專利名稱：用于改變玉米脂質(zhì)特征的去飽和酶的基因的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及含有一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的全部或者基本全部、一種硬脂酰-?；d體蛋白(stearoyl-ACP)去飽和酶以及一種δ-12去飽和酶的核酸片段的制備和使用，上述的片段可以被單個(gè)或者結(jié)合使用以改變玉米脂質(zhì)的特征。整合有此類核酸片段以及合適的調(diào)控序列的嵌合基因可以被用于創(chuàng)造具有被改變的脂質(zhì)特征的轉(zhuǎn)基因玉米植物。
發(fā)明的背景植物脂質(zhì)具有多種不同的工業(yè)和營(yíng)養(yǎng)用途，而且對(duì)植物膜的功能和植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)具有重要的作用。這些脂質(zhì)代表了數(shù)量浩大的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且這些結(jié)構(gòu)決定了脂質(zhì)的生理學(xué)和工業(yè)性質(zhì)。這些結(jié)構(gòu)中的許多是由代謝過程直接或間接產(chǎn)生的，代謝過程改變了脂質(zhì)去飽和的程度。在不同的植物中的不同的代謝體系產(chǎn)生了這些被改變的脂質(zhì)，為了能夠經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)出大量所需的脂質(zhì)，通常需要對(duì)外來植物種類進(jìn)行馴化或者是對(duì)經(jīng)過農(nóng)藝學(xué)適應(yīng)的種類進(jìn)行修飾。
植物脂質(zhì)的主要用途是以三酰基甘油的形式用作食用油。食用油的特定的性能和健康品質(zhì)在很大的程度上取決于它們脂肪酸的組成。大部分的植物油來源于多種商業(yè)性植物并主要含有棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)、以及亞麻酸(18∶3)。棕櫚酸和硬脂酸分別是16-碳和18-碳的不飽和脂肪酸。油酸、亞油酸以及亞麻酸是18-碳的不飽和脂肪酸，分別含有一個(gè)、兩個(gè)、以及三個(gè)雙鍵。油酸被稱為單不飽和脂肪酸，而亞油酸以及亞麻酸則被稱為多聚不飽和脂肪酸。在常用的食用植物油中飽和和不飽和脂肪酸的相對(duì)數(shù)量總結(jié)于下表(表1)中
表1在所挑選的油類植物中，油中飽和和不飽和脂肪酸的百分比
玉米油主要是由偶數(shù)碳鏈脂肪酸組成。在典型的玉米油中脂肪酸的分配是大約12％棕櫚酸(16∶0)、2％硬脂酸(18∶0)、25％油酸(18∶1)、60％亞油酸(18∶2)、以及1％亞麻酸(18∶3)。棕櫚酸和硬脂酸被稱為飽和脂肪酸，因?yàn)樗鼈兊碾逆渻H含有單鍵，它們的肽鏈為氫原子所“飽和”。油酸、亞油酸以及亞麻酸分別含有一個(gè)、兩個(gè)以及三個(gè)雙鍵，它們被成為不飽和脂肪酸。玉米油中脂肪酸幾乎總是在甘油的羥基上脂化，因而形成甘油三酯。提煉后的玉米油的大約99％是由甘油三酯組成的(“玉米油(corn oils)”,Corn Refiners Association,Inc.,1001 Connecticut Ave.,N.W.,Washington,DC 20036,1986,第24頁(yè))。
許多最近的研究努力已經(jīng)調(diào)查了飽和和不飽和脂肪酸在減少冠心病風(fēng)險(xiǎn)中的作用。過去認(rèn)為，單不飽和脂肪酸不同于飽和脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸，它對(duì)血清膽固醇和冠心病風(fēng)險(xiǎn)沒有影響。最近好幾例人的臨床研究提示單不飽和脂肪酸含量高、飽和脂肪酸含量低的日常飲食可以減少“壞的”(低密度脂蛋白)膽固醇，同時(shí)能夠保持“好的”(高密度脂蛋白)膽固醇(Mattson等(1985)Journal of lipidResearch 26:194-202)一種飽和脂肪酸總含量低，單不飽和脂肪酸含量高的植物油可以給消費(fèi)者提供顯著的健康利益，同時(shí)給油類處理商提供經(jīng)濟(jì)利益。例如，蕓苔油被認(rèn)為是一種非常健康的油。然而，在使用中，蕓苔油中所含的高水平的多聚不飽和脂肪酸使油很不穩(wěn)定、容易被氧化、并且容易產(chǎn)生令人不愉快的氣味和味道(Gailliard(1980)，見植物的生物化學(xué)(The Biochemistry of Plants)第4卷第85-116頁(yè)，Stumpf，P.K.編輯，Academic Press,New York)。多聚不飽和脂肪酸的水平可以通過氫化作用來減少，但是這一工序的費(fèi)用以及隨之產(chǎn)生的剩余的不飽和脂肪酸的在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上有質(zhì)疑的反式異構(gòu)體減少了氫化油總體的合意性(Mensink等(1990)N.Eng.J.Med.N323:439-445)。
當(dāng)不飽和脂肪酸被暴露于空氣中時(shí)，它產(chǎn)生氧化，氧化使油具有腐臭味。高溫，例如在油炸的情況下，可以加速氧化。對(duì)于不飽和程度較高的油，其氧化的速率提高。因此，含有兩個(gè)雙鍵的亞油酸比僅含一個(gè)雙鍵的油酸更不穩(wěn)定。氧化縮短了含有玉米油的產(chǎn)品的保質(zhì)期，因?yàn)槠渲泻懈弑壤膩営退?。通常將玉米油和含有玉米油的產(chǎn)品用塑料或者金屬薄片包裝于氮?dú)庵?，或者將其冷凍保存以延長(zhǎng)它們的保質(zhì)期。這些用于減少氧化以及隨后的腐臭的另外的措施給含有玉米油的產(chǎn)品增加了相當(dāng)可觀的費(fèi)用。
減少玉米油氧化作用的另一個(gè)措施是對(duì)油進(jìn)行化學(xué)氫化處理。這一將氫添加到不飽和脂肪酸的雙鍵上的具有商業(yè)重要性的工序改變了油的物理性質(zhì)并延長(zhǎng)了含有玉米油的產(chǎn)品的保質(zhì)期。經(jīng)過氫化的植物油被用于制作，例如人造黃油、色拉調(diào)味品、烹調(diào)油、以及起酥油(shortenings)。
大約5億磅的玉米油，即美國(guó)生產(chǎn)的玉米油的大約40-50％，被用于烹調(diào)和色拉油(Fitch,B.,(1985)JAOCS,第62卷，第11期，第1524-31頁(yè))。通過遺傳方法來生產(chǎn)一種更為穩(wěn)定的油顯然將具有重要性，它可以減少或者消除用于化學(xué)氫化的時(shí)間和投入費(fèi)用。
除了與化學(xué)氫化相關(guān)連的經(jīng)濟(jì)因素以外，人類健康因素也支持天然的高油酸油的生產(chǎn)。在氫化的過程中，脂肪酸中的雙鍵被完全氫化或者被從反式構(gòu)型轉(zhuǎn)化為順式構(gòu)型。順式雙鍵使脂肪酸分子“彎曲”，這削弱了結(jié)晶并使油在室溫下保持液態(tài)。在氫化的過程中，順式鍵被弄直變成反式構(gòu)型，導(dǎo)致油在室溫下變硬。最近對(duì)日常飲食中反式脂肪酸對(duì)膽固醇水平影響的研究顯示，油酸的反式異構(gòu)體使血液膽固醇水平提高的程度至少與飽和脂肪酸的相當(dāng)，后者在一段時(shí)間前已經(jīng)被知道會(huì)提高人的膽固醇(Mensink,R.P.和B.K.Katan,(1990)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl.J.Med.),323:439-45)。另外，這些研究顯示，高反式脂肪酸膳食的后果是，不合需要的低密度脂蛋白的水平會(huì)提高，而合乎需求的高密度脂蛋白的水平則降低。在人造黃油、起酥油(shortenings)、以及用于油炸的油中存在著大量的反式脂肪酸；在人類日常飲食中，含量最為豐富的反式脂肪酸是油酸的反式異構(gòu)體，反油酸(elaidic acid)。
從提供健康日常飲食的角度來看，飽和脂肪酸含量低的油是合乎需求的，同時(shí)在一些食物中，由于它們的功能特性，又需要在其中有在室溫下呈固態(tài)的脂肪。此類應(yīng)用包括不含奶的人造黃油以及面包涂料(spread)的生產(chǎn)，以及在糖果和烘焙中的各種不同的應(yīng)用。許多動(dòng)物脂肪和奶脂肪具有所需的物理特性，但是它們同時(shí)還含有膽固醇和產(chǎn)生膽固醇的中鏈脂肪酸。用于固體脂肪應(yīng)用的的理想的甘油三酯(triacylglyceride)應(yīng)該含有占優(yōu)勢(shì)的熔點(diǎn)很高的長(zhǎng)鏈脂肪酸-硬脂酸、以及差額的單不飽和脂肪酸和極少量的多不飽和脂肪。天然的植物固體脂肪組分典型地具有甘油三酯的結(jié)構(gòu)，其中飽和脂肪酸占據(jù)著甘油三酯的sn-1和sn-3位置，而不飽和脂肪酸則占據(jù)著sn-2位置。這一整體的脂肪酸組成和甘油三酯結(jié)構(gòu)賦予了一個(gè)最優(yōu)的固體脂肪晶體結(jié)構(gòu)以及一個(gè)最高的熔點(diǎn)，而又含有最少量的飽和脂肪酸。
這種高熔點(diǎn)植物脂肪的一個(gè)天然的脂肪原型是可可脂。全球(每年)生產(chǎn)20億磅以上的可可脂，它們是最昂貴的日用食用油。美國(guó)每年進(jìn)口好幾億美元價(jià)值的可可脂。可可脂昂貴的、不穩(wěn)定的價(jià)格以及不確定的供應(yīng)已經(jīng)鼓勵(lì)人們發(fā)展可可脂的替代品?？煽芍闹舅峤M成是26％棕櫚酸、34％硬脂酸、35％油酸、以及3％的亞油酸。大約72％的可可脂甘油三酯的結(jié)構(gòu)是其中飽和脂肪酸占據(jù)位置1和3，油酸占據(jù)位置2?？煽芍母视腿シ肿拥莫?dú)特的脂肪酸組成和分配賦予它特別適合供糖果業(yè)直接使用(end-use)的特性它在27℃以下是脆的，而且取決于它的結(jié)晶狀態(tài)，它會(huì)在25°-30℃或者35°-36℃迅速熔化。因此，它在常溫下堅(jiān)硬而不油膩，而在口中則迅速熔化。而且它極不容易產(chǎn)生腐臭。因此，生產(chǎn)硬脂酸含量提高的，特別是在其棕櫚酸含量高出正常水平的玉米株系(line)中生產(chǎn)，而不飽和脂肪酸水平降低的玉米油被期望可以在玉米中生產(chǎn)可可脂的替代品。這將給油和食物加工商創(chuàng)造另加的價(jià)值，同時(shí)減少某些熱帶油的外來進(jìn)口。
人類的日常飲食也可以通過減少飽和脂肪的攝取來得以改善。人類日常飲食中的飽和脂肪來源于肉制品。家禽和豬的日常食物通常都含有動(dòng)物脂肪，它們高含飽和脂肪酸以充當(dāng)能量來源。通過日常食物的修改可以很容易地使象這樣的非反芻類動(dòng)物的組織脂肪酸發(fā)生變更(M.F.Miller，等(1990)動(dòng)物科學(xué)雜志(J Anim.Sci.)，68:1624-31)。動(dòng)物飼料的大部分是由玉米組成的，玉米典型地僅含有大約4％的油。通過將飼料中的補(bǔ)充性的動(dòng)物脂肪的一部分或全部替代為油含量高的玉米種類中的油(最高可達(dá)10％)，可以生產(chǎn)飽和脂肪含量較低的肉制品。給豬喂食高含油酸的食物的喂養(yǎng)試驗(yàn)顯示在脂肪組織中所貯存的油酸的量可以被極大地提高，但卻并不不利地影響肉的質(zhì)量(M.F.Miller等；L.C.St.John等(1987)動(dòng)物科學(xué)雜志(J.Anim.Sci.),64:1441-47)。組成油的那些脂肪酸的飽和程度決定了該種油是液態(tài)的還是固態(tài)的。在這些研究中，高含油酸的動(dòng)物日常飲食所導(dǎo)致的肉的質(zhì)量對(duì)于肉加工工業(yè)是可以接受的，因?yàn)檫@種肉中多聚不飽和脂肪酸的含量低。
只有在最近才開始非常努力地通過植物育種，特別是在誘變之后，來改善玉米油的質(zhì)量，而且在實(shí)驗(yàn)株系中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了范圍廣泛的脂肪酸組成。這些發(fā)現(xiàn)(以及那些在其它油作物中的發(fā)現(xiàn))提示了在不影響玉米植物的農(nóng)藝學(xué)性能的同時(shí)可以使玉米油中脂肪酸的組成被顯著地改變。
應(yīng)用突變來變更脂肪酸的組成存在嚴(yán)重的局限性。以下的突變是不大可能被發(fā)現(xiàn)的a)導(dǎo)致顯性(“獲得功能的”)表現(xiàn)型的突變，b)發(fā)生于對(duì)植物的生長(zhǎng)致關(guān)重要的基因上的突變，以及c)發(fā)生于不具有種屬局限性而且由多個(gè)基因編碼的酶上的突變。即使在突變的玉米株系中已經(jīng)獲得了一些所需的突變，通過傳統(tǒng)的培育技術(shù)將它們的基因漸滲到精良的株系中也是緩慢而昂貴的，因?yàn)樗璧挠衩椎挠徒M分非?？赡苌婕暗胶脦讉€(gè)隱性基因。
最近的分子生物學(xué)和細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)為克服突變方法的一些局限，包括需要昂貴的培育，提供了可能。特別有用的一些技術(shù)是外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的種子特異的表達(dá)[見Goldberg等(1981)細(xì)胞(Cell)56:149-160]，以及使用反義RNA以占優(yōu)勢(shì)的、組織特異的方式對(duì)植物的目的基因進(jìn)行抑制[見van der Krol等(1988)基因(Gene)72:45-50]。其它的進(jìn)展包括將外源基因轉(zhuǎn)移到優(yōu)良的商業(yè)性油料作物的商品化種類，如大豆[Chee等(1989)植物生理學(xué)雜志(Plant Physiol.)91:1212-1218；Christou等(1989)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86:7500-7504；Hinchee等(1988)Bio/Technology 6:915-922；歐洲專利出版EPO0301749A2]、油菜子[De Block等(1989)植物生理學(xué)雜志(PlantPhysiol.)91:694-701]、以及向日葵[Everett等(1987)Bio/Technology 5:1201-1204)之中，以及在培育計(jì)劃中將基因作為“限制性片段長(zhǎng)度多肽性(RFLP)”的標(biāo)記物，這使隱性品質(zhì)的基因可以被快速地、更便宜地漸滲到優(yōu)良株系中[Tanksley等(1989)Bio/Technology 7:257-264]。然而，這些技術(shù)每一項(xiàng)的應(yīng)用都需要對(duì)具有商業(yè)重要性的基因進(jìn)行鑒定和分離。
WO91/13972(1991年9月19日出版)描述了與植物中脂肪酸合成相關(guān)的去飽和酶，特別是δ-9(delta-9)去飽和酶。
美國(guó)專利號(hào)5,443,974(Hitz等，1995年8月22日發(fā)表)描述了編碼大豆種子硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶或其前體的核酸片段的制備以及將其用于修改植物油的組成。
WO94/11516(1994年5月26日出版)描述了來源于植物的微粒體δ-12去飽和酶的基因以及相關(guān)的酶。該發(fā)明描述了一個(gè)編碼種子微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶的玉米(Zea mays)cDNA的克隆。該文獻(xiàn)中的討論作為參照結(jié)合于本發(fā)明中。
植物中油的生物合成已經(jīng)被很好地研究[見Hanvood(1989),Critical Review in Plant Sciences 8(1):143]。棕櫚酸、硬脂酸以及油酸的生物合成是通過“?；d體蛋白通道(ACP track)”中三種關(guān)鍵酶一棕櫚酰-酰基載體蛋白延長(zhǎng)酶(elongase)、硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶、以及?；?酰基載體蛋白硫酯酶(thioesterase)的相互作用在質(zhì)體中發(fā)生的。
硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶在硬脂酰-?；d體蛋白上引入第一個(gè)雙鍵以形成油酰-酰基載體蛋白。它是決定植物油未飽和程度的中樞。因?yàn)樗谥舅嵘锖铣芍械年P(guān)鍵地位，因此希望它是一個(gè)重要的調(diào)控步驟。雖然這個(gè)“酶”的天然底物是硬脂酰-酰基載體蛋白，但是已經(jīng)顯示它象酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中它的對(duì)應(yīng)物(counterpart)一樣，可以使硬脂酰-輔酶A去飽和，雖則能力較差[McKeon等(1982)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)257:12141-12147]。在質(zhì)體中合成的脂肪酸以?；?輔酶A的形式被輸出到細(xì)胞質(zhì)中。在油的生物合成過程中，至少有三種不同的甘油?；?甘油-3-P酰基轉(zhuǎn)移酶、1-?；?甘油-3-P?；D(zhuǎn)移酶以及二?；视娃D(zhuǎn)移酶)協(xié)助?；糠謴募?xì)胞質(zhì)進(jìn)入甘油三酯中。這些?；D(zhuǎn)移酶很強(qiáng)地、但不是絕對(duì)地優(yōu)選將飽和脂肪酸結(jié)合于甘油三酯的sn-1和sn-3位，而將單不飽和脂肪酸結(jié)合于sn-2位。因此，改變?；氐闹舅峤M成將因?yàn)橘|(zhì)量作用的作用驅(qū)使油中脂肪酸組成發(fā)生相應(yīng)的變化。另外，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，由于這一特異性，如果脂肪酸的組成正確的話，植物可以生產(chǎn)適合用作可可脂替代品的油[Bafor等(1990)JAOCS 67:217-225]。
基于以上的討論，改變蔬菜油中硬脂酸和油酸的水平的一個(gè)方法是通過改變它們?cè)谟糜谟蜕锖铣傻募?xì)胞質(zhì)?；?輔酶A池中的水平。用遺傳的方法來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)有兩種方法。一種是通過調(diào)控種子中硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的水平來改變質(zhì)體中硬脂酸和油酸的生物合成，這可以通過使該基因過量表達(dá)或者對(duì)該基因進(jìn)行反義抑制來實(shí)現(xiàn)。另外一種方法是在細(xì)胞質(zhì)中將硬脂酰-輔酶A轉(zhuǎn)化為油酰-輔酶A，這可以通過使硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
為了在種子中對(duì)硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶使用反義或有義抑制，關(guān)鍵的是分離種子中編碼一個(gè)或多個(gè)目的酶的一個(gè)或多個(gè)基因或者cDNA，因?yàn)樯鲜龅娜魏我环N抑制機(jī)制需要在反義RNA(見Stam等(1997)，植物學(xué)年鑒(Annals of Botany)79:3-12)和目的基因之間有高度的互補(bǔ)性。預(yù)期來源于異源物種的硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶基因并不存在這樣的高度的序列互補(bǔ)性或者一致性。
哺乳動(dòng)物微粒體硬脂酰輔酶A去飽和酶的純化和核苷酸序列已經(jīng)被發(fā)表[Thiede等(1986)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262:13230-13235；Ntambi等(1988)生物化學(xué)雜志(J Biol.Chem.)263:17291-17300以及Kaestner等(1989)生物化學(xué)雜志(J Biol.Chem.)264:14755-14761]。然而，植物酶與它們不同。植物酶是可溶性的，它使用不同的電子供體，而且底物特異性也不同。動(dòng)物酶的純化和核苷酸序列并沒有教導(dǎo)如何純化一種植物酶或者分離一種植物基因。已經(jīng)報(bào)道了從紅花的種子中[McKeon等(1982)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)257:12141-12147)以及從大豆中(美國(guó)專利號(hào)5,443,974)純化出硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶。
大鼠肝臟硬脂酰輔酶A去飽和酶蛋白已經(jīng)被表達(dá)于大腸桿菌中[Strittmatter等(1988)生物化學(xué)雜志(J Biol.Chem.)263:2532-2535]，但是如上所述，它的底物特異性和電子供體與植物的是很不同的。
已經(jīng)從多種種類克隆了植物硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的cDNA，包括紅花[Thompson等(1991)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)88:2578]、蓖麻(castor)[Shanklin和Somerville(1991)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)88:2510-2514]、以及黃瓜[Shahklin等(1991)植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)97:467-468]。Kutzon等[(1992)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)89:2624-2648]已經(jīng)報(bào)道當(dāng)油菜籽硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶以反義的取向在Brassica rapa和B.napa中表達(dá)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因種子中可以增加到18∶0的水平。
