專利名稱：制備阿霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞改善柔紅霉素至阿霉素轉(zhuǎn)化的方法，所述重組載體包含編碼柔紅霉素C-14羥化酶的DNA和賦予對(duì)蒽環(huán)素類抗生素的抗性的基因。
柔紅霉素類蒽環(huán)素(例如阿霉素、洋紅霉素和阿克拉霉素及其合成的類似物)是抗腫瘤療法中最廣泛應(yīng)用的藥劑(F.Arcamone，阿霉素(Doxorubicin),Academic Press New York,1981,pp.12；A.Grein,生化過程(Process Biochem.),16:34,1981；T.Kaneko,Chimicaoggi,1988年5月11日；C.E.Myers等，基于蒽環(huán)素和蒽二酮的抗癌劑的“腫瘤細(xì)胞殺傷的生化機(jī)制”(“Biochemical mechanism of tumour cellkill”in Anthracycline and Anthracenedione-Based Anti-cancerAgents)(Lown,J.W.編輯)，Elsevier Amsterdam,pp.527～569,1988；J.W.Lown,藥物療法(Parmac.Ther.),60:185,1993)。
柔紅霉素類蒽環(huán)素通常是通過各種鏈霉菌屬(Streptomyces)[波賽鏈霉菌(S.peucetius)、天藍(lán)微紅鏈霉菌(S.coeruleorubidus)、加利利鏈霉菌(S.galilaeus)、灰色鏈霉菌(S.griseus)、灰紅鏈霉菌(S.griseoruber)、標(biāo)記鏈霉菌(S.insignis)、綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridochromogenes)、S.bifurcus和鏈霉菌菌株C5(S.sp.strainC5)]菌株和通過Actinomyces carminata生產(chǎn)的天然化合物。阿霉素主要是通過波賽鏈霉菌菌株生產(chǎn)的。具體地說，柔紅霉素和阿霉素是在波賽鏈霉菌ATCC 29050和波賽鏈霉菌青灰亞種(S.peucetiussubsp.caesius)ATCC 27952中生產(chǎn)的。蒽環(huán)素阿霉素是由波賽鏈霉菌27952通過下列文獻(xiàn)中概述的方法從丙二酸、丙酸和葡萄糖生產(chǎn)的Grein,應(yīng)用微生物學(xué)進(jìn)展(Advan.Applied Microbiol.),32:203,1987以及Eckart和Wagner，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志(J.BasicMicrobiol.)28:137,1988。阿克醌霉素(11-脫氧-ε-紫紅霉酮)、ε-紫紅霉酮、紫紅霉素D、洋紅霉素和柔紅霉素都是該過程中產(chǎn)生的中間體。該途徑中的最后步驟涉及柔紅霉素至阿霉素的C-14羥基化。
用于柔紅霉素生物合成的基因是通過克隆試驗(yàn)從波賽鏈霉菌29050和波賽鏈霉菌27952獲得的(Stutzman-Engwall和Hutchinson,美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:3135,1988；Otten等，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)172:3427,1990)。如WO96/27014(公布日期為1996年9月6日)中描述的那樣，編碼柔紅霉素C-14羥化酶(它使柔紅霉素轉(zhuǎn)化成阿霉素)的基因是通過克隆試驗(yàn)從波賽鏈霉菌29050及其突變型獲得的，并且，它在鏈霉菌和大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的宿主細(xì)胞中被超量表達(dá)。
柔紅霉素生物合成聚簇的兩種基因(drrA和drrB，它們賦予淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)抗阿霉素和柔紅霉素的抗性)是從波賽鏈霉菌ATCC 29050菌株(Guilfoile和Hutchinson，美國國家科學(xué)院院報(bào)88:8553,1991)(Genbank的入藏登記號(hào)為M73758)和從波賽鏈霉菌7600突變型(EP-0371,112-A和Colombo等，細(xì)菌學(xué)雜志，174:1641,1992)克隆的。這些基因編碼兩種翻譯上偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，它們二者都是該宿主中柔紅霉素和阿霉素抗性所需的。這兩種基因之一的預(yù)計(jì)產(chǎn)物的序列類似于其它轉(zhuǎn)運(yùn)基因和抗性基因的產(chǎn)物(最值得注意的是來自哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞的P-糖蛋白)。另一種基因drrC(它賦予抗柔紅霉素和阿霉素的抗性，與DNA的切除修復(fù)中涉及的大腸埃希氏菌和藤黃微球菌(Micrococcus luteus)UvrA蛋白質(zhì)具有高度的序列相似性)是從波賽鏈霉菌ATCC 29050克隆的(Lomovskaya等，細(xì)菌學(xué)雜志178:3238,1996)。
