專利名稱：含乳酸菌的組合物、藥物和食物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含乳酸菌的組合物和含有它的藥物和食物。
背景技術：
已長久的認為含乳酸菌的藥物制劑對治療腸道疾病是有效的，而且，經(jīng)多年使用測試，被當成十分安全的藥物。同時，已知在前藥典雙岐桿菌和前藥典嗜酸性乳酸桿菌制劑中，基于乳酸菌的藥物制劑的活性成分配制的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)和糞鏈球菌(Strptococcus faecalis)，是人腸的固有菌，這些細菌作為腸道菌在保持和促進健康方面起了非常重要的作用。
由于藥理學作用的可靠性和副作用的低威脅性，如今重新有興趣對這些乳酸菌進行了深入的研究和開發(fā)。
特別是，在抗胃炎、抗?jié)兒兔谀蛏称骺垢腥緞╊I域中，預見到了乳酸菌應用的驚人進展。
作為消化性潰瘍的治療藥物，目前已開發(fā)了甲腈咪胍(cimetidine)、雷尼替丁(ranitidine)、法莫替丁(famotidine)等H2-受體拮抗劑，omeprazole等質(zhì)子泵抑制劑，和胃粘膜保護劑，并取得了值得稱贊的治療效應。然而，有被認為已完全治愈的潰瘍重新復發(fā)和加劇，已發(fā)現(xiàn)這些復發(fā)事件的病因是在胃粘膜活組織切片檢查標本中檢測到的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)。
幽門螺桿菌是感染胃粘膜的革蘭氏陰性微需氧螺桿菌。已提示由于其強大的脲酶活性，該微生物將衍生自宿主的尿素分解成氨，來中和胃酸，并從而使自身能夠在胃中生長。
現(xiàn)在全世界都已承認，幽門螺桿菌的清除是治療消化性潰瘍的新方法，而且直到目前，已發(fā)現(xiàn)青霉素、羥氨芐青霉素、氨芐青霉素等β-內(nèi)酰胺，紅霉素、clairithromycin、氮紅霉素、roxithromycin等大環(huán)內(nèi)酯物，阿貝卡星、慶大霉素等氨基糖苷類，四環(huán)素抗生素，用作抗原蟲劑的滅滴靈，和鉍制劑對除去幽門螺桿菌是有效的，而且確實在美國和歐洲國家中被使用。
另外，最近在H2-受體拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑等抗?jié)儎┑闹委燁愋椭校验_發(fā)了還具有針對幽門螺桿菌的抗菌作用的新化合物，而且一些已進入市場。因此，對于胃炎或胃與十二指腸潰瘍的治療及其復發(fā)的預防，已進行了許多嘗試，用抗菌劑和其它對幽門螺桿菌有活性的藥物來除去該生物。
然而，用常規(guī)抗菌劑治療，不僅需要超過一般感染所需的通常劑量的大劑量，而且還需要長期用藥，其可能伴有新抗性菌株的產(chǎn)生，而且也會有副作用的威脅。
例如，在用抗菌劑排除幽門螺桿菌的治療領域中，一直期望用乳酸菌的生物前治療。日本專利號2672247公開了一種嗜酸乳桿菌的菌株在從腸和胃細胞中除去幽門螺桿菌是有效的。然而，當實際將嗜酸乳桿菌施給病人時，不能獲得預期效果。
日本公開出版物Hei-9-241173公開了唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)或短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的某些菌株具有抗胃炎、抗?jié)兒推渌钚?。這些菌株在某種程度上是有效的，但當口腔施用時，很可能乳酸菌將從胃和小腸中迅速被清除，導致幽門螺桿菌清除作用的顯著減弱。
第二個期待乳酸菌應用的驚人進步的領域是其用于腸出血性大腸桿菌(EHEC)的除去。
1977年發(fā)現(xiàn)的EHEC是命名為“EHEC-0157”的病原性生物，因為其菌株大部分屬于0157:H7血清組。
該細菌病原體的感染經(jīng)常在攝入污染食物或水引起的大量食物中毒爆發(fā)中發(fā)現(xiàn)，而且在腹瀉和腹痛等前期癥狀后，發(fā)生伴有腹部深度疼痛和帶血糞便的出血性結腸炎。嚴重病人伴有作為并發(fā)癥的溶血性尿毒綜合征，血栓形成性血小板增多癥紫癜和腦病，最壞的情況下引起死亡。該感染性疾病的病因是EHEC產(chǎn)生的Vero毒素(VT)。VT被分成兩類，即與痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)產(chǎn)生的志賀毒素相同的VT1和生物活性與VT1相似，但物理化學不同，而且免疫學性質(zhì)也已知與志賀類毒素相似的VT2。
VT是所有細胞毒素中最烈性的，而且由于其RNA N-糖苷酶的活性誘導的蛋白合成抑制，表現(xiàn)了強烈的殺死小鼠作用、細胞毒性和腸毒性。在EHEC感染中，用磷霉素、氟哌酸和卡那霉素等抗生素，但直到今日還沒有足夠有效的治療形式，仍期待著新治療方法的開發(fā)。
第三個期待乳酸菌應用的驚人進步的領域是其用于食物過敏治療的應用。
世界上食物過敏病人的數(shù)目正穩(wěn)步上升，而該趨勢在發(fā)達國家中特別明顯。對于食物過敏的治療和/或預防，現(xiàn)在已采用了不吃引起過敏的食物和抗過敏藥物的施用，但不吃食物極大加重了人體的生理和精神負擔，而且也受到家庭生活或集體生活觀念的許多限制?？惯^敏藥物的長期施用涉及副作用的高度威脅。
由于在發(fā)達國家中最近食物過敏事件的增加，已推測由于人類目前接觸各種致病性微生物的機會降低了，人的體質(zhì)已發(fā)生了變化，從而對這些抗原刺激過度應答。已知實驗性構建的無菌動物防御機制的特征，顯示對食物過敏原入侵的過度反應。
當人工喂養(yǎng)嬰兒與母乳喂養(yǎng)的嬰兒比較時，人工喂養(yǎng)嬰兒顯示顯著高的過敏病發(fā)生率且免疫球蛋白E過多癥發(fā)生率，對糞便菌落的檢查揭示了雙岐桿菌群在人工喂養(yǎng)嬰兒中明顯比母乳喂養(yǎng)的嬰兒低，相反的，前者嬰兒給出了較高的梭菌和假單胞菌計數(shù)或檢測率[“嬰兒營養(yǎng)和腸道菌群”，Mitsuoka,T.:“腸道菌群和營養(yǎng)”，p.13,Gakkai Shuppan Center,1983]。
近年來，已報道過敏的發(fā)生和Th1和Th2細胞間的平衡有關，Th1細胞比例的減少導致過敏的發(fā)生[現(xiàn)代醫(yī)學，53,No.12,p.72-79,1998],Th1細胞由IL-12誘導[醫(yī)學進展，180,p.85-89,1997]，和乳酸菌具有刺激IL-12產(chǎn)生的活性[日本公開出版物Hei-10-139674]。
因此，希望可通過雙岐細菌的吸收來預防和治療食物過敏。
當擴大了乳酸菌的新應用范圍，并將其設想得越來越重要時，基本的問題仍存在于施用的乳酸菌被迅速從消化道中清除，沒有有效預防該過早清除，并保持或增強其藥理學作用的方法。
同時，第四個期待乳酸菌應用的驚人進步的領域是其治療和/或預防泌尿生殖道感染的應用。
在正常的健康婦女陰道中建立的是乳酸菌作為優(yōu)勢成員的良好平衡的菌群。然而，由于陰道自清潔作用的減弱、子宮內(nèi)避孕裝置的插入、化學或機械刺激、雌激素功能的異常和/或性交有關的感染干擾了該陰道菌群的平衡，許多其它種類的細菌替換了乳桿菌，導致細菌性陰道病或真菌性陰道病的發(fā)生。另外，猜想乳桿菌在尿道上形成一層保護性生物膜，從而防止大腸桿菌等革蘭氏陰性桿菌從肛周區(qū)向上侵入，并保護尿道抵抗細菌感染。因此，該乳桿菌保護性生物膜的崩潰可導致尿道感染復發(fā)事件。
當這種細菌性陰道炎、復發(fā)性尿道感染等不及時治療時，它們將發(fā)展成更嚴重的疾病，如骨盆內(nèi)感染、術后感染等，而且已報道骨盆內(nèi)感染和患細菌性陰道病的病人容易患HIV感染[AIDS,vol 2,p.1699-1706,1998]。
在這些泌尿生殖器感染中，已嘗試用乳酸菌進行生物前治療[日本抗生素雜志,759(No 39),p.51-12,1998；FEMS免疫學和醫(yī)學微生物學，6,251-264,1993]。然而，這些泌尿生殖器官感染的特征是，即使曾經(jīng)獲得減輕，仍將經(jīng)歷復發(fā)，而完全治愈是困難的。
而由于這些情況，乳酸菌的該新應用變得更廣泛，而且越來越重要了?；镜膯栴}仍存在于，在施用后，乳酸菌從泌尿生殖器官中迅速被清除，而對預防該過早清除和保持和/或加強其藥理學作用還沒有有效方法。
發(fā)明簡述在本領域的上述描述中，本發(fā)明的目的是提供一種含乳酸菌的組合物，它對增強在消化道和/或泌尿生殖器官中顯示藥物作用的乳酸菌的藥理學作用是有益的，而且拮抗從消化道和/或泌尿生殖器官中清除乳酸菌。
因此，本發(fā)明針對含有乳酸菌的組合物，其包含在消化道和/或泌尿生殖器官中顯示藥理作用的乳酸菌，其中增強了所述乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著性，從而加強所述藥物作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及含乳酸菌的組合物，其包含在消化道和/或泌尿生殖器官中顯示藥理作用的乳酸菌，其中增強了所述乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著來加強所述藥物作用。
本發(fā)明的發(fā)明人假定，在攝入或施用后從消化道和/或泌尿生殖器官中為了拮抗含有顯示藥理學作用的乳酸菌組合物的清除，從而增強其藥理學作用，至關重要的是使這些細菌在消化道和/或泌尿生殖器官中保留時間延長，并為了達到該目的，提高乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著。本發(fā)明由該發(fā)現(xiàn)完成。