已經(jīng)有人報(bào)道了硬脂酸鹽(stearate)的操作(Knutzon,D.S.等，(1992)美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(7):2624-2628)?？梢酝ㄟ^硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶的不足表達(dá)(underexpression)來提高硬脂酸鹽種子油的水平，這種酶負(fù)責(zé)在植物中的18-碳脂肪酸中導(dǎo)入第一個(gè)雙鍵。來源于B.campestris和B.napus植物的、通過一個(gè)編碼B.campestris硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的cDNA使用一個(gè)種子特異的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行反義表達(dá)獲得的種子產(chǎn)生高含硬脂酸的油，但是與來源于同一種類的未經(jīng)修飾的植物相比，該油中亞油酸(18∶3)的含量同時(shí)也提高了。在大豆中通過類似的硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的不足表達(dá)也使硬脂酸的水平提高(美國(guó)專利號(hào)5,443,974)。在蕓苔中通過硬脂酰-?；d體蛋白硫酯酶的過量表達(dá)也使硬脂酸的水平提高(美國(guó)專利號(hào)5,530,186)。通過突變育種也產(chǎn)生了一些其種子油中硬脂酸水平提高的大豆株系(Graef,G.L.等,(1985)JAOCS 62:773-775；Hammond,E.G.和W.R.Fehr,(1983)作物科學(xué)(Crop Sci.)23:192-193)。
多聚不飽和脂肪酸促成了液體植物油的低熔點(diǎn)。在高飽和油中含有它們是一個(gè)賣點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兘档土巳埸c(diǎn)，因此需要有更高水平的不合需要的飽和脂肪酸才能使油在室溫下形成可塑性脂肪。另外，當(dāng)用于烘焙和糖果業(yè)用途時(shí)，高水平的多聚不飽和脂肪酸如上所述導(dǎo)致液體油的氧化不穩(wěn)定性。因此，為了實(shí)現(xiàn)最大程度的效用，在玉米中生產(chǎn)的高飽和脂肪應(yīng)該含有飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、以及盡可能少的多聚不飽和脂肪酸。本發(fā)明中所揭露的基因結(jié)合為玉米提供了符合這些標(biāo)準(zhǔn)的新穎的脂肪酸特征。在由其它的結(jié)合所獲得的脂質(zhì)特征中，油酸的含量不少于總體油含量的60％。這些結(jié)合中許多也使用了一種來源于皺縮1(shrunken 1)基因的新穎的玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子或者一種內(nèi)含子/外顯子區(qū)域，或者同時(shí)使用一種油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子以及一種來源于皺縮1基因的內(nèi)含子/外顯子區(qū)域。
玉米種子中脂質(zhì)的貯備主要是在一個(gè)被稱為角質(zhì)鱗片(scutellum)的特定的胚組織中合成并貯存的。當(dāng)種子成熟時(shí)，這些脂質(zhì)貯備構(gòu)成了胚干重的50％。與在所有的種子中一樣，玉米中的貯備脂質(zhì)被堆積形成被稱為油體(old body)的簡(jiǎn)單的細(xì)胞器。這些微小的球狀細(xì)胞器含有一個(gè)被單層的磷脂所包圍的甘油三酯內(nèi)核，其中在上述的單層磷脂中鑲嵌有被稱為油質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)(Huang(1985)現(xiàn)代植物分析方法(Modern Methods of Plant Analysis)1:175-214；Stymme和Stobart(1987)植物的生物化學(xué)(TheBiochemistry of Plants)10:175-214；Yatsue和Jacks(1972)植物生理學(xué)(Plant Physiol.)49:937-943；以及Gurr(1980)植物的生物化學(xué)(The Biochemistry of Plants)4:205-248)。
在不同的植物種類中已經(jīng)鑒定了至少兩類油質(zhì)蛋白同種型(Tzen等(1990)植物生理學(xué)(Plant Physiol.)94:1282-1289)。這兩類油質(zhì)蛋白在一種特定的種類中被任意地命名為高(H)和低(L)分子量同種型。根據(jù)來源于不同種類的同一種同種型的成員擁有共有的免疫化學(xué)特性以及它們的氨基酸序列存在著顯著的一致性，以及它們顯然與另一種同種型的成員存在差異，認(rèn)為它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上是相關(guān)的(Hatzopoulos等(1990)植物細(xì)胞(Plant Cell)2:457-467；Lee和Huang(1994)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)26(6):1981-1987；Murphy等(1991)生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochim.Biophys.Acta)1088:86-94；Qu和Huang(1990)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265:223 8-2243)。
在玉米種子中有三種油質(zhì)蛋白同種型。經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們的比例大約為2∶1∶1。這些同種型被命名為OLE 16、OLE 17、以及OLE 18，對(duì)應(yīng)于它們表觀的分子量，這些分子量介于大約16kDa和18kDa之間。OLE17和OLE 18是H類的緊密相關(guān)的成員，而OLE 16則是L類的一個(gè)成員(Lee和Huang,1994)。編碼這三個(gè)油質(zhì)蛋白的那些基因已經(jīng)被克隆并測(cè)序(Qu和Huang(1990)生物化學(xué)雜志(j.Biol.Chem.)265:2238-2243；以及Huang，個(gè)人通信)。在種子發(fā)育的過程中這些基因只有在胚中的組織(角質(zhì)鱗片和胚軸)以及在糊粉中表達(dá)，而且接受激素脫落酸的正調(diào)控(Vance和Huang(1988)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)263:1476-1491；Huang(1992)植物生理學(xué)與植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)43:177-200)。油質(zhì)蛋白在胚中高度表達(dá)，占所有的角質(zhì)鱗片蛋白的5-10％，或者占所有種子蛋白的2-8％。
那些來源于表達(dá)樣式具有胚以及糊粉特異性(“胚/糊粉”樣式)的基因，如油質(zhì)蛋白基因，的啟動(dòng)子將是被用于轉(zhuǎn)基因方法的很有吸引力的侯選者，用于引導(dǎo)一個(gè)編碼油修飾酶(Qu和Huang(1990)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265:2238-2243；以及Huang(1992))或者其它的具有胚特異性的感興趣的酶的基因的表達(dá)，特別是在玉米中的表達(dá)。另一個(gè)可以從中分離出一個(gè)玉米胚/糊粉-特異性啟動(dòng)子的潛在的侯選基因是玉米的球蛋白基因(Belanger和Kriz,1989，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)91:636-643)。然而，到目前為止，并沒有人報(bào)道此類啟動(dòng)子的表達(dá)、調(diào)控、或者將其用于瞬時(shí)表達(dá)分析或者穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因玉米植物中。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及一種被分離的包含一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與序列編號(hào)19或者38-49的任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與序列編號(hào)19或者38-49的任一中所述的核苷酸序列基本類似并功能等同的核苷酸序列片段或者亞片段。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-9硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，它基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8和10中任一所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段。本發(fā)明還包括一些包含此類片段或其亞片段，或上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列的嵌合基因，它們可操作地與合適的調(diào)控序列相連接，其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米硬脂酸表現(xiàn)型。
在第三個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段，它基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列或其任何一種功能等同的亞片段，以及一些包含上述片段或其亞片段、或上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列的嵌合基因，它們可操作地與合適的調(diào)控序列相連接，其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油酸表現(xiàn)型。
在第四個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及一些嵌合基因，它們包含一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-9硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，上述片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8和10中任一所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段，或上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列；以及包含一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段或其任何功能等同的亞片段，或上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列，它們可操作地相互連接，而且其中此類結(jié)合的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油表現(xiàn)型。
這些嵌合基因的任何一個(gè)可以進(jìn)一步包含一個(gè)經(jīng)過分離的包含有一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與序列編號(hào)19或者38-49的任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與序列編號(hào)19或者38-49的任一中所述的核苷酸序列基本類似并功能等同的核苷酸序列片段或者亞片段；或者包含一個(gè)皺縮1內(nèi)含子1/外顯子1；或者包含兩者。
本發(fā)明同時(shí)還包括玉米植物及其包含有各種不同的嵌合基因的植物部分、此類植物的種子、從此類植物的籽粒獲得的油、在此類籽粒的加工過程中產(chǎn)生的動(dòng)物飼料、將上述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中、對(duì)此類油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所獲得的產(chǎn)品、以及改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
序列清單和附圖的簡(jiǎn)要介紹本發(fā)明可以通過下面的詳細(xì)介紹和附圖及序列介紹更完全地被理解，這些介紹是本發(fā)明的一個(gè)組成部分。
序列介紹概述了本發(fā)明所附帶的序列清單。序列清單中核苷酸序列字符用單字符編碼來表示，氨基酸用三字符編碼來表示，如在國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)-國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC-IUB)所定義的，見核酸研究(Nucleic Acids Research)13:3021-3030(1985)以及生物化學(xué)雜志(Biochemical Journal)219(2):345-373(1984)。核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)所用的符號(hào)和格式進(jìn)而符合管理核苷酸以及/或者氨基酸序列在專利申請(qǐng)中公開的規(guī)定，如在37C.F.R.§1.821-1.825以及世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織標(biāo)準(zhǔn)第25條(WIPO StandardSt.25)中所描述的。
序列編號(hào)1是一個(gè)從編碼一個(gè)δ-12去飽和酶(fad2-1)的玉米cDNA獲得的1790核苷酸序列。此序列也被描述于WO94/11516中。
序列編號(hào)2是一個(gè)從編碼另一個(gè)δ-12去飽和酶(fad2-2)的玉米cDNA獲得的1733核苷酸序列。
序列編號(hào)3是序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列的翻譯產(chǎn)物。該翻譯產(chǎn)物是一個(gè)含有392個(gè)氨基酸的多肽(翻譯框核苷酸176-1351)。
序列編號(hào)4是一個(gè)來源于玉米基因組DNA的12,313核苷酸序列，它含有fad2-2編碼區(qū)上游的區(qū)域。
序列編號(hào)5是一個(gè)來源于玉米基因組DNA的2,907核苷酸序列，它含有fad2-1內(nèi)含子。
序列編號(hào)6是一個(gè)18堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增玉米δ-9去飽和酶。
序列編號(hào)7是一個(gè)17堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增玉米δ-9去飽和酶。
序列編號(hào)8是玉米δ-9去飽和酶cDNA的1714核苷酸序列，如包含于質(zhì)粒pCD520中的一般。
序列編號(hào)9是序列編號(hào)8中所述的核苷酸序列的翻譯產(chǎn)物。該翻譯產(chǎn)物是一個(gè)含有392個(gè)氨基酸的多肽(翻譯框核苷酸134-1312)。
序列編號(hào)10是另一個(gè)玉米δ-9去飽和酶cDNA的1709核苷酸序列，如包含于質(zhì)粒pBN408中的一般。
序列編號(hào)11是序列編號(hào)10中所述的核苷酸序列的翻譯產(chǎn)物。該翻譯產(chǎn)物是一個(gè)含有392個(gè)氨基酸的多肽(翻譯框核苷酸102-1280)。
序列編號(hào)12是一個(gè)18堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增玉米fad2-1的一部分。
序列編號(hào)13是一個(gè)17堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增玉米fad2-1的一部分。
序列編號(hào)14和15都是21堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa基因的一部分。
序列編號(hào)16和17分別是22和20堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白18kDa基因的一部分。
序列編號(hào)8是一個(gè)46堿基的寡核苷酸酸，被用作鑒定油質(zhì)蛋白基因的雜交探針。
序列編號(hào)19是一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的1714核苷酸序列。
序列編號(hào)20是一個(gè)32堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)21是一個(gè)33堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)22是一個(gè)33堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)23是一個(gè)32堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)24是一個(gè)37堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)25是一個(gè)32堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)26是一個(gè)32堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)27是一個(gè)33堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)28是一個(gè)24堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)29是一個(gè)19堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的刪除衍生物。
序列編號(hào)30是一個(gè)25堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增皺縮1內(nèi)含子1/外顯子1。
序列編號(hào)31是一個(gè)25堿基的寡核苷酸酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增皺縮1內(nèi)含子1/外顯子1。
序列編號(hào)32和33都是30個(gè)堿基的寡核苷酸酸，被用作鑒定含有球蛋白-1基因的克隆的雜交探針。
序列編號(hào)34和35都是30個(gè)堿基的寡核苷酸酸引物，用于擴(kuò)增球蛋白-1啟動(dòng)子。
序列編號(hào)36和37分別是36和39個(gè)堿基的寡核苷酸酸引物，用于擴(kuò)增球蛋白-1啟動(dòng)子。
序列編號(hào)38是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)1.1kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)39是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.9kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)40是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.55kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)41是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.95kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)42是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)1.4kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)43是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)1.0kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)44是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.75kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)45是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.4kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)46是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)1.3kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)47是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.8kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)48是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.6kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)49是油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子的一個(gè)0.3kb的刪除衍生物。
序列編號(hào)50和51都是29個(gè)堿基的寡核苷酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增fad2-1的編碼區(qū)。
序列編號(hào)52和53分別是31和30個(gè)堿基的寡核苷酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增δ-9去飽和酶的編碼區(qū)。
序列編號(hào)54和55分別是20和25個(gè)堿基的寡核苷酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增fad2基因的部分。
序列編號(hào)56和57都是20個(gè)堿基的寡核苷酸引物，用于通過PCR來擴(kuò)增fad2-1的內(nèi)含子。
序列編號(hào)58是質(zhì)粒pBN257的完整的核苷酸序列，它含有從1978位開始的用于fad2-1的框外翻譯起始點(diǎn)(out-of-frametranslation start)。
序列編號(hào)59是一個(gè)來源于pBN257的fad2-1基因的截短形式。來源于pBN257的編碼框由序列編號(hào)58的1991-3136位核苷酸來表示。


圖1描述了對(duì)胚和糊粉中高度表達(dá)的基因的發(fā)育調(diào)控進(jìn)行的RNA印跡分析。各個(gè)印跡分別使用以下探針圖1A,fad2-1；圖1B,δ-9去飽和酶；圖1C和1D，球蛋白-1，圖1E和1F，油質(zhì)蛋白16kDa。
