18通過熒光偏振檢測果膠酶活性
檢測果膠酶(多聚半乳糖醛酸酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ，得自棘孢曲霉的果膠裂合酶和得自地衣芽孢桿菌的果膠酸裂合酶)活性的方法包括將各種果膠酶與兩種經(jīng)熒光素標(biāo)記的甲基化或酯化(％DE)程度不同的果膠一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因果膠酶所致的水解使得經(jīng)標(biāo)記的果膠的熒光偏振降低。
表7顯示出相對于不含果膠酶的對照樣品而言，不同組合的果膠和果膠酶之間的反應(yīng)結(jié)果。
結(jié)果證實多聚半乳糖醛酸酶，果膠裂合酶和果膠酸裂合酶都顯示出預(yù)期的反應(yīng)模式。多聚半乳糖醛酸酶和果膠酸裂合酶僅與3％DE果膠反應(yīng)，而果膠裂合酶僅與77％DE果膠反應(yīng)。
在室溫下，pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉和2mMCaCl2)中將多聚半乳糖醛酸酶分別與70μg/ml77％ DE或35μg/ml3％DE經(jīng)標(biāo)記的果膠保溫75分鐘即可進(jìn)行多聚半乳糖醛酸酶水解反應(yīng)。
在室溫下，pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉和2mMCaCl2)中將果膠裂合酶分別與70μg/ml77％ DE或35μg/ml3％DE經(jīng)標(biāo)記的果膠保溫180分鐘即可進(jìn)行果膠裂合酶水解反應(yīng)。
在室溫下，pH10.0甘氨酸緩沖液(50mM甘氨酸，100mMNaCl和2mM CaCl2)中將果膠酸裂合酶分別與70μg/ml77％ DE或35μg/ml3％DE經(jīng)標(biāo)記的果膠保溫75分鐘即可進(jìn)行果膠酸裂合酶水解反應(yīng)。
通過熒光偏振也可檢測由克隆的大腸桿菌SJ2轉(zhuǎn)化子表達(dá)的果膠酶。從37℃振蕩過夜培養(yǎng)的主平板中取出約50μl等分試樣，將等分試樣混合于含有150μlpH10.0的甘氨酸緩沖液(4mM CaCl2和100mM甘氨酸)的微滴板孔中，所述緩沖液中還含有6.8μg用熒光素標(biāo)記的3％DE果膠。室溫下檢測15分鐘內(nèi)因果膠解聚所致的熒光偏振變化，結(jié)果示于圖7，其中顯示了含有表達(dá)未被鑒定的果膠酶(方塊)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2和未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌SJ2(三角形)的樣品的FP檢測結(jié)果。從圖7中還可以看出大腸桿菌SJ2固有的背景值非常低，不會干擾檢測。
檢測由微滴板孔中存在的大腸桿菌SJ2釋放的果膠酶活性的方法適于高物料流通量的基因文庫篩選法。表7實施例19通過熒光偏振檢測甘露聚糖酶活性
檢測甘露聚糖酶活性的方法包括將得自棘孢曲霉的甘露聚糖酶與經(jīng)熒光素標(biāo)記的得自Locus豆膠的半乳甘露聚糖(0.8％)一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因甘露聚糖酶活性所致的解聚作用而使經(jīng)標(biāo)記的半乳甘露聚糖熒光偏振降低。表8
表8所示的結(jié)果闡明相對于未加入甘露聚糖酶的反應(yīng)而言，加入1μl甘露聚糖酶可使經(jīng)標(biāo)記的半乳甘露聚糖解聚，從而使熒光偏振降低。于40℃，在pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉和1mMCaCl2)中將甘露聚糖酶與35μg/ml經(jīng)標(biāo)記的半乳甘露聚糖一起保溫2小時即可進(jìn)行解聚反應(yīng)。反應(yīng)體積為250μl，F(xiàn)P檢測在室溫下進(jìn)行。實施例20通過熒光偏振檢測鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性
檢測鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的方法包括將得自棘孢曲霉的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶與經(jīng)熒光素標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(0.1％)一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性所致的解聚作用而使經(jīng)標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖熒光偏振降低。表9
表9所示的結(jié)果闡明相對于未加入鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶的反應(yīng)而言，加入1μl鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶可使經(jīng)標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖解聚，從而使熒光偏振降低。于40℃，在pH5.0檸檬酸鹽緩沖液(100mM檸檬酸鈉和1mMCaCl2)中將鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶與50μg/ml經(jīng)標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖一起保溫2小時即可進(jìn)行解聚反應(yīng)。反應(yīng)體積為250μl，F(xiàn)P檢測在室溫下進(jìn)行。實施例21利用經(jīng)熒光素標(biāo)記的直鏈淀粉為底物通過熒光偏振檢測淀粉酶活性