上述一系列發(fā)明，即加強藥理學作用，在消化道和/或泌尿生殖器官中保持時間的延長，和對消化道和/或泌尿生殖器官粘著的增強在文中顯而易見，但對任何人來說，即使設想關于乳酸菌的這些想法也是很困難的，因為在本領域的描述中，乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著在技術上幾乎是不可能的。只有獲得將在下文詳細描述的具有促進粘著性的特殊物質(zhì)，發(fā)明人才能實現(xiàn)本發(fā)明。
本說明書中所用的術語“消化道”是一般術語，指人體內(nèi)掌管消化和吸收的管道，包括口、食道、胃、小腸、大腸和直腸。同樣，在本說明書中使用的術語“泌尿生殖器官”也是一般術語，指涉及尿的產(chǎn)生和排出的器官，和涉及生殖器官，包括婦女的外陰和陰道，男性的生殖器和尿道。本說明書中使用的術語“消化道和/或泌尿生殖器官”根據(jù)上下文而定，僅指消化道，或僅指泌尿生殖器官，或同時指消化道和泌尿生殖器官。
本說明書上下文中的含乳酸菌的組合物是指含有乳酸菌的組合物。本說明書上下文中乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著指乳酸菌繼續(xù)存在于消化道和/或泌尿生殖器官的粘膜上皮細胞表面。乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官粘著的提高指繼續(xù)存在于消化道和/或泌尿生殖器官的粘膜上皮細胞表面的乳酸菌數(shù)目的增加。在本發(fā)明中，所述細菌數(shù)目(也稱為粘著細菌數(shù)目)的增加至少是未治療對照組的2倍，通常是10倍到100倍之多。
乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官粘著的提高，導致乳酸菌藥理學作用增強的事實已由本發(fā)明人實驗性證明。因此，顯而易見提高乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著是增強所述藥理作用的非常有效的方法。還已發(fā)現(xiàn)，為了增強所述藥理作用的目的，要粘著在消化道和/或泌尿生殖器官上的乳酸菌優(yōu)選是活有機體。
本發(fā)明含乳酸菌的組合物含有乳酸菌。上文提到的乳酸菌包括各種用于人和動物的細菌，包括乳酸桿菌，例如唾液乳桿菌，嗜酸乳桿菌，短乳桿菌，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)，類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)，路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)，加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)，約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)，高加索乳桿菌(Lactobacillus kefir)等；乳球菌，例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，植物乳球菌(Lactococcusplantarum)，棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)，唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)，乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)，腸膜乳明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等；和雙岐細菌，如動物雙岐桿菌(Bifidobacterium animalis)，雙岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)，嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)，長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum)，假長雙岐桿菌(Bifidobacterium pseudolongum)，嗜熱雙岐桿菌(Bifidobacteriumthermophilum)，青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis)等。
這些乳酸菌可單用，或可用兩種或更多。
作為所述乳酸菌，在本發(fā)明中乳酸菌生長可用常規(guī)培養(yǎng)法和用離心分離過程收集。
本發(fā)明的特征是，所述乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著增強，因而可用任何能盡可能長時間的增強所述乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著的方法，但優(yōu)選是由混合一種大分子物質(zhì)組成優(yōu)選堿性多聚物的方法。
不特別限于堿性多聚物，只是提供具有高分子量的堿性物質(zhì)。另外，就兩性多聚物而言，例如具有在堿性一側的等電點的堿性蛋白質(zhì)的多聚物(當pH比其等電點低時是帶正電的)也落在“堿性多聚物”的范圍內(nèi)。另外，本說明書中所用術語“多聚物”，包括像具有大約808分子量的脫乙酰殼多糖四聚物等物質(zhì)。
上文提到的堿性多聚物包括脫乙酰殼多糖、聚賴氨酸、膽甾胺樹脂和膽甾酰亞胺等抗高血脂陰離子交換樹脂、魚精蛋白、明膠、異丁烯酸氨烷酯共聚物E、異丁烯酸氨烷酯共聚物RS、乳鐵蛋白和溶菌酶等。
上文提到的脫乙酰殼多糖是通過幾丁質(zhì)的化學處理獲得的大分子多糖，該幾丁質(zhì)是蟹外殼、蝦殼、蝗蟲、蠶、蝶蛹等昆蟲的表皮、香菇，enokidake等擔子菌綱Basidiomycetes真菌，根霉Rhizopus等接合菌綱Zygomycetes真菌的細胞壁。已知它們具有抗腫瘤性、抗微生物性、免疫增強性和其它活性。
日本公開出版物Hei-8-165246公開了一種包含高-核酸物質(zhì)和脫乙酰殼多糖的生理活性增強劑，而且日本公開出版物Hei10-191928公開了一種含有脫乙酰殼多糖和雙岐細菌的健康食品。然而，還未發(fā)現(xiàn)脫乙酰殼多糖曾對乳酸菌與消化道和/或泌尿生殖器官的粘著性提高有利，而且鑒于本發(fā)明實現(xiàn)的作用，看來預測本發(fā)明也還是困難的。
用于本發(fā)明的脫乙酰殼多糖是通過堿處理天然幾丁質(zhì)獲得的脫乙酰產(chǎn)物。該脫乙酰殼多糖，根據(jù)平均分子量的順序和脫乙?；潭?，存在大范圍的等級，但本發(fā)明可用的脫乙酰殼多糖包括任一和全部這些脫乙酰殼多糖的等級(包括脫乙酰殼多糖寡糖)。如熟知的，脫乙酰殼多糖是一種食料；因此，它對本發(fā)明的目的是高度安全并十分適合的。
在本發(fā)明中，脫乙酰殼多糖相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
本發(fā)明可用的聚賴氨酸是基本氨基酸L-賴氨酸的同聚物，通過在L-賴氨酸的ε-N末端和C-末端之間的n個酰胺鍵形成，而且聚合的程度(n)可以是約20到25。已知聚賴氨酸是已證實其對微生物的生長有抑制活性的化合物。
在本發(fā)明中，聚賴氨酸相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
本發(fā)明可用的抗高血脂陰離子交換樹脂不受具體限制，但包括膽甾胺樹脂和膽甾酰亞胺等。已知膽甾胺樹脂是合成的強烈結合膽固醇的堿性離子交換樹脂。它可以商品名Dowex；1-X2-Cl,MK-135等商業(yè)購得，也在Merck目錄中被列為No.2257。上文提到的膽甾酰亞胺是已知的抗高血脂化合物，可以商品名Cholebine商業(yè)購得。
在本發(fā)明中，抗高血脂陰離子交換樹脂相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg 。
本發(fā)明所用的魚精蛋白是主要作為與魚精細胞核中的DNA結合的核蛋白(核精蛋白)存在的強堿性蛋白質(zhì)，并且是J.Antibact.Antifung.Agents Vol.23,No 10,pp 635-642(1995)中所述的已知化合物。今天，魚精蛋白主要在食品工業(yè)中用作食品防腐劑，而且其氨基酸組成和立體結構已經(jīng)被闡明。
在本發(fā)明中，魚精蛋白相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
本發(fā)明中所用的明膠是能通過酸或堿處理動物骨骼、韌帶或腱，并熱水抽提得到的粗膠原蛋白制備的蛋白質(zhì)，并且尤其是日本藥典中描述的已知物質(zhì)。
當在實施本發(fā)明中要用明膠時，優(yōu)選用酸處理的明膠。酸處理明膠的等電點是pH7.0到9.0，而且當pH低于該等電點時，該明膠是帶正電的，因此，其可作為本說明書中描述的堿性聚合物。
在本發(fā)明中，明膠相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
本發(fā)明中所用的異丁烯酸氨烷酯共聚物E是異丁烯酸甲酯/異丁烯酸丁酯/和異丁烯酸二甲基氨基乙酯的三聚物，而且已被用作藥物學片劑和顆粒的涂層劑，因此是已知物質(zhì)。例如可以商品名Eudragit E(Rhein)購得。異丁烯酸氨烷酯共聚物E可溶于有機溶劑，但在水中幾乎不溶，而且由于顯示堿性，該物質(zhì)也屬于本說明書中所稱的堿性聚合物目錄。