圖2A描述了質(zhì)粒pML63的限制性圖譜。
圖2B描述了質(zhì)粒pSH12的限制性圖譜。
圖2C描述了質(zhì)粒pSM100的限制性圖譜。
圖3A描述了質(zhì)粒pBN256的限制性圖譜。
圖3B描述了質(zhì)粒pBN257的限制性圖譜。
圖3C描述了質(zhì)粒pBN264的限制性圖譜。
圖3D描述了質(zhì)粒pBN262的限制性圖譜。
圖3E描述了質(zhì)粒pBN414的限制性圖譜。
圖3F描述了質(zhì)粒pBN412的限制性圖譜。
圖4A描述了從玉米株系FA013-2-4獲得的個(gè)體種仁(kernel)的脂質(zhì)特征。
圖4B的直方圖描述了從玉米株系FA013-2-4獲得的個(gè)體種仁的脂質(zhì)特征的分離分析。
圖5描述了從玉米株系FA013-2-15獲得的個(gè)體R2種仁的脂質(zhì)特征。
圖6描述了從玉米株系FA014-5-1獲得的個(gè)體R1種仁的脂質(zhì)特征。
圖7A描述了質(zhì)粒pBN427的一個(gè)限制性酶切圖譜。
圖7B描述了質(zhì)粒pBN428的一個(gè)限制性酶切圖譜。
圖7C描述了質(zhì)粒pBN431的一個(gè)限制性酶切圖譜。
本發(fā)明的詳細(xì)介紹在本發(fā)明的上下文中將使用許多術(shù)語(yǔ)。
如本文所用的，一種“經(jīng)過分離的核酸片段”是一種RNA或者DNA的聚合物，它是單鏈的或者是雙鏈的，可選地含有合成的、非天然的或者被改變的核苷酸堿基。一種DNA聚合體形式的經(jīng)過分離的核酸片段可以含有一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA、或者合成的DNA片段。
術(shù)語(yǔ)“具有等同功能的亞片段”以及“功能等同的亞片段”在本文中被交換使用。這些術(shù)語(yǔ)指的是一種經(jīng)過分離的核酸片段的一部分或其亞片段，其中改變基因表達(dá)或者產(chǎn)生一種特定的表現(xiàn)型的能力仍被保持，不管這一片段或者亞片段是否編碼一種活性酶。例如，這一片段或者亞片段可以被用于設(shè)計(jì)嵌合基因以在被轉(zhuǎn)化的植物中生產(chǎn)所需的表現(xiàn)型。嵌合基因可以被設(shè)計(jì)用于以相對(duì)于植物啟動(dòng)子序列合適的取向，通過聯(lián)接一個(gè)核酸片段或者亞片段來在共抑制或者反義中發(fā)揮作用，不管它是否編碼一種活性酶。
術(shù)語(yǔ)“基本類似”以及“基本對(duì)應(yīng)”在本文中被用于指一些核酸片段，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的變化并不影響核酸片段調(diào)?；虮磉_(dá)或者產(chǎn)生一種特定的表現(xiàn)型的能力。這些術(shù)語(yǔ)同時(shí)還指本發(fā)明核酸片段的一些修飾，例如刪除或者插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸，它們基本上并不改變由此獲得的核酸片段相對(duì)于原來的、未經(jīng)修飾的片段的功能特性。因此應(yīng)該理解的是，如本工藝的熟練人員所將理解的，本發(fā)明包括了除了具體實(shí)施例中的序列以外的更多的序列。
然而，本工藝的熟練人員認(rèn)識(shí)到包括于本發(fā)明之中的基本類似的核酸序列同時(shí)也通過它們?cè)谥械葒?yán)格條件下(例如，0.5×SSC,0.1％SDS,60℃)與此處所例舉的序列、或者此處所報(bào)道的核苷酸序列的任何一部分的雜交的能力且它們對(duì)于本發(fā)明的啟動(dòng)子都是功能等同的被定義。本發(fā)明中所包括的優(yōu)選的基本類似的核酸序列是那些與本發(fā)明中所報(bào)道的核苷酸序列80％相同的序列，或者是那些與本發(fā)明中所報(bào)道的核苷酸序列的任何部分80％相同的序列。更為優(yōu)選的是那些與本發(fā)明中所報(bào)道的核苷酸序列90％相同的序列，或者是那些與本發(fā)明中所報(bào)道的核苷酸序列的任何部分90％相同的序列。最為優(yōu)選的是那些與本發(fā)明中所報(bào)道的核苷酸序列95％相同的序列，或者是那些與本發(fā)明中所報(bào)道的核苷酸序列的任何部分95％相同的序列。序列對(duì)齊和百分比相似度計(jì)算可以用LASARGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的Megalign程序來確定。多個(gè)序列的對(duì)齊可以用Clustal對(duì)齊方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)，采用缺省的參數(shù)(GAP PENALTY=10,GAP LENGTHPENALTY=10)來進(jìn)行。使用Clustal方法來進(jìn)行蛋白序列的成對(duì)對(duì)齊(pairwise alignment)和百分比相同度計(jì)算的缺省參數(shù)為KTUPLE=1,GAP PENALTY=3,WINDOW=5以及DIAGONALS SAVED=5。對(duì)于核酸，這些參數(shù)為GAP PENALTY=10,GAP LENGTH PENALTY=10,KTUPLE=2,GAP PENALTY=5,WINDOW=4以及DIAGONALS SAVED=4。氨基酸或者核苷酸序列的一個(gè)“基本的部分”所含有的一個(gè)多肽的氨基酸序列或者一個(gè)基因的核苷酸序列應(yīng)該足以提供該多肽或者基因的推定的鑒定，要么是由本工藝的熟練人員對(duì)序列進(jìn)行手工的評(píng)估，要么是通過使用諸如BLAST(Altschul,S.F.,等，(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)以及Gapped Blast(Altschul,S.F.等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402)之類的算法的計(jì)算機(jī)自動(dòng)化序列比較和鑒定方法；同時(shí)請(qǐng)參考www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
“基因”指的是表達(dá)一個(gè)特定蛋白的核酸片段，包括位于編碼序列的5’非編碼序列之前的、以及3’端非編碼序列之后的調(diào)控序列?！疤烊坏幕颉敝傅氖且粋€(gè)如在自然中發(fā)現(xiàn)的基因以及它自己的調(diào)控序列。“嵌合基因”指的是任何一種非天然基因的基因，包括在自然中沒有被發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)控序列和編碼序列。相應(yīng)的，一個(gè)嵌合基因可以包含來源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者來源于相同來源的調(diào)控序列和編碼序列，但是它們卻是以不同于天然的方式安排的?！皟?nèi)源性基因”指的是一種位于一種生物體的基因組中的天然的位置上的天然的基因。一種“外來的”基因指的是一種在宿主生物體中正常并沒有發(fā)現(xiàn)的、但是通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到宿主生物體中的基因。外來基因可以包含插入于非天然生物體中的天然基因，或者嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”指的是一種通過轉(zhuǎn)化步驟被導(dǎo)入到基因組中的基因。
“編碼序列”指的是一種編碼一個(gè)特定的氨基酸序列的DNA序列?！罢{(diào)控序列”指的是位于編碼序列的上游(5’端非編碼區(qū))、之中、或者下游(3’端非編碼區(qū))的核苷酸序列，它影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或者穩(wěn)定性、或者相關(guān)的編碼序列的翻譯。調(diào)控序列可以包括，但不局限于，啟動(dòng)子、翻譯引導(dǎo)序列、內(nèi)含子、以及多聚腺苷酸化識(shí)別序列。
“啟動(dòng)子”指的是一種能夠控制編碼序列或者功能性RNA的表達(dá)的DNA序列，啟動(dòng)子序列包含臨近的以及更遠(yuǎn)端的上游元件，后者通常被稱為增強(qiáng)子。相應(yīng)地，“增強(qiáng)子”序列是一種可以刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，它可以是啟動(dòng)子的一個(gè)固有的元件或者是一個(gè)插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子水平或者組織特異性的異源元件。啟動(dòng)子可以完全地來源于一個(gè)天然的基因，或者它也可以含有來源于不同的天然啟動(dòng)子的不同的元件，或者它甚至可以含有合成的DNA片段。本工藝的熟練人員應(yīng)該理解的是，不同的啟動(dòng)子可以指導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中、或者在發(fā)育的不同階段進(jìn)行表達(dá)，或者響應(yīng)不同的環(huán)境條件而表達(dá)。引起一個(gè)基因在大部分的細(xì)胞類型中、在大部分的時(shí)間內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子被稱為“組成型啟動(dòng)子”。各種不同類型的在植物細(xì)胞中有用的新的啟動(dòng)子不斷地被發(fā)現(xiàn)；在Okamuro和Goldberg(1989)編輯的書[植物的生物化學(xué)(Biochemistry of plants)15:1-82]可以找到許多例子。進(jìn)一步又認(rèn)識(shí)到，因?yàn)樵诖蟛糠值那樾沃校{(diào)控序列的確切的邊界并沒有被完整地定義，所以具有一些變化的DNA片段可能會(huì)具有相同的啟動(dòng)子活性。
“內(nèi)含子”是基因中的一個(gè)間插序列，它并不編碼蛋白序列的一部分。因此，此類序列被轉(zhuǎn)錄到RNA中但是隨后就被剪切下來，它并沒有被翻譯。這一術(shù)語(yǔ)也被用于被剪切的RNA序列?！皟?nèi)含子”是一個(gè)基因的序列的一部分，它被轉(zhuǎn)錄并存在于來源于該基因的成熟的信使RNA中，但是它并不一定必然是編碼最終的基因產(chǎn)品的序列的一部分。
術(shù)語(yǔ)“皺縮1內(nèi)含子/外顯子”指的是玉米皺縮1基因的一個(gè)區(qū)域。在本發(fā)明中所用的特定的內(nèi)含子/外顯子來源于皺縮1基因的一個(gè)非編碼區(qū)(“外顯子1/內(nèi)含子1”)，它與GenBank訪問號(hào)#X02382序列的第1138至第2220位核苷酸是相同的。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)皺縮1及其縮寫Sh1交替使用。
“翻譯引導(dǎo)序列”指的是一段位于基因的啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯引導(dǎo)序列存在于被完整地加工的mRNA中翻譯起始序列的上游。翻譯起始序列可以影響初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被加工成mRNA的過程、mRNA的穩(wěn)定性或者翻譯的效率。翻譯引導(dǎo)序列的例子已被描述[Turner,R.和Foster.G.D.(1995)分子生物技術(shù)(MolecularBiotechnology)3:225]。
措辭“3’端非編碼序列”指的是位于編碼序列下游的DNA序列，它包括多聚腺苷酸化識(shí)別序列以及其它的編碼能夠影響mRNA加工或者基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)的序列。多聚腺苷酸化信號(hào)的特征通常在于它影響多聚腺苷酸尾(tract)添加到一個(gè)mRNA前體的3’端。不同的3’端非編碼序列的應(yīng)用被Ingelbrecht等(1989)植物細(xì)胞(PlantCell)1:671-680)舉例說明。
“RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物”指的是一種DNA序列在RNA多聚酶的催化下轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是DNA序列的一個(gè)完美的互補(bǔ)拷貝時(shí)，它被稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；或者它也可以是一個(gè)來源于初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，此時(shí)它被稱為成熟RNA?！靶攀筊NA”(“mRNA”)指的是不含內(nèi)含子的、可以由細(xì)胞翻譯為蛋白的RNA。“cDNA”指的是一種用反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA合成并與其互補(bǔ)的DNA。cDNA可以是單鏈的或者可以使用DNA多聚酶1的Klenow片段將其轉(zhuǎn)換為雙鏈的。“有義的”RNA指的是包含mRNA的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此它可以在細(xì)胞中或者在體內(nèi)被翻譯成蛋白?！胺戳xRNA”指的是一種RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它與目的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者mRNA的全部或者部分是互補(bǔ)的并且阻止目的基因的表達(dá)或者翻譯積累(美國(guó)專利號(hào)5,107,065)。反義RNA可以與特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的任何部分，例如5’端非編碼序列、3’端非編碼序列、內(nèi)含子、或者編碼序列，具有互補(bǔ)性?！肮δ苄訰NA”指的是反義RNA、核糖酶RNA或者其它的可能不被翻譯、但是卻影響細(xì)胞加工的RNA。
術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指的是核酸序列與一個(gè)單個(gè)的核酸片段相聯(lián)系使得它們其中一個(gè)的功能受到另一個(gè)的影響。例如，一個(gè)可操作地與一個(gè)編碼序列連接的啟動(dòng)子可以影響該編碼序列的表達(dá)，即，該編碼序列處于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。編碼序列可以以有義的或者反義的取向與調(diào)控序列可操作地連接。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”，如此處所用，指的是一種功能性終產(chǎn)物的生產(chǎn)。一個(gè)基因的表達(dá)或者過量表達(dá)涉及該基因的轉(zhuǎn)錄以及mRNA翻譯成為前體或者成熟的蛋白?！胺g抑制”指的是生產(chǎn)出能夠抑制目的蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。“過量表達(dá)”指的是在轉(zhuǎn)基因生物體中一種基因產(chǎn)物的生產(chǎn)水平超出了在正常的或者非轉(zhuǎn)化的生物體中的生產(chǎn)水平?！肮惨种啤敝傅氖巧a(chǎn)出能夠抑制相同的或者基本類似的外來或者內(nèi)源性的基因的表達(dá)或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累的有義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(美國(guó)專利號(hào)5,231,020)。共抑制的機(jī)制可以是在DNA水平(例如DNA甲基化)、在轉(zhuǎn)錄水平、或者在轉(zhuǎn)錄后水平。
“被變更的表達(dá)”指的是在轉(zhuǎn)基因生物體中基因產(chǎn)物的生產(chǎn)在數(shù)量上或者在比例上顯著不同于在野生型生物體的可比較的組織中的活性。
“成熟”蛋白指的是一種經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工的多肽，即在初始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在的前-或者原-肽已經(jīng)被除去?！扒绑w”蛋白指的是mRNA翻譯的初始產(chǎn)物，即仍含有前-和原-肽。前-和原-肽可以是，但不局限于，細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。
“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”是一個(gè)氨基酸序列，它與一個(gè)蛋白連合翻譯并指導(dǎo)該蛋白到達(dá)葉綠體或者到達(dá)在該蛋白被制造的細(xì)胞中存在的其它的質(zhì)體類型中。“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列”指的是編碼一種葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列?！靶盘?hào)肽”是一種氨基酸序列，它與一種蛋白連合被翻譯并指導(dǎo)該蛋白到達(dá)分泌系統(tǒng)(Chrispeels,J.J.,(1991)Ann.Rev.Plant phys.Plant Mol.Biol.42:21-53)。如果蛋白要被引導(dǎo)到液泡，那么可以進(jìn)一步加入一個(gè)液泡尋靶信號(hào)(見上)，或者如果要被引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，那么就加入一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持留信號(hào)(見上)。如果蛋白要被引導(dǎo)到核，那么應(yīng)該將任何已經(jīng)存在的信號(hào)肽都除去并將一個(gè)核定位信號(hào)包括進(jìn)去(Raikhel(1992)Plant Phys.100:1627-1632)。
“δ-9去飽和酶”(可選地稱為“硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶”)催化在硬脂酰-?；d體蛋白的第9和第10位碳原子之間引入一個(gè)雙鍵的反應(yīng)，使其成為油?；??；d體蛋白。它還能夠?qū)⒂仓??；d體蛋白轉(zhuǎn)換成油酰基-?；d體蛋白，雖然效率下降。
“δ-12去飽和酶”指的是一種脂肪酸去飽和酶，它催化在一種18碳長(zhǎng)的脂肪酸鏈的第6位碳和第7位碳(從甲基端開始編號(hào))，即對(duì)應(yīng)于第12位和第13位碳(從羰基碳開始編號(hào))之間形成雙鍵的反應(yīng)。
如本文所用的，措辭“編碼玉米δ-9去飽和酶的核酸片段”以及“編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段”指的是來源于一個(gè)去飽和酶eDNA或者基因組序列的核酸片段，但是它們可能生產(chǎn)或者不生產(chǎn)活性酶。例如，這樣的片段可以是一個(gè)并不產(chǎn)生翻譯產(chǎn)物的突變序列，或者其編碼框已經(jīng)被移動(dòng)并可能產(chǎn)生一種不同的多肽，但是它卻具有改變?nèi)ワ柡兔杆降墓δ堋Q句話說，這樣的一個(gè)片段可以被用于構(gòu)建一個(gè)共抑制或者反義的嵌合基因以改變?nèi)ワ柡兔傅乃?，從而改變被轉(zhuǎn)化有此種嵌合基因的植物的脂質(zhì)特征。
“轉(zhuǎn)化”指的是將一種核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物體的基因組中并導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的繼承性。含有被轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物體被稱為“轉(zhuǎn)基因”生物體。玉米細(xì)胞轉(zhuǎn)化的優(yōu)選的方法是使用微粒加速或者“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein K.等(1987)Nature (London)327:70-73；美國(guó)專利號(hào)4,945,050)，或者是使用一種合適的含有轉(zhuǎn)基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法(Ishida Y.等1996,Nature Biotech,14:745-750)。措辭“轉(zhuǎn)基因事件”指的是來源于一個(gè)含有轉(zhuǎn)基因的單個(gè)的愈傷組織的一種獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。
本發(fā)明中所使用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)在本工藝中是眾所周知的，而且在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A LaboratoryManual),Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold SpringHarbor,1989(下文稱″Sambrook″)中有更詳細(xì)的描述。
“PCR”或者“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是一種用于合成大量的特定的DNA片段的技術(shù)，它包括一系列的重復(fù)周期(Perkin Elmer CetusInstruments,Norwalk,CT)。典型地，將雙鏈DNA加熱變性，在低的溫度下將與目的片段的3’端邊界互補(bǔ)的引物退火，然后在中間的溫度延伸。一套這樣的三個(gè)聯(lián)貫的步驟組成一個(gè)周期。“表達(dá)構(gòu)建物”是一個(gè)質(zhì)粒載體或含有該嵌合基因的亞片段。質(zhì)粒載體的選擇取決于轉(zhuǎn)化宿主植物時(shí)所要采用的方法。熟練的技術(shù)人員非常了解為了能夠成功地轉(zhuǎn)化、篩選、以及繁殖含有嵌合基因的宿主細(xì)胞，質(zhì)粒載體必須含有哪些遺傳元件。熟練的技術(shù)人員同時(shí)也會(huì)認(rèn)識(shí)到不同的獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同的表達(dá)水平和模式(Jones等，(1985)EMBO J.4:2411-2418；De Almelda等，(1989)Mol.Gen.Genetics 218:78-86)，而且對(duì)多個(gè)事件都必須進(jìn)行篩選以便獲得顯示所需表達(dá)水平和模式的株系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達(dá)的Northern印跡分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的Western印跡分析、或者表現(xiàn)型分析來實(shí)現(xiàn)。