本發(fā)明提供了一種通過重組載體在宿主細(xì)胞中改善柔紅霉素至阿霉素轉(zhuǎn)化的方法，所述重組載體包括含有編碼柔紅霉素C-14羥化酶的基因dxrA的DNA區(qū)或片段以及含有一種，兩種或三種選自賦予抗柔紅霉素和阿霉素的抗性的drrA、drrB和drrC的基因的DNA區(qū)或片段。最后的三種基因在宿主細(xì)胞中賦予抗阿霉素(所述轉(zhuǎn)化過程中的產(chǎn)物)高水平的抗性，使該過程比以前的更有效，以前的過程應(yīng)用以重組載體(只攜帶含有dxrA基因的DNA片段)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(描述于WO96/27014中，即使應(yīng)用了強(qiáng)啟動(dòng)子)。
本發(fā)明的DNA優(yōu)選包含drrA、drrB和drrC基因的全部三種或者只含drrA和drrB兩種基因。
所述DNA可按正確形式連接到異源轉(zhuǎn)錄控制序列上或者在適當(dāng)?shù)靥幱谳d體中的轉(zhuǎn)錄控制序列附近的限制位點(diǎn)處被克隆入載體中。通常，該載體是一種質(zhì)粒。所述重組載體可被用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。該宿主可以是放線菌(Actinomycetes)菌株(它不生產(chǎn)或者生產(chǎn)蒽環(huán)素類)，優(yōu)選是鏈霉菌屬菌株。


圖1(a～c)闡述了實(shí)施例1中描述的質(zhì)粒pIS156的構(gòu)建。該質(zhì)粒是通過在強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*(Bibb等，分子微生物學(xué)(Molec.Microbiol.)14:533,1994)控制下，將2.9kb的片段插入質(zhì)粒pWHM3(Vara等，細(xì)菌學(xué)雜志171:5872,1989)而構(gòu)建的，所述片段包含doxA(以前是dxrA)、dnrV(以前是dnrORF10)和dnrU(ΔdnrU，以前是dnrORF9)基因的C-末端部分，得自重組質(zhì)粒pIS70(WO 96/27014和A.InventiSolari等，GMBIM′96,P58)。
為了更好地描述本發(fā)明，我們提供了2.867nt的序列1，它包含doxA、dnrV和dnrU(ΔdnrU)基因的C-末端部分(編碼鏈的互補(bǔ)鏈)。
圖2(a～d)闡述了實(shí)施例1中描述的質(zhì)粒pIS284的構(gòu)建。該質(zhì)粒包含2.9kb片段，它擁有doxA、dnrV和dnrU基因的C-末端部分，得自重組質(zhì)粒pIS70，受強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*的控制，以及2.3Kb包含drrA和drrB抗性基因的DNA片段，所述drrA和drrB抗性基因得自被亞克隆入質(zhì)粒pWHM3的質(zhì)粒pWHM603(P.Guilfoile和C.R.Hutchinson,美國國家科學(xué)院院報(bào)88:8553,1991)。
圖3(a～c)闡述了實(shí)施例2中描述的質(zhì)粒pIS287的構(gòu)建。所述質(zhì)粒是通過在強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*的控制下，將2.9kb的BamHⅠ-HindⅢ片段(它包含doxA(以前是dxrA)、dnrV(以前是dnr-ORF10)和dnrU(ΔdnrU，以前是dnr-ORF9)基因的C-末端部分，得自重組質(zhì)粒pIS70(WO 96/727014))與2.3kb含drrA和drrB抗性基因的Xbal-HindⅢ DNA片段和3.9kb含drrC抗性基因的EcoRⅠ-HindⅢ片段一起插入質(zhì)粒pWHM3而構(gòu)建的。
圖1、2和3中示出的圖不需詳盡列出所述DNA片段中存在的全部限制位點(diǎn)。然而，報(bào)導(dǎo)的位點(diǎn)足以清楚識(shí)別所述DNA節(jié)段。
限制位點(diǎn)縮寫Ap,安普霉素；tsr,蘚霉素；amp,氨芐西林；B,BamHⅠ；G,BglⅡ；N,NotⅠ；K,KpnⅠ；E,EcoRⅠ；H,HindⅢ；P,PstⅠ；S,SphⅠ；X,XbaⅠ；L,BglⅠ；T,SstⅠ。
本發(fā)明提供了一種DNA分子，其中，將包含編碼柔紅霉素C-14羥化酶的基因的DNA區(qū)或片段連接到包含一種、兩種或三種選自drrA、drrB和drrC基因(它們編碼賦予宿主細(xì)胞抗柔紅霉素和阿霉素的抗性的蛋白質(zhì))的不同基因的DNA區(qū)或片段上。
包含編碼柔紅霉素C-14羥化酶的基因的DNA區(qū)優(yōu)選是通過用BamHⅠ-HindⅢ酶消化而得自重組質(zhì)粒pIS70(描述于專利WO96/27014中)的2.9 kb DNA區(qū)。該片段包含編碼C-14羥化酶的doxA基因。柔紅霉素C-14羥化酶將柔紅霉素轉(zhuǎn)化成阿霉素。該2.9 kb DNA片段還包含處于NotⅠ-KpnⅠ位點(diǎn)之間的dnrV基因和包含dnrU(ΔdnrU)基因的C-末端部分的NotⅠ-SphⅠ片段。
