專利名稱：人蛋白c多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬人類醫(yī)藥領域。具體而言，本發(fā)明尤其涉及一種具有截短的重鏈的分離的人蛋白C多肽，以及運用這種人蛋白C多肽的方法，和此種人蛋白C多肽的藥物組合物。
蛋白C是維生素K依賴的絲氨酸蛋白水解酶，它天然產(chǎn)生抗凝劑，此抗凝劑通過鈍化凝結級聯(lián)中的因子Ⅴa和Ⅷa而調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)。人蛋白C最初在肝臟中以461氨基酸的單鏈多肽形式產(chǎn)生。前體分子經(jīng)過多次翻譯后修飾，包括1)42個氨基酸的信號肽的裂解；2)從單鏈酶原中蛋白水解除去156位的賴氨酸殘基和157位的精氨酸殘基，形成雙鏈形式的分子，(即一條165氨基酸殘基的輕鏈通過二硫鍵與含絲氨酸蛋白水解酶的262氨基酸殘基的重鏈相連)；3)輕鏈的前42位氨基酸中聚集的9個谷氨酸進行維生素K依賴的羧化，形成9個γ羧基谷氨酸殘基；和4)在4個位點糖附著(1個位點在輕鏈，另三個位點在重鏈)。最后，環(huán)狀的雙鏈酶原經(jīng)過凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白復合體裂解環(huán)狀酶原的活化肽(殘基158-169)活化產(chǎn)生活化的蛋白C(aPC)。
與其它蛋白聯(lián)合，蛋白C作為最重要的促進血栓形成的血液凝結因子的下調(diào)者起作用。因此，蛋白C酶系統(tǒng)代表抗凝血的主要生理機制。
蛋白C在調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)中的關鍵作用通過雜合缺失中的血栓形成增加的速率，蛋白C抗性(例，由于共同因子V Leiden突變)和未處理的純合蛋白C缺失導致的致命結果例示?；罨娜说鞍證，血漿來源的和重組的，在靜脈和動脈血栓形成的許多動物模型中表現(xiàn)為有效和安全的抗凝劑。在近來臨床研究中，蛋白C在人血栓形成疾病中表現(xiàn)得十分有效，包括對蛋白C缺失的治療和微血管血栓形成的治療，如與膿血癥相關的彌散性血管內(nèi)凝血。
不幸的是，在蛋白C活化過程中，重鏈的C末端裂解，可能改變蛋白的結構，從而在藥物制備上有缺陷。申請人發(fā)現(xiàn)aPC的截短的形式具有生物學活性。本發(fā)明因此提供一種帶有截短的重鏈的分離的aPC多肽，一種優(yōu)選制備這種多肽的方法，以及其作為藥物的運用。
本發(fā)明提供一種分離的人蛋白C多肽，它包括一條輕鏈和一條截短的重鏈，其中所述的多肽為SEQ ID NO:1。
本發(fā)明進一步提供編碼具有截短的重鏈的人蛋白C多肽的重組DNA分子，其中所述的DNA分子是SEQ ID NO；2。
本發(fā)明進一步提供一種治療患者的血栓形成的疾病的方法，它包括，向所述的患者施用藥物有效量的具有截短的重鏈的分離的人蛋白C多肽。
本發(fā)明還包括制備分離的具有截短的重鏈的人蛋白C多肽的方法。
為在此公開及權利要求的本發(fā)明的目的，以下術語如下定義。
aPC或活化的蛋白C，無論重組的或血漿衍生的aPC包括并優(yōu)選人蛋白C，盡管aPC可包括其它具有蛋白C蛋白水解，酰胺裂解，酯水解，和生物活性(抗凝血的或血纖維蛋白溶酶水解)的種或衍生物。蛋白C衍生物的實施例在美國專利號5,453,373，美國專利號5,516,650中描述，在此全文納入?yún)⒖嘉墨I。
APTT-活化的部分組織促凝血酶原激酶時間。
HPC-人蛋白C酶原。
r-hPC-重組的人蛋白C酶原，產(chǎn)生于原核細胞，真核細胞或轉基因動物。
r-aPC-重組的人活化的蛋白，通過體外活化r-hPC或從原核細胞，真核細胞或轉基因動物的蛋白C的活化形式的直接分泌產(chǎn)生(WO97/20043)，包括，例如，從人腎293細胞作為酶原分泌，然后通過本領域技術人員熟知的技術純化并活化，如美國專利號4,981,952中所述，且在此全文引入作為參考文獻。
酶原-指分泌的，鈍化的形式，蛋白C的單鏈或雙鏈形式。
截短的重鏈-指蛋白C的具有4個C末端氨基酸的重鏈裂解。對人活化的蛋白C，截短的重鏈包括氨基酸殘基170-415如SEQ ID NO:1所示。
輕鏈-指蛋白C的輕鏈。對于人活化的蛋白C，輕鏈包括氨基酸殘基1-155或在C端有1或更多氨基酸缺失的多肽。