在本發(fā)明中，異丁烯酸氨烷酯共聚物E相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
本發(fā)明中所用的異丁烯酸氨烷酯共聚物RS是乙酰乙酯/異丁烯酸甲酯/異丁烯酸三甲基氯化銨甲酯的三聚物，是作為藥物學片劑和顆粒的涂層劑的已知化合物?？梢陨唐访鸈udragit RS,Eudragit Retard S，和Eudragit RL(R)等購得。異丁烯酸氨烷酯共聚物RS在有機溶劑中可溶，而在水中幾乎不溶，但由于其顯示堿性，也在本說明書所稱的“堿性共聚物”目錄內(nèi)。
在本發(fā)明中，異丁烯酸氨烷酯共聚物RS相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
本發(fā)明中所用的乳鐵蛋白是作為多功能蛋白質(zhì)存在于人和哺乳動物乳汁中的己知物質(zhì)。乳鐵蛋白是一種分子量大約8×104的蛋白質(zhì)，已經(jīng)鑒定了人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白的氨基酸序列。由于它顯示堿性，乳鐵蛋白是本說明書所稱的堿性聚合物之一。
在本發(fā)明中，乳鐵蛋白相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
溶菌酶是一種作為酶的已知物質(zhì)，其水解細菌的細胞壁粘肽(EC.3.2.1.17.)的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β1-4鍵。例如，來自雞蛋清的溶菌酶是一種由129個氨基酸殘基構成，分子量14300，等電點11的單鏈多肽，因此是本說明書所稱的堿性聚合物之一。
在本發(fā)明中，溶菌酶相對于乳酸菌的用量優(yōu)選每1×109乳酸菌不少于0.00015mg，更優(yōu)選的是不少于0.001mg。
在本發(fā)明中，可使用一種、或兩種、或更多種上文提到的堿性聚合物。
可將含乳酸菌的組合物用于除去幽門螺桿菌的目的。當乳酸菌具有上文提到的除去幽門螺桿菌的作用時，本發(fā)明含乳酸菌的組合物(其中所述細菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著性增強)比僅含有乳酸菌的組合物顯示更強的除去幽門螺桿菌的效果。
可將本發(fā)明含乳酸菌的組合物用于清除腸出血性大腸桿菌的目的。當乳酸菌具有上文提到的除去出血性大腸桿菌的作用時，本發(fā)明含乳酸菌的組合物(其中所述細菌對消化道的粘著性增強)比僅含有乳酸菌的組合物顯示更卓越的除去出血性大腸桿菌的效果。
可將本發(fā)明含乳酸菌的組合物用于食物過敏的治療。當已證明乳酸菌具有上文提到的對食物過敏的治療作用時，本發(fā)明含乳酸菌的組合物(其中所述細菌對消化道的粘著性增強)比僅含有乳酸菌的組合物顯示顯著提高的治療食物過敏的效力。
可將本發(fā)明含乳酸菌的組合物用于泌尿生殖器官感染的治療和/或預防。當已顯示乳酸菌對上文提到的泌尿生殖器官感染的治療和/或預防有效時，本發(fā)明含乳酸菌的組合物(其中所述細菌對泌尿生殖器官的粘著性增強)比僅含有乳酸菌的組合物顯示卓越的對泌尿生殖器官感染的治療和/或預防的效力。
上文提到的泌尿生殖器官感染不受具體限制，但包括細菌性陰道病、真菌性陰道病和復發(fā)尿道感染等。
可用各種方法生產(chǎn)本發(fā)明的含乳酸菌的組合物。例如可通過混合所述堿性聚合物粉末與乳酸菌懸液的方法，混合所述堿性聚合物的水溶液或懸液與乳酸菌懸液的方法，或混合所述堿性聚合物與乳酸菌粉末的方法獲得本發(fā)明的含乳酸菌的組合物。
另外，可用合適的穩(wěn)定劑補充和通過干燥，例如凍干來粉末化組合物。至于混合變量條件，不具體限制濃度，但為了考慮乳酸菌的穩(wěn)定性，溫度和pH最好作明智的選擇。
例如，所述乳酸菌懸液和堿性聚合物的所述水溶液或懸液的溫度和pH優(yōu)選分別不高于60℃和pH2到9。也可通過混合所述堿性聚合物的粉末與乳酸菌粉末來獲得本發(fā)明含乳酸菌的組合物。當用脫乙酰殼多糖或異丁烯酸氨烷酯共聚物E作為堿性聚合物來制備脫乙酰殼多糖或異丁烯酸氨烷酯共聚物E的水溶液時，優(yōu)選加入酸性成分，因為通常脫乙酰殼多糖和異丁烯酸氨烷酯共聚物E都會在酸性條件下膨脹并溶解。
上述酸性成分不受具體限制，但包括鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、脂肪酸、琥珀酸、馬來酸、檸檬酸和酒石酸等。
將如此獲得的本發(fā)明含乳酸菌的組合物作為藥物或食品施用給人或動物，或讓其被人或動物攝入。包含本發(fā)明含乳酸菌組合物的藥物也是本發(fā)明的一個實施例，而且包含本發(fā)明含乳酸菌的組合物的食品也是本發(fā)明的另一個實施例。
可通過常規(guī)技術以各種形式提供上述的藥物或食物。關于胃腸道應用的劑形，可通過口服途徑安全施用粉末、細粒、顆粒、膠囊、片劑、錠劑、糖漿等。關于泌尿生殖器官應用的劑量形式，可示范性使用栓劑、片劑、膠囊、霜、凝膠、油膏、洗劑、洗液和灌洗液。
可通過配制含乳酸菌的組合物和各種在藥物學和食品加工過程中常規(guī)使用的各種添加劑，如賦形劑、粘合劑、崩解劑、涂層劑、潤滑劑等以已知方式來生產(chǎn)這些藥物學制備物。
人的劑量依賴于靶疾病和疾病的嚴重程度，但就成人病人而言，可根據(jù)需要每日一次或一日內(nèi)分幾劑施用不少于1×106活細胞，優(yōu)選1×108到1×1012活細胞。
賦形劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖等糖和玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、稻淀粉、部分糊精化淀粉等淀粉。
粘合劑包括糊精、藻酸鈉、角叉菜膠、瓜耳樹膠、阿拉伯樹膠、瓊脂等多糖，黃蓍膠、明膠、面筋等天然存在的大分子物質(zhì)，羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基乙基纖維素、羧基甲基纖維素鈉等纖維素衍生物，和聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和乙酸乙烯酯樹脂等合成聚合物。
崩解劑包括羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈣、低-飽和度羥丙基纖維素等纖維素衍生物，和羧基甲基淀粉鈉、羥丙基淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、稻淀粉和部分糊精化的淀粉等淀粉。
潤滑劑包括滑石、硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、硅膠、水化二氧化硅、各種石蠟和氫化油等。
涂層劑包括二甲基氨基乙基異丁烯酸酯-異丁烯酸共聚物、聚乙烯縮乙醛二乙基氨基乙酸酯，乙酸乙酯-異丁烯酸共聚物、乙酸乙酯-異丁烯酸甲酯-氯化三甲基銨甲基異丁烯酸酯共聚物、乙基纖維素等水不溶性聚合物，異丁烯酸-乙酸乙酯共聚物，鄰二苯甲酸羥丙基甲基纖維素酯、醋酸羥丙基甲基纖維素酯琥珀酸酯等腸聚合物，和甲基纖維素。羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇等水溶性聚合物。
可將本發(fā)明含乳酸菌的組合物加到食品中。食品種類不受具體限制，但包括酸奶和其它發(fā)酵的乳制品。
實施本發(fā)明的最佳模式下列工作、試驗和配方實施例意圖更詳細的說明本發(fā)明，而不是要限制本發(fā)明的范圍。
在評估本發(fā)明的各種效果時，用人胃癌細胞系MKN45(JCRB 0254,Yamaguchi,H.等日本傳染病協(xié)會雜志，72,487,1998)作為常規(guī)使用的胃細胞模型；用人結腸癌細胞系Caco 2(ATCC HTB-37,Coconnie M.H.等FEMS微生物學通信，110,299,1993)作為常規(guī)使用的腸道細胞模型；用在乳酸菌存在下分泌IL-2的單核細胞白血病細胞系THP-1(Infect.Immun.,64.1906,1996)作為食品過敏模型細胞；和用人子宮癌細胞系HeLa(RCB007,Gey GO等癌癥研究，12,264,1952)作為常規(guī)使用的泌尿生殖器官細胞模型。這些將有利于體外評估。
實施例1乳酸菌接種于MRS Broth(Difco),37℃液體培養(yǎng)16小時。在培養(yǎng)完成后，3000rpm離心培養(yǎng)液5分鐘，收集細胞濃縮液。在該濃縮液中加入預先用1N鹽酸調(diào)節(jié)到pH5的磷酸緩沖鹽水(在本文后面稱為PBS(pH5),NissuiPharmaceutical)，提供每毫升2×109或3×109乳酸菌的懸液。
將脫乙酰殼多糖(Chitosan 10,≥80％脫乙酰，0.5％粘度=5到20cps.,WakoPure Chemical Ind.)懸浮于30毫升蒸餾水中，加入1N鹽酸使之溶解。然后用0.1N氫氧化鈉/H2O將溶液調(diào)節(jié)到pH5，并用水補充到100毫升，得到脫乙酰殼多糖的水溶液。然后將10毫升乳酸菌懸液和10毫升該脫乙酰殼多糖的水溶液混合，提供含乳酸菌的組合物。
