專利名稱：非生成麥芽糖的外淀粉酶及其在延遲淀粉凝沉方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)，尤其是能夠降解淀粉的蛋白質(zhì)。
具體地說，本發(fā)明涉及能夠延遲有害的淀粉凝沉的蛋白質(zhì)的應用。
有害的凝沉過程，諸如變陳，通常發(fā)生在淀粉介質(zhì)、特別是水性淀粉懸浮液的加熱和冷卻之后，并且是由于糊化淀粉轉(zhuǎn)化為越來越有序狀態(tài)而引起的。
更具體地講，本發(fā)明涉及能夠延遲支鏈淀粉的有害凝沉的蛋白質(zhì)的應用。
更具體地講，本發(fā)明涉及制備烤面包制品的蛋白質(zhì)的應用以及涉及所述烤面包制品本身。
更具體地講，本發(fā)明涉及延遲焙烤面粉面包制品中的變陳。
更具體地講，本發(fā)明涉及變陳延遲或減少的焙烤面粉面包制品的生產(chǎn)方法，包括將非生成麥芽糖的(non-maltogenic)外淀粉酶(exoamylase)加入發(fā)酵面團中。
本發(fā)明也涉及用于面團和焙烤面粉面包制品的包含非生成麥芽糖的外淀粉酶的增酵劑組合物。
背景技術：
淀粉包括支鏈淀粉和直鏈淀粉。支鏈淀粉是高度分支的具有短α-(1→4)-D-葡聚糖鏈的糖聚合物，所述葡聚糖鏈在分支點通過α-(1→6)鍵連接在一起，形成分支的叢狀結構。每20-25個α-(1→4)聯(lián)葡萄糖殘基平均有一個分支點。相反，直鏈淀粉是線性結構，主要由不分支的α-(1→4)-D-葡聚糖單位組成。通常，淀粉含有約75％的支鏈淀粉分子和約25％的直鏈淀粉分子。
更具體地講，線性麥芽寡糖由2-10個通過α-(1→4)鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖單位構成。由于其特性諸如甜度低、持水量高并且防止蔗糖結晶[1]，因此這些化合物在食品工業(yè)具有潛在的應用。然而，制備更大量的聚合度高于3(即DP＞3)的麥芽寡糖繁瑣且昂貴。
作為背景資料，DP1=葡萄糖，DP2=麥芽糖，DP3=麥芽三糖，DP4=麥芽四糖，DP5=麥芽五糖，DP6=麥芽六糖，DP7=麥芽七糖，DP8=麥芽八糖，DP9=麥芽九糖，DP10=麥芽十糖。
產(chǎn)生特定長度的麥芽寡糖的微生物酶的發(fā)現(xiàn)，使得可以生產(chǎn)更大量的這些寡糖[2]。
淀粉酶是淀粉降解酶，分類為水解酶，它切割淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷鍵。一般而言，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1,α-D-(1→4)葡聚糖葡聚糖水解酶)被定義為內(nèi)作用酶，以隨機方式切割淀粉分子中的α-D-(1→4)O-糖苷鍵[3]。相反，外作用淀粉水解酶諸如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2,α-D-(1→4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和某些產(chǎn)物特異性淀粉酶從底物的非還原末端切割淀粉分子[4]。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(E.C.3.2.1 20,α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3,α-D-葡聚糖葡糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可以由淀粉產(chǎn)生特定長度的麥芽寡糖。
先前已經(jīng)鑒定出產(chǎn)生具有特定DP的麥芽寡糖的幾種淀粉酶，包括得自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoma)[5,6]、枯草桿菌(Bacillussubtilis)[7]、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)G-6[8]、環(huán)狀芽孢桿菌F-2[9,10]和熱速芽孢桿菌(B.caldovelox)[11,12]的產(chǎn)生麥芽六糖的淀粉酶。已經(jīng)在地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)584[13]和種名待定的假單胞菌(Pseudomonas spp.)[14,15]中檢測到產(chǎn)生麥芽五糖的淀粉酶。此外，已經(jīng)報道了得自施氏假單胞菌(Pseudomona stutzeri)NRRL B-3389[16,171、芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)MG-4[18]和假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)IMD353[19]的產(chǎn)生麥芽四糖的淀粉酶以及得自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)NA-468[20]和枯草桿菌[21]的產(chǎn)生麥芽三糖的淀粉酶。
EP-B1-298,645描述了一種采用遺傳工程技術制備施氏假單胞菌或嗜糖假單胞菌(P.saccharophila)的外麥芽四糖水解酶的方法。
US-5,204,254描述了天然的和遺傳修飾的嗜堿細菌(DSM 5853)的外麥芽五糖水解酶。
已經(jīng)鑒定了非常少的在高pH下有活性的產(chǎn)物特異性淀粉酶。已經(jīng)鑒定的那些淀粉酶的實例包括得自芽孢桿菌屬菌種H-167的產(chǎn)生麥芽六糖的淀粉酶[22,23]、得自細菌分離物(163-26,DSM 5853)的產(chǎn)生麥芽五糖的淀粉酶[24]、得自芽孢桿菌屬菌種IMD370的產(chǎn)生麥芽四糖和更小的麥芽寡糖的淀粉酶[25]以及得自芽孢桿菌屬菌種GM 8901的最初由淀粉產(chǎn)生麥芽六糖、然后在延長的水解期間將其轉(zhuǎn)化為麥芽四糖的淀粉酶[26]。
在水存在下加熱的淀粉粒經(jīng)歷其中液體被溶漲的淀粉粒吸收的稱為凝膠化的有序-無序相轉(zhuǎn)變。不同的淀粉凝膠化溫度不同，且對于天然的未修飾的淀粉而言，凝膠化溫度取決于其生物來源。
根據(jù)的淀粉濃度，冷卻將凝膠化相轉(zhuǎn)變?yōu)檎硰椥院驈椥阅z。在此過程中，直鏈淀粉和支鏈淀粉鏈再締合形成更加有序的結構。隨著時間的推移，形成更多的締合，并且它們甚至更加有序。人們認為，支鏈淀粉鏈DP 15-20的締合導致熱致可逆的準晶體結構。
有害凝沉的結果是所述糊或凝膠系統(tǒng)的持水量改變，這對凝膠結構和食用價值有重要關聯(lián)。
已知烤面包制品的質(zhì)量在貯藏期間逐漸變質(zhì)。面包瓤喪失了柔軟度和彈性，變得堅實并且碎屑多。這種所謂的變陳主要是因為淀粉的有害凝沉，人們認為這是糊化淀粉在焙烤期間從無定形狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闇式Y晶狀態(tài)。面包瓤堅實度的增加通常用作衡量面包變陳過程的尺度。
當新鮮焙烤的面包冷卻時，直鏈淀粉部分在數(shù)小時內(nèi)凝沉產(chǎn)生網(wǎng)絡。這一過程是有益的，因為它產(chǎn)生堅實度低且切片性能改善的所需的面包瓤結構。在焙烤后數(shù)天期間，在糊化淀粉粒內(nèi)發(fā)生更多的支鏈淀粉逐漸結晶。在這一過程中，人們認為支鏈淀粉增強其中包埋淀粉粒的直鏈淀粉網(wǎng)絡。這種增強導致面包瓤的堅實度增加。這種增強是面包變陳的主要原因之一。
支鏈淀粉有害凝沉或結晶的速率取決于支鏈淀粉側鏈的長度。根據(jù)這一點，谷類支鏈淀粉的凝沉速率低于平均鏈長度比谷類支鏈淀粉長的豌豆或馬鈴薯的支鏈淀粉的凝沉速率。
以下對支鏈淀粉凝膠系統(tǒng)的觀察支持這一點具有DP(即聚合度)≤11的平均鏈長的支鏈淀粉根本不結晶。此外，存在DP 6-9的非常短的鏈似乎可能因為位阻而抑制周圍較長側鏈的結晶。因此這些短鏈似乎具有強的抗有害凝沉效應。根據(jù)這一點，支鏈淀粉凝沉與DP 14-24的側鏈的摩爾份數(shù)成正比，而與DP 6-9側鏈的摩爾份數(shù)成反比。
在小麥和其它谷類中，支鏈淀粉的外部側鏈范圍為DP 12-19。因此，支鏈淀粉側鏈的酶促水解可以顯著降低其結晶傾向。
本領域已知通過采用生成葡萄糖和生成麥芽糖的外淀粉酶諸如淀粉糖苷酶(通過釋放葡萄糖水解淀粉)和生成麥芽糖的外淀粉酶或β-淀粉酶(通過從非還原鏈末端釋放麥芽糖而水解淀粉)來延遲面包變陳。
在這方面，Jakubczyk等(Zesz.Nauk.Sck.Gl.Gospod Wiejsk.Warzawie,Technol.Reino-Spozyw,1973,223-235)報道，淀粉葡糖苷酶可以延遲焙烤的小麥粉面包的變陳。
JP-62-79745和JP-62-79746陳述，使用分別由嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothernophilus)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)產(chǎn)生的β-淀粉酶可以有效地延遲淀粉食品包括面包的變陳。
EP-A-412,607公開了通過將熱穩(wěn)定性外淀粉酶加入面團，生產(chǎn)具有變陳延遲特性的面包制品的方法，其中所述熱穩(wěn)定性外淀粉酶在凝膠化前不被失活。僅淀粉葡糖苷酶和β-淀粉酶列為待使用的合適的外淀粉酶。該外淀粉酶的量在焙烤期間，通過從直鏈淀粉或支鏈淀粉的非還原末端將葡萄糖或麥芽糖斷開來選擇性地改變支鏈淀粉組分的結晶特性。根據(jù)EP-A-412,607所述，所述外淀粉酶選擇性地降低支鏈淀粉的結晶性能，而基本上不影響直鏈淀粉的結晶性能。
EP-A-494,233公開了使用生成麥芽糖的外淀粉酶以α-構型釋放麥芽糖，所述麥芽糖在生產(chǎn)具有變陳延遲性能的焙烤制品的過程中在凝膠化之前不被失活。具體僅公開了得自芽孢桿菌屬菌株NCIB 11837的生成麥芽糖的α-淀粉酶。顯然，所述生成麥芽糖的外淀粉酶通過從多糖鏈的非還原末端以分步方式去除α-麥芽糖單位，水解淀粉(和相關多糖)的(1→4)-α-葡糖苷鍵。
因此，現(xiàn)有技術指出，某些生成葡萄糖的外淀粉酶和生成麥芽糖的外淀粉酶通過縮短支鏈淀粉側鏈選擇性地減小支鏈淀粉有害的凝沉傾向，可以提供抗變陳效應。
然而，仍需要提供不同且有效的、最好更有效的延遲淀粉制品(特別是焙烤制品，更特別為面包制品)有害凝沉(諸如延遲變陳)的方法。
本發(fā)明也提供可用于本發(fā)明方法的酶。
本發(fā)明的酶為淀粉酶。更具體地講，本發(fā)明的酶為非生成麥芽糖的外淀粉酶。
應該注意，非生成麥芽糖的外淀粉酶迄今尚未用以延遲淀粉制品有害凝沉，更不用說延遲焙烤制品的變陳了。
因此，按照本發(fā)明的第一方面，提供淀粉制品的生產(chǎn)方法，包括向淀粉介質(zhì)中加入非生成麥芽糖的外淀粉酶，所述外淀粉酶能夠通過從支鏈淀粉側鏈的非還原末端切下主要由4-8個D-吡喃葡糖基單位組成的線性麥芽寡糖而水解淀粉。
將非生成麥芽糖的外淀粉酶加入淀粉介質(zhì)中可以發(fā)生在所述淀粉制品加熱期間和/或之后。
因此，按照本發(fā)明的第二方面，提供用按照本發(fā)明的方法獲得的焙烤制品。
因此，按照本發(fā)明的第三方面，提供面團增酵劑組合物；其中所述組合物包含一種非生成麥芽糖的外淀粉酶和至少一種另一面團組分或面團添加劑。
因此，按照本發(fā)明的第四方面，提供非生成麥芽糖的外淀粉酶在淀粉制品中延遲淀粉制品有害凝沉方面的應用。
因此，按照方面的第五方面，提供一種新的非生成麥芽糖的外淀粉酶。
本發(fā)明的這些方面和其它方面陳述于所附的權利要求書中，另外，以下陳述并討論本發(fā)明的這些方面和其它方面及其優(yōu)選方面。一般定義因此，本發(fā)明涉及能夠延遲淀粉介質(zhì)、尤其是淀粉凝膠有害凝沉的蛋白質(zhì)的應用。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及能夠延遲淀粉變陳的蛋白質(zhì)的應用。
另一方面，本發(fā)明涉及能夠延遲淀粉介質(zhì)諸如淀粉凝膠有害凝沉的蛋白質(zhì)的應用。
按照本發(fā)明，術語“淀粉”是指淀粉本身或其組分，尤其是支鏈淀粉。
按照本發(fā)明，術語“淀粉介質(zhì)”是指包含淀粉的任何合適的介質(zhì)。
術語“淀粉制品”是指含有或基于或衍生自淀粉的任何制品。
所述淀粉制品最好含有或基于或衍生自得自小麥粉的淀粉。