優(yōu)選地，編碼柔紅霉素C-14羥化酶的2.9 kb DNA片段被連接到包含得自質(zhì)粒pWHM603的drrA和drrB抗性基因的2.3kbXbal-HindⅢ DNA片段和含有得自質(zhì)粒pWHM264的drrC基因的3.9kbEcoRⅠ-HindⅢ片段上；在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該2.9 kb DNA片段只被連接到2.3kb Xbal-HindⅢ DNA片段上。
被描述于WO 96/27014中的、編碼柔紅霉素C-14羥化酶的全部DNA分子都可應(yīng)用于本發(fā)明中。
特別是，本發(fā)明的DNA分子可包含2.9 kb DNA片段的全部或者只是該片段的部分，至少1.2 kb長(zhǎng)度相應(yīng)于含doxA的DNA分子的KpnⅠ-BamHⅠ片段，doxA編碼柔紅霉素C-14羥化酶(它將柔紅霉素轉(zhuǎn)化成阿霉素)。該DNA分子基本上包含專利申請(qǐng)WO 96/27014中報(bào)導(dǎo)的序列，該序列被稱為“dxrA”序列。此外，柔紅霉素C-14羥化酶的推斷氨基酸序列也被示于該專利申請(qǐng)中。
本發(fā)明的DNA分子可包含至少2247nt的2.3kb Xbal-HindⅢ DNA片段，該片段包含drrA和drrB基因，這些基因編碼賦予宿主細(xì)胞抗柔紅霉素和阿霉素的抗性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的DNA分子可包含含有drrC抗性基因的3.9 kb EcoRⅠ-HindⅢ片段的全部或部分，至少2.5kb長(zhǎng)度相應(yīng)于含drrC的DNA分子的SstⅠ-SphⅠ片段，drrC編碼賦予宿主細(xì)胞抗柔紅霉素和阿霉素的抗性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括這樣的DNA它包含賦予抗柔紅霉素和阿霉素的抗性的基因，該基因的序列至少80％與drrA和drrB基因(Guilfoile和Hutchinson，美國國家科學(xué)院院報(bào)88:8553,1991)的序列和/或drrC基因(Lomovskaya等，細(xì)菌學(xué)雜志178:3238,1996)的序列相同。
本發(fā)明的DNA可以正確形式連接到異源轉(zhuǎn)錄控制序列上或者在適當(dāng)?shù)靥幱谳d體中的轉(zhuǎn)錄控制序列附近的限制位點(diǎn)處被克隆入載體中。優(yōu)選地，不同基因的轉(zhuǎn)錄可通過共同的強(qiáng)啟動(dòng)子如ermE*(Bibb等，分子微生物學(xué)14:533,1994)協(xié)調(diào)。
本發(fā)明的DNA分子可被連接入任何自主復(fù)制劑和/或整合劑(它包含一種DNA分子，該DNA分子中可被添加一個(gè)或多個(gè)另外的DNA節(jié)段)。不過，通常，所述載體是一種質(zhì)粒。一種優(yōu)選的質(zhì)粒是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒pWHM 3或pIJ702(Katz等，普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)129:27031,983)。其它合適的質(zhì)粒是pIJ680(Hopwood等，“鏈霉菌屬的遺傳操作。實(shí)驗(yàn)指南”(GeneticManipulation of Streptomyces.A laboratory Manual),John InnesFoundation,Norwich,UK,1985)和pWHM601(Guilfoile和Hutchinson,美國國家科學(xué)院院報(bào)88:8553,1991)。
可應(yīng)用任何合適的技術(shù)將所述DNA插入載體。可通過將該DNA在適當(dāng)位點(diǎn)處連接入線性化載體而實(shí)現(xiàn)插入。為此，可應(yīng)用粘性末端或平端的直接組合，均聚物加尾，或者應(yīng)用接頭分子或銜接分子。
可應(yīng)用重組載體轉(zhuǎn)化不生產(chǎn)或生產(chǎn)環(huán)蒽素類的合適的宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞可以是柔紅霉素或阿霉素敏感的(即，在一定量柔紅霉素或阿霉素的存在下不能生長(zhǎng))或者是柔紅霉素或阿霉素抗性的。在任何情況下，生成的重組克隆(通過用本發(fā)明的新重組載體轉(zhuǎn)化獲得的)比親代宿主顯示更高水平抗柔紅霉素和阿霉素的抗性。重組淺青紫鏈霉菌中的阿霉素抗性水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在生產(chǎn)蒽環(huán)素的波賽鏈霉菌ATCC29050和ATCC 27952菌株中觀察到的水平。
所述宿主可以是微生物(例如細(xì)菌)。不生產(chǎn)蒽環(huán)素類的放線菌屬菌株(尤其是淺青紫鏈霉菌株和其它鏈霧菌屬株)可被轉(zhuǎn)化。與波賽鏈霉菌dnrN突變型相比，淺青紫鏈霉菌TK 23是更合適的宿主，所述突變型是用重組質(zhì)粒pIS70轉(zhuǎn)化的，該pIS70包含用于柔紅霉素至阿霉素生物轉(zhuǎn)化的dxrA基因(WO 96/27014)。
本發(fā)明的重組載體還可被用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)柔紅霉素的合適的宿主細(xì)胞，以便增強(qiáng)柔紅霉素至阿霉素的轉(zhuǎn)化。