“R0”植物等同于“初始轉(zhuǎn)化植株”，它是在用基因槍或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化之后直接從組織培養(yǎng)步驟再生的植物。將從R0植物收獲的種子稱為R1或者R0:1種子。來源于R1種子的后代是R1植物，從R1植物收獲的種子是R2或者R1:2種子。接下去的世代都根據(jù)這一慣例進(jìn)行命名。
“種仁”是玉米的殼果，含有一個(gè)成熟的胚和胚乳，它們是雙受精的產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“玉米”代表的是Zea mays L.的任何一個(gè)品種、栽培變種、或者種群。
“籽粒”包含由商業(yè)種植者生產(chǎn)的成熟的玉米種仁，供農(nóng)場(chǎng)使用或者銷售給消費(fèi)者用于除了生長(zhǎng)或再生這一種類以外的目的?！胺N子”是為了繁殖種類目的而生產(chǎn)并銷售給商業(yè)種植者的成熟的玉米種仁。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)種子、種仁、以及籽粒可以被交替使用。“胚”或者“胚芽(germ)”是一種開始一個(gè)快速生長(zhǎng)階段(種子萌芽)之前的孢子體植物。玉米的胚(胚芽)含有在種仁中發(fā)現(xiàn)的絕大部分的油。谷類作物胚的結(jié)構(gòu)包括胚軸和角質(zhì)鱗片。角質(zhì)鱗片是谷類作物胚的單個(gè)的子葉，專門用于胚乳的吸收?！昂邸笔且环N蛋白質(zhì)材料，通常呈小顆粒狀，存在于玉米和其它籽粒的胚乳的最外層細(xì)胞中。
“顯性”性狀需要一個(gè)等位基因相對(duì)于一個(gè)可選的等位基因是顯性的，如果該顯性等位基因的純合的個(gè)體細(xì)胞或者生物體與雜合體在表現(xiàn)型上是難以分辨的話。另外那個(gè)可選的等位基因被稱為是隱性的?！半[性”描述了一個(gè)其表現(xiàn)型表達(dá)在一個(gè)雜合體中被顯性等位基因所掩飾的基因?！鞍腼@性”描述了在雜合體中的一種中間表現(xiàn)型。術(shù)語(yǔ)“純合的”描述了一種遺傳狀況，當(dāng)相同的等位基因存在于兩個(gè)同源染色體的相應(yīng)的位點(diǎn)上時(shí)，這種狀況出現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“雜合的”描述了一種遺傳狀況，當(dāng)不同的等位基因存在于兩個(gè)同源染色體的相應(yīng)的位點(diǎn)上時(shí)，這種狀況出現(xiàn)。
如本文在描述“油酸含量”時(shí)所用的，術(shù)語(yǔ)“高油酸鹽(oleate)”指的是一種其油酸含量不少于種子油總含量的大約60％(質(zhì)量比，在濕度為0％時(shí)測(cè)定)的籽?；蛘叻N子。在描述“硬脂酸含量”時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高硬脂酸鹽”指的是一種其硬脂酸含量不少于種子油總含量的大約20％(質(zhì)量比，在濕度為0％時(shí)測(cè)定)的籽粒或者種子。“飽和脂肪酸”是一種含有飽和烴基鏈的脂肪酸。術(shù)語(yǔ)“高飽和脂肪酸鹽(saturate)”指的是一種其總的飽和脂肪酸含量不少于種子油總含量的大約30％(質(zhì)量比，在濕度為0％時(shí)測(cè)定)的籽?；蛘叻N子。籽?；蛘叻N子的飽和脂肪酸組分的主要成分包括，但不局限于，棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、以及花生酸(20∶0)。
一個(gè)“動(dòng)物胴體質(zhì)量改善量”是改善動(dòng)物胴體質(zhì)量所需的量。本發(fā)明涉及玉米中脂質(zhì)特征的改變。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)過分離的包含一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子含有一個(gè)核苷酸序列，這一序列基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)19或者38至49的任一中所述的核苷酸序列或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)片段或者亞片段，它與在序列編號(hào)19或者38至49的任一中所述的核苷酸序列基本類似并且功能等同。另外，上面所討論的片段或者亞片段可以在中等嚴(yán)格條件下與在序列編號(hào)19或者38至49中所述的核苷酸序列雜交。這一新穎的玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)基因以胚和糊粉特異的方式高水平表達(dá)。在發(fā)育中玉米胚中的強(qiáng)的啟動(dòng)子活性可以通過在一個(gè)如下面的實(shí)施例中所討論的表達(dá)構(gòu)建物中使用與在序列編號(hào)39中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列以及一個(gè)內(nèi)含子元件來最佳地實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與從球蛋白-1基因獲得的玉米胚/糊粉特異的啟動(dòng)子相比，油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的活性高了許多，而且它在發(fā)育中的玉米種仁中的表達(dá)也早了許多。優(yōu)選的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子具有在序列編號(hào)39中所述的核苷酸序列。然而，就象本工藝的熟練人員將會(huì)理解的，任何一種具有胚/糊粉特異性的功能性啟動(dòng)子在本發(fā)明中都是有用的。其它合適的啟動(dòng)子對(duì)于本工藝的熟練人員是眾所周知的，它的例子被描述于WO94/11516中，該文獻(xiàn)的內(nèi)容作為參考被結(jié)合于本發(fā)明中。進(jìn)而，本工藝的熟練人員將可以使用在下面的實(shí)施例中所描述的方法和分析來鑒定其它的其具有所需的胚/糊粉表達(dá)特異性的啟動(dòng)子。例如，使用經(jīng)過瞬時(shí)優(yōu)化(instantoptimized)的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子作為對(duì)照，可以鑒定其它的以相似的方式發(fā)揮功能的序列，其中使用組織學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)胚/糊粉啟動(dòng)子的功能，例如GUS報(bào)告基因功能的表達(dá)水平、與種子油形成同時(shí)發(fā)生的基因表達(dá)的時(shí)間安排、以及合適的組織特異性，進(jìn)行確定。
在第二個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種經(jīng)過分離的編碼δ-9硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，它基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8或者10任一中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段?？梢詷?gòu)建含有這一核酸片段或其亞片段或者此類片段或者亞片段的反向互補(bǔ)序列與合適的調(diào)控序列可操作地聯(lián)接的嵌合基因，其中這一嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米硬脂酸表現(xiàn)型。
可以制造這樣的轉(zhuǎn)基因植物，在這些轉(zhuǎn)基因植物中，玉米δ-9去飽和酶的水平比正常的更高或者更低或者出現(xiàn)在它正常并不存在于其中的細(xì)胞類型或者發(fā)育階段中。這可以改變?chǔ)?9去飽和酶在這些細(xì)胞中的水平。在一些應(yīng)用中，減少或者消除一種編碼δ-9去飽和酶的基因在植物中表達(dá)或者減少這一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在這一植物中的積累可能是合乎需求的。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以通過將編碼玉米δ-9去飽和酶的一個(gè)核酸片段或其亞片段聯(lián)接到植物的啟動(dòng)子序列上來構(gòu)建一個(gè)設(shè)計(jì)用于內(nèi)源性δ-9去飽和酶的共抑制的嵌合基因?？蛇x地，可以通過將核酸片段或者亞片段反向與植物的啟動(dòng)子序列聯(lián)接，即通過將上述片段或者亞片段的反向互補(bǔ)序列與植物啟動(dòng)子序列聯(lián)接，來構(gòu)建一個(gè)被設(shè)計(jì)用于為本發(fā)明的核酸片段的全部或者部分表達(dá)反義RNA的嵌合基因。共抑制基因或者反義嵌合基因都可以通過轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入到植物中，其中相應(yīng)的內(nèi)源性基因的表達(dá)或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累被減少或者消除[Stam，等(1997)植物學(xué)年鑒(Annals of botany)79:3-12]。
一個(gè)性狀基因在玉米種仁中的表達(dá)可以通過構(gòu)建一個(gè)嵌合基因來實(shí)現(xiàn)，在上述的嵌合基因中，性狀基因的編碼區(qū)以及其它的調(diào)控元件(例如內(nèi)含子)是可操作地與油質(zhì)蛋白16kda啟動(dòng)子聯(lián)接的。這一嵌合基因可以在其5’非翻譯序列中包含皺縮1外顯子1/內(nèi)含子1以增強(qiáng)基因的表達(dá)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Sh1外顯子Ⅰ序列可以作為mRNA中的引導(dǎo)序列的一部分在剪切之后仍然被保留下來。性狀基因的編碼序列的全部或者部分位于Sh1外顯子1/內(nèi)含子1序列的3’端，而且其取向可以是有義的或者是反義的。
這樣的嵌合基因同時(shí)還可以包含一種或多種內(nèi)含子以便利基因的表達(dá)。內(nèi)含子元件的位置可以位于如上所述的翻譯引導(dǎo)序列中，或者位于性狀基因的編碼區(qū)中。也可以用來源于其它基因，例如肌動(dòng)蛋白-1、泛素-1、Adh-1、fad2-1、以及fad2-2，的內(nèi)含子元件來替代Sh1元件以產(chǎn)生同樣的作用。相應(yīng)地，在本發(fā)明的實(shí)踐中也可以使用來源于其它基因的內(nèi)含子元件。也可以在嵌合基因中提供含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的3’端非編碼序列。
本發(fā)明的核酸片段的全部或者部分也可以被用作探針用于制作這樣的基因的遺傳學(xué)和物理圖譜它屬于該基團(tuán)的一部分，或者可用作與這些基因相聯(lián)的性狀的標(biāo)記物。此類信息在以發(fā)展具有所需表現(xiàn)型的株系為目的的植物培育中是有用的。例如，此類片段可以被用作一個(gè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的標(biāo)記物。可以用本發(fā)明的核酸片段作為探針來對(duì)經(jīng)過限制性酶切的植物基因組DNA進(jìn)行DNA印跡(Sambrook)。隨后可以用計(jì)算機(jī)程序，如MapMaker(Lander等.,(1987)Genomics 1:174-181)，對(duì)由此獲得的條帶樣式進(jìn)行遺傳學(xué)分析以便構(gòu)建一個(gè)遺傳學(xué)圖譜。另外，本發(fā)明的核酸片段可以被用作對(duì)經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶解的基因組DNA進(jìn)行DNA印跡的探針，上述的基因組DNA來源于代表著一個(gè)特定的遺傳雜交的親代和后代的一組個(gè)體。DNA多態(tài)性的分離被記錄下來并被用于計(jì)算這一示例性核酸序列在原先使用這一種群獲得的遺傳學(xué)圖譜中的位置(Botstein,D.等，(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。
制造來源于植物的探針并將其用于制定遺傳學(xué)圖譜被描述于R.Bematzky,R.和Tanksley,S.D.(1986) Plant Mol.Biol.Reporter 4(1):37-41。數(shù)目眾多的出版物描述了使用上述的方法學(xué)或其變種來制作特定cDNA克隆的遺傳學(xué)圖譜。例如，可以將F2雜交種群、回交種群、隨機(jī)交配種群、近等基因(near isogenic)株系、以及其它的個(gè)體組合用于圖譜的制作。這些方法學(xué)對(duì)于本工藝的熟練人員是眾所周知的。
也可以將來源于示例性核酸序列的核酸探針用于物理圖譜的制作中(即，將序列配置于物理圖譜中；見Hoheisel,J.D.，等Nonmammalian Genomic Analysis:A Practical Guide,Academicpress 1996，第319-346頁(yè)，以及本文中所引用的參考文獻(xiàn))。
在第三個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種經(jīng)過分離的編碼一個(gè)玉米δ-12去飽和酶的核酸片段，它基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段。微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶的基因被描述于WO94/11516(1994年5月26日發(fā)表)中，它可以被用于實(shí)踐本發(fā)明?？梢詷?gòu)建包含這樣一個(gè)核酸片段或其亞片段或者上述片段或者亞片段的反向互補(bǔ)序列可操作地與合適的調(diào)控序列聯(lián)接的嵌合基因，其表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油酸表現(xiàn)型。如在上面針對(duì)一個(gè)經(jīng)過分離的編碼δ-9去飽和酶的核酸片段所討論的，減少或者消除編碼δ-12去飽和酶的基因在植物中的表達(dá)或者其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在植物中的積累，在一些應(yīng)用中可能是合乎需求的。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以通過將編碼玉米δ-12去飽和酶的一個(gè)核酸片段或其亞片段聯(lián)接到植物的啟動(dòng)子序列上來構(gòu)建一個(gè)設(shè)計(jì)用于內(nèi)源性δ-12去飽和酶的共抑制的嵌合基因?？蛇x地，可以通過將核酸片段或者亞片段反向與植物的啟動(dòng)子序列聯(lián)接，即通過將上述片段或者亞片段的反向互補(bǔ)序列與植物啟動(dòng)子序列聯(lián)接，來構(gòu)建一個(gè)被設(shè)計(jì)用于為這一核酸片段的全部或者部分表達(dá)反義RNA的嵌合基因。共抑制基因或者反義嵌合基因都可以通過轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入到植物中，其中相應(yīng)的內(nèi)源性基因的表達(dá)被減少或者消除。
上述的嵌合基因可以進(jìn)一步包括(1)一種經(jīng)過分離的編碼玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38至49任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38至49任一中所述的核苷酸序列基本相似并功能等同的片段或者亞片段，以及/或者(2)一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子。
在另一個(gè)方面，嵌合基因可以被構(gòu)建成包含各種不同的組合，包括但不局限于a)一個(gè)嵌合基因，包含一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-9硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，該片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8或者10任一中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，以及一個(gè)編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，其中片段或亞片段是可操作地聯(lián)接的，而且其中這一嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米油表現(xiàn)型。
被用于構(gòu)建此類嵌合基因的編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段可以是在WO94/11516中所鑒定的那個(gè)片段或者是與序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段基本對(duì)應(yīng)的片段。
b)在上面的(a)中所述的嵌合基因可以進(jìn)一步包含一種經(jīng)過分離的包含一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38-49任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38-49任一中所述的核苷酸序列基本相似并功能等同的片段或亞片段。
c)在上面的(a)或(b)中所述的嵌合基因每一個(gè)可以進(jìn)一步包括一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子。
d)一個(gè)嵌合基因，包含(1)一個(gè)經(jīng)過分離的包含玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38-49任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38-49任一中所述的核苷酸序列基本相似并功能等同的片段或亞片段。(2)一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-9硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶的核酸片段，該片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8或者10任一中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，(3)一個(gè)編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，(4)一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中片段或亞片段是可操作地聯(lián)接的，而且其中這一嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米油表現(xiàn)型。在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼δ-12去飽和酶的核酸片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列。
e)一種嵌合基因，包含(1)一個(gè)經(jīng)過分離的包含一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38-49任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或者38-49任一中所述的核苷酸序列基本相似并功能等同的片段或亞片段。(2)一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米8-12去飽和酶的核酸片段，該片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)1中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，或者一個(gè)經(jīng)過分離的與在序列編號(hào)58或59中任一所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)的核酸片段或其任何功能等同的亞片段，或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列以及一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中這些片段是可操作地聯(lián)接的，而且其中這一嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米油表現(xiàn)型。在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼δ-12去飽和酶的核酸片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列。
本發(fā)明同時(shí)還涉及在它們的基因組中包含著這些不同的嵌合基因的玉米植物及其植物部分。從此類植物獲得的玉米籽粒將具有被改變的玉米油表現(xiàn)型。例如，從一種在其基因組中包含一個(gè)嵌合基因，上述的嵌合基因包含著一個(gè)經(jīng)過分離的編碼玉米δ-9硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，該核酸片段與在序列編號(hào)8或10任一中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段、或者上述的片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列基本相應(yīng)，而且其中上述的片段是與合適的調(diào)控序列可操作地聯(lián)接的，的玉米植物獲得的玉米籽粒的硬脂酸的含量將不少于總的油含量的大約20％或者其飽和脂肪酸鹽的總含量不少于總的油含量的大約35％。優(yōu)選的調(diào)控序列是油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子。如果這一嵌合基因進(jìn)一步包含一種經(jīng)過分離的編碼一個(gè)玉米δ-9硬脂酰-?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，上述的核酸片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8或10任一中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，以及/或者一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子，同樣也可以獲得相同的結(jié)果。