血栓形成失調(diào)-由于血液凝塊在血管中的存在或形成導致的失調(diào)。血栓形成失調(diào)包括，但不僅限于中風，心肌梗塞，不穩(wěn)定心絞痛，血管成形術或擴張后的突然關閉和外周血管手術導致的血栓形成。
血管閉塞失調(diào)和血凝過快狀態(tài)失調(diào)包括但不僅限于膿血癥，彌散性血管內(nèi)凝血，紫癜爆發(fā)，重大創(chuàng)傷，重大外科手術，燒傷，成人呼吸窘迫綜合癥，移植，深靜脈血栓形成，肝素誘導的血小板減少，鐮狀細胞貧血病，地中海貧血癥，病毒性出血熱，血栓形成血小板減少性紫癜，和溶血性尿毒綜合癥。
藥用制劑-一種適合作為治療試劑施用的制劑或溶液。
在此所用的藥學有效量，代表一定量的能夠在哺乳動物中抑制血栓形成紊亂的本發(fā)明的化合物。依據(jù)本發(fā)明施用的化合物的具體劑量取決于案例的具體情況，包括施用的化合物，處理的具體條件，和類似的需要考慮的事項。
HPC的結構是根據(jù)翻譯后修飾的數(shù)量的復合體。HPC結構包括一條輕鏈(殘基1-155)和一條重鏈(殘基158-419)。HPC分子最初表達為一條419氨基酸的多肽鏈，但在其從細胞分泌之前，通過移除156-157位的賴氨酸-精氨酸二肽，蛋白轉變?yōu)楫惗垠w形式。
重組的人蛋白C(r-hPC)其結構和復雜度與HPC類似。R-hPC向r-aPC的轉變過程中，凝血酶選擇性裂解活化十二肽(殘基158-169)。申請人發(fā)現(xiàn)使四肽(殘基416-419)從重鏈的C-末端裂解的條件導致脫416-419aPC多肽的形成。申請人進一步發(fā)現(xiàn)該aPC的形式是具有生物活性的(見實施例1，表1)，它可作為治療劑單獨使用或與天然aPC聯(lián)合使用。本發(fā)明因此提供分離的脫(416-419)aPC，以及擇優(yōu)制備脫(416-419)aPC的方法，及其作為藥物的運用。
本發(fā)明還提供用于制備具有截短的重鏈的蛋白C的DNA化合物。這些DNA化合物包括在野生型酶原蛋白C的前體肽的附近，下游，和位于翻譯讀碼框內(nèi)的人蛋白C的輕鏈編碼序列。此DNA序列還編碼在蛋白C分子成熟過程中加工的Lys-Arg二肽，和活化肽和蛋白C分子的截短的重鏈。
本領域的技術人員可認識到，由于遺傳密碼的簡并性，不同的DNA化合物可編碼以上所述的活化的蛋白C多肽。美國專利號4,775,624，在此全文引入作為參考文獻，公開并要求保護編碼人蛋白C分子的野生型形式的DNA序列。技術人員很容易確定DNA序列中的何種變化可用于構建其它能編碼在此公開的多肽的DNA序列，本發(fā)明不限于具體的DNA序列。因此，以下描述的優(yōu)選的本發(fā)明的DNA化合物，載體和轉化體僅為例證而不限本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的DNA化合物可通過對人蛋白C基因的定位誘變制備。適用便利技術收獲培養(yǎng)物并分離質(zhì)粒，質(zhì)?？芍苯愚D染到真核宿主細胞中制備具有截短的重鏈的蛋白C。優(yōu)選將質(zhì)粒轉染到表達腺病毒E1A立即早期基因產(chǎn)物的宿主細胞，其中GBMT轉錄控制單元中發(fā)現(xiàn)的BK增強子在E1A存在時非常有效地增強表達。GBMT轉錄控制單元在美國專利號5,573,938和歐洲專利號91301451.0的文獻中詳細描述，在此全文引入作為參考文獻。熟練技術人員了解宿主細胞表達或能夠表達大DNA病毒的立即早期基因產(chǎn)物的量。優(yōu)選用于本發(fā)明的衍生物表達的最優(yōu)選細胞系為人腎293細胞系，在美國專利號為4,992,373的文獻中公開，在此全文引入作為參考文獻。在細胞系中表達后，從細胞培養(yǎng)物上清中純化衍生物，方法見美國專利號為4,981,952的文獻，在此全文引入作為參考文獻。
本發(fā)明的DNA序列可化學合成，或通過結合限制性片段技術，結合或任何本領域的技術合成。DNA合成儀可用于構建本發(fā)明的DNA化合物。
本發(fā)明的例示的載體包括GBMT轉錄單元載體單元通過腺病毒晚期啟動子刺激編碼序列的轉錄。本領域的技術人員了解許多本領域常見的真核啟動子，增強子，和表達載體，比個運用它們表達DNA序列，制備本發(fā)明的蛋白C的衍生物。本領域技術人員還了解可以在無增強子元件時發(fā)揮功能的真核表達載體。本發(fā)明的關鍵在于新的DNA序列和相應的具有截斷的重鏈的aPC。