本文所用的術語“小麥粉”是小麥或其它谷物的細磨粉的同義詞。然而，該術語最好是是指得自小麥本身而不是得自另一種谷物的面粉。因此，除非另有說明，否則本文所用的術語“小麥粉”最好是指小麥粉本身以及存在于介質(zhì)中時的小麥粉，諸如面團。
優(yōu)選的面粉是小麥粉或黑麥粉或小麥粉和黑麥粉的混合物。然而，也設想了包含得自其它類型谷物諸如水稻、玉米、大麥和高粱的面粉的面團。
所述淀粉制品優(yōu)選面包房產(chǎn)品。
所述淀粉制品更優(yōu)選面包制品。
所述淀粉制品甚至更優(yōu)選焙烤面粉面包制品。
術語“焙烤面粉面包制品”不用說是指這樣的任何焙烤制品，所述制品基于磨碎谷物并對通過將面粉、水、發(fā)酵劑和在面團成形條件下混合可獲得的面團焙烤而制成。然而，正是在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，可以將另外的組分加入所述面團混合物中。
術語“淀粉酶”以其通常的意義使用-例如為特別是能夠催化淀粉降解的酶。特別是，它們是能夠切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷鍵的水解酶。
術語“非生成麥芽糖的外淀粉酶”是指該酶最初不將淀粉降解為大量的麥芽糖。在一個高度優(yōu)選的方面，該術語也是指該酶最初不將淀粉降解為大量的麥芽糖和葡萄糖。
在本發(fā)明之前，還沒有人建議將非生成麥芽糖的外淀粉酶用于延遲淀粉介質(zhì)、特別是淀粉凝膠的有害凝沉。
以下敘述用于測定按照本發(fā)明的淀粉酶活性的合適測定。為了方便起見，該測定被稱為“淀粉酶測定方案”。
因此，術語“非生成麥芽糖的外淀粉酶”最好是指如按照本文敘述的“淀粉酶測定方案”中所述的產(chǎn)物測定程序所分析的、最初不將淀粉降解為大量麥芽糖的酶。
在一個優(yōu)選方面，所述非生成麥芽糖的外淀粉酶可以表征為，如果于50℃的溫度、pH6.0下，將0.7單位的所述非生成麥芽糖的外淀粉酶在每ml緩沖液含10mg預沸騰的蠟質(zhì)玉米淀粉、含有50mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸和2mM氯化鈣的4ml水溶液中溫育15分鐘，則該酶將產(chǎn)生水解產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選的葡萄糖；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃配葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選包含4-8個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
為了易于參考以及為了本發(fā)明目的，于50℃的溫度、pH6.0下，將0.7單位的所述非生成麥芽糖的外淀粉酶在每ml緩沖液含10mg預沸騰的蠟質(zhì)玉米淀粉、含有50mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸和2mM氯化鈣的4ml水溶液中溫育15分鐘，可以將此特征稱為“蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗”。
因此，換句話說，優(yōu)選的非生成麥芽糖的外淀粉酶的特征為在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中有能力產(chǎn)生這樣的水解產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選的葡萄糖；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃配葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選包含4-8個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中的水解產(chǎn)物包括一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位和可選的葡萄糖的線性麥芽寡糖。蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中的水解產(chǎn)物也可以包括其它水解產(chǎn)物。然而，3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖的％(重量)基于由一種或多種2-10個吡喃葡糖基單位和可選葡萄糖組成的水解產(chǎn)物的量。換句話說，3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖的％(重量)不基于除一種或多種由2-10個D-吡喃葡糖基單位和葡萄糖組成的麥芽寡糖以外的水解產(chǎn)物。
可以用任何合適的方法分析所述水解產(chǎn)物。例如，可以用配有脈沖電流測定的Dionex PA 100柱以及用例如由葡萄糖至麥芽七糖組成的已知線性麥芽寡糖作為標準，通過陰離子交換HPLC分析所述水解產(chǎn)物。
為了易于參考以及為了本發(fā)明的目的，用配有脈沖電流測定的Dionex PA 100柱以及用由葡萄糖至麥芽七糖組成的已知線性麥芽寡糖作為標準，通過陰離子交換HPLC分析所述水解產(chǎn)物，可以將此特征稱為“通過陰離子交換分析”。當然，正如剛剛指出的，其它分析技術以及其它的特定陰離子交換技術能滿足要求。
因此，換句話說，優(yōu)選的非生成麥芽糖的外淀粉酶的特征為在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中有能力產(chǎn)生這樣的水解產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包含一種或多種由2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選葡萄糖組成，其中能夠通過陰離子交換分析所述水解產(chǎn)物；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃配葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選包含4-8個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
關于本發(fā)明所用的術語“線性麥芽寡糖”以通常的含義使用，是指以α-(1→4)鍵連接的2-10個α-D-吡喃葡萄糖單位。
術語“可得自嗜糖假單胞菌的”是指該酶不需要一定得自嗜糖假單胞菌。而是該酶可以利用重組DNA技術制備。
關于可得自嗜糖假單胞菌的酶的術語“其功能等同物”，是指該功能等同物可以得自其它來源。功能等同的酶可以具有不同的氨基酸序列，但具有非生成麥芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同的酶可以具有不同的化學結構和/或分子式，但具有非生成麥芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同酶的非生成麥芽糖的外淀粉酶活性不需要一定與得自嗜糖假單胞菌的非生成麥芽糖的外淀粉酶相同。對于某些應用而言，所述功能等同酶具有的活性分布型最好至少與得到嗜糖假單胞菌的酶一樣。
術語“可得自克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)的”是指該酶不需要一定得自克勞氏芽孢桿菌。而是該酶可以利用重組DNA技術制備。
關于可得自克勞氏芽孢桿菌的酶的術語“其功能等同物”，是指該功能等同物可以得自其它來源。功能等同的酶可以具有不同的氨基酸序列，但具有非生成麥芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同的酶可以具有不同的化學結構和/或分子式，但具有非生成麥芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同酶的非生成麥芽糖的外淀粉酶活性不需要一定與得自克勞氏芽孢桿菌的非生成麥芽糖的外淀粉酶相同。對于某些應用而言，所述功能等同酶具有的活性分布型最好至少與得到克勞氏芽孢桿菌的酶一樣(諸如圖7所示的反應性分布型)。一般評述本發(fā)明基于這樣一個驚人的發(fā)現(xiàn)，即非生成麥芽糖的外淀粉酶在延遲或減少淀粉制品、特別是焙烤制品的有害凝沉諸如變陳方面非常有效。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶在延遲面包中的有害凝沉諸如變陳方面可以比生成葡萄糖和生成麥芽糖的外淀粉酶更有效。
有害凝沉的減少可以用本領域已知的標準技術測量。例如，以下在題為“用于測量凝沉的測定”一節(jié)中敘述了某些技術。
在我們的研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在面團中加入足夠量活性的非生成麥芽糖的外淀粉酶，象例如具有足夠熱穩(wěn)定性的外麥芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)，提供諸如在貯藏條件下與對照面包相比，有害凝沉減少、在某些情況下顯著減少的焙烤制品。相比之下，加入等量活性的、其熱穩(wěn)定性與所示非生成麥芽糖的外淀粉酶相當?shù)纳甥溠刻堑耐獾矸勖笇τ泻δ恋臏p少作用顯著降低。因此，非生成麥芽糖的外淀粉酶的抗凝沉效應比生成麥芽糖的外淀粉酶的抗凝沉效應更有效。我們相信，這種差異可能部分起因于支鏈淀粉側鏈縮短的程度。我們也相信，當采用按照本發(fā)明的釋放麥芽七糖和/或麥芽八糖和/或麥芽六糖的非生成麥芽糖的外淀粉酶時，所述抗凝沉效應可能甚至更顯著。
在我們的研究中，我們也純化并特征鑒定了于高pH下產(chǎn)生麥芽六糖的產(chǎn)物特異性淀粉酶活性。從克勞氏芽孢桿菌BT-21的耐堿菌株中分離出該淀粉酶。
此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過采用按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶可獲得的有害凝沉的延遲，在非常寬的范圍內(nèi)為劑量反應性的。這與得自生成麥芽糖的外淀粉酶的效應形成對比，生成麥芽糖的外淀粉酶的效應是相當有限的，并且具有強烈降低的劑量反應。淀粉酶一方面，本發(fā)明提供某些淀粉酶制備淀粉制品諸如面包房產(chǎn)品的應用。在該方面，為非生成麥芽糖的外淀粉酶的淀粉酶延遲或減少淀粉制品、特別是焙烤面粉面包制品的變陳性能(即降低變陳速率)。
所述淀粉酶最好為分離的形成和/或大致純形式。在此，術語“分離的”是指該酶不處于其天然環(huán)境中。
如上所述，本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶最初不將淀粉降解為大量的麥芽糖。
按照本發(fā)明，所述非生成麥芽糖的外淀粉酶能夠從支鏈淀粉側鏈的非還原末端切下主要是由4-8個D-吡喃葡糖基單位組成的線性麥芽寡糖。根據(jù)在淀粉酶測定方案(參見下文)中敘述的模型系統(tǒng)中其水解凝膠化蠟質(zhì)玉米淀粉的能力，鑒定具有該特征并適用于本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶。
當在淀粉酶測定方案中于所需條件下溫育15分鐘時，適于按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖的外淀粉酶將產(chǎn)生這樣的水解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物包含一種或多種由2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選的葡萄糖組成，使得水解產(chǎn)物的產(chǎn)物類型包含至少60％(重量)、特別是至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的非麥芽糖和葡萄糖的淀粉水解降低產(chǎn)物。