因此，包含它們的生產(chǎn)蒽環(huán)素類的突變型的波賽鏈霉菌ATCC29050和ATCC 27952菌株可被轉(zhuǎn)化。特別是，可應(yīng)用波賽鏈霉菌株WMH1654，它是得自波賽鏈霉菌ATCC 29050的突變菌株，并且被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 UniversityBoulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,USA，入藏登記號(hào)為ATCC55936。
鏈霉菌屬菌株的轉(zhuǎn)化體一般可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化而獲得。
本發(fā)明包括改善通過柔紅霉素轉(zhuǎn)化的阿霉素生產(chǎn)的方法，該方法包括在不生產(chǎn)蒽環(huán)素類的宿主中將添加的柔紅霉素變?yōu)榘⒚顾氐纳镛D(zhuǎn)化過程和在直接生產(chǎn)柔紅霉素的宿主中生產(chǎn)阿霉素的發(fā)酵過程。柔紅霉素至阿霉素的生物轉(zhuǎn)化過程該方法包括1)培養(yǎng)用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的不生產(chǎn)柔紅霉素的重組宿主細(xì)胞，往其中添加柔紅霉素，以及2)從培養(yǎng)物分離阿霉素。
在該方法中，可在20℃～40℃(例如24℃～37℃)的溫度下培養(yǎng)重組菌株。在24～96小時(shí)的生長(zhǎng)期中往培養(yǎng)基中添加柔紅霉素。優(yōu)選在振動(dòng)下進(jìn)行培養(yǎng)。在柔紅霉素存在下的培養(yǎng)時(shí)間可以是12～72小時(shí)。培養(yǎng)液中柔紅霉素的濃度可以是20～1000mcg/ml(例如100～400mcg/ml)。通過發(fā)酵生產(chǎn)阿霉素該方法包括1)培養(yǎng)用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的重組柔紅霉素生產(chǎn)宿主細(xì)胞，以及2)從培養(yǎng)物分離阿霉素。
在該方法中，可在20℃～40℃(例如26℃～34℃)的溫度下培養(yǎng)重組菌株。在振動(dòng)下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間可以是72～168小時(shí)。原料和方法細(xì)菌菌株和質(zhì)粒大腸埃希氏菌株DH5α(它是氨芐西林和安普霉素敏感的)被用于亞克隆DNA片段。宿主淺青紫鏈霉菌TK23得自D.A.Hopwood(John Innes Institute,Norwich,United Kindom)，宿主波賽鏈霉菌WMH1654是得自波賽鏈霉菌ATCC 29050的突變株，已被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 UniversityBoulevard,Manassas,Virginia 20110-2209,USA，入藏登記號(hào)為ATCC55936。質(zhì)?？寺≥d體是pGem-7Zf(+)和相關(guān)的質(zhì)粒(Promega,Madison,WI),pIJ4070(D.A.Hopwood)和大腸埃希氏菌-鏈霉菌屬穿梭載體pWHM3(Vara等，細(xì)菌學(xué)雜志171:5872,1989)。培養(yǎng)基和緩沖液大腸埃希氏菌株DH5α被保持在LB瓊脂上(Sambrook等，“分子克隆。實(shí)驗(yàn)指南”(Molecular Cloning.A Laboratory manual)，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。當(dāng)選擇轉(zhuǎn)化體時(shí)，以100μg/ml的濃度添加氨芐西林或安普霉素。淺青紫鏈霉菌TK23和波賽鏈霉菌WMH1654分別被保持在R2YE(Hopwood等，“鏈霉菌屬的遺傳操作。實(shí)驗(yàn)指南”，John InnesFoundation,Norwich,UK,1985)和ISP4(Difco,Detroit,MI)瓊脂培養(yǎng)基上。當(dāng)選擇轉(zhuǎn)化體時(shí)，在平板上鋪一層含濃度為50μg/ml蘚霉素的軟瓊脂。亞克隆DNA片段用適當(dāng)?shù)南拗泼赶疍NA樣品并通過標(biāo)準(zhǔn)方法在瓊脂糖凝膠上分離(Sambrook等，“分子克隆。實(shí)驗(yàn)指南”，第2版，ColdSpring Harbor PressC,old Spring Harbor,NY,1989)。從凝膠切除包含感興趣的DNA片段的瓊脂糖切片，應(yīng)用GENECLEAN裝置(Bio101,La Jolla,CA)或等效物從這些切片分離DNA。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等，“分子克隆。實(shí)驗(yàn)指南”，第2版，Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)將分離的DNA片段亞克隆入用于常規(guī)操作的大腸埃希氏菌和大腸埃希氏菌-鏈霉菌屬穿梭載體或用于表達(dá)實(shí)驗(yàn)的鏈霉菌屬載體。