在此所述的活化的蛋白C多肽也可通過將活化的蛋白C與凝血酶反應從重鏈C末端裂解四肽(殘基416-419)制備。裂解如下進行，將aPC暴露給凝血酶一段時間，在適當條件下10分鐘到3-5小時。通過用凝血酶處理r-aPC制備的aPC多肽或通過真核細胞直接表達制備的aPC具有與aPC相同的活性。因此，具有截短的重鏈的aPC在對人血栓形成疾病的治療中有效，對人血栓形成疾病的治療包括對蛋白C缺失的，血管閉塞失調(diào)和包括膿毒，彌散性血管內(nèi)凝血，紫癜爆發(fā)，重大創(chuàng)傷，重大外科手術，燒傷，成人呼吸窘迫綜合癥，移植，深靜脈血栓形成，肝素誘導的血小板減少，鐮狀細胞貧血病，地中海貧血癥，病毒性出血熱，血栓形成血小板減少性紫癜，和溶血性尿毒綜合癥血凝過快狀態(tài)以及包括血栓形成失調(diào)和造成血栓形成的疾病如中風，心肌梗塞的置換治療，方法為施用具有截短的重鏈的分離的人蛋白C多肽。
本發(fā)明的另一個實施方案是治療血栓形成失調(diào)的方法，包括給需要治療的患者施用藥學有效量的帶有截短的重鏈的分離的人蛋白C多肽和抗血小板劑。
本發(fā)明的另一個實施方案為治療膿毒的方法，包括向患者施用藥物有效量的具有截短的重鏈的人蛋白C多肽和細菌滲透性增加蛋白。
具有截短的重鏈的分離的人蛋白C多肽可加藥物允許的稀釋基制劑為aPC的類似物的形式。稀釋劑優(yōu)選包括糖，如蔗糖，鹽和檸檬酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，aPC衍生物在pH5.5-6.5條件下制備。通常，在此所述的aPC衍生物的藥學劑量與天然aPC類似，優(yōu)選0.01mg/kg/hr到O.05mg/kg/hr。
以下制備和實施例僅用于例示。本領域技術人員了解其它制備活化的重組蛋白C的方法。
制備1人蛋白C的制備運用本領域技術人員熟知的技術，如在美國專利4,981,952中所述，從人腎293細胞重制備重組人蛋白C，美國專利4,981,952在此全文納入?yún)⒖嘉墨I。美國專利2,775,624公開并要求保護編碼人蛋白C的基因，在此也全文納入?yún)⒖嘉墨I。用于在293細胞中表達人蛋白C的質(zhì)粒為質(zhì)粒pLPC，在公開于美國專利4,992,373和美國專利5,661,002，在此全文納入?yún)⒖嘉墨I。質(zhì)粒pLPC的結構也公開于歐洲專利公開0445939，和Grinnell等，1987，生物技術5:1189-1192，在此全文納入?yún)⒖嘉墨I。簡要的，該質(zhì)粒轉染到293細胞，然后鑒定穩(wěn)定轉化體，在無血清培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)生長。發(fā)酵后，微量過濾獲得無細胞培養(yǎng)基。
從培養(yǎng)液分離人蛋白C，使用美國專利4,981,952中技術的改進方法，在此全文納入?yún)⒖嘉墨I。澄清的培養(yǎng)基以4mM溶在EDTA中，后吸收到陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)。4體積20mMTris,200mM NaCl,pH7.4和2體積20mM Tris,150mM NaCl,pH7.4洗，結合的重組人蛋白C酶原用20mM Tris,150 mM NaCl,10mM CaCl2,pH7.4洗脫。洗脫后的蛋白經(jīng)SDS-聚丙酰胺凝膠電泳測定純度高于95％。
蛋白的進一步純化如下進行，蛋白3M溶在NaCl中，后吸附到疏水相互作用樹脂(Toyopearl Phenyl 650M,TosoHaas),在20mM Tris，3M NaCl,10mM CaCl2,pH7.4中平衡。用2體積無CaCl2的平衡緩沖液洗2次，重組人蛋白C用20mM Tris,pH7.4洗脫。洗脫的蛋白移除殘余鈣。重組人蛋白C通過金屬親合柱(Chelex-100,Bio-Rad)，移去鈣并再次與陰離子交換柱(Fast-Flow Q,Pharmacia)結合。這些柱按系列安排并在20mM Tris,150mM NaCl,5mMEDTA,pH7.4中平衡。加入蛋白后，Chelex-100柱在將其從系列中拆開前用一體積相同的緩沖液洗。陰離子交換柱先用3體積平衡緩沖液洗，后用0.4 M NaCl,20mM Tris-醋酸，pH6.5洗脫蛋白。重組人蛋白C和重組活化的蛋白C溶液的蛋白濃度分別在UV 280nm，消光系數(shù)0.1％=1.81或1.85測。