關于本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，當在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗描述的條件下溫育15分鐘時，適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖的外淀粉酶將提供所述水解產(chǎn)物，使得所述水解產(chǎn)物具有的產(chǎn)物模式為至少60％(重量)、特別是至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖，特別是由4-8個D-吡喃葡糖基單位構成的線性麥芽寡糖。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選方面，所述試驗中的所述水解產(chǎn)物具有的產(chǎn)物模式為至少60％(重量)、特別是至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的4或6個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選方面，所述試驗中的所述水解產(chǎn)物具有的產(chǎn)物模式為至少60％(重量)、特別是至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的4個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選方面，所述試驗中的所述水解產(chǎn)物具有的產(chǎn)物模式為至少60％(重量)、特別是至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的6個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
較好的是，所述非生成麥芽糖的外淀粉酶基本上不水解其初級產(chǎn)物，以將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖或麥芽三糖。如果是這種情況，則所述初級產(chǎn)物將作為底物與支鏈淀粉的非還原鏈末端競爭該酶，使得其抗凝沉效率降低。
因此，較好的是，當在類似于蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗的條件、但其中將15分鐘延長至300分鐘的條件下溫育所述非生成麥芽糖的外淀粉酶300分鐘時，as an aside，為了方便起見，對于這種情況，這種改進的蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗可以稱為“延長的蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗”，仍將產(chǎn)生所述水解產(chǎn)物，其中所述水解產(chǎn)物具有的產(chǎn)物模式將為至少50％、特別是至少60％(重量)、更優(yōu)選至少70％(重量)、最優(yōu)選至少80％(重量)的4-8個D-吡喃葡糖基單位。
例如，可用于本發(fā)明方法的非生成麥芽糖的外淀粉酶可以表征為，它在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中能夠產(chǎn)生包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選葡萄糖的水解產(chǎn)物，使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選由4-8個D-吡喃葡糖基單位構成的線性麥芽寡糖；并且其中所述酶可得自嗜糖假單胞菌或為其功能等同物。
作為另一實例，可用于本發(fā)明方法的另一非生成麥芽糖的外淀粉酶可以表征為，它在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育時間中能夠產(chǎn)生包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選葡萄糖的水解產(chǎn)物；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選由4-8個D-吡喃葡糖基單位構成的線性麥芽寡糖；并且其中所述酶可得自克勞氏芽孢桿菌或為其功能等同物；并且其中所述酶的分子量約101,000Da(通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳估計)和/或所述酶于pH9.5和55℃下有最佳活性。
最好是，適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖的外淀粉酶在焙烤期間有活性，并且在于約55℃開始的淀粉粒凝膠化期間和之后水解淀粉。熱穩(wěn)定性越好，則所述非生成麥芽糖的外淀粉酶可以有活性的時間越長，因此，提供的抗變陳效應越大。然而，在于約85℃以上的溫度焙烤期間，所述非生成麥芽糖的外淀粉酶優(yōu)先逐漸被失活，使得在焙烤過程之后在成品面包中基本上無活性。因此，較好的是，當于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃下，在具有4ml溶液(10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉的50mMMES、2mM氯化鈣的pH6.0，如上所述制備，并如上所述根據(jù)水解產(chǎn)物的釋放進行分析)的試管中溫育15分鐘時，適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖的外淀粉酶的最適溫度高于45℃并低于98℃。所述非生成麥芽糖的外淀粉酶的最適溫度最好高于55℃并低于95℃，更優(yōu)選高于60℃并低于90℃。
通過采用蛋白質(zhì)工程可以改進發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性可以較低的非生成麥芽糖的外淀粉酶，使其變得熱穩(wěn)定性更強，因此更適合按照本發(fā)明使用。因此，本發(fā)明設想了使用通過蛋白質(zhì)工程修飾而變得更加熱穩(wěn)定的非生成麥芽糖的外淀粉酶。
眾所周知，某些非生成麥芽糖的外淀粉酶可以具有某種程度的內(nèi)淀粉酶活性。在某些情況下，可以需要降低或消除這種類型的活性，因為內(nèi)淀粉酶活性由于積累分支的糊精而產(chǎn)生堅硬或膠粘的面包瓤，而可能負面影響成品面包制品的質(zhì)量。
因此，在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶每單位外外淀粉酶活性具有低于0.5內(nèi)淀粉酶單位(EAU)。
適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖的外淀粉酶每單位外淀粉酶活性優(yōu)選具有低于0.05EAU的內(nèi)外淀粉酶活性，更優(yōu)選每單位外淀粉酶活性低于0.01 EAU的內(nèi)淀粉酶活性。
所述內(nèi)淀粉酶單位可以利用下述內(nèi)淀粉酶測定方案測定。
適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖外淀粉酶的實例包括外麥芽四糖水解酶(EC.3.2.1.60)、外麥芽五糖水解酶和外麥芽六糖水解酶(E.C 3.2.1.98),它們水解淀粉多糖中的1,4-α-糖苷鍵，以便從還原鏈末端分步去除連續(xù)的麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽六糖殘基。實例是嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌的外麥芽四糖水解酶(EP-0 298 645 B1)、嗜堿性革蘭氏陽性細菌(US 5,204,254)和假單胞菌屬菌種(Shida等Biosci.Biotechnol.Biochem.,1992,56,76-80)的外麥芽五糖水解酶以及芽孢桿菌屬菌種#707(Tsmkamoto等，Biochem.Biophys.Res Commun.,1988,151,25-31)、環(huán)狀芽孢桿菌F2(Taniguchi,ACS Symp.,1991,Ser.458,111-124)和產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aetogenes)(Kainuma等，Biochim,Biophys.Acta,1975,410,333-346)的外麥芽六糖水解酶。
適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖外淀粉酶的另一實例是嗜堿芽孢桿菌屬菌株GM8901的外淀粉酶(28)。這是一種由淀粉產(chǎn)生麥芽四糖以及麥芽五糖和麥芽六糖的非生成麥芽糖的外淀粉酶。
此外，適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖外淀粉酶也包括水解淀粉多糖中1,4-α-糖苷鍵以從非還原鏈末端分別去除麥芽七糖或麥芽八糖的殘基的外麥芽七糖水解酶或外麥芽八糖水解酶?；蛘咄ㄟ^篩選野生型菌株可以發(fā)現(xiàn)外麥芽七糖水解酶和外麥芽八糖水解酶，或者可以通過蛋白質(zhì)工程從其它淀粉分解酶研制外麥芽七糖水解酶和外麥芽八糖水解酶。因此，通過蛋白質(zhì)工程從其它淀粉分解酶研制而成為非生成麥芽糖的外淀粉酶的非生成麥芽糖的外淀粉酶，也適用于本發(fā)明。新的淀粉酶一方面，本發(fā)明也提供適用于按照本發(fā)明制備淀粉制品諸如面包房產(chǎn)品的新的淀粉酶。本發(fā)明的新淀粉酶為非生成麥芽糖的外淀粉酶。在我們的研究中，我們已經(jīng)特征鑒定了適用于制備食品、特別是用于制備面包房產(chǎn)品的面團的這種新淀粉酶。
因此，本發(fā)明也提供非生成麥芽糖的外淀粉酶，其中所述非生成麥芽糖的外淀粉酶的特征還在于，它在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中能夠產(chǎn)生包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選葡萄糖的水解產(chǎn)物；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選由4-8個D-吡喃葡糖基單位構成的線性麥芽寡糖；并且其中所述酶可得自克勞氏芽孢桿菌或為其功能等同物；并且其中所述酶的分子量約101,000Da(通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳估計)和/或所述酶于pH9.5和55℃下有最佳活性。
所述淀粉酶最好為分離的形成和/或大致純形式。在此，術語“分離的”是指該酶不處于其天然環(huán)境中?？贵w本發(fā)明的酶也可以用來產(chǎn)生抗體，諸如利用標準技術產(chǎn)生抗體。因此，可以產(chǎn)生針對按照本發(fā)明的每種酶的抗體。所述抗體或某種抗體可以用來篩選其它合適的按照本發(fā)明的淀粉酶。另外，所述抗體或每種抗體可以用來分離一定量的本發(fā)明的酶。
關于抗體的生產(chǎn)，通過注射抑制劑或其任何部分、變異體、同系物、片段或衍生物或保留免疫原性特性的寡肽，可以免疫各種宿主，包括山羊、兔子、大鼠、小鼠等。根據(jù)宿主的種類，可以用不同的佐劑增強免疫應答。這類佐劑包括但不限于氟氏佐劑、礦物質(zhì)凝膠諸如氫氧化鋁和表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔戚血藍蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)是可以使用的潛在有用的人用佐劑。
甚至可以采用提供用培養(yǎng)的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術，制備針對所述酶的單克隆抗體。這些技術包括但不限于最初由Koehler和Milstein描述的雜交瘤技術(1975 Nature 256:495-497)、人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等(1983)Immunol Today 4:72；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)和EBV-雜交瘤技術(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss INc，第77-96頁)。另外，可以采用研制用于生產(chǎn)“嵌合抗體”、將小鼠抗體基因剪接至人抗體基因以獲得具有合適抗原特異性和生物活性的分子的技術(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312:604-608；Takeda等(1985)Nature 314:452-454)?；蛘?，可以采用描述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(US-A-4946779)來生產(chǎn)抑制劑特異性單鏈抗體。