一種玉米籽粒，在其基因組中包含一種嵌合基因，該嵌合基因包含一種經(jīng)過分離的包含一個(gè)玉米δ-12去飽和酶的核酸片段，該片段與在序列編號(hào)1中所述的核苷酸序列及其功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列基本對(duì)應(yīng)，或者包含一種經(jīng)過分離的片段，該片段與在序列編號(hào)58或59任一中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列基本對(duì)應(yīng)，以及一種經(jīng)過分離的包含一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸片段，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)的或者是部分的，而且其中上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)核酸序列，該核酸序列與在序列編號(hào)19或38-49任一中所述的核苷酸序列基本對(duì)應(yīng)，或者上述的啟動(dòng)子包含一個(gè)與在序列編號(hào)19或38-49任一中所述的核苷酸序列基本相似并功能等同的片段或亞片段，以及皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中上述的片段是可操作地聯(lián)接的，而且其中這一嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米油酸表現(xiàn)型，其中上述的玉米籽粒中油含量的范圍是占干重的大約6％至大約10％之間，而且其中上述的油含有不少于大約60％的油酸(占種子總的油含量)，而且優(yōu)選的不少于大約70％油酸(占種子總的油含量)。
這樣的一種玉米籽?？梢酝ㄟ^在上面的實(shí)施例中所描述的TopCross籽粒生產(chǎn)方法獲得。在這一方法中，親本的其中之一含有一個(gè)上述的嵌合基因，另一個(gè)親代包含一種高油表現(xiàn)型(占重量或者干物質(zhì)的大約2％至20％)。可選地，親代的其中之一可以同時(shí)既包含一個(gè)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因，例如一個(gè)本發(fā)明的嵌合基因，又包含一種高油表現(xiàn)型，而另一個(gè)親代則是一個(gè)精良的雜交株系。
從一種玉米植物，在這種植物的基因組中包含有一個(gè)嵌合基因，該基因包含一個(gè)經(jīng)過分離的編碼一個(gè)玉米δ-12去飽和酶的核酸片段，該片段與在序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列或其任何一種功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列基本對(duì)應(yīng)，其中這些片段可操作地與合適的調(diào)控序列聯(lián)接，中獲得的玉米籽粒的油酸含量將不少于總的油含量的大約60％。優(yōu)選的調(diào)控序列是油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子。如果這一嵌合基因進(jìn)一步包含一種經(jīng)過分離的編碼一個(gè)玉米δ-9硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶的核酸片段，上述的核酸片段基本對(duì)應(yīng)于在序列編號(hào)8或10任一中所述的核苷酸序列或其任何功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，以及/或者一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子，同樣也可以獲得相同的結(jié)果。
就在上面的(a)至(e)中所討論的含有各種不同組合的嵌合基因而言，從包含此類嵌合基因的植物獲得的玉米籽粒中飽和脂肪酸鹽的總含量將不少于總的油含量的大約30％，而油酸的含量將不少于總的油含量的大約30％。
本發(fā)明同時(shí)還涉及從含有任何上述嵌合基因的玉米植物獲得的種子、從此類種子獲得的油、來源于此類籽粒的加工過程的動(dòng)物飼料、這些油在食物、動(dòng)物飼料、烹飪、或者工業(yè)應(yīng)用中的應(yīng)用、以及從這些油的氫化、分餾、交換酯化、或者水解制造的產(chǎn)品、在這些油的生產(chǎn)過程中制造的副產(chǎn)品、以及用于改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
本發(fā)明還涉及一種用于改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法，包括給動(dòng)物喂食胴體質(zhì)量改善量的動(dòng)物飼料，上述的動(dòng)物飼料來源于從本發(fā)明的任何一種玉米植物獲得的玉米種子/籽粒的加工過程。
植物油經(jīng)常被用于高溫的應(yīng)用中。油的氧化在熱的存在下被加速。重要的是，一種油應(yīng)該能夠經(jīng)受這些在例如油炸、烘焙、烘烤等應(yīng)用中存在的情況。在一些情形中，可能會(huì)加入抗氧化劑來改善油的穩(wěn)定性，但是并不是所有的抗氧化劑都能夠忍耐高溫。另外，在許多情形中，如果需要使用無添加成分的商標(biāo)，食品制造商并不想使用加有抗氧化劑的油。因此，一種不添加任何添加劑或者不經(jīng)過其它加工而在高溫下又能保持氧化穩(wěn)定性的油是非常合乎需求的。對(duì)油過度加熱通常會(huì)導(dǎo)致油的熱聚合，而且氧化產(chǎn)物使得用于加熱的設(shè)備沾上了一層粘乎乎的油漆樣的油垢并使油過度發(fā)泡。氧化導(dǎo)致形成了許多種降解產(chǎn)物，這取決于油所暴露的條件。高溫穩(wěn)定性可以通過將油暴露于高溫并監(jiān)控不合需求的降解產(chǎn)物的形成來進(jìn)行評(píng)估。這些降解產(chǎn)物包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性的產(chǎn)物，可以是碳?xì)浠衔铩⒋碱?、醛類、酮類、以及酸類。非揮發(fā)性的成分可以進(jìn)一步被分類為極性和聚合化合物。存在于降解的油中的極性和聚合化合物可以用反相高性能液相色譜[描述于Lin,S.S.,1991，脂肪和油的氧化(Fats and oilsoxidation)，脂肪和油技術(shù)的介紹(Introduction to Fats and OilsTechnology)(Wan,P.J.編輯)，第211-232頁(yè)，美國(guó)油化學(xué)家協(xié)會(huì)(Am.Oil Chem.Soc.)]直接進(jìn)行分析。
本發(fā)明的油可以被用于各種不同的應(yīng)用中。一般而言，氧化穩(wěn)定性是與味道穩(wěn)定性相關(guān)的。本發(fā)明的油可以被用于食品的制作中。例子包括，但不局限于，用作食品成分、涂覆物、色拉油、噴霧油、烘烤用油、以及油炸用油。在其中可能使用油的食物包括，但不局限于，餅干和點(diǎn)心、糖果制品、糖漿和放在食品上的澆頭(toppings)、調(diào)味料和肉湯、湯、奶油面糊(batter)和面包面(breading mixes)、烘焙面(baking mixes)、以及生面團(tuán)(dough)。使用本發(fā)明的油的食品可以在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持更好的味道，因?yàn)檫@種油改善了抗氧化的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的油也可以被用作一種混合原材料，用于制造一種混合的油制品。此處使用“混合原材料”，其含意是本發(fā)明的油可以被與其它的植物油一起混合以改善其它油的特征，例如脂肪酸組成、味道、以及氧化穩(wěn)定性。本發(fā)明的油可以被使用的量將取決于由此所得的最終混合油制品所要達(dá)到的性質(zhì)?；旌嫌椭破返睦影?，但不局限于，人造黃油、起酥油、油炸用油、色拉油、等等。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的油的工業(yè)應(yīng)用，用于例如具有多種用途的工業(yè)潤(rùn)滑劑、充當(dāng)水壓液、等等。在工業(yè)上將植物油用作潤(rùn)滑劑的基液已經(jīng)被知道好幾年了。然而，因?yàn)閷?duì)在環(huán)境敏感地區(qū)使用石油油料的環(huán)境憂慮，這一興趣正在加強(qiáng)。植物油是可以被容易地生物降解的、它毒性低、具有良好的潤(rùn)滑特性。然而，高凝固點(diǎn)(pourpoint)以及在高溫下的快速氧化限制了它們的應(yīng)用。由于本發(fā)明的油中多聚不飽和脂肪酸鹽的含量低，如本文中所描述的，而且具有高度的氧化穩(wěn)定性以及高溫穩(wěn)定性，這些特征同時(shí)也使本發(fā)明的油適合于工業(yè)性的應(yīng)用，例如工業(yè)用油，即，用作工業(yè)潤(rùn)滑劑或者水壓液，等等?？梢员挥糜谥圃旃I(yè)潤(rùn)滑劑和水壓液的添加劑都是商業(yè)可供的。實(shí)際上，有一些添加劑已經(jīng)被特別地配制用于與高含油酸的植物油一起使用。添加劑一般包含氧化劑和一些防止發(fā)泡、耗損、生銹等的材料。
油是通過一個(gè)研磨工序從植物獲得的。玉米油是通過使用濕的或干的研磨工序從種仁提取的。濕研磨是一個(gè)多步驟的工序，包括種仁的浸泡和研磨以及淀粉、蛋白、油以及纖維成分的分離。玉米濕研磨工藝的一個(gè)綜述見于S.R.Eckhoff在第四屆玉米利用會(huì)議論文集(Proceedings of the Fourth Corn Utilization Conference),1992年6月24-26日,St.Louis,MO，國(guó)立玉米栽培者協(xié)會(huì)(NationalCorn Growers Association)、CIBA-GEIGY種子分部(SeedDivision)以及美國(guó)農(nóng)業(yè)部(United States Department ofAgriculture)。干研磨法是這樣一個(gè)工藝，在這一工藝中，通過有控制地在籽粒中加入水，然后讓其通過一個(gè)脫仁壓榨機(jī)和一系列的滾轉(zhuǎn)機(jī)和篩子來使玉米的胚和種仁的殼與胚乳分離開來。美國(guó)的干研磨工業(yè)每年生產(chǎn)大約5千萬磅的粗玉米油，而濕研磨工業(yè)生產(chǎn)10億磅以上的粗玉米油(Fitch,B.(1985)JAOCS 62(11):1524-1531)。如此獲得的油被稱為粗油。
可以用水合磷脂和其它的極性和中性脂質(zhì)復(fù)合物來使粗油脫膠，上述的復(fù)合物便利了它們從非水合的甘油三酯部分分離出來?？梢赃M(jìn)一步對(duì)油進(jìn)行精煉以除去雜質(zhì)；主要是游離的脂肪酸、色素、以及殘余的樹膠(gum)。精煉是通過添加腐蝕劑來實(shí)現(xiàn)的，上述的腐蝕劑與游離的脂肪酸相互作用，在粗油中形成肥皂、磷脂水合物和蛋白。用水來清洗掉在精煉的過程中形成的微量的肥皂。皂料副產(chǎn)品可以被直接用于動(dòng)物飼料中或者被酸化以回收游離的脂肪酸。通過用一種漂白土進(jìn)行吸收來除去顏色，這種漂白土可以除去大部分的葉綠素和類胡蘿卜素化合物?？梢詫⒕珶捄蟮挠蜌浠纬删哂懈鞣N不同熔化性質(zhì)和質(zhì)地的脂肪。可以用凝析(Winterization)(分餾)的方法在仔細(xì)控制的冷卻條件下從氫化后的油中除去硬脂酸。最后的一個(gè)步驟是除臭，主要是在真空下進(jìn)行蒸氣蒸餾，它被設(shè)計(jì)用于除去那些賦予油氣味或味道的化合物。其它有價(jià)值的副產(chǎn)品，如維生素E和固醇，可以在除臭的過程中被除去。含有這些副產(chǎn)品的除臭后的餾出物可以被出售用于制造天然的維生素E和其它高價(jià)值的制藥產(chǎn)品。經(jīng)過精煉、漂白、(氫化、分餾)和除臭處理的油和脂肪可以被直接包裝并出售，或者也可以被進(jìn)一步加工成更特殊化的產(chǎn)品。
氫化是一個(gè)化學(xué)反應(yīng)，在這個(gè)反應(yīng)中在催化劑，如鎳，的幫助之下氫被加入到不飽和脂肪酸的雙鍵上。高含油酸的油含有未飽和油酸、亞油酸、以及少量的亞麻酸，它們都可以被氫化。氫化具有兩個(gè)主要的作用。首先，油的氧化穩(wěn)定性因?yàn)椴伙柡椭舅岷康慕档投岣?。再者，油的物理性質(zhì)被改變，因?yàn)橹舅岬男揎椞岣吡巳埸c(diǎn)，導(dǎo)致油在室溫下呈半液體或固體狀的脂肪。
有許多變量影響氫化反應(yīng)，而氫化反應(yīng)則改變最終產(chǎn)品的組成。壓力、溫度、催化劑類型以及濃度、激發(fā)和反應(yīng)器設(shè)計(jì)等操作條件是可以被控制的較重要的參數(shù)中的一些。可以用選擇性的氫化條件來優(yōu)選地氫化不飽和程度更高的脂肪酸，而不是不飽和程度較低的那些脂肪酸。通常采用非常輕度的或者迅速的氫化來增加液體油的穩(wěn)定性。進(jìn)一步的氫化將會(huì)把液體油轉(zhuǎn)換為物理上呈固態(tài)的脂肪。氫化的程度取決于為特定的終產(chǎn)物所設(shè)計(jì)的希望達(dá)到的性能和熔化特征。用于烘焙產(chǎn)品制造的液體的起酥油(shortenings)、用于商業(yè)性油炸和烘烤操作終的固體的脂肪和起酥油(shortenings)、以及用于人造黃油中的基本油料是通過氫化獲得的無數(shù)種可能的油之中的一些。對(duì)氫化和氫化產(chǎn)品的更為詳細(xì)的描述見于Patterson,H.B.W.,1994，脂肪和油的氫化理論和實(shí)踐(Hydrogenation of Fats and Oils:Theoryand Practice)。美國(guó)油化學(xué)家協(xié)會(huì)(The American Oil Chemists’Society)。
交換酯化指的是脂肪酰部分在一個(gè)酯和一個(gè)酸之間的交換(酸解作用)、在一個(gè)酯和一個(gè)醇之間的交換(醇解作用)、或者在一個(gè)酯和另一個(gè)酯之間的交換(轉(zhuǎn)酯作用)。交換酯化反應(yīng)是通過使用化學(xué)的或者酶學(xué)的步驟實(shí)現(xiàn)的。隨機(jī)的或者被導(dǎo)向的轉(zhuǎn)酯過程將脂肪酸重排于甘油三酯分子之上，同時(shí)不改變脂肪酸的組成。經(jīng)過修飾的甘油三酯結(jié)構(gòu)可能會(huì)導(dǎo)致一種物理性質(zhì)被改變的脂肪。人們對(duì)通過使用脂肪酶的被導(dǎo)向的交換酯化反應(yīng)來生產(chǎn)高價(jià)值的專門產(chǎn)品，如可可脂替代品，的興趣正在增加。使用交換酯化反應(yīng)進(jìn)行商業(yè)性生產(chǎn)所獲得的產(chǎn)品包括，但不局限于，起酥油(shortenings)、人造黃油、可可脂替代品以及含有中鏈脂肪酸和多聚不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)。交換酯化在Hui,Y.H.(1996,Bailey’s Industrial Oil and FatProducts，第4卷，John Wiley & Sons)中有進(jìn)一步的討論。
脂肪酸和脂肪酸甲基酯是來源于植物油的最重要的油化學(xué)品的其中兩種。脂肪酸被用于生產(chǎn)許多產(chǎn)品，包括肥皂、中鏈甘油三酯、多元醇酯、烷醇酰胺等。植物油可以被水解或分離成它們的相應(yīng)的脂肪酸和甘油。用各種不同的脂肪分離工序生產(chǎn)的脂肪酸可以粗糙地被使用或者更經(jīng)常地被通過蒸餾和分餾純化成小部分或者個(gè)體的脂肪酸。由此獲得的經(jīng)過純化的脂肪酸被轉(zhuǎn)換成各種各樣的油化學(xué)品，如二聚酸和三聚酸、二價(jià)酸、醇類、胺類、酰胺、以及酯類。脂肪酸甲基酯正在越來越多地代替脂肪酸作為許多油化學(xué)品，如脂肪醇、烷醇酰胺、a-磺酸化甲基酯、內(nèi)燃機(jī)油成分等，的起始材料。通過植物油的分離或水解來剪切甘油三酯同時(shí)也獲得了甘油。關(guān)于脂肪酸和油化學(xué)品的商業(yè)用途的進(jìn)一步的參考文獻(xiàn)可見Erickson,D.R.,1995，大豆的加工和利用實(shí)用手冊(cè)(PracticalHandbook of Soybean Processing and Utilization)，美國(guó)油化學(xué)家協(xié)會(huì)(The American Oil Chemists’Society)，以及UnitedSoybean Board；Pryde,E.H.,1979，脂肪酸(Fatty Acids)，美國(guó)油化學(xué)家協(xié)會(huì)(The American Oil Chemists’Society)；以及Hui,Y.H.,1996,Bailey’s Industrial Oil Fat Products，第4卷，John Wiley & Sons。
如上面所討論的，本發(fā)明包括一種轉(zhuǎn)基因玉米，它能夠生產(chǎn)其油酸的含量不少于總的油含量的大約60％的籽粒。高含油酸鹽的性狀是顯性的。因此，只要親本品種中的其中之一在種子或籽粒的生產(chǎn)流程圖(production scheme)中含有該性狀基因，就可以獲得所需的表現(xiàn)型。商業(yè)性地生產(chǎn)油酸水平提高的玉米的時(shí)間線(timeline)可以被大大地加速。
另外，轉(zhuǎn)基因的高含飽和性狀是顯性的。因此，只要親本品種中的其中之一在種子或籽粒的生產(chǎn)流程圖中含有該性狀基因，就可以獲得所需的表現(xiàn)型。商業(yè)性地生產(chǎn)油酸水平提高的玉米的時(shí)間線可以被大大地加速。在本發(fā)明中所述的DNA序列信息可以被用于從玉米中分離編碼δ-9和δ-12去飽和酶的cDNA和基因。使用依賴于序列的協(xié)議來分離同源基因在本工藝中是眾所周知的。依賴于序列的協(xié)議的例子包括，但不局限于，核酸雜交法、以及DNA和RNA擴(kuò)增法，如核酸擴(kuò)增技術(shù)的各種不同的應(yīng)用(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))所例示的。
例如，編碼去飽和酶的基因(可以是cDNA或者是基因組DNA)可以通過使用示例的核酸序列的全部或者一部分來創(chuàng)造DNA雜交探針，通過使用本工藝熟練人員眾所周知的方法學(xué)用這些探針來篩選文庫(kù)這樣來直接分離?；谑纠怂嵝蛄械奶囟ǖ墓押塑账崴崽结樋梢杂帽竟に嚬姆椒?Sambrook)來設(shè)計(jì)和合成。另外，可以通過熟練的技術(shù)人員所公知的方法，如隨機(jī)引物DNA標(biāo)記法、缺口平移法、或者末端標(biāo)記技術(shù)、或者RNA探針，使用可供的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，用全部的序列來直接合成DNA探針。另外，可以設(shè)計(jì)并使用特定的引物來擴(kuò)增示例序列的一部分或者全部。由此獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可以在擴(kuò)增的過程中被直接標(biāo)記或者在擴(kuò)增反應(yīng)之后被標(biāo)記，并且被用作探針在合適強(qiáng)度的條件下分離全長(zhǎng)cDNA或者基因組片段。對(duì)于本工藝的熟練人員同樣也是眾所周知的還有，可以用各種不同的體外突變協(xié)議來制造次要的變更(替換、添加或者刪除)。這樣就可以容易地獲得本發(fā)明的任何一種核酸片段。
實(shí)施例本發(fā)明在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步被定義，在這些實(shí)施例中，所有的部分和百分比都是以重量計(jì)算的，溫度則以攝氏度來表示，除非另有說明。從以上的討論和這些實(shí)施例，本工藝的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不背離本發(fā)明的精神和范圍的基礎(chǔ)上，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種不同的變化和修飾以使其適應(yīng)各種不同的用途和條件。
實(shí)施例1玉米fad2-2 cDNA以及基因組DNA克隆用一個(gè)放射同位素標(biāo)記的DNA片段對(duì)一個(gè)玉米胚的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，上述的DNA片段是通過PCR獲得的，含有編碼玉米δ-12去飽和酶的基因(″fad2-1″,WO94/11516，見序列編號(hào)1)。根據(jù)序列鑒定了另一個(gè)δ-12去飽和酶cDNA克隆。將第二個(gè)編碼δ-12去飽和酶的基因指定為fad2-2。
在序列編號(hào)2中顯示了全長(zhǎng)的cDNA序列。它編碼一個(gè)392氨基酸的多肽(其翻譯框?yàn)楹塑账?76-1351)。玉米fad2-2的編碼區(qū)與fad2-1在序列上具有顯著的一致性它們?cè)诎被崴缴弦恢滦詾?8％，在核苷酸水平上一致性為92％。它們?cè)?’端未翻譯區(qū)域具有77％的一致性，在3’端一致性為64％。
由于fad2-1和fad2-2基因在編碼區(qū)具有顯著的同源性，所以上述的任一基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)或者其中一部分，以反義或者有義的方法，都可以被用于對(duì)fad2-1以及fad2-2基因或者基因產(chǎn)物進(jìn)行抑制，由此在轉(zhuǎn)基因玉米中產(chǎn)生一個(gè)高含油酸鹽的表現(xiàn)型。
在對(duì)一個(gè)玉米的基因組DNA文庫(kù)(Mo17株系，于λFixⅡ載體中，Stratagene,La Jolla,CA)進(jìn)行篩選的過程中，使用玉米fad2-1cDNA插入序列作為探針，鑒定出一個(gè)基因組克隆，該克隆含有一個(gè)含有fad2-2基因的的13kb的插入序列。位于編碼區(qū)上游的序列示于序列編號(hào)4中，它含有上游調(diào)控元件、5’端未翻譯區(qū)域、以及位于5’未翻譯區(qū)域內(nèi)的一個(gè)6.7kb的內(nèi)含子(核苷酸第5651-12301位)。內(nèi)含子剪切位點(diǎn)(/GT-AG/)是保守的。內(nèi)含子兩側(cè)的5’端引導(dǎo)序列(核苷酸第5492-5650位以及第12302-12313位)與fad2-2 cDNA的5’端未翻譯區(qū)域相匹配。推定的TATA盒(TAAATA)位于第5439-5444位，它位于fad2-2 cDNA克隆的第一個(gè)核苷酸的上游的47個(gè)核苷酸處。這一基因的啟動(dòng)子元件可以被用于在轉(zhuǎn)基因玉米植物中表達(dá)感興趣的基因。