利用熒光標(biāo)記的直鏈淀粉檢測淀粉酶活性的方法包括將C.thermosulfurogenes β-淀粉酶或Novamyl淀粉酶與經(jīng)熒光素標(biāo)記的直鏈淀粉(0.7％)一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因淀粉酶活性所致的解聚作用而使經(jīng)標(biāo)記的直鏈淀粉熒光偏振降低。表10
表10所示的結(jié)果闡明相對于未加入淀粉酶的反應(yīng)而言，加入1μlβ-淀粉酶或1μl Novamyl可使經(jīng)標(biāo)記的直鏈淀粉解聚，從而使熒光偏振降低。于42℃，在pH6緩沖液(50mM MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)和1mM CaCl2)中將淀粉酶與約10μg/ml經(jīng)標(biāo)記的直鏈淀粉一起保溫2小時即可進(jìn)行解聚反應(yīng)。反應(yīng)體積為250μl，F(xiàn)P檢測在42℃下進(jìn)行。實施例22利用經(jīng)熒光素標(biāo)記的支鏈淀粉為底物通過熒光偏振檢測淀粉酶活性
利用熒光標(biāo)記的支鏈淀粉檢測淀粉酶活性的方法包括將C.thermosulfurogenes β-淀粉酶或Novamyl淀粉酶與經(jīng)熒光素標(biāo)記的支鏈淀粉(0.4％)一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因淀粉酶活性所致的解聚作用而使經(jīng)標(biāo)記的支鏈淀粉熒光偏振降低。表11
表11所示的結(jié)果闡明相對于未加入淀粉酶的反應(yīng)而言，加入1μlβ-淀粉酶或1μl Novamyl可使經(jīng)標(biāo)記的支鏈淀粉解聚，從而使熒光偏振降低。于42℃，在pH6的MES緩沖液(50mM MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)和1mM CaCl2)中將淀粉酶與約10μg/ml經(jīng)標(biāo)記的支鏈淀粉一起保溫2小時即可進(jìn)行解聚反應(yīng)。反應(yīng)體積為250μl，F(xiàn)P檢測在42℃下進(jìn)行。實施例23利用經(jīng)熒光素標(biāo)記的極限糊精為底物通過熒光偏振檢測淀粉酶活性
利用熒光標(biāo)記的極限糊精(DP15-33)檢測淀粉酶活性的方法包括將Termamyl淀粉酶與經(jīng)熒光素標(biāo)記的極限糊精一起保溫并測定熒光偏振的變化。觀察到因淀粉酶活性所致的解聚作用而使經(jīng)標(biāo)記的極限糊精熒光偏振降低。表12
表12所示的結(jié)果闡明相對于未加入淀粉酶的反應(yīng)而言，加入1μl Termamyl可使經(jīng)標(biāo)記的極限糊精解聚，從而使熒光偏振降低。于50℃，在pH6.5的MES緩沖液(50mM MES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)和1mMCaCl2)中將淀粉酶與1mg/ml經(jīng)標(biāo)記的極限糊精一起保溫24小時即可進(jìn)行解聚反應(yīng)。FP檢測在室溫下進(jìn)行。實施例24通過熒光偏振檢測纖維素酶活性
纖維素酶活性的檢測方法包括于40℃，400rpm的振蕩速度下，在微滴板中將20μl多種稀釋度的Humicola insolens Cel45纖維素酶與200μl底物一起保溫1小時，并測定所得熒光偏振的變化。底物是2mg/ml已被熒光素共價標(biāo)記的經(jīng)磷酸溶脹的纖維素(PASC)。如表13所示(兩次檢測)，隨著酶濃度的增加，熒光偏振值穩(wěn)步降低。與纖維素酶保溫之后，經(jīng)熒光素標(biāo)記的用磷酸溶脹的纖維素的FP值如下所述。使用熒光素為已知標(biāo)準(zhǔn)(35mP)校準(zhǔn)儀器。表13實施例25從得自以前被稱為遲緩芽孢桿菌的芽孢桿菌菌株(等同于地衣芽孢桿菌CA63,DSM 9552)和芽孢桿菌菌株(等同于B.clausiiNCIMB 10309,DSM 8716)的基因組文庫中以高物料流通量篩選編碼果膠酶的核苷酸序列
圖1圖示說明了篩選方法。將小管中的內(nèi)容物，即被文庫轉(zhuǎn)化的大腸桿菌SJ2宿主細(xì)胞接種至10mlLB培養(yǎng)基中，37℃保溫40分鐘。隨后，用含有氯霉素(10μg/ml)的冷LB培養(yǎng)基稀釋10ml細(xì)胞至細(xì)胞終濃度為0.5-1個細(xì)胞/300μl培養(yǎng)基。