·通過在淋巴細胞群體中誘導體內(nèi)生產(chǎn)，或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或如Orlandi等(1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837)和WinterG和Milstein C(1991；Nature 349:293-299)公開的多組(panels)高度特異性結合試劑，也可以生產(chǎn)抗體。增酵劑組合物如上所述，本發(fā)明的一個方面涉及用于淀粉制品、特別是面團和/或由所述面團制作的焙烤面粉面包制品的增酵劑組合物。
所述增酵劑組合物包含按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶和至少一種另一面團組分或面團添加劑。
按照本發(fā)明，所述另一面團組分或面團添加劑可以是上述的任何面團組分和面團添加劑。
有利的是，所述增酵劑組合物為干粉組合物，包含與至少一種另一組分或添加劑混合的按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶。然而，所述增酵劑組合物也可以是液體制劑，包含溶解或分散于水或其它液體中的按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶和至少一種另一組分或添加劑。應該理解，所述增酵劑組合物中的酶活性的量將取決于形成所述增酵劑組合物的所述另一組分和添加劑的量和類型。
可選的是，所述增酵劑組合物可以為完全混合物的形式，即一種所謂的預混合物，含有用于制備特定焙烤制品的所有干組分和添加劑。淀粉制品的制備按照本發(fā)明的一個方面，所述方法包括通過向淀粉介質(zhì)中加入合適的非生成麥芽糖的外淀粉酶，諸如本文所述的新的非生成麥芽糖的外淀粉酶之一，形成所述淀粉制品。
如果所述淀粉介質(zhì)為面團，則通過將面粉、水、按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶和其它可能的組分和添加劑混合在一起，制備所述面團。
作為另一實例，如果所述淀粉制品是焙烤面粉面包制品(這是高度優(yōu)選的實施方案)，則所述方法包括以任何合適的順序，將面粉、水和發(fā)酵劑在面團成形條件下混合，再加入合適的非生成麥芽糖外淀粉酶。
所述發(fā)酵劑可以是一種化學發(fā)酵劑，諸如碳酸氫鈉或任何釀酒酵母(面包酵母)的任何菌株。
所述非生成麥芽糖的外淀粉酶可以與包括水或面團組分混合物在內(nèi)的任何面團組分或與任何添加劑或添加劑混合物一起加入。
可以采用焙烤工業(yè)或制作基于面粉面團的制品的任何其它工業(yè)常用的常規(guī)面團制備方法，制備所述面團。
通常通過于180-250℃范圍的烤爐溫度下將發(fā)酵面團焙烤15-60分鐘，完成面粉面包制品諸如白面包、由過篩黑麥粉和小麥粉制作的面包、面包卷等的焙烤。在焙烤期間在外層面團層經(jīng)常為陡峭的溫度梯度(200→120℃)，其中產(chǎn)生焙烤制品特征性的面包皮。然而，由于產(chǎn)生蒸汽引起的熱的消耗，在焙烤過程結束時面包瓤中的溫度僅接近100℃。
所述非生成麥芽糖的外淀粉酶可以作為液體制劑或作為干粉組合物加入，所述液體制劑或干粉組合物或者包含所述酶作為唯一的活性組分，或者包含與一種或多種額外的面團組分或面團添加劑混合的所述酶。
為了進一步改進焙烤制品的特性并賦予所述焙烤制品不同的質(zhì)量，可以將另外的面團組分和/或面團添加劑摻入面團中。通常，這類另外加入的組分可以包括面團組分諸如鹽、谷粒、油脂、糖、食物纖維物質(zhì)、奶粉、谷蛋白和面團添加劑，諸如乳化劑、其它酶、水解膠體、食用香料、氧化劑、礦物質(zhì)和維生素。
乳化劑可用作面團增強劑(strengthener)和面包瓤防硬劑。作為面團增強劑，所述乳化劑可以提供對面團發(fā)酵時間(resting time)的耐受和對醒發(fā)期間沖擊的耐受。此外，面團增強劑將改善給定面團對發(fā)酵時間變化的耐受。大多數(shù)面團增強劑在烤爐中也改善面團在烤爐中鼓起，這意味著從醒發(fā)制品至焙烤制品的體積增加。最后，面團增強劑將乳化所述配方混合物中存在于的任何脂肪。
主要為甘油一酯特征的面包瓤的防硬歸因于乳化劑和淀粉的直鏈淀粉部分之間的相互作用，這種相互作用導致與直鏈淀粉形成不溶性包含復合物，所述不溶性包含復合物在冷卻時不再結晶且因此不導致面包瓤堅實。
可以用作另外的面團添加劑的合適的乳化劑包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乙酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的檸檬酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、食用脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸鈉和硬脂酰-2-乳酸鈣。
可以用作另外的面團添加劑的其它酶包括例如氧化還原酶，諸如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和抗壞血酸氧化酶；水解酶，諸如脂酶和酯酶；以及糖苷酶，如α-淀粉酶、支鏈淀粉酶和木聚糖酶。氧化還原酶諸如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶，可以用于面團增強和控制焙烤制品的體積，且可以加入木聚糖酶和其它半纖維素酶以改進面團處理性能、面包瓤的防硬和面包體積。脂酶可用作面團增強劑和面包瓤防硬劑，可以將α-淀粉酶和其它淀粉分解酶加入面團中以控制面包體積并進一步減小面包瓤堅實。
按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶的加入量通常為導致出現(xiàn)每kg面粉50-100,000單位、優(yōu)選每kg面粉100-50,000單位的成品面團。在本發(fā)明的有用實施方案中，該量的范圍為每kg面粉200-20,000單位。
在本文中，1單位的所述非生成麥芽糖的外淀粉酶定義為當于50℃在具有如下所述4ml含10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉的50mM MES、2mM氯化鈣pH6.0的試管中每分鐘釋放相當于1μmol還原糖的水解產(chǎn)物的量。用淀粉酶制備的食品本發(fā)明提供用于生產(chǎn)食品的合適的淀粉酶。也包括動物飼料在內(nèi)的典型的食品包括乳制品、肉制品、禽產(chǎn)品、魚制品和面包房產(chǎn)品。
所述食品最好是面包房產(chǎn)品，諸如上述面包房產(chǎn)品。加入本發(fā)明范圍內(nèi)的典型的面包房(焙烤)產(chǎn)品包括面包，諸如面包、面包卷、小奶油面包、餡餅基料等；椒鹽卷餅、玉米粉煎餅、糕餅、曲奇餅、餅干、kracker等。淀粉酶分析方案采用以下系統(tǒng)特征鑒定適合按照本發(fā)明使用的非生成麥芽糖的外淀粉酶。
作為原始背景資料，蠟質(zhì)玉米支鏈淀粉(以WAXILYS 200可得自Roquette，法國)是支鏈淀粉含量非常高(高于90％)的淀粉。
在50mM MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)、2mM氯化鈣pH6.0的緩沖液中將20mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉煮沸3分鐘，隨后于50℃溫育并在半小時內(nèi)使用。
1單位的所述非生成麥芽糖的外淀粉酶定義為當于50℃在具有如上所述4ml含10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉的50mM MES、2mM氯化鈣pH6.0的試管中每分鐘釋放相當于1μmol還原糖的水解產(chǎn)物的酶。
用麥芽糖作為標準品，并采用Bernfeld,Methods Enzymol.,(1954),1,149-158的二硝基水楊酸法或本領域已知的用于定量分析還原糖的另一種方法，測定還原糖。
通過于50℃在具有4ml含10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉的上述緩沖液的試管中將0.7單位非生成麥芽糖的外淀粉酶溫育15或300分鐘，測定所述非生成麥芽糖的外淀粉酶的水解產(chǎn)物模式。通過將試管浸入沸水浴中3分鐘終止反應。
采用配有脈沖電流測定的Dionex PA 100柱，采用乙酸鈉、氫氧化鈉和水作為洗脫劑，用從葡萄糖至麥芽七糖的已知線性麥芽寡糖作為標準品，通過陰離子交換HPLC分析并定量水解產(chǎn)物。用于麥芽八糖至麥芽十糖的反應因數(shù)為麥芽七糖的反應因數(shù)。內(nèi)淀粉酶分析方案將0.75ml酶溶液與6.75ml含0.5％(w/v)AZCL-淀粉酶(天青蛋白交聯(lián)淀粉酶，可得自Megazyme，愛爾蘭)的50mM MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)、2mM氯化鈣pH6.0于50℃一起溫育。5、10、15、20和25分鐘后，分別將1.0ml反應混合物轉(zhuǎn)移至4.0ml包含4％TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)的終止溶液。
將終止的樣品通過Whatman1號濾紙過濾，于590nm下對蒸餾水測量其光密度。應該稀釋分析的酶溶液，使得獲得的光密度為時間的線性函數(shù)。光密度對時間直線的斜率用來計算相對于標準品GRINDAMYLTM A1000(可得自Danisco Ingredients)的內(nèi)淀粉酶活性，該標準品被定義具有1000內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/g。用于測量凝沉(包括變陳)的分析關于本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶的抗變陳效應的評估，可以在利用Instron 4301通用食品結構分析儀或本領域相似的設備焙烤后1、3和7天，測量面包瓤的堅實度。
在本領域中傳統(tǒng)使用的、用來評估按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶對淀粉凝沉效應的另一種方法基于DSC(示差掃描量熱法)。由此測量得自用酶或不用酶(對照)焙烤的模型系統(tǒng)面團的面包瓤中凝沉支鏈淀粉的熔融熵。用于所述實施例的DSC設備為Mettler-ToledoDSC820，以每分鐘10℃的溫度梯度從20℃運行至95℃。為了制備樣品，稱量10-20mg面包瓤并將其轉(zhuǎn)移到Mettler-Toledo鋁盤中，然后密封。
所述實施例中所用的模型系統(tǒng)面團含有標準小麥粉和最適量的水或緩沖液，加入或不加入按照本發(fā)明的非生成麥芽糖的外淀粉酶。分別將它們在10g或50g Brabender Fainograph中混合6或7分鐘。將面團樣品置于帶蓋玻璃試管(15×0.8cm)中。將這些試管在水浴中進行焙烤首先于33℃溫育30分鐘，然后以1.1℃/min的梯度從33℃加熱至95℃，最后于95℃溫育5分鐘。隨后，在DSC分析之前將試管貯藏于20℃的恒溫箱中。概述總之，本發(fā)明基于這樣一個驚人的發(fā)現(xiàn)，即通過從支鏈淀粉的非還原鏈末端切下4-8個D-吡喃葡糖基單位的麥芽寡糖而水解淀粉、且具有足夠程度的熱穩(wěn)定性的非生成麥芽糖的外淀粉酶，在延遲或減小焙烤制品有害凝沉方面非常有效。保藏根據(jù)布達佩斯條約，于1999年3月12日將以下樣品保藏于承認的保藏單位DSMZ(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg lb,D-38124 Brauschweig)。BT-21 DSM保藏號DMS 12731本發(fā)明也包括可得自那些保藏物和/可由那些保藏物表達的序列，也包括包含所述序列及其活性片段的實施方案。實施例小節(jié)和附圖的介紹現(xiàn)在僅作為實例，參考附圖描述本發(fā)明，在附圖中