以下評估了本發(fā)明的效果。將胃癌細胞系MKN45懸浮于最終濃度為每毫升5×104細胞的10％胎牛血清-RPMI 1640培養(yǎng)液中，以每孔100微升分到96孔微量滴定板的各孔中去。在37℃培養(yǎng)3日后，用PBS洗滌粘著在微量滴定板上的MKN45胃癌細胞三次，制備MKN45單層。另一組試驗將結腸癌細胞系Caco2懸浮在補充了20％血清，最終濃度為每毫升5×104細胞的Eagle’s MEM中，以每孔100微升分到96孔微量滴定板上。在37℃培養(yǎng)3日后，用PBS洗滌微量滴定板三次，制備單層Caco2結腸癌細胞。分別用PBS(pH5)2倍稀釋含乳酸菌的組合物和乳酸菌懸液，并將各0.1ml稀釋液加到單層MKN4胃癌細胞或單層Caco2結腸癌細胞上，然后37℃培養(yǎng)10分鐘。用PBS洗滌細胞后，革蘭氏染色乳酸菌，在光學顯微鏡下計數(shù)粘著在細胞上的乳酸菌。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表1和2)。
表1對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表2對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)


student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.05實施例2將乳酸菌以1％的量接種到含1％葡萄糖的GAM Bouillon(NissuiPharmaceutical)，進行37℃液體培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)完成后，3000rpm離心培養(yǎng)液5分鐘，得到細胞濃縮液。在該濃縮液中加入PBS(pH5)，從而得到每毫升含有2×109個乳酸菌的懸液。
然后，將10毫升獲得的乳酸菌懸液與10毫升如實施例1的相同方式制備的脫乙酰殼多糖水溶液，給予含乳酸菌的組合物。
如實施例1中的相同程序評估本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表3和4)。
表3對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表4對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例3通過將如實施例1制備的10毫升乳酸菌懸液和10毫升如實施例1制備的脫乙酰殼多糖水溶液混合來制備含乳酸菌的組合物。
通過如實施例1中的相同程序來評估本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表5和6)。
表5對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表6對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01
實施例4通過混合10毫升如實施例2中制備的乳酸菌懸液與10毫升如實施例1中制備的脫乙酰殼多糖水溶液制備了含乳酸菌的組合物。
如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的作用。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于Caco2結腸癌細胞(表7)。
表7對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例5分別用無菌PBS稀釋指定健康食品“MEIJI Bulgaria Yogurt”(Meiji MilkProducts)和“Onaka-e-GG！”(Takanashi Milk Products)，并接種在BL瓊脂培養(yǎng)基上，每皿0.1毫升。在37℃厭氧培養(yǎng)3日后，出現(xiàn)的菌落被分離出來。通過革蘭氏染色和API 50CL(Japan Biomellieu Biotech)鑒定如此分離的細菌染色。從“MEIJI Bulgaria Yogurt”中分離到德氏乳桿菌保加利亞亞種和唾液鏈球菌嗜熱亞種。從“Onaka-e-GG！”中，分離到鼠李糖乳桿菌。將如此分離和鑒定的乳酸菌在如實施例1的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到每毫升各含3×109個乳酸菌的懸液。
然后，將各10毫升乳酸菌懸液與如實施例1中的相同方式制備的脫乙酰殼多糖的水溶液混合，得到含乳酸菌的組合物。
用如實施例1中的相同程序評估本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表8和9)。
表8對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表9對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例6分別凍干唾液乳桿菌WB 1004懸液和如實施例1中獲得的含唾液乳桿菌WB1004的組合物懸液，制備含唾液乳桿菌WB 1004細胞的粉末和粉化的含唾液乳桿菌WB 1004細胞的組合物。
使用各懸浮在N0.1溶液J.P.(pH12)中的含唾液乳桿菌WB 1004細胞的粉末和粉化的含唾液乳桿菌WB 1004細胞的組合物，用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞(表10)。
表10對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例7將如實施例1中的相同方式制備的唾液乳桿菌WB 1004懸液(5毫升)3000rpm離心5分鐘，以獲得唾液乳桿菌WB 1004的細胞濃縮液。
分別將各種梯度的脫乙酰殼多糖(包括脫乙酰殼多糖寡糖)懸浮于30毫升蒸餾水中，并加入1N鹽酸使其溶解。在用0.1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH后，將各溶液用水補充到100毫升，得到脫乙酰殼多糖的水溶液。然后，將10毫升脫乙酰殼多糖的水溶液加到乳酸菌的細胞濃縮液中，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表11和12)。表11對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表12對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例8將如實施例1中的相同程序制備的唾液乳桿菌WB 1004懸液(5毫升)以3000rpm離心5分鐘，得到唾液乳桿菌WB 1004的細胞濃縮液。
將脫乙酰殼多糖(脫乙酰殼多糖10,≥80％乙?；?，0.5％粘度=5到20cps,Wako Pure Chemical Ind.，或脫乙酰殼多糖LL,≥80％脫乙酰化，0.5％粘度=≥20cps,Yaidzu Suisan Chemical)懸浮在30毫升蒸餾水中，并用不同的酸使其溶解。在用0.1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH3到5后，將各溶液用水補充到100毫升，得到脫乙酰殼多糖的水溶液。然后，將10毫升脫乙酰殼多糖溶液加到乳酸菌的細胞濃縮液中，得到含乳酸菌的組合物。
用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表13)。
表13對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例9將阿莫西林(Amoxicillin)(Sigma)和萬古霉素(ShionogiPharmaceutical)分別以最終濃度為每毫升200微克和每毫升10微克加到飲用水中，使ICR小鼠(雄性，5周齡)飲用該飲用水5日，來除去胃中的細菌。然后，將飲用水換成無菌水，并在1夜禁食后，以0.5ml(8×109個細胞)口腔施用如實施例1、實施例17或?qū)嵤├?9中制備的含唾液乳桿菌WB 1004的組合物懸液或唾液乳桿菌WB 1004細胞懸液的2倍PBS稀釋液。30分鐘后，殺死小鼠，分離胃，除去腸內(nèi)容物。用PBS洗滌胃并用玻璃勻漿器將9倍重量于胃的0.5M NaCl與胃-起勻漿。適當用0.5M NaCl稀釋如此獲得的勻漿物，并將其涂在含有改良LBS瓊脂培養(yǎng)基(Mitsuoka,T.,腸道細菌的世界，Sobun-sha)的培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)皿在37℃厭氧培養(yǎng)24小時，從長出的菌落數(shù)來測定粘著在胃上的細菌細胞數(shù)。用API 50 CH(Japan Biomillieu Biotech)分析數(shù)個菌落，并鑒定出它們是唾液乳桿菌WB 1004。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于小鼠胃(表14)。
表14對小鼠胃的粘著(n=4～5)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例10將MKN45胃癌細胞以終濃度為每毫升5×104個細胞懸浮在10％FCS-RPMI1640培養(yǎng)液中，并以0.1ml/孔分到96孔微量滴定板的孔中。37℃培養(yǎng)3日后，用PBS洗滌粘著在微量滴定板上的MKN45胃癌細胞三次，以制備單層MKN45胃癌細胞。
將如實施例1中獲得的唾液乳桿菌WB 1004的懸液或含唾液乳桿菌WB 1004組合物的懸液加到上述的MKN45單層上，并在培育30分鐘后，用PBS洗滌MNK45胃癌細胞三次。然后，加入0.1ml PBS，用超聲波儀(7250型，SeikoElectronics)以20kHz超聲粉碎5秒，來溶解MNK45胃癌細胞，并分離粘著在細胞上的唾液乳桿菌WB 1004。然后，用PBS稀釋該超聲液，并涂在MRS瓊脂板上，測定唾液乳桿菌WB 1004的活菌數(shù)。結果，當使用唾液乳桿菌WB 1004細胞懸液時，粘著在MKN45胃癌細胞上的乳酸菌活菌數(shù)是104.8±0.1，而當使用本發(fā)明含唾液乳桿菌WB 1004的組合物懸液時，活菌數(shù)是106.3±0.1，大約高30倍。