將稀釋的轉(zhuǎn)化子及其克隆置于冰上，同時，使用Micro液滴器將300μl/孔的等分試樣轉(zhuǎn)移至NUNC微滴板中。篩選一個細(xì)菌文庫一般需要40-50個微滴板就足夠了。將微滴板置于密閉的盒中以防止培養(yǎng)基從孔中蒸發(fā)，將密閉的盒放在搖床上，37℃振蕩(約175rpm)約70小時。黑色的微滴板中已加入含于支持所需pH值的緩沖液中的150μl34μg/ml經(jīng)熒光素-5-氨基硫脲標(biāo)記的甲基化程度不同的果膠溶液和4mM CaCl2(見表14)。隨后，使用自動化的移液裝置將主平板中吸出50μl轉(zhuǎn)化子/克隆懸浮液等分試樣并轉(zhuǎn)移至黑色的檢測板中。將檢測板置于室溫下(黑暗中)放置約150分鐘，通過熒光偏振讀數(shù)儀(FPM-2,Jolley Consulting,IL)進(jìn)行讀數(shù)。將熒光偏振值的降低記為陽性命中。根據(jù)果膠的來源和甲基化的程度，未反應(yīng)的果膠的mP值為70-200，而被果膠酶降解的果膠的mP值為60-130。
在不同條件下，在分離步驟中(圖1中的第四幅圖)用不同數(shù)目的轉(zhuǎn)化子或克隆/孔篩選兩個不同核苷酸來源的文庫。表14顯示出篩選果膠酶所用文庫的核苷酸來源，所用底物，所得陽性命中的數(shù)目。根據(jù)Poisson-分布的統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)公式將術(shù)語克隆/孔計算為-loge(空孔的頻率)，而(空孔的頻率)=(空孔數(shù))/(孔的總數(shù))。表14還顯示出所有果膠底物都表現(xiàn)有陽性命中，隨后的序列分析揭示出發(fā)現(xiàn)了編碼至少兩種果膠酸裂合酶(地衣芽孢桿菌和B.clausii)和一種果膠裂合酶(B.clausii)的核苷酸序列。該方法還闡明與B.clausii文庫相同，通過將文庫移液至具有各種底物的不同微滴板中即可同時篩選多個編碼酶的核苷酸序列。表14實施例26命中數(shù)作為不同的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞數(shù)目/微滴板孔的函數(shù)
為了研究命中數(shù)作為被接種至每個孔的pSJ1678質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的不同轉(zhuǎn)化子或克隆(圖1中的第四幅圖)數(shù)目的函數(shù)，稀釋轉(zhuǎn)化子和克隆(圖1中的第三幅圖)至一定濃度，使轉(zhuǎn)移的300μl等分試樣中含有0.5個轉(zhuǎn)化子或克隆/等分試樣至8個以上轉(zhuǎn)化子和/或克隆/孔。表15和圖2顯示出每孔中的轉(zhuǎn)化子和/或克隆數(shù)目是果膠酶的重要參數(shù)。在表15中，顯示了每1000個轉(zhuǎn)化子中陽性命中的數(shù)目以及每孔中轉(zhuǎn)化子或克隆的數(shù)目。圖2以圖的形式顯示了相同的信息。圖2中的菱形表示每1000個篩選的轉(zhuǎn)化子中的命中數(shù)。根據(jù)孔中的轉(zhuǎn)化子或克隆的分布遵循Poisson分布的假說，轉(zhuǎn)化子/孔表示每孔中轉(zhuǎn)化子或克隆的平均數(shù)。因此，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計學(xué)公式計算平均數(shù)平均數(shù)=-loge(空孔數(shù))/(孔的總數(shù))。
在實施例1給定的條件下，用經(jīng)熒光素標(biāo)記的3％DE果膠得到地衣芽孢桿菌的結(jié)果。該結(jié)果對B.clausii和其它％DE果膠同樣有效。
不必受理論的限制，現(xiàn)在推測在分離步驟中限制每孔中不同轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的數(shù)目之所以重要的原因是不表達(dá)能與選定熒光物質(zhì)反應(yīng)的生物化合物的克隆對對“陽性命中”克隆可能有生長抑制作用。表15實施例27通過使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的淀粉從芽孢桿菌種的菌株(DSM12708)的基因組文庫中以高物料流通量篩選編碼淀粉酶的核苷酸序列
將小管中的內(nèi)容物，即被克隆至pZEr0-2載體的文庫轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH10B宿主細(xì)胞接種至2.9升添加有卡那霉素(10μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，將接種有文庫的LB培養(yǎng)基置于冰上，同時，使用Micro液滴器將300μl/孔的等分試樣轉(zhuǎn)移至總共100個NUNC 96孔微滴板中。每孔中平均分布1.5個克隆，總共有約14400個克隆。將微滴板置于密閉的盒中以防止培養(yǎng)基從孔中蒸發(fā)，將密閉的盒放在搖床上，37℃振蕩(約200rpm)約48小時。