實(shí)施例2玉米fad2-1內(nèi)含子根據(jù)fad2-2內(nèi)含子的序列(序列編號(hào)4)，設(shè)計(jì)引物(序列編號(hào)54及55)，用于通過PCR從玉米的基因組DNA擴(kuò)增一個(gè)fad2-2片段，以供fad2-2位點(diǎn)圖譜的制作。
序列編號(hào)54 5’-CTGCACTGAAAGTTTTGGCA-3’序列編號(hào)55 5’-AGTACAGCGGCCAGGCGGCGTAGCG-3’在PCR中，除了預(yù)料的由fad2-2序列的擴(kuò)增所獲得的0.8kb的片段以外，還產(chǎn)生了另一個(gè)長(zhǎng)度為1.1kb的片段。將這一1.1kb的片段純化、測(cè)序，確定這一片段含有fad2-1內(nèi)含子的一部分。根據(jù)這一1.1kb的部分內(nèi)含子的序列以及fad2-15’端未翻譯區(qū)域設(shè)計(jì)了一套新的引物(序列編號(hào)56和57)。
序列編號(hào)56:5’-AAGGGGAGAGAGAGGTGAGG-3’序列編號(hào)57:5’-TGCAT’TGAAGGTGGTGGTAA-3’用新的這套引物和玉米基因組DNA作為模板，獲得了一個(gè)含有fad2-1內(nèi)含子的另外一半的PCR產(chǎn)物。將該片段純化并測(cè)序。使用一個(gè)與1.1kb片段重疊的序列組裝了一個(gè)含有完整的fad2-1內(nèi)含子的contig(？)。該contig示于序列編號(hào)5中。
對(duì)玉米fad2-1和fad2-2基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的位置是保守的。兩個(gè)內(nèi)含子都位于前導(dǎo)RNA的5’引導(dǎo)區(qū)域。fad2-1內(nèi)含子位于起始密碼(ATG)的上游11個(gè)堿基處，而fad2-2內(nèi)含子位于起始密碼的上游27個(gè)堿基處。在兩個(gè)內(nèi)含子中，內(nèi)含子剪切位點(diǎn)(/GT---AG/)的共有序列是保守的。
使用BestFit程序(Genetics Computer Group,Madison,WI；使用了Smith和Watemian的算法(1981)Advances in AppliedMathematics 2:482-489)對(duì)fad2-1和fad2-2內(nèi)含子進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在開始的0.76kb(fad2-1內(nèi)含子[序列編號(hào)5]中的第3-765位核苷酸，以及fad2-2內(nèi)含子[如序列編號(hào)4中所示]中的第5650-6790位核苷酸)中存在81％的序列一致性，在接近內(nèi)含子末端的位置(fad2-1內(nèi)含子[序列編號(hào)5]中的第2619-2893位核苷酸，以及fad2-2內(nèi)含子[序列編號(hào)4]中的第12006-12320位核苷酸)中存在73％的同源性。內(nèi)含子內(nèi)部的序列并不保守。
迄今已經(jīng)被研究的植物內(nèi)含子極少數(shù)長(zhǎng)度大于2-3kb(Simpson和Filipowicz(1996)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)32:1-41)。進(jìn)一步的調(diào)查顯示fad2-2內(nèi)含子不尋常的大尺寸是因?yàn)樵谄渲胁迦肓艘粋€(gè)回復(fù)可轉(zhuǎn)移(retrotransposable)元件，即Milt，的顯然原封不變的拷貝(大約4.8kb)(SanMiguel等(1996)科學(xué)(Science)274:765-768)。這一回復(fù)元件插入的取向與fad2-2基因的轉(zhuǎn)錄方向是相反的。fad2-1內(nèi)含子并不含有這一元件。
實(shí)施例3玉米δ-9去飽和酶cDNA的克隆和測(cè)序根據(jù)不同種屬的δ-9去飽和酶基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并性引物并將其用于PCR中。這些引物描述于序列編號(hào)6和7中。
5’-GAYATGATHACNGARGAR-3’序列編號(hào)65’-CCRTCRTACATNAGATG-3’序列編號(hào)7將這些寡聚體用作引物，將來源于玉米胚cDNA文庫(kù)的DNA用作模板，產(chǎn)生了兩個(gè)PCR片段(分別為520和500bp)。將這些片段純化并用作探針對(duì)玉米胚cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。分離到兩個(gè)獨(dú)立的克隆(pCD520和pCD500)。
將這兩個(gè)克隆測(cè)序，讓它們相互之間進(jìn)行交叉雜交并讓它們分別與大豆δ-9去飽和酶基因進(jìn)行交叉雜交。結(jié)果證實(shí)只有pCD520的插入序列與大豆δ-9去飽和酶基因是同源的。上述的cDNA序列示于序列編號(hào)8中。核苷酸1-133位是5’端的非翻譯引導(dǎo)序列。編碼序列開始于第134位(ATG)，而終止密碼子(TAA)位于1309-1312，它編碼了一個(gè)如序列編號(hào)9中所示的392個(gè)氨基酸的多肽。3’端未翻譯區(qū)域(1309-1714)有396個(gè)核苷酸，包括從第1661位核苷酸開始的poly(A)尾巴。在這一區(qū)域沒有明顯的多聚腺苷酸化信號(hào)，但是位于poly(A)尾巴上游31個(gè)堿基處的一個(gè)富含AT的區(qū)域(1621-1630)可能是個(gè)例外。
使用BLAST程序和算法(Altschul,S.F.等(1990)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215:403-410以及Altschul,S.F.等(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)作為查詢工具將pCD520(序列編號(hào)8)中的cDNA插入序列用作一個(gè)詢問序列，查詢一個(gè)DuPont EST數(shù)據(jù)庫(kù)。用這種方法鑒定出一個(gè)EST，這一EST所來源的那個(gè)cDNA克隆的完整的序列示于序列編號(hào)10中。5’端非翻譯引導(dǎo)序列位于核苷酸第1-101位，編碼序列開始于第102位，在第1278-1280位以一個(gè)終止密碼子(TAA)結(jié)束。這一序列同時(shí)還編碼一個(gè)392個(gè)氨基酸的多肽，該多肽的序列示于序列編號(hào)11中。第二個(gè)玉米δ-9去飽和酶基因的編碼區(qū)域與示于序列編號(hào)8中的存在顯著的同源性。這兩個(gè)序列在核苷酸水平的一致性為63％，相似性為83％，在氨基酸水平一致性為77％。序列編號(hào)10的3’端非翻譯區(qū)有429個(gè)核苷酸，包括從第1626位核苷酸開始的poly(A)尾巴。一個(gè)推定的多聚腺苷酸化信號(hào)(AATAA)位于第1588-1594位核苷酸。
買施例4δ-9去飽和酶和δ-12去飽和酶的空間及發(fā)育調(diào)控進(jìn)行RNA印跡分析以調(diào)查參與玉米胚脂質(zhì)生物合成的基因的空間和發(fā)育調(diào)控。從葉片、葉鞘、穗、根、以及在授粉15、20、25、以及30天后(day after pollination,DAP)從發(fā)育中的種仁剪切下來的未成熟的胚純化總RNA部分。制備RNA印跡并分別與用32P標(biāo)記的玉米fad2-1(序列編號(hào)1)、δ-9去飽和酶(序列編號(hào)8)、油質(zhì)蛋白16kDa(Vance和Huang1987)、以及球蛋白1(Belanger和Kriz,1989,植物生理學(xué)(Plant Physiol.)91:636-643)的探針雜交。探針是用經(jīng)過如下純化的基因特異的片段制備的。
使用fad2-1的序列(序列編號(hào)1)，設(shè)計(jì)與其3’端雜交的引物(序列編號(hào)12和13)，并將這些引物用于用fad2-1的cDNA為模板的PCR中。
5’-AGGACGCTACCGTAGGAA-3’序列編號(hào)125’-GCGATGGCACTGCAGTA-3’序列編號(hào)13將一個(gè)預(yù)期的0.16kb的PCR片段用凝膠進(jìn)行純化，并將其用作fad2-1特異的探針。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶解一個(gè)含有δ-9去飽和酶(序列編號(hào)8)的cDNA克隆并將一個(gè)含有整個(gè)cDNA插入序列的1.7kb的片段純化用作δ-9去飽和酶基因的探針。
油質(zhì)蛋白16kDa特異的探針是一個(gè)從一個(gè)PCR中純化的0.25kb的片段，在這個(gè)PCR中，使用玉米胚的cDNA文庫(kù)作為模板并使用與油質(zhì)蛋白16kDa基因的3’端未翻譯區(qū)域雜交的引物(序列編號(hào)14和15)。
5’-CTTGAGAGAAGAACCACACTC-3’序列編號(hào)145’-CTAGACATATCGAGCATGCTG-3’序列編號(hào)15用Xho1和Pst1酶解含有球蛋白1基因的玉米基因組克隆。純化一個(gè)含有外顯子4/內(nèi)含子5/外顯子5一部分的0.77kb的片段并將其用作球蛋白1特異的探針。
RNA印跡分析總結(jié)于圖1中。兩個(gè)脂質(zhì)生物合成基因(δ-9和δ-12去飽和酶)在所有被檢查的組織/器官中都有表達(dá)，只是水平各異。去飽和酶的表達(dá)在胚中似乎是被協(xié)同地調(diào)控的，但是它們?cè)诳臻g上有不同水平的表達(dá)。在授粉15天后的胚中，與fad2-1 cDNA同源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最豐富并隨著成熟的進(jìn)程減少。在δ-9去飽和酶基因中也檢測(cè)到同樣的發(fā)育表達(dá)特征。在葉片和穗中fad2-1都有高水平的表達(dá)，在根中的表達(dá)較少，在葉鞘中的表達(dá)少，但可以檢測(cè)到。在所檢查的這四種組織中，δ-9去飽和酶基因的表達(dá)水平都較低。
為了減量調(diào)節(jié)編碼δ-9去飽和酶或者微粒體δ-12去飽和酶的基因，一種其表達(dá)比目的基因更早，或者至少與目的基因相匹配的種子特異的啟動(dòng)子是非常合乎需求的。具體地，一種具有胚/糊粉特異性的啟動(dòng)子是合乎需求的，因?yàn)樗鼈兪琴A存油的組織。當(dāng)要在發(fā)育中的玉米胚中過量表達(dá)一種性狀基因時(shí)，同種啟動(dòng)子也是同樣合適的。因此，有兩種已知的玉米基因可以充當(dāng)啟動(dòng)子序列的良好來源的，即球蛋白-1(Belanger和Kriz,1989，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，91:636-643)以及油質(zhì)蛋白16kDa(Vance和Huang,1987，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262:11275-11279)。這兩種基因的表達(dá)特征也通過RNA印跡分析來確定。
球蛋白1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定態(tài)水平在授粉20天后開始積累并在一個(gè)相對(duì)較晚的發(fā)育階段(授粉后30天)達(dá)到最高水平。雖然油質(zhì)蛋白16kDa基因和球蛋白-1在空間上都是被嚴(yán)格地調(diào)控的并只有在種子中表達(dá)(Belanger和Kriz,1989，植物生理學(xué)(Plant Physiol.),91:636-643；Vance和Huang,1988，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)，163；1476-1481)，但是在所檢查的所有發(fā)育階段(授粉后15-30天)的胚樣品中，油質(zhì)蛋白16kDa的表達(dá)水平更大程度上是由強(qiáng)的雜交信號(hào)來決定的。油質(zhì)蛋白16kDa表達(dá)的時(shí)間比球蛋白-1基因的表達(dá)也早很多。免疫熒光顯微術(shù)顯示油質(zhì)蛋白16kDa蛋白被限制于發(fā)育中種子的胚和糊粉層中(Vance和Huang,1988，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)163:1476-1481)。因此，可以得出結(jié)論認(rèn)為油質(zhì)蛋白16kDa啟動(dòng)子將比球蛋白-1啟動(dòng)子更適合于驅(qū)動(dòng)性狀基因在玉米胚中得過量表達(dá)，而且其表達(dá)的時(shí)間也最適合于減量調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)生物合成途徑的基因。
實(shí)施例5玉米胚和糊粉特異的啟動(dòng)子的分離和測(cè)序?qū)⒂唾|(zhì)蛋白16kDa的基因表達(dá)特征與脂質(zhì)生物合成基因和球蛋白-1的進(jìn)行了比較，如圖1中所示。所得結(jié)論是油質(zhì)蛋白16kDa是一個(gè)可以從中分離出一個(gè)胚/糊粉特異的啟動(dòng)子序列的非常好的來源。
玉米油質(zhì)蛋白蛋白含有三個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域位于N-端的一個(gè)非常親水的結(jié)構(gòu)域；位于中心的一個(gè)疏水的發(fā)夾式α-螺旋結(jié)構(gòu)域；以及位于C-端的一個(gè)兩性的α-螺旋結(jié)構(gòu)域。然而，油質(zhì)蛋白18kDa和16kDa氨基酸和核苷酸序列僅在中心結(jié)構(gòu)域存在高度的相似性(Qu和Huang,1990，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)265:2238-2243)。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的油質(zhì)蛋白18kDa的序列(GenBank訪問號(hào)#J05212)設(shè)計(jì)了兩條引物(序列編號(hào)16和17)。
5’-AGGCGCTGACGGTGGCGACGCT-3’序列編號(hào)165’-GTGTTGGCGAGGCACGTGAG-3’序列編號(hào)17這兩條引物與油質(zhì)蛋白18kDa的cDNA序列的中心結(jié)構(gòu)域雜交。采用反轉(zhuǎn)錄-PCR(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)方法，用從發(fā)育中的玉米胚純化的總RNA以及上述的一對(duì)引物產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特的0.23kb的片段。片段經(jīng)凝膠純化后用32P標(biāo)記用作探針對(duì)玉米基因組文庫(kù)(Missouri 17株系，于λFixⅡ載體中，Stratagene)進(jìn)行篩選。鑒定出陽(yáng)性的基因組克隆并通過三輪的純化回收這些克隆。
合成一個(gè)油質(zhì)蛋白16 kDa特異的寡聚體(″3221-ATG″，序列編號(hào)18)。
5’-ACCTCCCGTCGCACCCCGGTGGTGATCAGCCATGGTAGGCTAGCAG-3’序列編號(hào)18這一寡核苷酸酸含有一個(gè)與位于油質(zhì)蛋白16kDa基因的翻譯起始密碼子側(cè)翼的序列互補(bǔ)的序列。具體地，這一寡核苷酸酸與起始于翻譯起始位點(diǎn)ATG上游12個(gè)核苷酸處并延伸另外33個(gè)核苷酸進(jìn)入編碼區(qū)域的區(qū)域互補(bǔ)。用[γ-32P]ATP和T4多聚核苷酸酸激酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)對(duì)這一寡聚體進(jìn)行32P標(biāo)記并用其篩選上述的陽(yáng)性基因組克隆。其中有一個(gè)含有一個(gè)15kb的插入序列的克隆，X3221，被鑒定出與寡聚體探針有強(qiáng)烈的雜交。從克隆X3221純化出DNA，用各種不同的限制性酶進(jìn)行酶解，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后印跡到一個(gè)Zeta-探針尼龍膜(Stratagene)上。將同樣的經(jīng)過32P標(biāo)記的寡聚體(3221-ATG)用作X3221限制性DNA印跡的探針以鑒定含有上游序列的片段。根據(jù)不同限制性酶解的雜交信號(hào)模式以及油質(zhì)蛋白16kDa的cDNA序列，將λ3221 DNA如下進(jìn)行亞克隆。將λ3221的DNA用XhoⅠ和XbaⅠ酶解并克隆到預(yù)先用同種酶酶切的pBluescript載體(pSK(-),Stratagene)上。通過將轉(zhuǎn)化子與32P標(biāo)記的3221-ATG寡聚體雜交來對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。分離陽(yáng)性的克隆。通過測(cè)序確證了其中的一個(gè)克隆(pBN 164)含有上游的元件、5’端引導(dǎo)序列、以及油質(zhì)蛋白16kDa基因的編碼區(qū)的N-端部分。
在pBN 164中的油質(zhì)蛋白16kDa基因的上游區(qū)域的1.7kb序列示于序列編號(hào)19中。根據(jù)引物延伸數(shù)據(jù)鑒定出轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)位于核苷酸第1609位。這位于ATG轉(zhuǎn)錄起始密碼子的上游92堿基對(duì)處。推定的TATA盒(TATAAA)位于第1565-1571位，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游37-43堿基對(duì)處。在第1420-1426位鑒定出另一個(gè)富含TA的盒。這兩個(gè)富含TA的盒都位于一個(gè)對(duì)于上游元件而言罕有地富含GC的區(qū)域。5’端非翻譯引導(dǎo)序列同樣也富含GC。從第1 326位到第1700位GC的含量為67％，而從第1位到第1325位GC的含量?jī)H為38％。用從玉米株系LH192(Holdens Foundation Seeds,IA)純化的基因組DNA與油質(zhì)蛋白16kda-特異的探針雜交進(jìn)行DNA印跡分析，結(jié)果顯示玉米油質(zhì)蛋白16kda是由一個(gè)或兩個(gè)基因編碼的。
實(shí)施例6Oleosin 16kDa啟動(dòng)子刪除化驗(yàn)用一個(gè)瞬時(shí)表達(dá)化驗(yàn)分析了來源于油質(zhì)蛋白16kda以及球蛋白-1的啟動(dòng)子的相對(duì)活性。用花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子作為陽(yáng)性對(duì)照。瞬時(shí)表達(dá)盒使用一個(gè)β-葡萄糖醛酸甙酶(GUS)作為報(bào)告基因，與胭脂堿合酶基因(NOS)的3’端融合以提供一個(gè)多聚腺苷酸化信號(hào)。推定的油質(zhì)蛋白16kda啟動(dòng)子片段含有油質(zhì)蛋白16kda基因上游片段的全長(zhǎng)(1.7kb，序列編號(hào)19)。球蛋白-1啟動(dòng)子含有球蛋白-1基因的一個(gè)1.1kb的上游片段。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的步驟(Wizard MiniprepKit,Promega,Madison,WI)制備質(zhì)粒DNA，將其涂覆于金微粒上，然后轟擊到從授粉后18-19天的玉米穗軸剪切下來的未成熟玉米胚中。在每一個(gè)平板上放置9個(gè)胚，每個(gè)試驗(yàn)的構(gòu)建物轟擊3個(gè)平板。轟擊之后，在37℃下將胚保溫于一種含有X-Gluc(Jefferson,1989,自然(Nature)342:837-838)的底物溶液中12小時(shí)，生長(zhǎng)出來的蘭色的焦點(diǎn)顯示了GUS基因的表達(dá)，用顯微鏡記數(shù)這些焦點(diǎn)。結(jié)果顯示油質(zhì)蛋白16kda基因的全長(zhǎng)上游片段只提供了最小限度的啟動(dòng)子活性，這表明在這一區(qū)域中可能存在一個(gè)消極的調(diào)控元件。
設(shè)計(jì)了許多不同長(zhǎng)度的油質(zhì)蛋白16kda啟動(dòng)子以除去潛在的消極調(diào)控元件，并確定具有高的活性而又不喪失組織特異性的最佳長(zhǎng)度。通過PCR或者限制性酶解使這一上游序列的5’端或3’端累進(jìn)地刪除。
在PCR中所用的引物、由此獲得的推定的啟動(dòng)子片段、以及它們?cè)谛蛄芯幪?hào)19中相應(yīng)的核苷酸位置，都示于表1中。如下所述，將玉米皺縮1基因的外顯子1/內(nèi)含子1片段(核苷酸位置1138-2220，GenBank訪問號(hào)X02382)克隆到5’端未翻譯區(qū)域以進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)盒。