鏈霉菌和大腸埃希氏菌的轉(zhuǎn)化通過氯化鈣法(Sambrook等，“分子克隆。實(shí)驗(yàn)指南”，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY,1989)制備大腸埃希氏菌的感受態(tài)細(xì)胞并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等，“分子克隆。實(shí)驗(yàn)指南”，第2版，Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)轉(zhuǎn)化。淺青紫鏈霉菌TK23生長(zhǎng)在液態(tài)R2YE培養(yǎng)基中(Hopwood等，“鏈霉菌屬的遺傳操作。實(shí)驗(yàn)指南”，John Innes Foundation,Norwich,UK,1985)，在48hr后收獲。用10.3％(wt/vol)蔗糖溶液將菌絲體顆粒洗滌兩次并用于按Hopwood指南中概述的方法(Hopwood等，“鏈霉菌屬的遺傳操作。實(shí)驗(yàn)指南”，John Innes Foundation,Norwich,UK,1985)制備原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體顆粒懸浮于約300微升P緩沖液(Hopwood等，“鏈霉菌屬的遺傳操作。實(shí)驗(yàn)指南”，John Innes Foundation,Norwich,UK,1985)，將50微升該懸浮液的等分樣用于每次轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體是用質(zhì)粒DNA按Hopwood等(“鏈霉菌屬的遺傳操作。實(shí)驗(yàn)指南”，John InnesFoundation,Norwich,UK,1985)、Stutzman-Engwall和Hutchinson(美國國家科學(xué)院院報(bào)86:3135,1988)或者Otten等(細(xì)菌學(xué)雜志172:3427,1990)的小規(guī)模轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化的。在30℃的R2YE培養(yǎng)基上再生17hr后，在平板上鋪一層200μg/ml的蘚霉素，讓它在30℃下生長(zhǎng)直至孢子形成。柔紅霉素和阿霉素抗性水平的評(píng)估該抗性水平以最小抑制濃度(MIC)表示并通過應(yīng)用R2YE培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)兩倍稀釋法測(cè)定。將菌株置于R2YE培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)并在28℃下培養(yǎng)8～10天。重組菌株是在添加了20μg/ml蘚霉素的相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的。包含大約106～107活細(xì)胞/ml的細(xì)菌培養(yǎng)物是從在28℃、280rpm下、胰胨豆胨培養(yǎng)液(Tryptic SoyBroth)(Difo)中生長(zhǎng)了48小時(shí)的培養(yǎng)物制備的。通過玻璃珠均化培養(yǎng)物。取一菌環(huán)量均化后的培養(yǎng)物接種在含0.39～800μg/ml不同濃度的柔紅霉素和阿霉素的瓊脂板上。在30℃下將該瓊脂板培養(yǎng)7天，以防止可見生長(zhǎng)的最低濃度測(cè)定MICs。柔紅霉素至阿霉素的生物轉(zhuǎn)化將帶有本發(fā)明的質(zhì)粒的淺青紫鏈霉菌TK23轉(zhuǎn)化體接種入25ml含40μg/ml蘚霉素的液態(tài)R2YE培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物在300ml錐形瓶中生長(zhǎng)，在30℃下280rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)。生長(zhǎng)2天后，將2.5ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到25ml APM生產(chǎn)培養(yǎng)基((g/l)葡萄糖(60)、酵母提取物(8)、麥芽提取物(20)、NaCl(2)、3-(嗎啉代)丙磺酸(MOPS鈉鹽)(15)、MgSO4·7H2O(0.2)、FeSO4·7H2O(0.01)、ZnSO4·7H2O(0.01)，補(bǔ)加了20μg/ml蘚霉素。在生長(zhǎng)期48hr添加400μg/ml柔紅霉素。使培養(yǎng)物在300ml錐形瓶中生長(zhǎng)，在30℃下280rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)72hr。用25mg/ml草酸酸化每一種培養(yǎng)物，在30℃下280rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)30min后，用等體積乙腈∶甲醇(1∶1)在30℃和300rpm下提取2hr。將提取液過濾，通過反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)分析濾液。