使用自動化的移液裝置自主平板吸取50μl轉(zhuǎn)化子/克隆懸浮液等分試樣移液至黑色的96孔檢測板中。隨后，使用Micro液滴器在每孔中加入220μl含有30μg/ml經(jīng)熒光素標(biāo)記的淀粉(Sigma)，50mMMES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)pH6,3mMCaCl2和1mMNaCl的溶液，用封口箔(NUNC，丹麥)密封微滴板，將微滴板置于60℃的溫箱中放置120分鐘。將微滴板冷卻至室溫約60分鐘之后除去封口箔。室溫下，通過熒光偏振讀數(shù)儀(Polarstar,BMG，德國)對微滴板進(jìn)行讀數(shù)，將熒光偏振值的降低記為陽性命中。陽性命中被定義為比各個微滴板的平均偏振值減去各個微滴板96個檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差的3.5倍這一值還低的偏振值。平均標(biāo)準(zhǔn)差約為2.2mP單位?？偣茶b定出10個經(jīng)證實的陽性命中(表達(dá)淀粉酶的克隆)，相當(dāng)于在1440個被篩選的克隆中有1個命中。對克隆進(jìn)行DNA測序，結(jié)果表明已克隆出至少2個不同的淀粉酶編碼基因。實施例28通過使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的直鏈淀粉從芽孢桿菌種的菌株(DSM 12709)的基因組文庫中以高物料流通量篩選編碼淀粉酶的核苷酸序列
將小管中的內(nèi)容物，即被克隆至pZErO-2載體的文庫轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH10B宿主細(xì)胞接種至2.9升添加有卡那霉素(10μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，將接種有文庫的LB培養(yǎng)基置于冰上，同時，使用Micro液滴器將300μl/孔的等分試樣轉(zhuǎn)移至總共100個NUNC 96孔微滴板中。每孔中平均分布0.4個克隆，總共有約3840個克隆。將微滴板置于密閉的盒中以防止培養(yǎng)基從孔中蒸發(fā)，將密閉的盒放在搖床上，37℃振蕩(約200rpm)約48小時。
使用自動化的移液裝置將主平板吸取50μl轉(zhuǎn)化子/克隆懸浮液等分試樣移液至黑色的96孔檢測板中。隨后，使用Micro液滴器在每孔中加入220μl含有10μg/ml經(jīng)熒光素標(biāo)記的直鏈淀粉，50mMMES(2-[N-嗎啉代]乙磺酸)pH6和1mMCaCl2的溶液，用封口箔(NUNC，丹麥)密封微滴板，將微滴板置于60℃的溫箱中放置120分鐘。將微滴板冷卻至室溫約60分鐘之后除去封口箔。室溫下，通過熒光偏振讀數(shù)儀(Polarstar，BMG，德國)對微滴板進(jìn)行讀數(shù)，將熒光偏振值的降低記為陽性命中。陽性命中被定義為比各個微滴板的平均偏振值減去各個微滴板96個檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差的3.5倍這一值還低的偏振值。平均標(biāo)準(zhǔn)差約為5.6mP單位?？偣茶b定出3個經(jīng)證實的陽性命中(表達(dá)淀粉酶的克隆)，相當(dāng)于在1280個被篩選的克隆中有1個命中。實施例29通過使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的PASC從芽孢桿菌種的菌株(DSM12682)的基因組文庫中以高物料流通量篩選編碼纖維素酶的核苷酸序列
實施例24的檢測方法也可用于檢測枯草芽孢桿菌克隆DSM12682的纖維素酶活性。DSM 12682是缺失了apr，npr，amyE和celA基因，并被pUB110載體轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌168，其中所述載體中含有與地衣芽孢桿菌之a(chǎn)myL信號肽融合的B.agaradhaerens Ce15a基因(GenBank AF067428)和amyL啟動子。于37℃，在TY培養(yǎng)基中以250rpm的振蕩速度將DSM12682保溫過夜。在實施例24所述的條件下，將20μlDSM12682上清液與200μl底物保溫。記錄到熒光偏振值為129mP，而無質(zhì)粒的對照菌株的熒光偏振值為214mP。該實驗表明檢測混合物中細(xì)胞的存在不會妨礙檢測的質(zhì)量。實施例30通過熒光偏振篩選野生型分離物的酶活性
在90℃，pH9的條件下檢測兩個野生型分離物芽孢桿菌種(DSM12663)和芽孢桿菌種(DSM 12664)的果膠酶活性。于30℃在BP-X培養(yǎng)基(pH9.7)中將分離物培養(yǎng)5天。當(dāng)培養(yǎng)物充分生長之后，將50μl培養(yǎng)物與250μl預(yù)熱的檢測緩沖液(35μg/ml經(jīng)熒光素標(biāo)記的果膠DE3％，50mM Bicine pH9(N,N-雙[2-羥基乙基]甘氨酸)和3mM CaCl2)混合。在保溫至90℃的Eppendorf管中進(jìn)行檢測達(dá)2小時。隨后冷卻檢測混合物，將其轉(zhuǎn)移至黑色的微滴板中，通過熒光偏振讀數(shù)儀(Polarstar,BMG，德國)對微滴板進(jìn)行讀數(shù)。2個野生型分離物的熒光偏振分析結(jié)果示于表16。表16