制備2重組人蛋白C的活化牛凝血酶在40mM HEPES,pH7.5的存在下與活化的CH-Sepharose4B(Pharmacia)在4℃偶聯(lián)。偶聯(lián)反應在裝入柱的樹脂上進行，使用約5000單位凝血酶/ml樹脂。凝血酶溶液循環(huán)通過柱約3小時，后加MEA到循環(huán)溶液至濃度0.6ml/l。含MEA的溶液循環(huán)10-12小時，直到樹脂上未反應的胺完全封阻為止。阻斷后，凝血酶偶聯(lián)的樹脂用10體積1M nAcL,20Mm Tris,pH 6.5洗，去除非特異性結合的蛋白，在活化緩沖液中平衡后，用于活化反應。
純化的rHPC 5mM溶于EDTA中(螯合任何殘留的鈣)，用20mMTris,pH7.4或20mM Tris-醋酸，pH 6.5稀釋到濃度為2mg/ml。此溶液通過37℃50mM NaCl或20mM Tris pH 7.4或20mM Tris-醋酸pH6.5平衡的凝血酶柱。調(diào)整流速使rHPC和凝血酶樹脂之間的接觸時間約20分鐘。收集流出物，立即測其酰胺裂解活性。如該物質(zhì)不具有相當于aPC已確定的標準的特異活性(酰胺裂解)，降其重加到凝血酶柱直到活化rHPC。然后將此物質(zhì)按1∶1用以上20mM緩沖液稀釋，pH7.4或6.5在等待下一步時保持aPC在低濃度。
從aPC物質(zhì)移除瀝濾的凝血酶，將aPC與在含150mM NaCl的活化緩沖液(20mM Tris,pH 7.4或20mM Tris-醋酸，pH6.5)中平衡的陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q,Pharmacia)結合。在此條件下，凝血酶不與陰離子交換樹脂作用，而通過柱進入點樣洗脫物。一旦aPC與柱結合，用20mM平衡緩沖液2-6體積柱，而后用一步洗脫液(0.4M NaCl溶于5mM Tris-醋酸，pH6.5或20mM Tris,pH 7.4)洗脫結合的aPC。更多體積的洗加速更完全去除十二肽。
活化的蛋白C的抗凝結活性取決于對活化的部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)凝塊分析的凝塊時間的延長測定。標準曲線在稀釋緩沖液(1mg/mL放射免疫測定級牛血清白蛋白(BSA),20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,0.02％NaN3)制備，蛋白C濃度范圍從125-1000ng/mL，樣品制備為在此濃度范圍內(nèi)的幾種稀釋液。每個樣品試管中加入50微升冰冷的馬血漿和50微升重組的活化的部分組織促凝血酶原激酶時間試劑(APTT試劑Sigma)，37℃溫育5分鐘。溫育后，向每管加入50微升適當樣品或標準。以稀釋緩沖液替代樣品或標準確定基本凝塊時間。Fibrometer(CoA Screener HemostasisAnalyzer,American Labor)的計時器在37℃向樣品或標準加入50微升30 mM CaCl2后立即啟動。樣品中活化的蛋白C濃度從標準曲線的線性回歸方程式計算得出。在此報道的凝塊時間為3次重復的最小值的平均數(shù)，包括標準曲線樣品。
實施例1脫416-419活化的蛋白C的制備
aPC用作制備脫416-419活化的蛋白C的起始材料。使用固定化的凝血酶樹脂(10mg凝血酶/ml CH-Sepharose 4B樹脂)。N-糖苷酶F購自Boehringer Mannheim。馬血漿為AnimalTechnologies,Inc.(Tyler,TX)產(chǎn)品?；罨腃H Sepharose4B購自Pharmacia Biotech。其它所有試劑為ACS試劑級，可從商業(yè)渠道獲得。
將6mL固定化的凝血酶樹脂加入0.2微米濾器。約5×20mL 40mMTris緩沖液，pH 7.02洗樹脂。洗過的固定化的凝血酶樹脂轉移到50mL聚丙烯小管，向管中加入一份12mL 2.67mg/mL aPC溶液(120mgaPC溶于45ml pH7.02的40mM tris緩沖液中)，Tris緩沖液將懸液最終體積補到約21mL。懸液在室溫溫育，不斷輕微攪動。溫育10,25,50,100,160和240分鐘后，從小管移出3mL液體。這些移出部分200RPM(ICE CRU-5000離心機)離心1分鐘，上清轉到1.5mL聚丙烯小管。這些小管立即置于干冰中冷凍溶液。同時用不含固定化的凝血酶的Ch-Sepharose 4B樹脂制備對照樣品。
蛋白含量分析。每分(150mcL)樣品溶液用450mcL的40mM tris緩沖液，pH7.02或試劑水稀釋。樣品細胞用樣品溶液洗兩次，測定溶液的UV吸收度(=280nm)。Tris緩沖液或試劑水用作測定的空白。