實施例11將聚賴氨酸(50％聚賴氨酸，Asama Kasei)溶于100毫升PBS中。然后將10毫升該聚賴氨酸溶液和10毫升如實施例1或2中的相同方式制備的乳酸菌懸液(pH7.2,2×109/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同方法評估了本發(fā)明的效果。然而，在pH7時進行對Caco2結腸癌細胞的粘著試驗。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表15和16)。
表15對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表16對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例12將膽甾胺樹脂(Sigma)懸浮在100毫升PBS中。然后，將10毫升該膽甾胺樹脂懸液與10毫升如實施例1或2中的相同方式制備的乳酸菌懸液(pH7,2×109/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同方式評估了本發(fā)明的效果。然而，在pH7下進行對Caco2結腸癌細胞粘著的試驗30分鐘。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表17和18)。
表17對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表18對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例13將魚精蛋白(Asama Kasei)溶于60毫升水，然后加入并溶解0.9克氯化鈉。用1N鹽酸將溶液調(diào)節(jié)到pH4，再用水稀釋到100毫升，從而獲得濃度為2.5％或0.15％的魚精蛋白水溶液。然后，將10毫升該魚精蛋白水溶液與10毫升如實施例1中的相同方式制備的唾液乳桿菌WB1004(pH4,3×109/ml)懸液混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效用。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表19和20)。
表19對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表20對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例14將硫酸魚精蛋白(來自鮭魚；Wako Pure Chemical Ind.)溶解在60毫升水中，然后加入并溶解0.9克氯化鈉。用1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)到pH7，并用水稀釋到100毫升，從而得到濃度為0.06到0.5％的魚精蛋白水溶液。然后，將每種濃度的魚精蛋白溶液10毫升與如實施例1或2中制備的乳酸菌懸液(pH7,3×109/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效用。然而，在pH7下進行對Caco2結腸癌細胞的30分鐘粘著試驗。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于Caco2結腸癌細胞(表21)。
表21對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例15將如實施例1或?qū)嵤├?中的相同方法制備的乳酸菌懸液(3×109/ml)(10ml)3000rpm離心10分鐘，得到乳酸菌的細胞濃縮液。
將明膠(AP-100型，Nitta Gelatin)懸浮在80毫升水中，50℃溫熱溶解，然后自然降溫。接著，加入并溶解0.9克氯化鈉，并用1N鹽酸調(diào)節(jié)到pH3，然后用水進一步稀釋到100毫升，從而得到明膠水溶液。然后，將20毫升明膠溶液加到上述乳酸菌細胞濃縮液中，得到含乳酸菌的組合物。
用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。然而，進行30分鐘粘著試驗。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表22和23)。
表22對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05表23對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例16將低分子量明膠(Miyagi Kagaku Kogyo)(10克)溶于80毫升水，然后加入并溶解0.9克氯化鈉。用1N鹽酸將該溶液調(diào)節(jié)到pH3，并用水稀釋到100毫升，從而獲得低分子量明膠的水溶液。然后，將10毫升該10％低分子量明膠水溶液與10毫升唾液乳桿菌WB1004的懸液(pH3,3×109細胞/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。然而，進行30分鐘的粘著試驗。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞(表24)。
表24對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例17將異丁烯酸氨烷酯共聚物RS(Eudragit RL100,Rhein)懸浮在80毫升水中，加熱到并維持在80C攪拌2小時，使異丁烯酸氨烷酯共聚物RS分散(平均顆粒直徑為49.3nm)。然后，加入0.96g克PBS粉末(Dulbecco’s PBS(-)，Nissui Pharmaceutical)并使之溶解，將溶液用水稀釋到100毫升并過濾(過濾材料1.2微米)，得到異丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液。然后，將10毫升該異丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液與10毫升如實施例5中的相同方式制備的乳酸菌懸液(pH7,3×109細胞/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1或?qū)嵤├?中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表25和26)。
表25對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05表26對結腸癌細胞系Caco2的粘著性(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05實施例18將異丁烯酸氨烷酯共聚物RS(Eudragit RS100,Rhein)懸浮在80毫升水中，加熱到并維持在80℃攪拌2小時，使異丁烯酸氨烷酯共聚物RS分散(平均顆粒直徑為60.9納米)。然后，溶解0.9克氯化鈉，并用1N鹽酸將溶液調(diào)節(jié)到pH4，用水稀釋到100毫升，然后過濾(1.2微米)，得到異丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液。然后，將10毫升該異丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液與10毫升如實施例1中的相同方式制備的乳酸菌懸液(pH4,3×109細胞/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1或?qū)嵤├?中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表27和28)。
表27對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表28對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05實施例19如實施例1或?qū)嵤├?中的相同方式獲得的乳酸菌懸液(3×109細胞/ml)(10ml)3000rpm離心10分鐘，得到乳酸菌的細胞濃縮液。
將異丁烯酸氨烷酯共聚物E(Eudragit E100,Rhein)懸浮在60毫升水中，并用1N鹽酸溶解。然后，加入0.9克氯化鈉并溶解。用0.1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)到pH5，用水稀釋到100毫升，得到異丁烯酸氨烷酯共聚物E的水溶液。然后，將20毫升該異丁烯酸氨烷酯共聚物E水溶液與上述乳酸菌的細胞濃縮液混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。然而，進行粘著試驗30分鐘。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表29和30)。