從表16可以看出，芽孢桿菌(DSM12663)分離物的熒光偏振值比芽孢桿菌(DSM12664)分離物和不含細(xì)胞的生長培養(yǎng)基的熒光偏振值低。由于構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)種(很可能是相同的種)的染色體文庫并從中篩選出了編碼果膠酶活性的核苷酸序列的存在，因此，芽孢桿菌(DSM12663)很可能就編碼果膠酶。分離了編碼果膠酶的核苷酸序列，顯示出以后可克隆到通過熒光偏振在野生型分離物中檢測到的酶活性。參考文獻(xiàn)Ausubel,F.M.等.(編)分子生物學(xué)最新方法，John Wiley和Sons,1995.Christgau,S.,Kofoed,L.V.,Halkier,T.,Andersen,L.N.,Hockauf,M.,Dorreich,K.,Dalboge,H.,和Kauppinen,S.,得自棘孢曲霉的果膠甲酯酶在酵母中進(jìn)行表達(dá)克隆并鑒定重組酶，生物化學(xué)雜志，319,pp 705-712,1996.Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Redegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjoholm,C.,″克隆編碼α-乙酰乳酸脫羧酶(短芽孢桿菌的胞外酶)的aldB″,細(xì)菌學(xué)雜志，172,pp 4315-4321,1990.Dretzen,G.,Bellard,M.,Sassone-Corsi,F.,Chambon,P.,″從瓊脂糖和丙烯酰胺凝膠中回收DNA片斷的可靠方法″，分析生物化學(xué)，112,pp 295-298,1981.Fry,S.,Smith,R.C.,Renwick,K.F.,Martin,D.J.,Hodge,S.K.,和Matthews,K.J.,″得自植物的木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶，一種新的壁-松解酶活性″，生物化學(xué)雜志，282,pp 821-828,1992.Fry,S.,″糖基轉(zhuǎn)移酶和糖基水解酶的新型點-印跡檢測法木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)活性的最優(yōu)化″，植物雜志，11,pp 1141-1150,1997.Harwood,C.R.,和Cutting,S.M.(編)，“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”，John Wiley和Sons,1990.Pitcher,D.G.,Saunders,N.A.,Owen,R.J.,″用硫氰酸胍快速提取細(xì)菌基因組DNA″，應(yīng)用微生物學(xué)通訊，8,pp 151-156,1989.Sambrook等.，″分子克隆實驗室手冊″，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約.(1989)Poulsen L.K.,Refn A.,Molin S和Andersson P.,大腸桿菌毒性Gef蛋白的拓?fù)浞治?，分子微生物學(xué)，5(7),pp.1627-1637,1991.Eisenstadt E.,Carlton B.C.和Brown B.J.，基因突變，普通和分子細(xì)菌學(xué)方法，pp.297-316，編輯Gerhardt P.,MurrayR.G.E.,Wood W.A.和Kneg N.R.,ASM,1994.Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,pp.10747-10751,1994.Stemmer，自然，370,pp.389-391,1994.Christiansen L.C.,Schou S.,Nygaard P和Saxild H.H.，枯草芽孢桿菌的黃嘌呤代謝鑒定xpt-pbuX操縱子，參與黃嘌呤補救和分解代謝的基因的受嘌呤和氮控制的表達(dá)的證據(jù)，細(xì)菌學(xué)雜志，179(8),pp 2540-2550,1997.Stoss 0.,Mogk A.和Schumann W.，構(gòu)建單拷貝的枯草芽孢桿菌調(diào)節(jié)區(qū)與編碼熱穩(wěn)定的β-半乳糖苷酶的bgaB報道基因之間的翻譯融合子所用的整合載體FEMS微生物學(xué)通訊，150(1),pp 49-54,1997.Checovich W.,Bolger R.＆Burke T.，熒光偏振-新的細(xì)胞和分子生物學(xué)工具，自然，375,254-256,1995.Ohuchi,S.等.；使用PCR擴增單個DNA分子和偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯體外產(chǎn)生蛋白質(zhì)文庫的方法，核酸研究，1998,vol.26.No.19,pp.4339-4346.Simonen M.,Palva I.；芽孢桿菌種的蛋白質(zhì)分泌；微生物學(xué)評論；1993；vol.57；pp.109-137.Gotz F.等；葡萄球菌脂酶，分子鑒定，分泌和加工；1998；vol.93；pp15-25Pugsley A.P.等.；Analysis of the subcellular location ofpullulanase produced by Escherichia coli carrying the pulA genefrom Klebsiella pneumoniae strain UNF5023；分子微生物學(xué)；1990；vol.4；pp.59-72.Gerhardt P.等.；普通和分子生物學(xué)方法，American Society forMicrobiology；1994；編Gerhardt P.,Murray R.G.E.,Wood W.A.,Krieg N.R.Ellman J.,Mendel D.,Anthony-Cahill S.J.,Noren C.J.和Schultz P.G.，酶學(xué)方法，1991；vol.202；pp.301-337.Schulein M.；細(xì)菌學(xué)雜志；1997；vol.57,pp.71-81.Shen et al.