RP-HPLC是應(yīng)用Vydac C18柱(4.6×250mm；5μm粒徑)以0.385ml/min的流速操作的。流動(dòng)相A是O.2％三氟乙酸(TFA，得自Pierce Chemical Co.)(于H2O中)，流動(dòng)相B是O.078％TFA[于乙腈(得自J.T.Baker Chemical Co.)中]。用20～60％溶于A相中的B相的線性梯度在33分鐘內(nèi)進(jìn)行洗脫并應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器定在488nm(帶寬12微米)監(jiān)測(cè)。柔紅霉素和阿霉素(10μg/ml于甲醇中)被用作外標(biāo)而定量分析從培養(yǎng)物分離的這些代謝物的量。阿霉素生產(chǎn)用本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化波賽鏈霉菌WMH1654突變型。將轉(zhuǎn)化體接種入25ml補(bǔ)加了20μg/ml蘚霉素的R2YE培養(yǎng)基。使培養(yǎng)物在30℃和280rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上的300ml錐形瓶中生長(zhǎng)。生長(zhǎng)2天后，將2.5ml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到25ml補(bǔ)加了20μg/ml蘚霉素的APM培養(yǎng)基。使培養(yǎng)物在28℃和280rpm旋轉(zhuǎn)振蕩器上的300ml錐形瓶中生長(zhǎng)96～120小時(shí)。用25mg/ml草酸酸化每一種培養(yǎng)物，在30℃下280rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)45min后，用等體積乙腈∶甲醇(1∶1)在30℃和300rpm下提取2hr。將提取液過濾，通過RP-HPLC按用于分析所述生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的同樣方法分析濾液。
包含drrA和drrB抗性基因的2.3kb BgⅡ片段在弄成平端后被從質(zhì)粒pWHM603轉(zhuǎn)移入質(zhì)粒pBluescriptⅡ SK+(Stratagene)的SmaⅠ位點(diǎn)而獲得質(zhì)粒pdrrAB，再將XbaⅠ-HindⅢ片段從pdrrAB轉(zhuǎn)移入載體pIJ4070而獲得pIS278。然后，pIS278被EcoRⅠ-XbaⅠ消化后被插入EcoRⅠ-XbaⅠ質(zhì)粒pWHM3中而獲得質(zhì)粒pIS281。用XbaⅠ消化該質(zhì)粒，插入質(zhì)粒pIS156的XbaⅠ片段而獲得質(zhì)粒pIS284。
序列表<110>PHARMACIA & UPJOHN S.P.A.<120>制備阿霉素的方法<130>1615-9003<140>PCT/UNKNOWN<141>1999-04-22<150>09/065,606<151>1998-04-24<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2870<212>DNA<213>波賽鏈霉菌<220><221>misc_feature<222>Comolement((I)..(2870))<223>編碼鏈的互補(bǔ)鏈<400>1ggatccgcac cgggtacacg gcacgggacc gcccaccgcg cggtgcgcgg cgggcggtcc 60cgtgccggtc gcggccggcg gatcagcgca gccagacggg cagttcggtg agccgcgccg 120tctgggcccc cttccggcac caccgcaact cgtcgtacgg cacggccagt cgggcctcgg 180ggaacctgct gcgcagtacg ccgatcatcg tgcgcgactc cagctgggcg agctgctccc 240cgatgcagta gtgcggcccg tcgccgaagg tgagccgccg ccacgaggga cggtccgggt 300ggaaggcgtg cggggcgtcg tgatggcggc cgtcggtgtt ggtgccctcg atgtccacca 360gcaccggcgc tccgcggggc agccggacgc cgccgatggt cacctccgtg gcagcgaacc 420tccacaacgt gtagggcacc ggcgggtggt agcgcagcgc ctcctccacg aaccgggaga 480cggcgtcctc gtcggcatcc gccgcgaggc ggcccgccag gacctccgcg agcaggaagc 540ccaggaagga gccggtggtg tcgtggccgg cgaagatgag cccggtgatc atgtagacga 600gctggtcgtc ggagaccgag ccgaactcgg cctgcgcgcg ctcgtacagc acgcgggtca 660tggtcggggt gtcgttccgc cgggctgagt gcacggcttc gaggagcagg ctctccaggg 720ccgaggtgtc cggcacgccc