表29對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05表30對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例20將5克鐵乳蛋白(Wako Pure Chemical Ind.)溶解在60毫升水中，然后加入0.9克氯化鈉并使之溶解。用1N鹽酸將溶液調(diào)節(jié)到pH4，用水稀釋到100毫升，然后過濾(1.2微米)，得到鐵乳蛋白水溶液。然后，將10毫升該5％鐵乳蛋白水溶液與10毫升如實施例1中的相同方式制備的唾液乳桿菌WB 1004懸液(pH4,3×109細胞/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞(表31)。
表31對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例21將蛋清溶菌酶(Wako Pure Chemical Ind.)溶解在60毫升水中，然后加入0.9克氯化鈉并使之溶解。用1N鹽酸將該溶液調(diào)節(jié)到pH4并用水稀釋到100毫升，得到溶菌酶水溶液。然后，將10毫升該溶菌酶水溶液與10毫升如實施例1中的相同方式制備的唾液乳桿菌WB 1004懸液(pH4,3×109細胞/ml)混合，得到含乳酸菌的組合物。用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞和Caco2結腸癌細胞(表32和33)。
表32對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01表33對結腸癌細胞系Caco2的粘著(n=4)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05實施例22用實施例1或?qū)嵤├?中的相同方式獲得的乳酸菌懸液(3×109細胞/ml)(1ml)3000rpm離心5分鐘，得到乳酸菌的細胞濃縮液。在該濃縮液中加入1毫升實施例1、實施例15、實施例17和實施例20中的相同方式制備的脫乙酰殼多糖水溶液、明膠水溶液、Eudragit RL100懸液和乳鐵蛋白水溶液的混合液，得到含乳酸菌的組合物。
用如實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞(表34)。
表34對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例23用實施例1或?qū)嵤├?中的相同方式獲得的乳酸菌(3×109細胞/ml)的培養(yǎng)液3000rpm離心5分鐘，得到乳酸菌的細胞濃縮液。然后，在獲得的細胞濃縮液中加入PBS來制備每毫升含3×109個乳酸菌的懸液。
將脫乙酰殼多糖(脫乙酰殼多糖10)懸浮在30毫升蒸餾水中，并用1N鹽酸溶解。用0.1NNa0H將溶液調(diào)節(jié)到pH5，用水稀釋到100毫升，得到脫乙酰殼多糖的水溶液。然后將1毫升該脫乙酰殼多糖溶液與1毫升乳酸菌懸液混合，得到含乳酸菌的組合物。
如下評估了本發(fā)明的效果。將THP-1單核白血病細胞以最終濃度6×106個細胞/ml懸浮在PBS中，并將該懸液以每孔50微升分散到96孔微量滴定板的各孔中。
將各用PBS稀釋兩倍的含乳酸菌組合物的懸液(50微升)或乳酸菌懸液加到孔中的THP-1單核白血病細胞中，并將該板在37℃培育30分鐘。然后，將含15％蔗糖的PBS以200微升/孔分散到96孔微量滴定板的各孔中，再放入20微升培育(30分鐘)的THP-1單核白血病細胞和含乳酸菌組合物的懸液或乳酸菌懸液的反應混合物，并將該板以500rpm離心5分鐘，收集細胞沉淀。用200微升PBS洗滌該沉淀，再500rpm離心5分鐘，得到細胞片狀沉淀物。革蘭氏染色乳酸菌，在光學顯微鏡下對粘著在細胞上的乳酸菌進行計數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的該含乳酸菌的組合物高度粘著于THP-1單核白血病細胞(表35)。
表35對單核白血病細胞系THP-1的粘著(n=4)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例24把1毫升用實施例23中的相同方式獲得的乳酸菌懸液與1毫升用實施例17中的相同方式制備的異丁烯酸氨烷酯共聚物RS的水相分散液混合，而制備了含乳酸菌的組合物。用實施例23中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的該含乳酸菌的組合物高度粘著于THP-1單核白血病細胞(表36)。
表36對單核白血病細胞系THP-1的粘著(n=4)


student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例25用1毫升用實施例23中的相同方式制備的乳酸菌懸液與1毫升用實施例19中的相同方式制備的異丁烯酸氨烷酯共聚物E的水相分散液混合，而制備了含乳酸菌的組合物。
如下評估了本發(fā)明的效果。將THP-1單核白血病細胞以最終濃度6×106個細胞/ml懸浮在鹽水(pH5)中，將該懸液以每孔50微升分散到96孔微量滴定板的各孔中。
將各用鹽水(pH4)稀釋兩倍的含乳酸菌組合物的懸液或乳酸菌懸液以每孔50微升加到事先分布在微量滴定板上的孔中的THP-1單核白血病細胞中，并將該板在37℃培育60分鐘。將含15％蔗糖的PBS以200微升/孔分別的分散到96孔微量滴定板的各孔中，每孔再分別的加入20微升已培育60分鐘的，含有THP-1單核白血病細胞和所述含乳酸菌組合物的懸液或乳酸菌懸液的反應混合物，并將該板以500rpm離心5分鐘，得到細胞濃縮液。用200微升PBS洗滌該濃縮液，再在500rpm離心5分鐘而獲得細胞片狀沉淀物。革蘭氏染色乳酸菌，在光學顯微鏡下對粘著在細胞上的乳酸菌進行計數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的該含乳酸菌的組合物高度粘著于THP-1單核白血病細胞(表37)。
表37對單核白血病細胞系THP-1的粘著(n=4)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例26將實施例23中的相同程序獲得的乳酸菌培養(yǎng)液(3×109個細胞/ml)以3000rpm離心5分鐘，而得到細胞濃縮液。在獲得的濃縮液中加入足量鹽水(pH4)，得到每毫升含有3×109個乳酸菌的懸液。
將明膠(AP100型，Nitta Gelatin)懸浮于80毫升水中，50℃溫熱溶解。自然冷卻后，加入0.9克氯化鈉并使之溶解，用1N鹽酸將溶液調(diào)節(jié)到pH4，用水稀釋到100毫升，得到明膠水溶液。然后，將1毫升乳酸菌懸液(在鹽水中，pH4)與1毫升上述明膠水溶液混合，得到含乳酸菌的組合物。
如下評估了本發(fā)明的效果。將THP-1單核白血病細胞以最終濃度6×106個細胞/ml懸浮在鹽水(pH4)中，將該懸液以每孔50微升分散到96孔微量滴定板的各孔中。
將各用鹽水(pH4)稀釋兩倍的含乳酸菌組合物的懸液或乳酸菌懸液以每孔50微升加到事先分布在微量滴定板上的孔中的THP-1單核白血病細胞中，并將該板在37℃培育90分鐘。將含15％蔗糖的PBS以200微升/孔分別分散到96孔微量滴定板的各孔中，再加入20微升所述含乳酸菌組合物的懸液或乳酸菌懸液和已培育90分鐘的THP-1單核白血病細胞的反應混合物，并將該板以500rpm離心5分鐘，得到細胞濃縮液。用200微升PBS洗滌該濃縮液，并重新在500rpm離心5分鐘而獲得細胞片狀沉淀。革蘭氏染色乳酸菌，在光學顯微鏡下對粘著在細胞上的乳酸菌進行計數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中該含乳酸菌的組合物高度粘著于THP-1單核白血病細胞(表38)。
表38對單核白血病細胞系THP-1的粘著(n=4)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例27為了研究本發(fā)明中該含乳酸菌組合物的有效藥理學效用，所以要著重注意作為藥理學活性物質(zhì)之一的乳酸菌，用下列方法測定了粘著在細胞上的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸量。因此，用實施例1中所述程序分別使在實施例1、12、14、15、17和19中獲得的含有乳酸菌(唾液乳桿菌WB 1004或屎腸球菌JCM 5804)的組合物粘著在MKN45胃癌細胞上。用PBS洗滌各系統(tǒng)3次后，加入0.1毫升Hanks平衡鹽溶液(Gibco,在下文稱為HBSS)，然后37℃培育3小時。用甲醇硫酸甲基化上清液中產(chǎn)生的乳酸，用氯仿抽提，并用氣象色譜分析。結果發(fā)現(xiàn)粘著在細胞上的含乳酸菌的組合物產(chǎn)生了大量乳酸(表39)。
表39粘著在胃癌細胞系MKN45上的乳酸菌的乳酸生產(chǎn)

實施例28為了研究本發(fā)明中該含乳酸菌組合物的有效藥理學效用，所以要著重注意作為藥理學活性物質(zhì)之一的乳酸菌，用下列方法測定了粘著在細胞上的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸量。因此，用實施例1中所述程序分別使在實施例1、15、17和19中制備的含有乳酸菌(唾液乳桿菌WB 1004)的組合物通過實施例1中所述的相同程序粘著在Caco2結腸癌細胞上。用PBS洗滌各系統(tǒng)3次后，加入0.1毫升HBSS，然后該混合液37℃培育3小時。用甲醇硫酸甲基化上清液中的乳酸，用氯仿抽提，并用氣象色譜分析。結果發(fā)現(xiàn)粘著在細胞上的該含乳酸菌的組合物產(chǎn)生了大量乳酸(表40)。
表40粘著在結腸癌細胞系Caco2上的乳酸菌的乳酸生產(chǎn)