；從Clostridium thermosulphurogenes中純化和鑒定新的熱穩(wěn)定性β-淀粉酶；生物化學(xué)雜志；1988；vol. 254；pp.835-840.Tada S.,Iimura Y.,Gomi K.,Takahashi K.,Hara S.,YoshizawaK.；米曲霉基因組Taka-淀粉酶基因的克隆和核苷酸序列；農(nóng)業(yè)生物化學(xué)；1989；vol.53；pp.593-599.Arndt D.J.et al.；通過自動化細(xì)胞分離研究細(xì)胞分化兩個模型系統(tǒng)友好病毒-轉(zhuǎn)化細(xì)胞和Hydra attenuata；組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)雜志；1976；vol.24；no.1；pp.332-347Lindmo T.和Steen H.B.；哺乳動物細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)熒光的熒光偏振流式細(xì)胞計數(shù)測定法；生物物理學(xué)雜志；1977；vol.18；pp.173-187.
權(quán)利要求
1．篩選編碼生物化合物的核苷酸序列的方法，所述方法包括
a)在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該核苷酸序列以產(chǎn)生生物化合物，
b)使生物化合物與能與該生物化合物反應(yīng)的熒光物質(zhì)接觸以發(fā)生反應(yīng)，
c)測定熒光物質(zhì)的熒光偏振，和
d)選擇熒光偏振發(fā)生變化的表達(dá)系統(tǒng)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)系統(tǒng)是體外偶聯(lián)的翻譯/轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，核苷酸序列是得自核苷酸來源的基因文庫。
3．權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
4．權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞是野生型細(xì)胞。
5．權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞是宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其中轉(zhuǎn)化子含有得自核苷酸來源的基因文庫。
6．權(quán)利要求2或5的方法，其中核苷酸來源是選自細(xì)菌細(xì)胞，古生物細(xì)胞和真核細(xì)胞的細(xì)胞。
7．權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌的種。
8．權(quán)利要求6的方法，其中真核細(xì)胞選自真菌細(xì)胞，人細(xì)胞和植物細(xì)胞。
9．權(quán)利要求5的方法，其中核苷酸來源是通過體內(nèi)基因改組而修飾的細(xì)胞。
10．權(quán)利要求5的方法，其中核苷酸來源是選自DNA,RNA,cDNA和人工基因的核苷酸序列體外制品。
11．權(quán)利要求10的方法，其中體外制備的核苷酸序列是通過選自基因改組，隨機誘變和PCR的技術(shù)而制備的。
12．權(quán)利要求5的方法，其中宿主細(xì)胞選自細(xì)菌，古生物和真菌。
13．權(quán)利要求12的方法，其中未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不能顯著表達(dá)所述生物化合物。
14．權(quán)利要求13的方法，其中使未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞顯著表達(dá)該生物化合物的核苷酸序列被缺失。
15．權(quán)利要求12的方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌種的細(xì)菌。
16．權(quán)利要求15的方法，其中大腸桿菌是大腸桿菌SJ2。
17．權(quán)利要求12的方法，其中宿主細(xì)胞是ElectroMAX DH10B細(xì)胞。
18．權(quán)利要求12的方法，其中宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬內(nèi)種的細(xì)菌。
19．權(quán)利要求12的方法，其中真菌是釀酒酵母。
20．權(quán)利要求12-19的方法，其中宿主細(xì)胞被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了。
21．權(quán)利要求20的方法，其中質(zhì)粒是pSJ1678或pZEr0-2。
22．權(quán)利要求20的方法，其中質(zhì)粒含有能賦予轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞抗生素抗性的核苷酸序列。
23．權(quán)利要求22的方法，其中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞對選自下列的抗生素具有抗性氯霉素，四環(huán)素，卡那霉素，氨芐青霉素，紅霉素和zeocin。