圖1顯示一曲線圖；圖2顯示一曲線圖；圖3顯示一曲線圖；圖4顯示一曲線圖；圖5顯示一曲線圖6顯示一描繪圖；和圖7顯示一曲線圖；更詳細地講圖1．在2％淀粉底物中于45℃培養(yǎng)的克勞氏芽孢桿菌BT-21的液體培養(yǎng)物中胞外淀粉分解活性(mU/ml)?！艨扇苄缘矸?，●支鏈淀粉，◆玉米淀粉，■全糙米。條帶顯示標準偏差。
圖2．pH對產(chǎn)物特異性淀粉酶活性的影響。于55℃下pH的影響。
圖3．溫度對產(chǎn)物特異性淀粉酶活性的影響。于pH9.5下■加入5mM CaCl2、口不加入CaCl2時的影響。
圖4．以在pH9.5加入5mM CaCl2下于增加的溫度下溫育后產(chǎn)物特異性淀粉酶殘留活性測試的熱穩(wěn)定性。
圖5．通過于55℃、pH9.5下將產(chǎn)物特異性淀粉酶(505mU/ml)與1％可溶性淀粉和5mM CaCl2一起溫育形成的產(chǎn)物?！鹌咸烟?，×麥芽糖，口麥芽三糖，▲麥芽四糖，●麥芽五糖，■麥芽六糖。
圖6．通過于pH9.5、55℃下將產(chǎn)物特異性淀粉酶(505mU/ml)與1％可溶性淀粉一起溫育獲得的HPAEC-PAD示蹤圖。A)不加入酶的可溶性淀粉，B)與酶一起溫育30分鐘。
圖7．與已知淀粉切割作用的淀粉酶相比，克勞氏芽孢桿菌BT-21產(chǎn)物特異性淀粉酶的內(nèi)活性和外活性的測定。藍色的形成(最大量的％)對mM麥芽糖的產(chǎn)生作圖。曲線的斜率顯示內(nèi)活性或外活性的優(yōu)勢。
實施例-A節(jié)實施例1嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的發(fā)酵和生產(chǎn)1.1生產(chǎn)嗜糖假單胞菌IAM第1544號得自日本東京大學，分子和細胞生物科學研究所IAM培養(yǎng)物保藏中心(IAM Culture Collection,Inst.ofMolecular and Cellular Biosciences,University of Tokyo,Japan)。
在Applikon ADI的3升生物反應器中進行該菌株的發(fā)酵，工作體積為2升，條件如下溫度30℃攪拌速率1000rpm通氣每分鐘每體積培養(yǎng)基1體積空氣pH 恒定pH7.4，用2M氫氧化鈉和10％(w/v)鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨20g/l細菌培養(yǎng)用酵母提取物 20g/l淀粉 20g/lNa2HO4·2H2O 5.6g/lKH2PO41.5g/l發(fā)酵1天后，將發(fā)酵肉湯離心并過濾以去除細胞。無細胞肉湯中非生成麥芽糖的外淀粉酶活性如上所述測定為5單位/ml。1.2嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的純化通過疏水相互作用色譜，用以200mM硫酸鈉、50mM三乙醇胺、2mM氯化鈣pH7.2的A緩沖液平衡的150ml苯基葡聚糖FF低sub柱(Pharmacia，瑞典)，部分純化嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶。將過濾的發(fā)酵肉湯(500ml)調(diào)節(jié)至200mM硫酸鈉和pH7.2，上樣至柱上。所述非生成麥芽糖的外淀粉酶用線性降低的硫酸鈉的A緩沖液梯度洗脫。合并含外淀粉酶活性的流分。
合并的流分用水稀釋3次，在用50mM三乙醇胺、5mM氯化鈣pH7.5的A緩沖液平衡的150ml Q-Sepharose FF(Phannacia)柱上，通過陰離子交換色譜進一步純化。所述非生成麥芽糖的外淀粉酶用0-1M氯化鈉的A緩沖液線性梯度洗脫。合并含有外淀粉酶活性的流分。這種部分純化的制備物用于下述的試驗。該制劑的活性為14.7單位/ml，當在對淀粉酶活性染色的聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中測試時僅有一條淀粉酶活性條帶。1.3 嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的特征鑒定作為介紹，編碼嗜糖假單胞菌外淀粉酶的基因(我們稱其為PS4)的DNA序列已經(jīng)由Zhou等發(fā)表(Zhou JH,Baba T,Takano T,KobayashiS,Arai Y(1989)FEBS Lett 1989 Sep 11；255(1):37-41“嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶基因的核苷酸序列”。另外，所述DNA序列可以在GenBank中選取，登錄號為X16732。
我們現(xiàn)在已經(jīng)通過質(zhì)譜(MALDI-TOFF)測定了純化的PS4酶的MW，為57500±500D，這與得自該序列的理論MW為57741 D相符合。
根據(jù)Zhou等所述(Zhou JH,Baba T,Takano T,Kobayashi S,Arai Y(1992) Carbohydr Res 1992 Jan；223:255-61“嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶基因(mta)在大腸桿菌中表達的酶的特性”)，PS4的最適溫度和最適pH為45℃和pH6.5。
通過分析在具有4ml上述含10mg/ml蠟質(zhì)玉米淀粉的試管中將0.7單位部分純化的非生成麥芽糖的外淀粉酶于50℃溫育15分鐘或300分鐘產(chǎn)生的水解產(chǎn)物，測定所述非生成麥芽糖的外淀粉酶的水解模式。
15分鐘或300分鐘后檢測的水解產(chǎn)物的模式示于表1，表明嗜糖假單胞菌產(chǎn)生如本發(fā)明定義的非生成麥芽糖的外淀粉酶，并且該酶在15分鐘和300分鐘水解后釋放麥芽四糖作為主要產(chǎn)物，所述麥芽四糖分別占85.8％(重量)和93.0％(重量)。表1 嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖外淀粉酶的從葡萄糖至麥芽十糖的水解產(chǎn)物
實施例2嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的焙烤試驗設定焙烤試驗以實測嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的抗堅實效應。采用Danish烤面包配方。它含有面粉(2000g)、干酵母(30g)、糖(30g)、鹽(30g)和水(約1200g，相當于面團稠度為400布拉班德爾單位(BU)+60g額外水，以補償所用的干酵母)，在Hobart混合器(A-200型)中低速混合2分鐘，高速混合12分鐘。混合結束時面團溫度為26℃。將面團于30℃靜置10分鐘，此后將面團切成750g的小塊面團。小塊面團在醒發(fā)成型室中于33℃的溫度和85％的相對濕度下靜置5分鐘。然后將小塊面團在Glimek成形機(LR-67型)中按以下設定成形1∶4、2∶2、3∶14和4∶12，此后將成形小塊面團轉(zhuǎn)移至焙烤模，在醒發(fā)成形室中于33℃和85％的相對濕度下醒發(fā)50分鐘。最后，將醒發(fā)的小塊面團在Wachtel烤爐(AE 416/38 COM型)中于220℃、10秒的蒸汽下焙烤40分鐘。
將部分純化的嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶制劑加入以1470單位/kg面粉配料的面團中。加入或不加入非生成麥芽糖的外淀粉酶下焙烤面包后，冷卻至20℃，此后于20℃貯藏于塑料袋中。焙烤后第3天和第7天時，利用Instron 4301通用食品結構分析儀測定堅實度，取第3天時一個面包10片以及第天時測定平均2個面包，每個面包10片的平均值。表2顯示，第3天和第7天觀察到加入酶的面包中堅實度較低。表2．嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的抗堅實效應
表3顯示，第7天時，嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶的抗堅實效應在95％可信度上具有統(tǒng)計學顯著性。表3.嗜糖假單胞菌非生成麥芽糖的外淀粉酶抗堅實效應的統(tǒng)計學分析由酶引起的第7天堅實度的AN0VA表變異分析來源平方和Df均方F-比率 P-值組間144.0 1 144.0 72.00 0.0136組內(nèi)4.0 2 2.0總計(Corr.) 148.0 3The StatAdvisorANVOA表將第7天的堅實度方差分解為兩個部分組間部分和組內(nèi)部分。F-比率在這種情況下為72.0，為組間估計與組內(nèi)估計之比。由于F-檢定的P-值低于0.05，因此在第7天平均堅實度從一種水平的酶至另一種水平的酶之間在95.0％可信度上有統(tǒng)計學顯著性差異。為了確定哪種方法與其它方法顯著不同，從表格選的列項表中選擇多范圍檢定。
在該方面，使嗜糖假單胞菌IAM 1520在2ml LB培養(yǎng)基中生長，通過20.000×g離心10分鐘收獲細胞。用略微改進的小量制備方案分離總DNA。將細胞再懸浮于300μl再懸浮緩沖液(50mM Tris-HCl,pH8.0；10mM EDTA；100μg/ml RNA酶A)中，此后用Fastprep FPl20(BIO10l；Califonia)破碎細胞。破碎后，加入300μl裂解緩沖液(200mMNaOH；1％SDS)和300μl中和緩沖液(3.0M乙酸鉀，pH5.5)。于4℃以20,000×g離心15分鐘后，收集上清液并加入0.6體積異丙醇。通過于4℃以20,000×g離心30分鐘沉淀DNA，用70％乙醇洗滌，再溶于100μl TE(10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)中。
關于PCR擴增，設計4種不同的PCR引物#1ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC位置213-233#2GCT CCT GAT ACG ACA GCG位置2403-2386#3GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC位置663-683CCG#4TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T位置2258-2238所述位置是指GenBank登錄號X16732中發(fā)現(xiàn)的mta序列的位置。較高數(shù)值在前的引物是反義引物，所述序列為互補序列。粗體表示不與模板DNA互補的核苷酸，在引入的限制位置下劃線。)#3引物引入一個獨特的Ncol位點，#4引物引入一個BamHⅠ位點，用來在隨后在表達載體pBAD/gⅢ(Invitrogen)中克隆。
用50-150ng基因組IAM1520 DNA作為模板，采用Expand DNA聚合酶(Boehringer Mannheim；德國)，按照生產(chǎn)商的說明和以下擴增方案94℃2分鐘，(94℃1分鐘，58℃2分鐘，72℃2分鐘)，進行35個循環(huán)，最后于72℃5分鐘，用以下引物組合進行第一次PCR擴增反應1#1+#2得到2190bp的片段。
用“gene clearn kit”(BIO101；Califomia)從凝膠中分離2190bp的片段。采用如上所述的相同擴增方案，在采用以下引物組合的第二次PCR中，該片段用作模板DNA
反應2#3+#4得到1605bp的片段。
純化1605bp的片段，并按照生產(chǎn)商的說明將其克隆入pCR-BLUNT載體(Invitrogen)。通過采用單染料測序技術和ALF測序儀(Pharmacia；瑞典)，采用通常引物和反向引物以及四種標記的內(nèi)部引物測序，證實所克隆片段的序列。
CAT CGT AGA GCA CCT CCA 999-982GAT CAT CAA GGA CTG GTC C 1382-1400CTT GAG AGC GAA GTC GAA C 1439-1421GAC TTC ATC CGC CAG CTG AT1689-1708所述位置是指GenBank登錄號X16732中發(fā)現(xiàn)的mta序列的位置。較高數(shù)值在前的引物是反義引物，所述序列為互補序列。
證實所述序列后，將所述mta基因克隆入表達載體pBAD/gⅢ(Invitrogen)中。通過用BamHⅠ消化，然后用Klenow片段平端化并用NcoⅠ消化，從pCR-BLUNT中釋放出所述mta基因，純化1602bp的片段。用NcoⅠ和PmeⅠ消化表達載體pBAD/gⅢ并將其純化。在連接后，將獲得的表達構成物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061細胞中，按照pBAD/gⅢ手冊(Invitrogen)表達所述蛋白。