ccggcagggt ccgtgccgtc acccccgccg ctctgcgggc 780cgccgaggcc gagtgccttg agaacgctga cggcctcgcg ggccatcgcc ggatcggtga 840ccggcacacc gagcagctcg cagatgacca acagcgggaa gtggtacgcg aagccgccga 900tcagctcggc cggtttgccc gaccggccgg aggcgtcggc gagttcggtg agcagccggc 960cggcgatcgc ggcgatgcga tccgtccgct cggccagccg gcgcgggttg aacgcaggtg 1020cgtggatgcg gcgcaggcgc cggtgggcct cgccgtccac ggcgatgagc gtgaacggac 1080gcagctccgg aacggggatg tcgagaccgt cgtccacccc ccgccaggcg gcgggggcga 1140ggtcggggtc cttcacgaac cggggatcgg ccagcacctc gcgggcgagg gcgtcatcgg 1200tgatgaccca ggcgggtccg cccgcggggg cgttcacctc gacgaccggg cccgcctccc 1260ggaaggcgtc gtgcacctcg ggcttgcgct gcatggtcat catgggacac gcgaacgggt 1320cgacggccac ccggggcgcc tcgccgctca cgaggcaccg cccgccgccg cggggtaccc 1380ctcccgcagt tcgaccaccg agaagccggc cccgtgcggg tcgagcaggt ccgcccgccg 1440ccccctgggc gtgtcggcgg gctcgttctc gacggagccg ccgagttcaa cggcgcgccg 1500gaccgtcgcg tcgcagtcgt gcacggcgaa cagcacggcc cagtgcggcc gtaccgcgcc 1560ggtgacgccc agctcctggg tgccggcgac cggtgtgtca ccgatgtgcc agaccgggtc 1620ggtgacgccc ttcagtccgg tgtcggccgg agccaggccg agggtcgccg ggtagaagtc 1680ccgggcggcc ccgatgccgt cggtcaccag ctcgacccag ccgaccgagc cgggcacgcc 1740cgtcacctcc gcgccctcca tgactccctt gcgccagacc gcgaacgcgg ccccggcggg 1800gtcggcgaag accgccatcc ggccgaggcc gaggacgtcc atcggagtca tgatgacctc 1860gccgcccgcc gtctcgaccc gcttggtcag tgcgtcggcg tcgtcggtgg cgaagtacac 1920ggtccagatg gccggcatgc cgtgctggtc gttcccgggc ccgtacggcc ggtggtaggg 1980ggtgtcgatc tggtggcggg cgaccgcggc gaccagcttc ccgtcggagc tgaacgtcgt 2040gtatcccccg gcgcccgggt cgctgaccac ggtggcggtc cagccgaaca ggccggtgta 2100gaagtcggcc gaggcggcga catcgggcga accgaggtcg aaccatgcgg gggcgccggg 2160cgcgaacctg gtcacgaatc gttcctttcg atggatcggc acacgagcgt ctgcgctcgc 2220ggatgagacg gacatctcgc ggatgagacg gacatgcggg cggggcgggc cgccgccgtc 2280agtgcgcggt gtcgccgacg gcggccgcgc cggcctccca gagcttcgcc gcgaggccgg 2340cgtcggcggt cgggccgctc accggggaca gccgccggtc gctgtagtag ccgcccgtgg 2400tcaactcctc ggccggcgcg gacgccagcc acacgagggt gtcggcgccc ttcgccgcgg 2460agcgcaggaa ggggttgaac cggaagtagg acgaggcgac cgtgccccgt ccgatgcggg 2520tgcggacctc accggggtga tagctgaccg ccagcacgtc cggccagcgc ctggcggcct 2580ccgccgcggt catgatgttg gcctgtttgg acgtgccgta cgcctggccg gcgctgtagc 2640ggtgacggtc gccgttgagg tcgtccgggt cgatccggcc ctgggtgtac gcgtcggacg 2700aggtgaggat cagccgcccg cccgcgagcc gctcccgcag cagccgtgcc agcaggaagc 2760ctgcgaggtg attgacctgg atggtggcct cgaacccgtc ctgggtcgtg gtgcgcgacc 2820agaacatgcc gccggcgttg ctggccatga catcgatgcg cgggtaccgg2870