24．上述任一權(quán)利要求的方法，其中所述生物化合物選自蛋白質(zhì)，多肽和肽。
25．權(quán)利要求24的方法，其中生物化合物是酶。
26．權(quán)利要求25的方法，其中酶選自氧化還原酶(EC 1.-.-.-)，轉(zhuǎn)移酶(EC 2.-.-.-)，水解酶(EC 3.-.-.-)，裂合酶(EC 4.-.-.-)，異構(gòu)酶(EC 5.-.-.-)和連接酶(EC 6.-.-.-)。
27．權(quán)利要求26的方法，其中水解酶選自內(nèi)肽酶，外肽酶，羧肽酶，氨肽酶，內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，脂肪酶和酯酶。
28．權(quán)利要求24的方法，其中生物化合物對人或動物體具有醫(yī)療作用。
29．權(quán)利要求28的方法，其中生物化合物作用于人或動物體中包含的受體。
30．權(quán)利要求29的方法，其中生物化合物是激素。
31．上述任一權(quán)利要求的方法，其中熒光物質(zhì)是被熒光標(biāo)記物標(biāo)記的有機分子。
32．權(quán)利要求31的方法，其中有機分子是多聚體，寡聚體或單體。
33．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物標(biāo)記了有機分子上0.01-10％可供結(jié)合的位點。
34．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物通過共價鍵、離子鍵或氫鍵與有機分子結(jié)合。
35．權(quán)利要求32的方法，其中有機分子選自蛋白質(zhì)，肽，糖蛋白，脂蛋白，多糖，寡糖，甘油三酯或核苷酸。
36．權(quán)利要求35的方法，其中蛋白質(zhì)選自酪蛋白，酪蛋白的衍生物，明膠，白蛋白，大豆蛋白，多克隆抗體，單克隆抗體，人受體蛋白或動物受體蛋白。
37．權(quán)利要求35的方法，其中肽是尸胺。
38．權(quán)利要求35的方法，其中多糖選自淀粉葡聚糖，果膠/多聚半乳糖醛酸，纖維素和半纖維素。
39．權(quán)利要求38的方法，其中多糖選自木葡聚糖，木聚糖，阿拉伯葡聚糖和阿拉伯聚糖，PASC，聚半乳糖醛酸，甘露聚糖，直鏈淀粉，支鏈淀粉，極限糊精。
40．權(quán)利要求31的方法，其中有機分子可得自動物，人，植物或微生物來源。
41．權(quán)利要求40的方法，其中有機分子被化學(xué)或酶促修飾或純化。
42．權(quán)利要求31的方法，其中有機分子是化學(xué)或酶促合成的。
43．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物是芳香族化合物。
44．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物在350-700nm范圍內(nèi)有最大激發(fā)。
45．權(quán)利要求44的方法，其中熒光標(biāo)記物在400-600nm范圍內(nèi)有最大激發(fā)。
46．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物在400-800nm范圍內(nèi)有最大發(fā)射。
47．權(quán)利要求46的方法，其中熒光標(biāo)記物在450-700nm范圍內(nèi)有最大發(fā)射。
48．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物與有機分子和其它熒光標(biāo)記物之間的空間距離為20-50埃。
49．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物的熒光弛豫時間為1-7納秒。
50．權(quán)利要求31的方法，其中熒光物質(zhì)的偏振值范圍為50-500mP。
51．權(quán)利要求31的方法，其中熒光標(biāo)記物選自BODIPY衍生物，熒光素，羅丹明，丹磺酰，德克薩斯紅以及花菁染料。
52．權(quán)利要求2的方法，包括步驟
a)制備基因文庫，
b)將文庫的基因片斷分開放在不同的容器中，
c)擴增分離的基因片斷，
d)體外偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯擴增的基因片斷以表達(dá)生物化合物，
e)將各個獨立容器中的生物化合物或其次生樣品與熒光物質(zhì)接觸，
f)將生物化合物與熒光物質(zhì)一起保溫，
g)通過與生物化合物反應(yīng)以檢測熒光物質(zhì)的FP變化。
53．權(quán)利要求3的方法，包括步驟
a)預(yù)增殖和稀釋含有該核苷酸序列的細(xì)胞，
b)將細(xì)胞分開放在不同的容器中，
c)增殖分離的細(xì)胞以增加各個獨立的容器中每個細(xì)胞的克隆數(shù)目，
d)將各個獨立容器中的細(xì)胞與熒光物質(zhì)接觸，
e)將細(xì)胞與熒光物質(zhì)一起保溫，
f)通過與細(xì)胞釋放的生物化合物反應(yīng)以檢測熒光物質(zhì)的FP變化。
54．權(quán)利要求53的方法，其中步驟a)將培養(yǎng)物的克隆總數(shù)增加了1-5倍。
55．權(quán)利要求53的方法，其中步驟b)通過稀釋培養(yǎng)物并將每份等分試樣含有0.5-10個轉(zhuǎn)化子/克隆的等分試樣轉(zhuǎn)移至不同的容器中來進(jìn)行。