表1．來源于油質(zhì)蛋白16kDa基因的推定的啟動(dòng)子片段啟動(dòng)子片段 PCRa中所使核苷酸的位置 5’端非翻譯(kb) 用的引物(于序列編號(hào)中) 序列f168(1.7)b-1-1700 天然的油質(zhì)蛋白16kDa 5’端引導(dǎo)序列f184(1.7)au:I,d:J 1-1700 Sh1f222(1.1)u:A,d:E512-1619 Sh1f220(0.9)u:B,d:E749-1619 Sh1f218(0.55) u:C,d:E1075-1619Sh1f236(0.4)b- 1254-1700 天然的油質(zhì)蛋白16kDa 5’端引導(dǎo)序列f254(0.95) u:B,d:H749-1700 天然的油質(zhì)蛋白16kDa 5’端引導(dǎo)序列f235(1.4)u:D,d:F 99-1501 Sh1f231(1.0)u:A,d:F512-1501 Sh1f232(0.75) u:B,d:F749-1501 Sh1f233(0.4)u:C,d:F 1075-1501 Sh1f227(1.2)u:D,d:G 99-1346 Sh1f228(0.8)u:A,d:G 512-1346Sh1f229(0.6)u:B,d:G 749-1346Sh1f230(0.3)u:C,d:G 1075-1346 Sh1a．用pBN164質(zhì)粒DNA作為模板，使用如表中所指定的上游(u)和下游(d)引物進(jìn)行PCR，例外的是，在f184中使用pBN168作為模板。在絕大多數(shù)的引物中都構(gòu)建了限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線)以便利克隆。A:5’-CTTATGTAATAGAAAAGACAGGATCCATATGG-3’(序列編號(hào)20)B:5’-GAGGAGTGAGGATCCTGATTGACTATCTCATTC-3’(序列編號(hào)21)C:5’-TCTGGACACCCTACCATTGGATCCTCTTCGGAG-3’(序列編號(hào)22)D:5’-AGAGTTGGATCCGTGTACAACTTGGTCTCTGG-3’(序列編號(hào)23)E:5’-GCCGCTGATGCTCGAGCTACGACTACGAGTGAGGTAG-3’(序列編號(hào)24)F:5’-ATGCGGGACTCGAGTCGGGGGCAGCGCGACAC-3’(序列編號(hào)25)G:5’-GTGGCGGGGCCGAATCTCGAGTGGGCCGTAGT-3’(序列編號(hào)26)H:5’-GCCACGTGCCATGGTAGGCTAGCAGAGCGAGCT-31(序列編號(hào)27)I:5’-AACACACACCCATGGATATCACAG-3’(序列編號(hào)28)J:5’-GGTCTGACTTACGGGTGTC-3’(序列編號(hào)29)b．片段f168是通過用XbaⅠ和NcoⅠ酶切pBN164質(zhì)粒DNA獲得的。這一片段含有pBN164上游區(qū)域的全長(zhǎng)(在油質(zhì)蛋白16kda基因的翻譯起始密碼子的位置中天然存在著一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn))片段f236存在于pBN236中。pBN236是通過用SpeⅠ和XbaⅠ酶切pBN168，用Klenow酶將其末端整平，然后再重新連接獲得的。
c．轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)是序列編號(hào)19中的第1609位核苷酸。因此，5’端的引導(dǎo)序列被認(rèn)為是從1609-1700位開始的。
d．Sh1包含有玉米皺縮1基因的外顯子1/內(nèi)含子1的序列(第1138-2220位核苷酸，GenBank訪問號(hào)#X02382)。
制造了三個(gè)中間表達(dá)構(gòu)建物pML63、pSH12、以及pSM100。pML63(圖2A)來源于商業(yè)可供的載體pGEM-9Zf(-)(Promega)，在其中含有一個(gè)含有35S啟動(dòng)子、GUS編碼區(qū)、以及一個(gè)NOS區(qū)的插入序列。質(zhì)粒pSH12含有玉米皺縮1基因的一個(gè)外顯子1/內(nèi)含子1片段(Sh1)，它插入于35S啟動(dòng)子和pML63的GUS編碼區(qū)之間。Sh1片段(第1139-2230位核苷酸，GenBank訪問號(hào)#X02382)是用PCR方法獲得的。合成了一對(duì)引物(序列編號(hào)30和31)。上游引物(序列編號(hào)30)含有一個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)(加下劃線)，下游引物(序列編號(hào)31)含有一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn)(加下劃線)。這些來源于已經(jīng)發(fā)表的玉米蔗糖合酶基因(X02382,GenBank)的序列被用于PCR中，這一PCR用一個(gè)玉米基因組文庫(kù)(Missouri 17株系，于λFixⅡ載體中，Stratagene)作為模板。
5’-CTCTCCCGTCCTCGAGAAACCCTCC-3’序列編號(hào)305’-CTTGGCAGCCATGGCTCGATGGTTC-3’序列編號(hào)31將所獲得的1.1kb片段用凝膠純化，用XhoⅠ和NcoⅠ酶進(jìn)行酶解，并插入到pML63的XhoⅠ和NcoⅠ位點(diǎn)使其變成pSH12(圖2B)。
質(zhì)粒pSM100含有一個(gè)球蛋白啟動(dòng)子、5’端的未翻譯區(qū)、GUS基因、以及一個(gè)NOS 3’端(圖2C)。球蛋白啟動(dòng)子來源于一個(gè)從玉米基因組文庫(kù)(在EMBL3構(gòu)建的，Clontech,Palo Alto,CA)分離的基因組克隆，在篩選的過程中使用末端標(biāo)記寡聚體(序列編號(hào)32和33)作為探針。寡聚體的序列是以球蛋白-1的cDNA序列(訪問號(hào)M24845,GenBank)為基礎(chǔ)的。
5’-ATGGTGAGCGCCAGAATCGTTGTCCTCCTC-3’序列編號(hào)325’-CATCCTGGCGGTCACCATCCTCAGGAGCGT-3’序列編號(hào)33一個(gè)含有一個(gè)10kb的、與兩個(gè)寡聚體探針都產(chǎn)生雜交的插入序列的陽(yáng)性克隆被確證含有球蛋白-1基因。從使用10kb克隆作為模板的PCR中獲得一個(gè)位于起始密碼子5’端的0.45kb的片段。用于擴(kuò)增0.45kb片段的引物示于序列編號(hào)34和35中。上游引物(序列編號(hào)34)含有一個(gè)EcoRⅠ酶的位點(diǎn)(加下劃線)，下游引物含有一個(gè)NcoⅠ酶的位點(diǎn)(加下劃線)。
5’-ATAGGGAATTCTCTGTTTTTCTAAAAAAAA-3’序列編號(hào)345’-GCTCACCATGGTGTAGTGTCTGTCACTGTG-3’序列編號(hào)35將片段純化并用EcoRⅠ和NcoⅠ酶切，然后插入到一個(gè)含有克隆用的相當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)的載體中。從10kb克隆中緊位于0.45kb區(qū)域上游的位置剪切出一個(gè)0.66kb的Hind Ⅲ-EcoRⅠ片段，并將其連接于0.45kb片段的上游，形成一個(gè)最終的1.1kb的啟動(dòng)子-1啟動(dòng)子片段。將這一克隆和球蛋白啟動(dòng)子特異的引物(序列編號(hào)36和37)一起用于PCR中。上游引物(序列編號(hào)36)含有一個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)(加下劃線)，上游引物(序列編號(hào)37)含有一個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)(加下劃線)。
5’-GGGGGATCCAAGCTTGAGGAGACAGGAGATAAAAGT-3’序列編號(hào)365’-GGGCTGCAGCTCGAGGGTGTAGTGTCTGTCACTGTGATA-3’序列編號(hào)37將由此獲得的1.1kb的PCR片段純化，用BamHⅠ和XhoⅠ酶解，然后再插入到pSh12的BamHⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)中以替代35S啟動(dòng)子。將如此獲得的質(zhì)粒指定為pSm100(圖2C)。
將所有的推定的油質(zhì)蛋白16kda啟動(dòng)子片段(列于表1中)用凝膠純化，然后再克隆到表達(dá)載體中。將f168片段插入到pML63的XbaⅠ和NcoⅠ位點(diǎn)中(以替代構(gòu)建物中原來的35S啟動(dòng)子)，將新的構(gòu)建物命名為pBN168。
將如表1中所述的經(jīng)過純化PCR片段用相應(yīng)的被設(shè)計(jì)于引物中的限制性酶(對(duì)于f222、f220、f218、f235、f231、f232、f233、f227、f228、f229、以及f230，使用BamHⅠ和XhoⅠ)進(jìn)行酶解，然后再插入到事先也用同樣的酶酶解的表達(dá)載體(pSM100)中以替代球蛋白-1啟動(dòng)子。片段f184用NcoⅠ酶切并插入到N168的NcoⅠ位點(diǎn)上。如此獲得的構(gòu)建物，pBN184，含有天然的油質(zhì)蛋白16kda 5’端引導(dǎo)序列，而且在5’未翻譯區(qū)域含有Sh1元件。片段f254用BamHⅠ和NcoⅠ酶切并插入到pML63的BamHⅠ/NcoⅠ位點(diǎn)。
在表1和2中列出了不同的引物和這些構(gòu)建物中所含的不同的5’端未翻譯片段。這些啟動(dòng)子(來源于全長(zhǎng)1.7kb啟動(dòng)子，不包括那些在克隆的過程中導(dǎo)入的限制性位點(diǎn))的序列都在以下的序列清單中列出。序列編號(hào)38是1.1kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)39是0.9kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)40是0.55kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)41是0.95kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)42是1.4kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)43是1.0kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)44是0.75kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)45是0.4kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)46是1.3kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)47是0.8kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)48是0.6kb的啟動(dòng)子片段，序列編號(hào)38是1.1kb的啟動(dòng)子片段，以及序列編號(hào)49是0.3kb的啟動(dòng)子片段。
將來源于這些構(gòu)建物的經(jīng)過純化的DNA用于如上所述的瞬時(shí)表達(dá)化驗(yàn)中。顯示啟動(dòng)子活性的GUS染色化驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表2中。
表2．Oleosin 16kDa啟動(dòng)子刪除化驗(yàn)質(zhì)粒 構(gòu)建物啟動(dòng)子活性aPBN168pOle-1.7kb5’::GUS::Nos3’+/-PBN184pOle-1.7kb5’::Sh::GUS::Nos3’-PBN222pOle-1.1kb5’::Sh::GUS--Nos3’+++pBN’220 POle-0.9kb5’::Sh::GUS::Nos3’+++++PBN218POle-0.55kb5’,::Sh::GUS::Nos3’，++++PBN254POle-0.95kb5’::GUS::Nos3’ +PBN216POle-0.4kb5’::GUS::Nos3’+/-PBN235POle-1.4kb5’’::Sh::GUS::Nos3’ ++PBN231POle-1.0kb5’’::Sh::GUS::Nos3’ ++PBN232POle-0.75kb5’’:Sh::GUS::Nos3’ ++PBN233POle-0.4kb5’’-:Sh::GUS::Nos3’ ++PBN227POle-1.3kb5”’::Sh::GUS::Nos3’ +PBN228POle-0.8kb5”’::Sh::GUS::Nos3’ +PBN229POle-0.6kb5”’::Sh::GUS::Nos3’ +PBN230POle-0.3kb5”’::Sh::GUS::Nos3’ +PSM100Pglo-1.1kb5’::Sh::GUS::Nos3’++a．啟動(dòng)子的活性是通過報(bào)告基因，GUS，的瞬時(shí)表達(dá)化驗(yàn)來測(cè)定的。根據(jù)對(duì)蘭色轉(zhuǎn)化灶的強(qiáng)度和數(shù)量的目測(cè)來指定+:-:0,+/-:0-1；+:2-10；++:10-50；+++:50-100；++++:50-100，但是其蘭色比+++的顯著加深；+++++:＞150個(gè)蘭色轉(zhuǎn)化灶。
全長(zhǎng)啟動(dòng)子(如于pBN 168和pBN 184中所含的)，不管是否與Sh1內(nèi)含子元件連接，在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中賦予不能檢測(cè)的或者是最低限度的啟動(dòng)子活性。當(dāng)將這一區(qū)域的遠(yuǎn)上游端漸進(jìn)地刪除時(shí)，啟動(dòng)子的活性增強(qiáng)。看起來在遠(yuǎn)上游區(qū)域(1-511)好象存在一個(gè)消極的調(diào)控元件。這一區(qū)域的刪除，如在pBN222中，顯著地增加了GUS的表達(dá)(與化驗(yàn)中pBN184的活性作比較)。刪除更多的序列，直到到達(dá)核苷酸第748位，進(jìn)一步增強(qiáng)了啟動(dòng)子的活性，如在構(gòu)建物pBN220中所示。然而，如果上游序列被刪除到第748位以后，啟動(dòng)子的活性就會(huì)降低(PBN218對(duì)比pBN220)。
TATA盒(1566-1571)的包括對(duì)獲得高的啟動(dòng)子活性是重要的。然而，上游的富含TATA的元件(1420-1436)可以取代TATA盒(1566-1571)，雖然其活性顯著下降。從這些數(shù)據(jù)來看，包圍著TATA盒的富含GC的區(qū)域(1326-1700)的功能并不明顯。當(dāng)將整個(gè)富含GC的區(qū)域，包括兩個(gè)TATA盒，都刪除時(shí)，仍然能夠檢測(cè)到最低限度的啟動(dòng)子活性。
在優(yōu)化基因的表達(dá)時(shí)，內(nèi)含子的增強(qiáng)作用是很重要的。在化驗(yàn)中，所有的缺少Sh1元件的構(gòu)建物都不能提供顯著水平的GUS表達(dá)。具有優(yōu)化的長(zhǎng)度和組成的油質(zhì)蛋白16kda啟動(dòng)子，如在pBN220中的，被發(fā)現(xiàn)比球蛋白啟動(dòng)子(如包含于pSM100中的)更強(qiáng)。用于確定年輕的發(fā)育中的玉米胚表達(dá)的早的時(shí)間安排特征的RNA印跡，結(jié)合其在表達(dá)化驗(yàn)中所顯示的高活力，表明了最佳的胚/糊粉特異的啟動(dòng)子是那個(gè)0.9kb的片段(序列編號(hào)39)，它是從油質(zhì)蛋白16kda基因分離出來的，同時(shí)在其5’端未翻譯區(qū)還結(jié)合有一個(gè)Sh1外顯子1/內(nèi)含子1元件。
實(shí)施例7帶有脂質(zhì)性狀基因的玉米胚/糊粉特異的表達(dá)構(gòu)建物構(gòu)建了含有一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白16kda啟動(dòng)子(長(zhǎng)度為0.9kb，表1和2，以及序列編號(hào)39)、一個(gè)位于啟動(dòng)子(3’端)和cDNA片段(5’端)之間的來源于皺縮1基因的外顯子1/內(nèi)含子1元件(1.1kb)、一個(gè)以相對(duì)于啟動(dòng)子有義或者反義的取向編碼性狀基因的一部分的cDNA片段、以及一個(gè)位于cDNA片段3’端的Nos 3’端，的表達(dá)構(gòu)建物并將其用于玉米的轉(zhuǎn)化中以改變由玉米籽粒中的性狀基因編碼的酶的水平(圖3B-3F)。所設(shè)計(jì)的構(gòu)建物適合于以胚/糊粉特異的方式表達(dá)任何在本發(fā)明中沒有述及的目的性狀基因。載體骨架中的可選標(biāo)記可以是任何抗生素(如氨芐青霉素、潮霉素、卡那霉素)抗性基因。
制造了一種經(jīng)對(duì)pBN220進(jìn)行修飾而獲得的中間構(gòu)建物，pBN256，用作帶有脂質(zhì)基因的各種不同的表達(dá)構(gòu)建物的起始載體。將pBN220用NcoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶解以除去其中的GUS編碼序列，用dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填充其末端，然后再將其重新連接。將如此獲得的質(zhì)粒指定為pBN256(圖3A)。
使用PCR來獲得一個(gè)含有其兩端均帶有KpnⅠ限制性位點(diǎn)的fad2-1編碼區(qū)域的片段。將fad2-1 cDNA克隆用作模板，使用對(duì)fad2-1序列特異的引物(序列編號(hào)50和51)，它們每一個(gè)都含有一個(gè)KpnⅠ位點(diǎn)(加下劃線)。
5’-CGGGGTACCGATGACCGAGAAGGAGCGGG-3’序列編號(hào)505’-GGCGGTACCTAGAACTTCTTGT’TGTACCA-3’序列編號(hào)51將預(yù)期的1.2kb片段用凝膠純化，用KpnⅠ酶解，然后再將其克隆到一個(gè)含有相當(dāng)?shù)腒pnⅠ位點(diǎn)的載體上以便利繁殖和進(jìn)一步的操作。將KpnⅠ片段從這個(gè)新的構(gòu)建物中酶切出來并將其末端如上所述整平，再將其插入到pBN256的SmaⅠ位點(diǎn)中，以變成pBN257。這一克隆含有幾乎全長(zhǎng)的fad2-1編碼區(qū)，但是其中的ATG翻譯起始密碼子位于(閱讀)框之外(圖3B)。
通過使用δ-9去飽和酶cDNA克隆(序列編號(hào)8)的DNA作為模板，使用含有NcoⅠ位點(diǎn)的編碼區(qū)特異的引物(序列編號(hào)52和53)進(jìn)行PCR，回收了一個(gè)含有δ-9去飽和酶編碼區(qū)的DNA片段。將由此獲得的片段用凝膠純化，用NcoⅠ酶切，然后再插入到經(jīng)過修飾的pBN220(其中的GUS基因已經(jīng)事先被除去)的NcoⅠ位點(diǎn)中。
5’-GGCCTCCGCCATGGCGCTCCGCTCCACGACG-3’序列編號(hào)525’-CTCCAACTCAAGCAGTCGCCATGGGTTTCC-3’序列編號(hào)53(將pBN220質(zhì)粒用NcoⅠ和SmaⅠ酶切以除去GUS基因，用Klenow處理填充其末端，然后再將其重新連接以形成經(jīng)過修飾的不含GUS的載體。)由此獲得的克隆含有一個(gè)截短的玉米δ-9去飽和酶編碼區(qū)域(大約0.9kb，包含全長(zhǎng)編碼序列的79％)。其取向有兩種可能，有義的(pBN264，圖3C)以及反義的(pBN262，圖3D)。
同時(shí)也將δ-9去飽和酶基因(序列編號(hào)8)的0.9kb的NcoⅠ片段克隆到pBN257的NcoⅠ位點(diǎn)以創(chuàng)造一個(gè)構(gòu)建物，pBN414，這一構(gòu)建物含有一個(gè)fad2-1和δ-9去飽和酶的融合的性狀基因，兩者都是有義取向，如圖3E中所示。pBN414中的fad2-1編碼序列與pBN257中的一樣，位于(閱讀)框之外，而且其C-末端序列被δ-9去飽和酶片段(占序列編號(hào)8中所示的全長(zhǎng)編碼區(qū)的79％)的插入所中斷。
將第二個(gè)δ-9去飽和酶克隆(序列編號(hào)10)用EcoRⅠ酶切，將1.1kb的EcoRⅠ片段純化并插入到pBN257的EcoRⅠ位點(diǎn)中以創(chuàng)造一個(gè)新的構(gòu)建物，pBN412(圖3F)，該構(gòu)建物含有一個(gè)δ-9去飽和酶和fad2的融合性狀基因，兩者都是有義取向。在pBN412中，δ-9去飽和酶片段含有一個(gè)全長(zhǎng)的編碼區(qū)(序列編號(hào)10)。δ-9的反義起始密碼子ATG位于pBN412的(閱讀)框中，但是fad2編碼序列位于(閱讀)框之外。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因玉米a．玉米的轉(zhuǎn)化上述的嵌合基因可以通過以下步驟被導(dǎo)入到玉米細(xì)胞中。從玉米自交株系H99和LH132的雜交植物、或者玉米自交株系H99和LH195的雜交植物、或者一種公用的HighⅡ株系(Armstrong,1991,MaizeGenetics Co.News Letter 65:92-93)、或者任何可以轉(zhuǎn)化和再生的玉米株系的發(fā)育中的殼果中剪切未成熟的玉米胚。這些胚在授粉10至11天之后，有1.0至1.5毫米長(zhǎng)時(shí)被分離。然后將這些胚軸側(cè)朝下放置，并與用瓊脂糖固化的N6培養(yǎng)基(Chu等，(1975)中國(guó)科學(xué)(北京)(Sci.Sin.Peking)18:659-668)接觸。將這些胚避免保持于27℃。從這些未成熟胚的角質(zhì)鱗片增殖出胚發(fā)生的愈傷組織。它含有未分化的細(xì)胞物質(zhì)，在胚柄結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生體漿的(somatic)原胚狀體和胚狀體。從原初的外植體(primary explant)分離的胚發(fā)生的愈傷組織可以被培養(yǎng)于N6培養(yǎng)基中并每2至3周在這一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)(sub-cultured)?？梢詫①|(zhì)粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士，Hoechst Ag,Frankfurt,Germany)與性狀基因一起用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中(共-轟擊)以便提供一個(gè)可選擇的標(biāo)記。這一質(zhì)粒含有Pat基因(見歐洲專利出版號(hào)0242236)，該基因編碼phosphinothricin乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)。這一基因來源于Streptomycesviridochromogenes,它的序列見GenBank，訪問號(hào)碼為X65195。酶PAT賦予了對(duì)除草劑谷氨酰胺合成酶抑制劑，如phosphinothricin(也以被指定為gluphosinate的化合物的形式可供)，的抗性。p35S/Ac中的pat基因處于花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等(1985)自然(Nature)313:810-812)以及來源于根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA的胭脂堿合成酶基因(NOS 3’端)的控制之下。可選地，可以將經(jīng)過凝膠純化的pat基因片段，包括35S啟動(dòng)子、pat基因編碼區(qū)、以及NOS 3’端，用作可選標(biāo)記。熟練的工作人員應(yīng)該可以理解在轉(zhuǎn)化中被用于提供選擇的片段可以有很大程度的差異，而且任何可能與pat基因相連接的含有35S啟動(dòng)子的片段都可以提供所需的可選性狀。另外一個(gè)可被用作phosphinothricin抗性的可選標(biāo)記的基因是來源于吸濕鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(GenBank訪問號(hào)X17220)，它可以被提供于一個(gè)質(zhì)粒中，也可以以單獨(dú)的DNA片段被提供。