蛋白多肽分布的LC/MS分析。約600mcL每份的樣品溶液與240mg脲，88mcL 3M tris緩沖液(pH=8.0)和15mcL50mg/mL二硫蘇糖醇混合，混合物在37℃溫育30分鐘。加入50mcL50mg/mL碘乙酰胺溶液烷化，黑暗中室溫溫育30分鐘。樣品在一次性凝膠過濾柱上去鹽，N-糖苷酶F去糖基化，LC/MS分析。
RP-HPLC分析。300-400微升一份的解凍樣品溶液與足夠體積的0.1％TFA溶液混合，得到約1mg/mL溶液。此溶液用作高濃度樣品。低濃度樣品通過將50mcL一份的高濃度樣品與450mcL的0.1％TFA溶液混合制備。100微升每份的酶中高濃度及低濃度樣品注入到HPLC系統(tǒng)。
APTT分析。樣品通過自動活化的部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)CoaLab分析儀分析。所有樣品用人工移液管稀釋到終濃度在410ng和420ng aPC/mL之間。分析中使用303/de aPC參考標準。如上所述制備的脫(416-419)aPC通過APTT分析測定，具有與天然aPC相同的生物學活性。APTT抗凝結活性和脫416-419aPC的百分比間的關系見表1。脫16-419aPC的百分比可高至68％而仍保持與天然aPC相同的抗凝結活性。通常，用在此描述的方法制備的aPC包括從1％到25％的脫416-419 aPC。
序列表<110>伊萊利利公司<120>蛋白C多肽<130>蛋白C截短的重鏈<140>x12279<141>1999-06-02<160>2<170>patentIn ver.2.0<210>1<211>1244<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述C末端截短的重組人蛋白C<400> 1gccaactcct tcctggagga gctccgtcac agcagcctgg agcgggagtg catagaggag 60atctgtgact tcgaggaggc caaggaaatt ttccaaaatg tggatgacac actggccttc 120tggtccaagc acgtcgacgg tgaccagtgc ttggtcttgc ccttggagca cccgtgcgcc 180agcctgtgct gcgggcacgg cacgtgcatc gacggcatcg gcagcttcag ctgcgactgc 240cgcagcggct gggagggccg cttctgccag cgcgaggtga gcttcctcaa ttgctcgctg 300gacaacggcg gctgcacgca ttactgccta gaggaggtgg gctggcggcg ctgtagctgt 360gcgcctggct acaagctggg ggacgacctc ctgcagtgtc accccgcagt gaagttccct 420tgtgggaggc cctggaagcg gatggagaag aagcgcagtc acctgaaacg agacacagaa 480gaccaagaag accaagtaga tccgcggctc attgatggga agatgaccag gcggggagac 540agcccctggc aggtggtcct gctggactca aagaagaagc tggcctgcgg ggcagtgctc 600atccacccct cctgggtgct gacagcggcc cactgcatgg atgagtccaa gaagctcctt 660gtcaggcttg gagagtatga cctgcggcgc tgggagaagt gggagctgga cctggacatc 720aaggaggtct tcgtccaccc caactacagc aagagcacca ccgacaatga catcgcactg 780ctgcacctgg cccagcccgc caccctctcg cagaccatag tgcccatctg cctcccggac 840agcggccttg cagagcgcga gctcaatcag gccggccagg agaccctcgt gacgggctgg 900ggctaccaca gcagccgaga gaaggaggcc aagagaaacc gcaccttcgt cctcaacttc 