56．權(quán)利要求55的方法，其中步驟b)通過稀釋培養(yǎng)物并將每份等分試樣含有0.5-5個轉(zhuǎn)化子/克隆的等分試樣轉(zhuǎn)移至不同的容器中來進(jìn)行。
57．權(quán)利要求56的方法，其中步驟b)通過稀釋培養(yǎng)物并將每份等分試樣含有0.5-1個轉(zhuǎn)化子/克隆的等分試樣轉(zhuǎn)移至不同的容器中來進(jìn)行。
58．權(quán)利要求53的方法，其中步驟b)包括步驟
a)將熒光物質(zhì)插入細(xì)胞，其特征在于通過與細(xì)胞內(nèi)部的生物化合物反應(yīng)而改變發(fā)射光強度，
b)利用FACS儀篩選、選擇和分離發(fā)射光強度發(fā)生變化的細(xì)胞。
59．權(quán)利要求53的方法，其中步驟c)將各個容器中的克隆數(shù)目增加至107-108個克隆/ml。
60．權(quán)利要求53的方法，其中通過將細(xì)胞與含有熒光物質(zhì)的溶液混合而使細(xì)胞與熒光物質(zhì)接觸。
61．權(quán)利要求53的方法，其中細(xì)胞是宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，并且轉(zhuǎn)化子含有得自核苷酸來源的基因文庫，步驟a)或c)在能選擇性殺死或抑制未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
62．權(quán)利要求61的方法，其中通過使用含有對非克隆宿主細(xì)胞而言為有效量的抗生素的培養(yǎng)基來殺死或抑制生長。
63．權(quán)利要求53的方法，其中步驟d)包括將細(xì)胞與兩種或多種熒光物質(zhì)接觸。
64．工業(yè)化生產(chǎn)新的生物化合物的方法，所述方法包括
a)根據(jù)上述任一權(quán)利要求鑒定所述生物化合物和編碼該生物化合物的核苷酸序列，
b)培養(yǎng)含有經(jīng)鑒定的核苷酸序列的微生物，
c)回收生物化合物和任選地配制生物化合物。
65．測定木聚糖酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的木聚糖被木聚糖酶水解之后熒光偏振的變化。
66．測定果膠甲酯酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的甲基化果膠被果膠甲酯酶去甲基化之后熒光偏振的變化。
67．測定阿拉伯聚糖酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的阿拉伯聚糖被阿拉伯聚糖酶水解之后熒光偏振的變化。
68．測定轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移至第二化合物之后熒光偏振的變化。
69．權(quán)利要求68的方法，其中所述轉(zhuǎn)移酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，所述物質(zhì)是經(jīng)熒光標(biāo)記的肽，所述第二化合物是蛋白質(zhì)。
70．權(quán)利要求68的方法，其中所述轉(zhuǎn)移酶是木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶，所述物質(zhì)是經(jīng)熒光標(biāo)記的寡木葡聚糖，所述第二化合物是木葡聚糖。
71．測定甘露聚糖酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的半乳甘露聚糖被甘露聚糖酶水解之后熒光偏振的變化。
72．測定鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖被鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶水解之后熒光偏振的變化。
73．測定纖維素酶活性的方法，所述方法包括測定經(jīng)熒光標(biāo)記的纖維素或纖維素衍生物被纖維素酶水解之后熒光偏振的變化。
74．權(quán)利要求65-73的方法，其中在發(fā)酵液中測定酶活性。
75．權(quán)利要求65-73的方法，其中在經(jīng)純化或配制的酶產(chǎn)物中測定酶活性。
76．被熒光團(tuán)標(biāo)記的多糖，其含有6-DTAF和選自鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、PASC和半乳甘露聚糖的多糖。
77．被熒光團(tuán)標(biāo)記的多糖，其含有熒光素-5-氨基硫脲和選自木葡聚糖、阿拉伯聚糖和果膠的多糖。
78．被熒光團(tuán)標(biāo)記的多糖，其含有麗絲胺羅丹明磺酰氯和木聚糖。
全文摘要
篩選編碼生物化合物的核苷酸序列的方法,所述方法包括測定與生物化合物反應(yīng)的熒光物質(zhì)的熒光偏振,所述生物化合物是由含有該核苷酸序列的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的。
文檔編號C12P19/04GK1297487SQ9980515
公開日2001年5月30日 申請日期1999年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月6日
發(fā)明者L·康斯巴克, K·S·喬根森, J·瓦爾伯喬恩, C·T·喬根森, T·L·胡薩姆, S·厄恩斯特, S·莫勒 申請人:諾沃挪第克公司