已經(jīng)通過“用于測量凝沉和變陳的測定”中所述的得自模型系統(tǒng)面團焙烤制品和貯藏制品的DSC分析，測試了兩種酶對淀粉凝沉的效應。關于該測試，將按照“淀粉酶測定方案”分析的485單位的嗜糖假單胞菌的非生成麥芽糖外淀粉酶和735單位的甘薯β-淀粉酶用于所述面團。制備不加(對照)或加入酶的50g標準Danish小麥粉(Danisco98022)與30.7ml 50mM檸檬酸鈉、5mM氯化鈣pH6.5制成的面團。
貯藏7天后，通過測量其熔融熵定量測定凝沉的支鏈淀粉的量。通過統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)兩種酶均顯著減少淀粉凝沉(表5)；即在第7天時嗜糖假單胞菌的非生成麥芽糖外淀粉酶將凝沉支鏈淀粉的量降至對照(2.05J/g)的86％(1.77J/g)，而甘薯β-淀粉酶將凝沉支鏈淀粉的量降至對照的96％(1.96J/g)?？傊?，嗜糖假單胞菌的非生成麥芽糖外淀粉酶對于減少凝沉和變陳而言比具有相當熱穩(wěn)定性的所述生成麥芽糖外淀粉酶顯然有效得多。表5．根據(jù)測量焙烤后7天凝沉支鏈淀粉熔融熵(以J/g計)的嗜糖假單胞菌的非生成麥芽糖外淀粉酶(PS4)和甘薯β-淀粉酶(SP2)對淀粉凝沉的效應通過處理對于熔融熵的多范圍測試方法 95.0％LSD處理 計數(shù)均值PS4131.77154SP2221.96273對照 6 2.05167對比 差異 +/-極限對照-PS4*0.2801280.0941314對照-SP2*0.0889394 0.087841PS4-SP2*-0.191189 0.06672*表示統(tǒng)計學顯著差異。
該表應用多比較方法，以確定哪種方法與其它方法顯著不同。輸出的下半部份顯示每對平均值之間的估計差異。在3對后標有星號，表明這些對在95,0％可信度下具有統(tǒng)計學顯著性差異。在所述方法中目前用于鑒別的方法是Fisher最小顯著性差異(LSD)法。
克勞氏芽孢桿菌BT-21的分離-該菌株從在丹麥Assens收集的土壤樣品分離，并由DSMZ(德國Braunschweig的德意志微生物保藏中心)鑒定。
所述酶的產(chǎn)生-克勞氏芽孢桿菌BT-21生長于最適化液體培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基由2.0％馬鈴薯可溶性淀粉、玉米支鏈淀粉、玉米淀粉或全糙米、0.5％酵母提取物、0.5％胰蛋白胨、0.1％KH2PO4、0.1％Na2HPO4、0.02％ MgSO4·7H2O、0.02％ CaCl2·2H2O和0.1％(NH4)2SO4。高壓滅菌后，加入無菌Na2CO3溶液至1％(約pH10)的終濃度。1ml甘油中的孢子懸液(貯藏于-80℃)用于接種100ml真正培養(yǎng)基，并在搖動培養(yǎng)箱(New Brunswick Scientific,Edison,N.J.，美國)中于45℃、200rpm培養(yǎng)18小時。用2ml該培養(yǎng)物接種具有200ml培養(yǎng)基的搖瓶，并于45℃在搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以規(guī)律的間隔取出等分樣品，測量600nm下的OD，以測定培養(yǎng)基中該菌株的生長。以9600rpm于4℃離心樣品(4ml)10分鐘，測定pH和淀粉酶活性。所有的生長試驗均以一式三份進行。確定均值(X=(∑ni=1Xi)/n)和標準偏差值(std.=√∑ni=1(Xi-X)/(n-1))。
產(chǎn)物特異性淀粉酶的純化-克勞氏芽孢桿菌BT-21在全糙米上生長52小時后，通過于4℃、9600rpm離心15分鐘，從胞外液中去除細胞和全糙米粒。用通過將β-環(huán)糊精共價結合至環(huán)氧活化的sepharose6B基質(zhì)(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)制備的親和凝膠[33]，純化所述產(chǎn)物特異性淀粉酶。使胞外無細胞上清液與12g凝膠一起在4℃振搖下溫育1小時。然后通過于4℃、9600rpm離心10分鐘去除上清液。用75ml50mM磷酸緩沖液pH8.0洗滌凝膠，然后離心，去除未結合的蛋白。洗滌步驟重復7次。結合蛋白用45ml含10mMα-環(huán)糊精的50mM磷酸緩沖液pH8.0洗脫，然后離心。洗脫步驟重復4次。用α-環(huán)糊精洗脫該酶，因為β-和γ-環(huán)糊精干擾Bradford的蛋白測定法(1976)[34]。然后通過于4℃攪拌下對5L10mM三乙醇胺pH7.5透析(6-8 kDa Sepctra/Por透析膜，The Spectrum Companies,Gardena,CA,美國)，去除α-環(huán)糊精。2小時后更換緩沖液，然后再透析12小時。將透析袋細雨CMC中以濃縮樣品。將10ml上樣至HiTrap Q柱(5ml預填充的，Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)，用FPLC-系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala瑞典)。用25ml 10 mM三乙醇胺pH7.5以1.0ml/min的速率洗脫，然后在10mM三乙醇胺pH7.5中以20mM NaCl/min的梯度洗脫所述蛋白。所述酶于0.5M NaCl下洗脫出。用Bradford法(1976)[34]，用BIO-RAD Protein Assay (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，美國)估計蛋白含量。將BSA用作標準品。
凝膠電泳-按照[35]所述方法，通過10％天然tris-甘油凝膠分析15μl樣品。然后將凝膠置于50mM磷酸緩沖液pH6.5中振搖30分鐘。將1％(w/v)可溶性淀粉溶液與凝膠一起溫育，同時振搖45分鐘。在緩沖液中洗滌后，將凝膠與碘溶液(4mM I2,160mM KI)一起溫育，用緩沖液脫色。脫色的條帶顯示淀粉水解活性。
按照[36]所述進行SDS-PAGE(10％)，然后進行銀染[37]。使用SDS-PAGE寬范圍的分子量標準(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，美國)。
酶測定-將2ml 0.1M硼酸緩沖液pH10.0中的可溶性淀粉溶液(1.25％)與0.5mL酶溶液一起于45℃溫育2小時。通過將混合物煮沸10分鐘終止反應。用CuSO4/二金雞鈉酸鹽測定[38]測定還原糖的形成，并以形成的mM麥芽糖相當物計算。一單位活性相當于于pH10.0/45@下產(chǎn)生1μmol麥芽糖相當物的酶量。
酶的特征鑒定-關于最適溫度的測定，將純化的酶在終濃度為1％可溶性淀粉的0.1M硼酸緩沖液pH10.0(加入或不加入5mM氯化鈣)中于30-90℃的溫度下溫育15分鐘。通過將純化的酶在含有5mM氯化鈣的50mM甘油-NaOH緩沖液pH9.5中于30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃下溫育30分鐘，進行溫度穩(wěn)定性的測定。通過將熱處理的酶在終濃度為1％可溶性淀粉的50mM甘油-NaOH緩沖液pH9.5中于55℃下溫育15分鐘，測定殘留活性。通過將純化的在含終濃度為1％可溶性淀粉的不同緩沖液中于55℃下溫育15分鐘，測定最適pH。所用的緩沖液為50mM檸檬酸(pH4.0-6.0)、50mM tris-馬來酸(pH6.5-8.5)和50mM甘油-NaOH(pH9.0-11.0)。
按照Fuwa,154所述[39]制備I2-KI溶液(0.02％I2和0.2％KI)。以一式兩份按照以下的改進測量淀粉-碘藍色形成。以不同的時間間隔從可溶性淀粉的酶促水解物中取出500μl樣品。然后加入250μl HCl和250μl I2-KI溶液。加入去離子水(4.0ml)并重復混合。于600nm下用分光光度計測量藍色的形成。
用馬鈴薯可溶性淀粉、玉米支鏈淀粉、葡聚糖、支鏈淀粉(1％)、直鏈淀粉(0.1％)和10mMα-、β-和γ-環(huán)糊精測試所純化酶對不同底物的水解。將底物溶于含5mM氯化鈣的50mM甘油-NaOH緩沖液pH9.5中，并加入所純化的酶(505mU/ml)。將各種底物于55℃溫育，并以不同的時間間隔取出樣品。通過煮沸10分鐘終止反應，并如下所述分析樣品。
用終濃度為2mM的麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖以及麥芽四糖至麥芽十糖的混合物(5mM)測試所純化酶對麥芽寡糖的水解。將麥芽寡糖溶于含5mM氯化鈣的50mM硼酸緩沖液pH9.5中，并加入所純化的酶(147mU/ml)。將各種底物于55℃溫育，并以不同的時間間隔取出樣品。通過煮沸10分鐘終止反應，并如下所述分析樣品。
水解產(chǎn)物的分析-用配有脈沖電流檢測的高效陰離子交換色譜(HPAEC-PAD)檢測水解產(chǎn)物。使用 CarboPac PA-1 柱(DionexCorporation,Sunnyvale,CA，美國)和在30分鐘內(nèi)在100mM NaOH中的1.0M乙酸鈉0-60％梯度，流速為1.0ml/min，使用Dionex DX-300或DX-500系統(tǒng)。通過將其保留時間與葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖比較，鑒定淀粉水解產(chǎn)物。由于同系物線性麥芽寡糖的保留時間隨聚合度而增加，因此可以容易第鑒定出中等DP的線性麥芽寡糖[40,41]。結果和討論克勞氏芽孢桿菌BT-21的鑒定-根據(jù)其脂肪酸組成，所述菌株顯示出與芽孢桿菌屬的相似性。16SrDNA的部分序列顯示出與克勞氏芽孢桿菌的相似性為99.4％。所述耐堿菌株的生理特性證實了這種鑒定。
由克勞氏芽孢桿菌BT-21產(chǎn)生淀粉酶活性-馬鈴薯可溶性淀粉、玉米淀粉、玉米支鏈淀粉和全糙米在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生不同水平的胞外淀粉酶活性，而與馬鈴薯淀粉相比，玉米淀粉含有更多的脂肪并且不含磷，而玉米支鏈淀粉具有含α-D-(1→6)O-糖苷鍵的高度分支的結構。這三種類型的淀粉在熱凝膠化后可為酶利用，而全糙米含有米粒中包裹的可利用性較低的淀粉。具有不同淀粉底物的液體培養(yǎng)物的胞外液中的淀粉酶活性示于圖1中。用全糙米作為底物獲得了最高的淀粉分解活性。這表明，可利用性較低的淀粉底物的存在導致克勞氏芽孢桿菌BT-21產(chǎn)生的胞外淀粉分解活性增加。用麥麩獲得了相似的結果，但麥麩難以在純化所述酶之前從胞外液中去除。先前已經(jīng)報道了諸如半乳糖、糖原和菊粉的碳源適用于用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)淀粉酶[27]，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉為嗜熱脂肪芽孢桿菌生產(chǎn)淀粉酶的最佳底物[28]。然而，這些研究中沒有一項研究包括可利用性較低的淀粉底物。
產(chǎn)物特異性淀粉酶的純化-通過β-CD Sepharose 6B親和色譜，然后通過陰離子交換色譜純化所述酶(表6)。
表6從克勞氏芽孢桿菌BT-21中純化產(chǎn)物特異性淀粉酶體積 活性總活性 總蛋白 比活得率 純化(ml) (mU/ml) (mU) (mg) (mU/mg％因數(shù)蛋白)胞外液4000 155620,000 424731 1001β-CD親和色譜 704.5 88 62,1378.53,647 10.0 5濃縮和透析172.6 25443,8404.84,581 7.16.3陰離子交換21525154,0512.013,493 8.718.5色譜活性染色的天然PAGE顯示在胞外液中存在3種淀粉分解活性。在β-CD親和色譜然后通過陰離子交換色譜后，將所述產(chǎn)物特異性酶與其它淀粉分解活性完全分離。所純化酶制劑的SDS-PAGE表明，已經(jīng)將所述產(chǎn)物特異性淀粉酶純化至均質(zhì)，其表觀分子量約101 kDa。環(huán)糊精sepharose 6B親和色譜先前已經(jīng)用于通過陰離子交換色譜去除其它淀粉酶后作為最后的純化步驟純化α-淀粉酶[29]。所述產(chǎn)物特異性淀粉酶的酶得率為8.7％，而純化因數(shù)為18.5，與這些作者報道的數(shù)值相似。