權(quán)利要求
1．一種DNA分子，它包含一個(gè)含有編碼柔紅霉素14-羥化酶的基因doxA的DNA區(qū)和一個(gè)含有至少一種賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因的DNA區(qū)。
2．權(quán)利要求1的DNA分子，它進(jìn)一步包含一種強(qiáng)啟動(dòng)子。
3．權(quán)利要求2的DNA分子，其中，所述強(qiáng)啟動(dòng)子是ermE*。
4．權(quán)利要求1的DNA分子，其中，所述賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因選自drrA、drrB和drrC基因及其任意混合物。
5．權(quán)利要求4的DNA分子，其中，所述賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因是drrA和drrB基因。
6．權(quán)利要求4的DNA分子，其中，所述賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因是drrA、drrB和drrC基因。
7．權(quán)利要求1的DNA分子，其中，包含編碼柔紅霉素14-羥化酶的基因doxA的區(qū)的長(zhǎng)度是2.9kb。
8．權(quán)利要求7的DNA分子，其中，包含基因doxA的片段相應(yīng)于包含doxA核苷酸序列的KpnⅠ-BamHⅠ片段。
9．權(quán)利要求5的DNA分子，其中，包含所述drrA和drrB基因的所述區(qū)是2.3kb XbaⅠ-HindⅢ DNA片段。
10．權(quán)利要求1的DNA分子，其中，所述賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因與選自drrA、drrB和drrC基因的基因至少是80％相同的。
11．一種包含權(quán)利要求1的DNA分子的載體。
12．權(quán)利要求11的載體，其中，所述載體是質(zhì)粒。
13．權(quán)利要求12的質(zhì)粒，其中，所述質(zhì)粒選自pIS284和pIS287。
14．一種用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
15．權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞不生產(chǎn)柔紅霉素。
16．權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是生產(chǎn)柔紅霉素的細(xì)菌細(xì)胞。
17．權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是鏈霉菌屬細(xì)胞。
18．一種用于將柔紅霉素生物轉(zhuǎn)化成阿霉素的方法，它包括如下步驟在含有柔紅霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種重組宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞包含一種DNA分子，該DNA分子包含一個(gè)含有編碼柔紅霉素14-羥化酶的基因doxA的DNA區(qū)和一個(gè)含有至少一種賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因的DNA區(qū)，其中，所述宿主細(xì)胞不生產(chǎn)柔紅霉素，以及從所述培養(yǎng)基分離任何生成的阿霉素。
19．一種通過發(fā)酵生產(chǎn)阿霉素的方法，它包括如下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種重組宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞包含一種DNA分子，該DNA分子包含一個(gè)含有編碼柔紅霉素14-羥化酶的基因doxA的DNA區(qū)和一個(gè)含有一種或多種賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因的DNA區(qū)，其中，所述宿主細(xì)胞是生產(chǎn)柔紅霉素的細(xì)菌細(xì)胞，以及從所述培養(yǎng)基分離任何生成的阿霉素。
全文摘要
轉(zhuǎn)化柔紅霉素至阿霉素的能力可通過用包含一種DNA分子的重組載體轉(zhuǎn)化一種宿主細(xì)胞而改善,所述DNA分子包含:含有編碼柔紅霉素14－羥化酶的基因doxA的DNA區(qū)或片段以及含有一種或多種賦予柔紅霉素和阿霉素抗性的基因的DNA區(qū)或片段。
文檔編號(hào)C12R1/465GK1298453SQ99805400
公開日2001年6月6日 申請(qǐng)日期1999年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月24日
發(fā)明者A·I·索拉瑞, G·扎諾索, S·費(fèi)利皮尼, F·陶緹, S·歐特恩, A·L·庫羅姆博, C·R·哈啻尼森 申請(qǐng)人:法瑪西雅厄普約翰公司