960atcaagattc ccgtggtccc gcacaatgag tgcagcgagg tcatgagcaa catggtgtct 1020gagaacatgc tgtgtgcggg catcctcggg gaccggcagg atgcctgcga gggcgacagt 1080ggggggccca tggtcgcctc cttccacggc acctggttcc tggtgggcct ggtgagctgg 1140ggtgagggct gtgggctcct tcacaactac ggcgtttaca ccaaagtcag ccgctacctc 1200gactggatcc atgggcacat cagagacaag gaagcccccc agaag 1245<210>2<211>415<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述C末端截短的重組人蛋白氨基的序列<400>2Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu1 5 10 15Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln20 25 30Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Leu Val Leu Pro Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys50 55 60Gly His Gly Thr Cys Ile Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys65 70 75 80Arg Ser Gly Trp Glu Gly Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu85 90 95Asn Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu100 105 110Val Gly Trp Arg Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp115 120 125Asp Leu Leu Gln Cys His Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro130 135 140Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu145150 155 160Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr165 170 175Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys180 185 190Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro ser Trp Val Leu Thr195 200 20權利要求
1．一種分離的人蛋白C多肽，包括一條輕鏈和一條截短的重鏈。
2．權利要求1的多肽，其中所述多肽為SEQ ID NO:1。
3．一種編碼權利要求1的人蛋白C多肽的重組DNA分子。
4．權利要求3的重組DNA分子，其中所述DNA分子是SEQ IDNO:2。
5．權利要求1的分離的人蛋白C多肽，其中所述人蛋白C多肽為活化的。
6．一種在需要治療的患者中治療患者的血栓形成失調(diào)，血管閉塞失調(diào)和凝血過快狀態(tài)的方法，該方法包括向所述患者施用藥學上有效量的權利要求1的具有截短的重鏈的分離的活化的蛋白C多肽。
7．一種包含權利要求2的核酸的載體。
8．一種包含權利要求2的分離的核酸的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了帶有一段截短的重鏈的分離的人蛋白C多肽。該分離的多肽保留了野生型人蛋白C的生物活性。此種多肽對血管閉塞失調(diào),血凝過快,血栓形成失調(diào)及造成血栓形成的疾病的治療有用。
文檔編號C12N15/09GK1303428SQ99806859
公開日2001年7月11日 申請日期1999年6月1日 優(yōu)先權日1998年6月1日
發(fā)明者L·黃, R·M·里金 申請人:伊萊利利公司