所述產(chǎn)物特異性淀粉酶的特征鑒定-所純化的酶顯示出于pH9.5下有最佳活性(圖2)，而在存在或不存在5mM氯化鈣下其活性的最適溫度為55℃(圖3)。該酶于pH9.5、5mM氯化鈣存在下的熱穩(wěn)定性示于圖4。高于55℃時，該酶在30分鐘溫育期間喪失其最大活性的75％。生成麥芽六糖[23]、麥芽五糖[24]和麥芽四糖[26]的5種其它產(chǎn)物特異性淀粉酶也顯示出堿性的最適pH。這些酶的分子量估計為59、73和80kDa[23]、180kDa[24]和97kDa[26]，而克勞氏芽孢桿菌BT-21的產(chǎn)物特異性淀粉酶顯示出估計的分子量為101kDa。這些產(chǎn)物特異性淀粉酶和α-淀粉酶中的大多數(shù)顯示出50-65kDa范圍內(nèi)的較低的分子量[3、16、17、19和21]。高于55℃的最適溫度與報道的上述產(chǎn)物特異性淀粉酶的最適溫度[23、24和26]相似。
所純化的產(chǎn)物特異性淀粉酶在1小時溫育后，將可溶性淀粉水解為作為低DP主要原始產(chǎn)物的麥芽六糖和麥芽五糖(52％和19％的總水解產(chǎn)物)(圖5)。溫育2小時后麥芽六糖的量和4小時后麥芽五糖的量減少，而麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖的量增加。這些產(chǎn)物在延長水解后積累，表明它們不再被進一步水解。淀粉水解24小時后，麥芽寡糖的量為(3％)麥芽六糖、(4％)麥芽五糖、(41％)麥芽四糖、(13％)麥芽三糖、(16％)麥芽糖和(4％)葡萄糖。用配有脈沖電流檢測示蹤的高效陰離子交換色譜(HPAEC-PAD)在30分鐘淀粉水解后獲得的示蹤結果(圖6)表明，不存在比麥芽六糖(DP6)大的淀粉水解產(chǎn)物。形成麥芽四糖的產(chǎn)物特異性淀粉酶對可溶性淀粉水解的時間進程研究也表明，在水解早期優(yōu)先產(chǎn)生麥芽六糖[23]。Kim等(1995)[26]發(fā)現(xiàn)，用形成麥芽六糖的產(chǎn)物特異性淀粉酶水解淀粉1小時后的原始水解產(chǎn)物主要為麥芽六糖(54％)，隨后麥芽四糖和麥芽糖的量逐漸增加，同時麥芽六糖的量減少。20小時后，麥芽寡糖的組成已經(jīng)變?yōu)?.6％麥芽六糖、1.3％麥芽五糖、53.2％麥芽四糖、8.3％麥芽三糖、27.6％麥芽糖和9％葡萄糖。
為了進一步檢查所述酶在淀粉水解期間的作用模式，將不同底物與所純化的酶一起溫育(表7)。
表7用所純化的產(chǎn)物特異性酶(67mU/ml)水解各種淀粉底物生成的DP1-DP6范圍的麥芽寡糖。數(shù)據(jù)以與底物初始量相比形成的葡萄糖％(重量)表示水解 生成的產(chǎn)物(％)底物時間(min) DP1 DP2 DP3 DP4DP5 DP6可溶性淀粉(1％) 150 00＜0.1 0.9 7.2240 0 000.67.0 17.8直鏈淀粉(0.1％) 150.2 000 2.4 13.6240 1.5 04.1 7.76.3 20.0支鏈淀粉(1％) 15＜0.1 000 0.8 3.6240 ＜0.1 0.5 0.1 0.99.2 24.8淀粉由直鏈淀粉(20-30％)和支鏈淀粉(80-70％)組成。直鏈淀粉為α-D-(1→4)O-糖苷鍵連接的線性葡聚糖，而支鏈淀粉為由于分子中存在α-D-(1→6)O-糖苷鍵而產(chǎn)生的分支的葡聚糖。根據(jù)與可溶性淀粉(7％和17.8％)和直鏈淀粉(6.3％和20％)相比形成麥芽五糖(9.2％)和麥芽六糖(24.8％)表明，所述產(chǎn)物特異性淀粉酶大多數(shù)容易水解支鏈淀粉。所述酶不水解支鏈淀粉，即由麥芽三糖主鏈組成的α-D-(1→6)O-糖苷鍵連接的葡聚糖；或右旋糖酐，即具有連接至0-3個所述主鏈單位的分支的α-D-(1→6)O-糖苷鍵連接的葡聚糖。α-、β-和γ-環(huán)糊精即由6、7和8個葡萄糖組成的環(huán)狀麥芽寡糖甚至在24小時溫育后也不被水解。
以右旋糖酐獲得的結果表明，α-D-(1→6)O-糖苷鍵不被所述產(chǎn)物特異性淀粉酶切割。對支鏈淀粉缺乏活性表明，所述產(chǎn)物特異性淀粉酶不能繞過緊接3個葡萄糖單位的α-D-(1→6)O-糖苷鍵，或不能攻擊這三個葡萄糖單位中的任何一個單位。對α-、β-或γ-環(huán)糊精不能水解表明，所述產(chǎn)物特異性淀粉酶通過外切割機制類型[30]水解淀粉。HPAEC-PAD示蹤結果(圖6)也顯示出所述外類型的切割機制，因為不存在大于DP6的淀粉水解產(chǎn)物。
為了進一步檢查所述酶對可溶性淀粉的切割作用，將淀粉-碘藍色形成對還原糖的產(chǎn)生作圖(圖7)。該曲線的斜率顯示普遍類型的淀粉分解性淀粉水解的切割機制[31]。內(nèi)作用酶將產(chǎn)生的斜率與外作用酶相比數(shù)值較小。用得自A.oryzae的α-淀粉酶(斜率為-61)表明，斜率數(shù)值小是由于隨機淀粉分解活性導致淀粉-碘藍色復合物快速減少的結果。斜率數(shù)值較大(斜率為-13)表明，得自施氏假單胞菌的胞外酶制劑顯示了普遍的外作用切割機制的證據(jù)。所純化的產(chǎn)物特異性淀粉酶顯示斜率數(shù)值為-6，表明為外作用。
通過與低DP底物一起溫育，檢查所述產(chǎn)物特異性淀粉酶對低DP底物的作用模式。麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖不被純化的克勞氏芽孢桿菌BT-21的淀粉酶水解。這證實了關于可溶性淀粉獲得的結果，即這些產(chǎn)物積累，并因此被認為是水解的終產(chǎn)物。
通過時間進程試驗研究對DP4-DP10的麥芽寡糖的混合物的所述產(chǎn)物特異性淀粉酶活性。用HPAEC-PAD獲得的峰面積變化相應于麥芽寡糖的生成或水解。麥芽六糖(DP6)的生成以及DP7、DP8、DP9和DP10的量的同時減少證實所述酶的麥芽六糖生成能力。然而，達到穩(wěn)態(tài)條件后，甚至在水解7天后也檢測不到通過淀粉水解發(fā)現(xiàn)的DP6的進一步降解。DP6的濃度低于淀粉水解時獲得的DP6的濃度，表明麥芽四糖和麥芽糖生成的繼續(xù)需要一定量的麥芽六糖。
發(fā)現(xiàn)克勞氏芽孢桿菌BT-21的產(chǎn)物特異性淀粉酶的淀粉水解類似兩步法。該方法包括將淀粉初始主要水解為麥芽六糖和少量麥芽五糖，麥芽六糖和麥芽五糖進一步主要水解為麥芽四糖和麥芽糖，它們在延長的水解后積累。至麥芽四糖和麥芽糖的第二個水解步驟看來受到較大底物最初水解為麥芽六糖的限制，因為濃度依賴性看來是進行第二步的調(diào)節(jié)劑。焙烤試驗用所述產(chǎn)物特異性淀粉酶進行焙烤試驗。用10g標準Danish小麥粉(Danico 98078)和6.2ml 0.2M NaOH-甘油緩沖液pH10以及不加入(對照)或加入40單位的所述酶(如B節(jié)材料和方法中所述于45℃、pH10下分析)制備面團，焙烤并在按照“用于測量凝沉和變陳的測定”貯藏后通過DSC分析。如表8所示，在焙烤后第7天發(fā)現(xiàn)，所述酶顯著減少凝沉支鏈淀粉的量，表明它具有顯著的抗變陳效應。表8．根據(jù)焙烤后7天測量凝沉支鏈淀粉的熔融熵(以J/g計)測定克勞氏芽孢桿菌的產(chǎn)物特異性淀粉酶對淀粉凝沉的效應通過處理對于熔融熵的多范圍測試方法 95.0％LSD處理對照均值酶 16 2.44375對照16 2.56對比 差異+/-極限對照-酶*0.116250.0491094*表示統(tǒng)計學顯著性差異。
已經(jīng)用蒸餾水提取了焙烤后冷凍的焙烤制品的面包瓤樣品(1g焙烤制品/10g水，攪拌1小時并離心)，并如上所述通過HPAEC-PAD分析，以檢測在面團焙烤期間由所述酶生成的淀粉水解產(chǎn)物。相對于對照，發(fā)現(xiàn)麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖的積累是該酶活性的結果。概述小節(jié)本發(fā)明公開了制作焙烤制品的方法以及適用于這種方法的淀粉酶。
通過編號的段落陳述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
1．變陳延遲的焙烤面粉面包制品的制備方法，包括向面團組分、面團添加劑或所述面團加入有效量的非生成麥芽糖外淀粉酶，所述非生成麥芽糖外淀粉酶能夠在焙烤過程中通過從支鏈淀粉側鏈的非還原末端切下主要由4-8個D-吡喃葡糖基單位組成的線性麥芽寡糖而水解淀粉。
2．根據(jù)段落1的方法，其中所述面粉為小麥粉或黑麥粉或小麥粉和黑麥粉的混合物。
3．根據(jù)段落1或2的方法，其中所述非生成麥芽糖的外淀粉酶的加入量范圍為50-100,000單位/kg面粉，優(yōu)選100-50,000單位/kg面粉。
4．根據(jù)段落3的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的加入量范圍為200-20,000單位/kg面粉。
5．根據(jù)段落1-4的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.5內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
6．根據(jù)段落1-4的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.05內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
7．根據(jù)段落1-4的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.01內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
8．根據(jù)段落1-4的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的特征在于，在4ml每ml含50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸和2mM氯化鈣的pH6.0緩沖液具有10mg/ml預煮沸的蠟質(zhì)玉米淀粉的水溶液中，將0.7單位量的所述非生成麥芽糖外淀粉酶于50℃溫育15分鐘時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的包含葡萄糖、麥芽糖和3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖的水解產(chǎn)物、由4-8個D-吡喃葡糖基單位構成的線性麥芽寡糖；采用配有脈沖電流檢測的Dionex PA 100柱和已知的從葡萄糖至麥芽七糖的線性麥芽寡糖作為標準品，通過陰離子交換HPLC分析所述水解產(chǎn)物。
9．根據(jù)段落8的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的的特征在于，當在段落8中所述的條件下溫育，并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽四糖。
10．根據(jù)段落8的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的的特征在于，當在段落8中所述的條件下溫育，并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽五糖。
11．根據(jù)段落8的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的的特征在于，當在段落8中所述的條件下溫育，并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽六糖。
12．根據(jù)段落8的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的的特征在于，當在段落8中所述的條件下溫育，并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽七糖。
13．根據(jù)段落8的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的的特征在于，當在段落8中所述的條件下溫育，并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽八糖。
14．根據(jù)段落1-4的方法，其中向所述面團組分、面團添加劑或所述面團加入至少一種乳化劑。