實施例29將水溶性脫乙酰殼多糖衍生物(CHGA,Tokyo Kasei)溶于水。用0.5N氫氧化鈉將該溶液調(diào)節(jié)到pH5，用水稀釋到100毫升，得到水溶性脫乙酰殼多糖衍生物的水溶液。然后，將10毫升該水溶性脫乙酰殼多糖衍生物的水溶液與10毫升用實施例1中所述的相同方法制備的唾液乳桿菌WB1004懸液混合，得到含乳酸菌的組合物。用實施例1中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中該含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞(表41)。
表41對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01
實施例30分別將脫乙酰殼多糖寡聚物(脫乙酰殼多糖四聚物，脫乙酰殼多糖五聚物和脫乙酰殼多糖六聚物；Seikagaku Kogyo)溶于水。將各溶液用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7，并用水稀釋到1毫升，得到脫乙酰殼多糖寡聚物的水溶液。然后將0.5ml該脫乙酰殼多糖寡聚物的水溶液與0.5ml用實施例1中的相同程序制備的唾液乳桿菌WB1004懸液(pH7,2×109個細胞/ml)混合，而得到含乳酸菌的組合物。用實施例1中的相同程序(培育時間30分鐘)評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)該含乳酸菌的組合物高度粘著于MKN45胃癌細胞(表42)。
表42對胃癌細胞系MKN45的粘著(n=4)

student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例31用實施例1或?qū)嵤├?中所述的程序制備了乳酸菌(3×109細胞/ml)的懸液。
將脫乙酰殼多糖(脫乙酰殼多糖10，脫乙?！?0％,0.5％粘度5到20cps WakoPure Chemical Ind.)懸浮在50毫升水中，用1N鹽酸滴加使之溶解。用0.1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)到pH5，用水稀釋到100毫升，得到脫乙酰殼多糖水溶液。然后，將乳酸菌懸液3000rpm離心10分鐘獲得的乳酸菌細胞濃縮液(1.5×109細胞)與1毫升脫乙酰殼多糖水溶液混合，而得到含乳酸菌的組合物。
如下評估本發(fā)明的效果。將HeLa子宮癌細胞以最終濃度為每毫升5×104細胞懸浮在10％血清-Eagles MEM中，并以100微升/孔分散到96孔微量滴定板的孔中。37℃培養(yǎng)3日后，用PBS洗滌粘著在微量滴定板上的子宮癌HeLa細胞3次，來制備單層HeLa細胞。然后，將用PBS(pH5)稀釋兩倍的0.1ml該含乳酸菌的組合物懸液或乳酸菌懸液加到單層HeLa細胞中，37℃培育10分鐘后，用PBS洗滌細胞。革蘭氏染色乳酸菌，并在光學顯微鏡下對粘著在細胞上的乳酸菌計數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中該含乳酸菌的組合物高度粘著于子宮癌HeLa細胞(表43)。
實施例43對子宮癌細胞系HeLa的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例32將1毫升用實施例17所述的程序制備的異丁烯酸氨烷酯共聚物RS與1毫升用實施例31的程序獲得的乳酸菌懸液(3×109個細胞/ml)混合，制備得到含乳酸菌的組合物。用實施例31中的相同方式評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于子宮癌HeLa細胞(表44)。
實施例44對子宮癌細胞系HeLa的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01實施例33同實施例1或?qū)嵤├?液體培養(yǎng)生長乳酸菌，然后以最終濃度3×109細胞/ml懸浮在PBS中。
在3000rpm離心10分鐘上述乳酸菌懸液獲得的細胞濃縮液(1.5×109個細胞)中加入1毫升用實施例19中的相同方式制備的異丁烯酸氨烷酯共聚物E水溶液，得到含乳酸菌的組合物。用實施例31中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于子宮癌HeLa細胞(表45)。
實施例45對子宮癌細胞系HeLa的粘著(n=4)

student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05
實施例34同實施例1液體培養(yǎng)生長乳酸菌，然后以最終濃度3×109細胞/ml懸浮在PBS中。
3000rpm離心10分鐘上述乳酸菌懸液獲得的細胞濃縮液(1.5×109個細胞)中加入1毫升用實施例15中的相同方式制備的明膠水溶液，得到含乳酸菌的組合物。用實施例31中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于子宮癌HeLa細胞(表46)。
實施例46對子宮癌細胞系HeLa的粘著(n=4)


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05實施例35如實施例1或?qū)嵤├?液體培養(yǎng)生長乳酸菌，然后以最終濃度3×109細胞/ml懸浮在PBS中。
將明膠(LCP型，Nitta Gelatin)溶于80毫升水中，然后加入并溶解0.9克氯化鈉。用1N鹽酸將該溶液調(diào)節(jié)到pH3，并用水稀釋到100毫升，得到明膠水溶液。將1毫升明膠水溶液加到通過3000rpm離心10分鐘乳酸菌懸液獲得的細胞濃縮液(1.5×109個細胞/ml)中，制得含乳酸菌的組合物。用實施例31中的相同程序評估了本發(fā)明的效果。結果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明含乳酸菌的組合物高度粘著于子宮癌HeLa細胞(表47)。
表47含乳酸菌的組合物


student’s t-試驗**顯著差異，p＜0.01student’s t-試驗*顯著差異，p＜0.05實施例36為了研究本發(fā)明中含乳酸菌的組合物的有效藥理學作用，要著重注意作為藥理學活性物質(zhì)之一的乳酸菌，用下列程序測定了粘著在細胞上的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸量。因此，分別使實施例31到35中的相同方法獲得的含有乳酸菌(唾液乳桿菌WB 1004或屎腸球菌JCM 5804)的組合物通過實施例31中所述的相同方法粘著在子宮癌HeLa細胞上。用PBS洗滌各系統(tǒng)3次后，加入0.1毫升HBSS，然后37℃培育混合物3小時。用甲醇硫酸甲基化上清液中產(chǎn)生的乳酸，用氯仿抽提，并用氣象色譜分析。結果發(fā)現(xiàn)粘著在細胞上的該含乳酸菌的組合物產(chǎn)生了大量乳酸(表48)。
表48粘著在子宮癌細胞系HeLa上的乳酸菌的乳酸生產(chǎn)

試驗實施例1對含唾液乳桿菌WB1004的組合物對胃癌細胞表面的幽門螺桿菌存在的抑制作用的試驗1)單層人胃癌細胞系MKN45的制備將人胃癌MNK45細胞以每毫升5×104個細胞的最終濃度懸浮在10％FCS-PRMI 1640培養(yǎng)液中，再將懸液以每孔0.1ml分布到96孔微量滴定板的孔內(nèi)。37℃培養(yǎng)3日后，用PBS洗滌粘著在微量滴定板上的細胞3次，制得單層。
2)唾液乳桿菌WB 1004的培養(yǎng)以及細胞懸液和含乳酸菌的組合物的制備將唾液乳桿菌WB 1004接種在MRS Broth中，37℃液體培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)完成后，3000rpm離心培養(yǎng)液5分鐘，得到細胞濃縮液。在獲得的細胞濃縮液中加入PBS，制得含有3×109/ml唾液乳桿菌WB 1004的細胞懸液。取出一部分該細胞懸液，與等份的由脫乙酰殼多糖10(0.25％水溶液)、EudragitRL(0.008％水懸液)和Eudragit E100(0.008％水懸液)組成的溶液混合，得到含有乳酸菌的組合物。
3)幽門螺桿菌的培養(yǎng)和細胞懸液的制備幽門螺桿菌ATCC 43504在含有5％馬去纖維蛋白血的腦心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)液(Difco)中37℃微量氧培養(yǎng)4天。培養(yǎng)完成后，用白金環(huán)收集適量的細胞，用HBSS洗滌，以濁度(540nm)為5(大約5×108個細胞/ml)的濃度懸浮在HBSS中。
4)對細胞表面上幽門螺桿菌存在的抑制作用的試驗在單層MKN45細胞中加入100微升唾液乳桿菌WB 1004的懸液或含乳酸菌的組合物的懸液(兩者都是1.6×109個細胞/ml)，使在37℃粘著1小時。用PBS作為對照。用PBS洗滌細胞3次后，加入50微升幽門螺桿菌懸液，該混合物在37℃培育2到4小時。用PBS洗滌單層MKN45細胞3次，用下列程序測定細胞表面上存活的幽門螺桿菌數(shù)。
因此，加50微升0.5％的胰島素(Gibco)，在37℃作用于單層細胞2分鐘，使細胞從微量滴定板上分離。然后，加入100微升5％的FCS-BHI培養(yǎng)液(Difco)，從而滅活胰島素。適當?shù)挠孟♂寗┫♂尯?，將懸液涂在?％馬去纖維血的BHI瓊脂平板上，測定每孔每單層細胞存在的細胞數(shù)。為了抑制唾液乳桿菌WB 1004的生長，在培養(yǎng)基中加入每毫升5微克的甲氧芐氨嘧啶和每毫升10微克的萬古霉素，37℃微量氧培養(yǎng)3日。
結果發(fā)現(xiàn)含乳酸菌的組合物懸液顯著抑制了幽門螺桿菌在胃癌細胞表面的存在。另一方面，唾液乳桿菌WB1004的懸液幾乎不導致抑制(表49)。
表49含乳酸菌的組合物對在胃癌細胞表面上幽門螺桿菌存在的抑制

試驗實施例2對含唾液乳桿菌WB1004的組合物對結腸癌細胞表面的大腸桿菌存在的抑制作用的試驗1)單層人結腸癌Caco2細胞的制備將人胃癌MNK45細胞以每毫升5×104個細胞的最終濃度懸浮在20％FCS-Eagle’s MEM Broth中，并將懸液以每孔0.1ml分布到96孔微量滴定板的孔內(nèi)。37℃培養(yǎng)3日后，用PBS洗滌粘著在微量滴定板上的細胞3次，制得單層。
2)唾液乳桿菌WB 1004的培養(yǎng)以及細胞懸液和含乳酸菌的組合物的制備將唾液乳桿菌WB 1004接種在MRS Broth中，37℃液體培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)完成后，3000rpm離心培養(yǎng)液5分鐘，得到細胞濃縮液。在獲得的細胞濃縮液中加入PBS，制得含有3×109/ml唾液乳桿菌WB 1004的細胞懸液。取出一部分該細胞懸液，與等份的0.25％脫乙酰殼多糖10溶液混合，而得到含有乳酸菌的組合物。
3)大腸桿菌的培養(yǎng)和細胞懸液的制備在BHI培養(yǎng)液中30℃需氧培養(yǎng)大腸桿菌ATCC 25922 6小時。培養(yǎng)完成后，3000rpm離心培養(yǎng)液5分鐘，得到細胞濃縮液。在獲得的細胞濃縮液中加入MRSBroth制得每毫升含有大約6×105個細胞的大腸桿菌ATCC 25922懸液。
4)對細胞表面上細菌存在的抑制作用的分析在單層Caco2細胞中加入100微升唾液乳桿菌WB 1004懸液或含乳酸菌的組合物的懸液(兩者都是1.6×109個細胞/ml)，使在37℃粘著1小時。用PBS作為對照。用PBS洗滌細胞3次后，加入100微升大腸桿菌懸液，該混合物在37℃培育2到4小時。用PBS洗滌Caco2單層3次，用下列程序測定大腸桿菌的存活數(shù)。因此，加50微升0.5％的胰島素(Gibco)在37℃作用于單層細胞2小時，使細胞從微量滴定板上分離。然后，加入100微升BHI培養(yǎng)液來滅活胰島素。適當?shù)挠孟♂寗┫♂尯?，將懸液涂在DHI瓊脂平板(NissuiPharmaceutical)上，測定每孔單層細胞上存在的細胞數(shù)。
結果發(fā)現(xiàn)含乳酸菌的組合物懸液顯著抑制了大腸桿菌在結腸癌細胞表面的存在(表50)。
表50含乳酸菌的組合物對結腸癌細胞表面上大腸桿菌存在的抑制

配方實施例1如實施例1制備100毫升含唾液乳桿菌WB 1004的組合物，然后向其內(nèi)加入50克蔗糖、1克抗壞血酸和甜味劑來制造糖漿。
配方實施例2如實施例1制備100毫升含唾液乳桿菌WB 1004的組合物，向其內(nèi)加入50克蔗糖、1克抗壞血酸和10克明膠和甜味劑，然后冷凍，來制造凍膠。
配方實施例3如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，將得到的粉末與100克商業(yè)酸奶(MEIJI Bulgaria Yogurt,MEIJI MilkProducts)混合，來制造含唾液乳桿菌WB 1004的組合物-酸奶食品。
配方實施例4
如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，將得到的粉末填充入鋁包中，以制造一種伴商業(yè)酸奶(MEIJI Bulgaria Yogurt,MEIJI Milk Products)的唾液乳桿菌WB 1004組合物，飲食前臨時混合。
配方實施例5如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，并在得到的粉末中加入100克乳糖、10克玉米淀粉、10克羥丙基纖維素和5克氫化油后，用壓片機擠壓混合物從而得到每片重240毫克的片劑。
配方實施例6如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，并在得到的粉末中加入100克乳糖、10克玉米淀粉、10克羥丙基纖維素后，用流化床?；瘷C使混合物?；⒏稍铮缓笥?0-網(wǎng)篩選擇大小，得到細粒。
配方實施例7如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，并將得到的粉末與5克液態(tài)石蠟混合。分別將75克白色礦脂預先融化，以小部分加到上述混合物中。通過外部冷卻的容器，使整個混合物在攪拌下固化，以得到油膏型的栓劑。
配方實施例8如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，并將得到的粉末與9克聚乙二醇1500和2克聚乙二醇4000捏和。在逐步冷卻后，將捏和物分成10份，用栓劑模成型，而得到栓劑。
配方實施例9如實施例1制備含唾液乳桿菌WB 1004的組合物(100毫升)，再凍干，并在得到的粉末中加入100克乳糖、10克玉米淀粉和5克硬脂酸鎂后，用壓片機擠壓混合物來得到片劑型栓劑。
工業(yè)應用性由上構成的本發(fā)明能增強乳酸菌在消化道和/或泌尿生殖器官中顯示的藥理作用，并拮抗乳酸菌從消化道和/或泌尿生殖器官清除的藥理活性。因此本發(fā)明的貢獻是極其有效的除去幽門螺桿菌、除去腸出血性大腸桿菌和治療食物過敏，并能提供用于治療和/或預防泌尿生殖器官感染的藥物學產(chǎn)品和食物。
權利要求
1．一種含乳酸菌的組合物，其特征在于，該組合物含有在消化道和/或泌尿生殖器官中顯示藥物作用的乳酸菌，增強了所述乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著性，從而加強了所述藥物作用。
2．如權利要求1所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，一種大分子物質(zhì)的配方導致增強所述乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著。
3．如權利要求2所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述大分子物質(zhì)是堿性聚合物。
4．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是脫乙酰殼多糖。
5．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是聚賴氨酸。
6．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是膽甾胺樹脂。
7．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是魚精蛋白。
8．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是明膠。
9．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是異丁烯酸氨烷酯共聚物E。
10．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是異丁烯酸氨烷酯共聚物RS。
11．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是乳鐵蛋白。
12．如權利要求3所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述堿性聚合物是溶菌酶。
13．如權利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述藥理學作用是除去幽門螺桿菌。
14．如權利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述藥理學作用是除去腸出血性大腸桿菌。
15．如權利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述藥理學作用是對食物過敏的治療活性。
16．如權利要求1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述藥理學作用是對泌尿生殖器官感染的治療和/或預防活性。
17．如權利要求16所述的含乳酸菌的組合物，其特征在于，所述泌尿生殖器官是陰道。
18．一種藥物學產(chǎn)品，其特征在于，該藥物學產(chǎn)品包含如權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的含乳酸菌的組合物。
19．一種食品，其特征在于，該食品包含如權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的含乳酸菌的組合物。
全文摘要
含乳酸菌的組合物能增強由對消化道和/或泌尿生殖器官具有藥理學作用的乳酸菌顯示的藥理作用,并抑制乳酸菌從消化道和/或泌尿生殖器官排出。即,這些組合物是含乳酸菌的組合物,含有對消化道和/或泌尿生殖器官有藥理學作用的乳酸菌,乳酸菌對消化道和/或泌尿生殖器官的粘著性得到了改善,從而增強了上述藥理學作用。
文檔編號A23L1/03GK1304313SQ99807015
公開日2001年7月18日 申請日期1999年6月4日 優(yōu)先權日1998年6月5日
發(fā)明者石川宏, 鈴木信之, 中谷清吾, 平田晴久 申請人:若素制藥株式會社 被以下專利引用 (4),