15．根據(jù)段落14的方法，其中所述乳化劑選自卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乙酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的檸檬酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、食用脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸鈉和硬脂酰-2-乳酸鈣。
16．根據(jù)段落1-4中任一段落的方法，其中向所述面團組分、面團添加劑或所述面團中加入至少一種另一種酶。
17．根據(jù)段落16的方法，其中所述另一種酶選自纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、氧化還原酶和蛋白酶。
18．用于面團和由所述面團制成的焙烤面粉面包制品的增酵劑組合物，包含一種非生成麥芽糖外淀粉酶和至少一種另一種面團組分或面團添加劑，所述非生成麥芽糖外淀粉酶能夠在焙烤過程中從支鏈淀粉側鏈的非還原末端切下主要由4-8個D-吡喃葡糖基單位組成的線性麥芽寡糖而水解淀粉。
19．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.5內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
20．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.05內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
21．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.01內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
22．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其特征在于，在4ml每ml含50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸和2mM氯化鈣的pH6.0緩沖液具有10mg/ml預煮沸的蠟質(zhì)玉米淀粉的水溶液中，將0.7單位量的所述非生成麥芽糖外淀粉酶于50℃溫育15分鐘時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的包含葡萄糖、麥芽糖和3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖的水解產(chǎn)物、由4-8個D-吡喃葡糖基單位構成的線性麥芽寡糖；采用配有脈沖電流檢測的Dionex PA 100柱和已知的從葡萄糖至麥芽七糖的線性麥芽寡糖作為標準品，通過陰離子交換HPLC分析所述水解產(chǎn)物。
23．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶當在段落8中所述的條件下溫育并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽四糖。
24．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶當在段落8中所述的條件下溫育并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽五糖。
25．根據(jù)段落18的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶當在段落8中所述的條件下溫育并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽六糖。
26．根據(jù)段落22的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶當在段落8中所述的條件下溫育并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽七糖。
27．根據(jù)段落22的增酵劑組合物，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶當在段落8中所述的條件下溫育并且如段落8所述分析水解產(chǎn)物時，產(chǎn)生至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的麥芽八糖。
28．根據(jù)段落19-27中任一段落的增酵劑組合物，其包含至少一種選自乳化劑和水解膠體的添加劑。
29．根據(jù)段落28的增酵劑組合物，其中所述乳化劑選自卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乙酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的檸檬酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、食用脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸鈉和硬脂酰-2-乳酸鈣。
30．根據(jù)段落28的增酵劑組合物，其中所述水解膠體選自藻酸鹽、角叉藻聚糖、果膠和植物膠。
31．根據(jù)段落19-30中任一段落的增酵劑組合物，其包含至少一種選自纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、氧化還原酶和蛋白酶的另一種酶。
32．可用根據(jù)段落1-17中任一段落的方法獲得的焙烤面粉面包制品。
以上說明書中提及的所有出版物均通過引用結合到本文中。在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對本發(fā)明的所述方法和系統(tǒng)的各種改進和變化對于本領域技術人員是顯而易見的。盡管本發(fā)明已經(jīng)結合具體優(yōu)選實施方案進行了描述，但應該理解，要求保護的本發(fā)明不應過度限于這類具體的實施方案。實際上，對于生化領域或相關領域的技術人員顯而易見的對所述實踐本發(fā)明的模式的各種改進，將屬于以下權利要求書的范圍。
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權利要求
1．淀粉制品的制作方法，包括向淀粉介質(zhì)中加入一種非生成麥芽糖外淀粉酶，所述非生成麥芽糖外淀粉酶能夠通過從支鏈淀粉側鏈的非還原末端切下主要由4-8個D-吡喃葡糖基單位組成的線性麥芽寡糖而水解淀粉。
2．根據(jù)權利要求1的方法，其中所述淀粉介質(zhì)包括面粉，其中素面粉為小麥粉或黑麥粉或小麥粉和黑麥粉的混合物。
3．根據(jù)權利要求2的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的加入量范圍為50-100,000單位/kg面粉，優(yōu)選100-50,000單位/kg面粉，更優(yōu)選200-20,000單位/kg面粉。
4．根據(jù)權利要求1-3任一項的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.5內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性，優(yōu)選其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.05內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性，更優(yōu)選其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶的內(nèi)淀粉酶活性低于0.01內(nèi)淀粉酶單位(EAU)/單位外淀粉酶活性。
5．根據(jù)權利要求1-4中任一項的方法，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶進一步的特征在于，在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中，所述非生成麥芽糖外淀粉酶能夠產(chǎn)生水解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選的葡萄糖；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選包含4-8個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
6．根據(jù)權利要求5的方法，其中至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的所述水解產(chǎn)物為麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖或麥芽八糖。
7．根據(jù)權利要求6的方法，其中至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)的所述水解產(chǎn)物為麥芽四糖。
8．根據(jù)權利要求7的方法，其中所述酶可得自嗜糖假單胞菌或其功能等同物。
9．根據(jù)權利要求6的方法，其中至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物為麥芽六糖。
10．根據(jù)權利要求9的方法，其中所述酶可得自克勞氏芽孢桿菌或其功能等同物。
11．根據(jù)權利要求10的方法，其中所述酶的分子量約101,000Da(通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳估計)。
12．根據(jù)權利要求10或11的方法，其中所述酶在pH 9.5和55℃下具有最佳活性。
13．根據(jù)任一前述權利要求的方法，其中所述淀粉制品為面團。
14．根據(jù)任一前述權利要求的方法，其中所述淀粉制品為焙烤面團。
15．根據(jù)任一前述權利要求的方法，其中所述淀粉制品用于焙烤面粉面包制品。
16．根據(jù)任一前述權利要求的方法，其中焙烤所述淀粉制品。
17．用根據(jù)權利要求16的方法獲得的焙烤制品。
18．用于面團的增酵劑組合物；其中所述組合物包含一種權利要求1-17中任一項中定義的非生成麥芽糖外淀粉酶和至少一種另一種面團組分或面團添加劑。
19．可得自克勞氏芽孢桿菌的非生成麥芽糖外淀粉酶或其功能等同物；其中所述酶的分子量約101,000Da(通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳估計)和/或所述酶在pH 9.5和55℃下具有最佳活性。
20．根據(jù)權利要求19的非生成麥芽糖外淀粉酶，其中所述非生成麥芽糖外淀粉酶進一步的特征在于，在蠟質(zhì)玉米淀粉溫育試驗中，所述非生成麥芽糖外淀粉酶能夠產(chǎn)生水解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物包含一種或多種2-10個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖和可選的葡萄糖；使得至少60％(重量)、優(yōu)選至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)、最優(yōu)選至少85％(重量)的所述水解產(chǎn)物包含3-10個D-吡喃配葡糖基單位的線性麥芽寡糖，優(yōu)選包含4-8個D-吡喃葡糖基單位的線性麥芽寡糖。
21．非生成麥芽糖外淀粉酶在淀粉制品中延遲所述淀粉制品變陳的應用。
22．大致如本文所述并參考權利要求1的方法、增酵劑組合物、酶或應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及非生成麥芽糖外淀粉酶延遲淀粉有害凝沉的應用。此外,本發(fā)明涉及得自克勞氏芽孢桿菌的新的非生成麥芽糖外淀粉酶。
文檔編號C12N9/24GK1303427SQ99806638
公開日2001年7月11日 申請日期1999年3月30日 優(yōu)先權日1998年4月1日
發(fā)明者K·M·克拉格, B·拉森, P·拉斯穆森, L·德達爾-奧勒森, W·茲默曼 申請人:丹尼斯科有限公司