微粒轟擊方法(Klein等，(1987)自然(Nature)327:70-73)被用于將基因轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)細(xì)胞中。根據(jù)這一方法，用如下的技術(shù)將金微粒(直徑0.6μm或者1μm)涂覆上DNA。將大約10μg的質(zhì)粒DNA加入到50μL的金微粒的懸浮液(60mg/mL)中。給這些微粒添加氯化鈣(2.5M的溶液，50μL)以及不含亞精胺的堿(1.0M溶液，20μL)。在加入這些溶液時(shí)將懸浮液渦旋震蕩。10分鐘之后，將各個(gè)管快速地離心(15,000rpm,5秒鐘)并除去上清。將微粒重懸于200μL的無水乙醇中，再次離心并除去上清。重新用乙醇潤(rùn)洗并將微粒重懸于終體積為30μL的乙醇中。然后將一個(gè)等分試樣(5μL)的涂覆有DNA的金微粒放置于一個(gè)Kapton飛碟(Bio-Rad Labs)的中心。將胚組織放置于一張覆蓋于經(jīng)瓊脂糖固化的N6培養(yǎng)基上的濾紙上。將組織鋪薄薄的一層，讓其覆蓋直徑大約為5cm的中心區(qū)域。將含有這些組織的有蓋培養(yǎng)皿放置于一個(gè)離阻擋屏大約8cm的PDS-1000/He槍膛中。將槍膛中的空氣抽真空到28英尺汞柱的真空度。用一個(gè)Biolistic PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments,Hercules CA)將涂覆有DNA的微粒加速進(jìn)入玉米組織中，使用1000psi的氦氣壓強(qiáng)，間隙距離為0.5cm，飛行距離為1.0cm。
在轟擊的幾天之后將組織轉(zhuǎn)移到含有g(shù)luphosinate(5mg/L)、不含酪蛋白或組氨酸的N6培養(yǎng)基中。組織在這一培養(yǎng)基中繼續(xù)緩慢生長(zhǎng)。再過兩周之后將組織轉(zhuǎn)移到含有g(shù)luphosinate的新鮮的N6培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基)中。將組織培養(yǎng)在該選擇培養(yǎng)基中，每隔兩周轉(zhuǎn)移一次，總共傳代3-4次。在一些含有選擇培養(yǎng)基的平板上鑒定出直徑為1cm的面積的活躍生長(zhǎng)的愈傷組織。當(dāng)在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，這些愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)。
通過首先將成簇的組織轉(zhuǎn)移到添加有0.2mg/L 2,4-D的N6培養(yǎng)基(再生培養(yǎng)基)中來使植物從轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生。2-3周之后組織開始形成類似體殖(somatic embryo)的結(jié)構(gòu)并在組織被轉(zhuǎn)移到光下生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生綠色的區(qū)域。在總共3-4周之后，小植物從再生培養(yǎng)基中冒出來。將它們個(gè)別地轉(zhuǎn)移到含有再生培養(yǎng)基的植物組織培養(yǎng)管中。在根和芽充分生長(zhǎng)之后，將小植物移植到生長(zhǎng)室中的4英尺盆中，隨后再將其移盆到10-12英尺盆中，在溫室中生長(zhǎng)直至成熟(Fromm等，(1990)Bio/Technology 8:833-839)。b．在籽粒中富含飽和脂肪酸組成的轉(zhuǎn)基因玉米使用上述的基因槍(biolistic gun)方法，用pBN262質(zhì)粒DNA和bar基因片段對(duì)玉米愈傷組織進(jìn)行共-轟擊。根據(jù)上述的步驟挑選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植株并再生轉(zhuǎn)基因玉米植株。原初轉(zhuǎn)化植株(標(biāo)示為R0植物)在溫室中生長(zhǎng)。讓這些植物自交或者與來源于Holdens株系LH132的野生型花粉雜交。在30 DAP收獲玉米的穗軸。從種仁中剪切出胚并進(jìn)行消毒。從每一個(gè)胚取出小片的愈傷組織并用如在WO94/11516中所述的GC法對(duì)這些愈傷組織進(jìn)行脂肪酸組成化驗(yàn)。將剩下的胚種植在含有再生培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)管中。將表現(xiàn)型陽(yáng)性(即脂質(zhì)成分中飽和脂肪酸含量高)的胚從培養(yǎng)管移植到盆中，并在溫室中生長(zhǎng)為R1植物。讓成熟的R1植物自交或者與野生型花粉(來源于株系5-12-24,Pioneer Hybrid International,Johnston,IA)雜交。在45 DAP收獲玉米穗軸并收集R2種仁。從種仁個(gè)體中取出小片的愈傷組織并對(duì)其脂肪酸進(jìn)行分析。
鑒定出兩種獨(dú)立的具有高飽和脂肪酸表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因株系-FA013-2-4和FA013-3-2。
圖4A顯示了來源于從株系FA013-2-4的R1植物收獲的一個(gè)單個(gè)的玉米穗軸的R1:2種仁分離系(segregant)的表現(xiàn)型的一種典型的例子。讓這一植物的R0代與來源于LH132(Holden)的野生型花粉進(jìn)行異花授粉。收獲玉米穗軸并分析單個(gè)種仁的脂質(zhì)組成。結(jié)果顯示種子的分離為1∶1(高飽和表現(xiàn)型野生型)，這表明在FA013-2-4中存在一個(gè)單個(gè)的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)。種植一個(gè)含有26.1％的硬脂酸的雜合種仁(野生型種仁含2％)并讓其生長(zhǎng)為一株R1植物。讓R1植物自交。對(duì)R2種子進(jìn)行分析，分析數(shù)據(jù)表明分離率為3∶1(圖4A和4B)，確證了FA013-2-4含有一個(gè)單一的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)，而且該性狀的表現(xiàn)型是顯性的。在R2種子的分離系中，種仁中硬脂酸鹽的含量介于27-43％之間，平均的脂肪酸組成為13％ 16∶0,37％ 18∶0,4％ 18∶1,39％ 18∶2,2.8％ 18∶3,以及0.5％ 20∶0和20∶1。飽和脂肪酸的總含量為54％。發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸含量最高的高達(dá)61％。這種情況存在于一個(gè)總體組成如下的株系中13％ 16∶0,43％ 18∶0,3％ 18∶1,34％18∶2,2.3％ 18∶3,4.6％ 20∶0,以及0.2％ 20∶1。作為比較，野生型分離系的組成是16％ 16∶0,2％ 18∶0,19％ 18∶1,63％ 18∶2,1.0％18∶3,以及0.1％ 20∶0。野生型分離系的飽和脂肪酸總含量為18％。
在標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)室條件下，來源于株系FA013-2-4的種子的萌芽率接近100％，這表明胚/糊粉中飽和脂肪酸的含量并不影響種子的發(fā)育能力。
圖5顯示了從兩株株系FA013-2-15的R1植物收獲的R1:2種仁的表現(xiàn)型和分離的一個(gè)典型的例子。讓這些植物的相應(yīng)的R0代自交，讓其相應(yīng)的R1代植物都與來源于株系5-12-24的野生型花粉進(jìn)行異花授粉。第一種植物來源于本來含有12％硬脂酸鹽的R0:1種仁，第二種植物來源于含有21％硬脂酸鹽的一種種仁。然而，來源于這兩種植物的R1:2種仁的硬脂酸鹽含量最高達(dá)到38-39％。它們的R1:2種仁的硬脂酸鹽水平的變化范圍分別為29-38％以及16-39％。根據(jù)分離的比率，這表明在株系FA013-2-15中存在一個(gè)單一的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)。飽和酸鹽的平均含量為50％以上，而這一株系的種子萌芽率為大約40％。
R3:4種子來源于FA013-2-4事件的雜合植物。這些雜合籽粒的脂質(zhì)組成平均為15％ 16∶0,15％ 18∶0,14％ 18∶1,53％ 18∶2,1.5％18∶3，1.5％ 20∶0，以及0.5％ 20∶1。然而，從相同的R3∶4代的雜合植物收獲的種仁中硬脂酸鹽的含量更高(為31％，雜合背景的為15％)。在TopCross(TC)籽粒生產(chǎn)方法中，將這一雜合的植物作為花粉的提供者與一個(gè)雜交的雌性植物(34K77，杜邦)進(jìn)行雜交所獲得的籽粒的情況是類似的(表3)。
表3．在FA013-2-4的R0:1、純合的以及雜合的R3:4、以及各種不同的雜交產(chǎn)物中種仁脂質(zhì)的組成表現(xiàn)型(％)基因型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 20∶0 20∶1R0:1 x LH132 14 23 12 47 4R3:4自交 15 15 14 53 1.51.50.5(純合體)R3:4自交 12 8 44 2.43.00.3(雜合體)a34K77(TC)x R3a12 2 7 45 2.12.70.3野生型a15 1.21865 0.70.30.3a數(shù)據(jù)代表了具有顯性表現(xiàn)型的種仁的平均脂質(zhì)組成。R3:4的種仁來源于雜合的R3植物的自交玉米穗軸。將同樣的R3植物用作花粉的提供者給34K77植物授粉。
b讓一些34K77植物自交以獲得野生型的種仁充當(dāng)對(duì)照。
使用與上述的類似的過程，在新的轉(zhuǎn)基因事件中產(chǎn)生高含硬脂酸鹽，也即高飽和，的表現(xiàn)型(表4)。在這些實(shí)驗(yàn)中所使用的性狀基因構(gòu)建物來源于pBN264或者pBN427(圖7A)。質(zhì)粒pBN264與pBN262類似，只是δ-9去飽和酶位于一個(gè)相對(duì)于啟動(dòng)子有義的定位。轉(zhuǎn)基因序列包含于pBN427的SalⅠ片段(第3248-44位)中，與pBN264中相應(yīng)的SalⅠ片段(第2-3206位)是相同的。然而，pBN427使用一個(gè)帶有潮霉素抗性可選標(biāo)記(HPT，來源于pKS17，描述于WO94/11516中)的載體骨架，而在pBN262和pBN264中使用的則是氨芐青霉素標(biāo)記。制備用于轟擊的轉(zhuǎn)基因是來源于pBN264的經(jīng)過限制性酶切的或者是經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化的DNA片段(在來源于FA025實(shí)驗(yàn)的事件中，轉(zhuǎn)基因片段被標(biāo)記為fBN264)，或者是原封不動(dòng)的pBN427質(zhì)粒DNA(用于來源于FA029實(shí)驗(yàn)的事件)。用于剪切轉(zhuǎn)基因的限制性酶可以是SalⅠ或者XbaⅠ，它們會(huì)釋放一個(gè)3.2kb的具有轉(zhuǎn)錄功能的轉(zhuǎn)基因，而且可以用瓊脂糖凝膠電泳純化。使用轉(zhuǎn)基因DNA片段，而不是使用整個(gè)質(zhì)粒，使得在轉(zhuǎn)基因事件的回收中不含有細(xì)菌的具有抗生素抗性的基因。
表4．高硬脂酸鹽表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因事件轉(zhuǎn)基因事件硬脂酸鹽a總的鹽b構(gòu)建物c共抑制頻率d野生型＜2％ 18％1) FA025-1-4 16-27％32-42％fBN2642) FA025-2-1 12-39％28-60％fBN2643) FA025-2-1217-39％50-55％fBN264 6/30=20％4) FA025-2-1710％ 27％ fBN2645) FA025-3-5 22-27％41-48％fBN2646) FA025-3-9 6-35％ 22-53％fBN2647) FA029-2-4 17-34％32-50％pBN4278) FA029-2-5 18-25％35-42％pBN4279) FA029-2-7 29％ 46％ pBN42710) FA029-3-2 9-33％ 25-50％pBN427 5/25=20％11) FA029-3-4 26-29％40-43％pBN427a 典型地，在每一個(gè)事件中，從4個(gè)同胞玉米穗軸中選取20個(gè)種仁并逐個(gè)進(jìn)行分析。所示的范圍標(biāo)示的是在該事件中，單個(gè)種仁的硬脂酸鹽的最低和最高的含量。
b 飽和脂肪酸的總含量=16∶0+18∶0+20∶0。
c．f=純化的片段、p=原封不動(dòng)的質(zhì)粒DNA。
d．共抑制頻率=顯示陽(yáng)性表現(xiàn)型的事件總數(shù)/從相應(yīng)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的basta抗性克隆的總數(shù)。
新事件中轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)型是通過使用上述的同樣的GC法從完全成熟的玉米穗軸收獲的單個(gè)種仁中脂質(zhì)的組成確定的。取樣是沒有破壞性的，因?yàn)閮H從個(gè)體種仁中切出非常小的胚小片用于脂肪酸組成化驗(yàn)。種仁仍然具有存活能力并可以被種植于溫室中或者田間以繁殖下一代。
表4顯示了在其R0:1代鑒定出高含硬脂酸鹽(而且總體的飽和脂肪酸含量高)的表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因事件。典型地，從每一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中的同胞植物中取出4-6個(gè)玉米穗軸，并從每一個(gè)穗軸上取用5-20個(gè)種仁用于脂質(zhì)化驗(yàn)。硬脂酸鹽以及所有的飽和脂肪酸的含量用占油的百分比來表示，所示的范圍代表的是在該事件中所分析的所有的個(gè)體種仁中的最低以及最高的百分比。
結(jié)果顯示在玉米中可以獲得一致的高頻率的(10-20％)共抑制事件(表4和6)，不管使用的原封不動(dòng)的質(zhì)粒DNA或者經(jīng)過純化的片段。然而，在純化片段的制備過程中仍可能存在少量的載體DNA污染，應(yīng)該進(jìn)行DNA印跡分析來查證該事件確實(shí)沒有細(xì)菌可選標(biāo)記。所進(jìn)行的DNA印跡分析表明使用DNA片段，與使用原封不動(dòng)的質(zhì)粒DNA相比，傾向于產(chǎn)生插入樣式更為簡(jiǎn)單的事件(僅有一個(gè)或極少數(shù)幾個(gè)轉(zhuǎn)基因插入)。后者可能會(huì)形成復(fù)雜的多聯(lián)體并在使用基因槍方法時(shí)會(huì)一起整合到植物的基因組中，導(dǎo)致形成復(fù)雜的插入位點(diǎn)，這些復(fù)雜的插入位點(diǎn)可能會(huì)造成一些轉(zhuǎn)基因的不穩(wěn)定。
c．在籽粒中高含油酸的轉(zhuǎn)基因玉米如上所述，用pBN257 DNA(序列編號(hào)58)和一個(gè)bar基因片段對(duì)玉米愈傷組織進(jìn)行共轟擊，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物，收獲其R0:1種仁并對(duì)脂質(zhì)的組成進(jìn)行分析。
一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，即FA014-5-1，被鑒定具有高含油酸鹽的表現(xiàn)型。圖6顯示了從一個(gè)單個(gè)的玉米穗軸收獲的R0:1種子分離的一個(gè)典型的例子。該玉米穗軸是從一個(gè)野生型的雌性植物(LH132)收獲的，它是用株系FA014-5-1的轉(zhuǎn)基因植物的花粉授粉的。陽(yáng)性表現(xiàn)型野生型的比率為1∶1，這表明株系FA014-5-1含有一個(gè)單一的插入位點(diǎn)，而且高含油酸鹽的轉(zhuǎn)基因性狀可能是顯性的。陽(yáng)性表現(xiàn)型的脂質(zhì)特征平均為12％ 16∶0,1.3％ 18∶0,70％ 18∶1,15％ 18∶2，以及1.4％18∶3。在從這一玉米穗軸取出的樣品中發(fā)現(xiàn)油酸的最高含量為81％，而在另外一個(gè)玉米穗軸的一些種仁中油酸的含量達(dá)83％。油酸的高水平積累犧牲了亞油酸，如圖6中所述。其中棕櫚酸降低了大約2-4％，而18∶0,18∶3,20∶0，或者20∶1的含量并沒有明顯的變化。
R3:4種仁是從純合的植物收獲的，其脂質(zhì)組成為10％ 16∶0,1.5％18∶0,68％ 18∶1,19％ 18∶2，以及0.8％ 18∶3。這一組成與雜合的R0:1的是類似的，只是油酸的含量降低了2％，這表明基因型背景可能會(huì)影響轉(zhuǎn)基因的表現(xiàn)型。在TopCross籽粒生產(chǎn)方法(美國(guó)專利號(hào)5,704,160和5,706,603)中，當(dāng)將轉(zhuǎn)基因純合子R3植物用作花粉的來源并與高含油的天然株系QX47(其油總含量為14％)、QH102(其油總含量為9％)、或者雜合株系34K77雜交時(shí)，在每一雜交中各自的種仁的脂質(zhì)組成示于表5中。純的QX47株系的種仁中油酸鹽的含量為43％。將FA014-5-1與這一株系雜交也導(dǎo)致在籽粒中油酸的含量增加(含量為79％，而在純合的FA014-5-1植物的種仁中含量為68％)。將FA014-5-1與QX47雜交所獲得的籽粒的油總含量為8％-10％，而將FA014-5-1與QH102雜交的為6％-7％。
表5．在R0:1、純合體R3:4、以及FA014-5-1的各種不同的雜交中的種仁脂質(zhì)的組成表現(xiàn)型基因型 16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶’3R0:1 x LH132 121.3 70151.7R3:4自交a101.5 68190.8QX47(HO) x R39 2 79100.4QH102(HO) x R3 102 71160.534K77(TC) x R3 101 71160.7野生型b151.2 18650.7a．種仁來源于自交的雜合R3植物。將同樣的雜合植物用作花粉來源以供下列雌性植物雜交之用。
b．將少數(shù)的34K77植物自交以獲得野生型的種仁，以供對(duì)照之用。
使用類似的過程，在新的轉(zhuǎn)基因事件中產(chǎn)生高含油酸鹽的表現(xiàn)型(表6)。在這些實(shí)驗(yàn)中所使用的性狀基因構(gòu)建物來源于pBN257或者pBN428(圖7B)。在pBN428的SalⅠ片段(第44-3468位)中的轉(zhuǎn)基因序列與pBN257中的SalⅠ片段(第2-3426位)是相同的，只是pBN428使用一個(gè)帶有潮霉素抗性可選標(biāo)記基因(HPT，來源于pKS17，描述于WO94/11516中)的載體骨架，而在pBN257中使用的則是氨芐青霉素可選標(biāo)記。
制備用于轟擊的轉(zhuǎn)基因是經(jīng)過限制性酶切的或者是經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化的DNA片段，或者是如表6中所示的原封不動(dòng)的質(zhì)粒DNA。用于剪切轉(zhuǎn)基因的限制性酶可以是SalⅠ或者XbaⅠ，它們會(huì)釋放一個(gè)3.4kb的具有轉(zhuǎn)錄功能的轉(zhuǎn)基因，而且可以通過瓊脂糖凝膠電泳純化表6．高含油酸鹽的表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因事件轉(zhuǎn)基因事件油酸鹽a構(gòu)建物b共抑制頻率c野生型 ~22％1)FA014-5-1 ~70％ pBN257 1/10=10％2)FA027-1-9 60-69％ fBN2573)FA027-4-1 79-87％ fBN257 3/20=15％4)FA027-4-5 81-87％ fBN2575)FA028-1-8 39-63％ pBN4286)FA028-1-10 50-55％ pBN4287)FA028-3-1 64-78％ pBN428 4/32=13％8)FA028-3-3 30-83％ pBN4289)FA030-2-1 78-82％ fBN42810) FA030-2-9 82-83％ fBN428 6/61=10％11) FA030-3-1 80-84％ fBN42812) FA030-3-3 40-68％ fBN42813) FA030-4-25 42-77％ fBN42814) FA030-5-17 71-86％ fBN42815) FA031-5-8 58-76％ fBN428 1/6=17％a．典型地，在每一個(gè)事件中，從4個(gè)同胞玉米穗軸中選取20個(gè)種仁并逐個(gè)進(jìn)行分析。所示的范圍標(biāo)示的是在該事件中，單個(gè)種仁的硬脂酸鹽的最低和最高的含量。
b．f=純化的片段、p=原封不動(dòng)的質(zhì)粒DNA。
c．共抑制頻率=顯示陽(yáng)性表現(xiàn)型的事件總數(shù)/從相應(yīng)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的basta抗性克隆的總數(shù)。
高含油酸鹽的兩個(gè)事件中，F(xiàn)A027-4-1和FA027-4-5被帶到R1:2代。這些子孫的種仁的油酸鹽含量標(biāo)示著一個(gè)穩(wěn)定的高含油酸鹽的表現(xiàn)型(81-87％，得自單個(gè)的種仁分析)。
d．在種仁中高含飽和脂肪酸和油酸的轉(zhuǎn)基因玉米通過將一個(gè)高含飽和脂肪酸鹽的轉(zhuǎn)基因株系(FA013-2-4或者FA013-3-2)和一個(gè)高含油酸鹽的轉(zhuǎn)基因株系(FA014-5-1)雜交，或者通過將一個(gè)高含飽和脂肪酸鹽的轉(zhuǎn)基因株系與一個(gè)高含油酸的突變體，如株系B730L或者AEC2720L(WO95/22598)雜交，可以產(chǎn)生在種仁中高含飽和脂肪酸和油酸的玉米。
獲得高含飽和脂肪酸和油酸的玉米植物的一種可選的方法是用一個(gè)含有融合的fad2和δ-9去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物(例如，在pBN412或pBN414或pBN431中)(見圖7C)來創(chuàng)造一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。或者轉(zhuǎn)化也可以通過用pBN257(或者pBN428)以及pBN264(或者pBN427或pBN262)的共轟擊來實(shí)現(xiàn)。
包含來源于pBN431的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因事件具有一種表現(xiàn)型，在這個(gè)表現(xiàn)型中，飽和脂肪酸鹽的總的水平不少于種子油總含量的大約30％，硬脂酸水平的范圍在占總的種子油含量的大約11％-31％之間，油酸水平的范圍在占總的種子油含量的大約27-37％之間。有人相信可以通過將這些轉(zhuǎn)基因事件與一個(gè)具有高含油酸的表現(xiàn)型的株系，例如在上面的表6中所述的任何一種轉(zhuǎn)基因事件、或者上面所提及的B730L或AEC2720L，進(jìn)行雜交來獲得一種油酸水平范圍介于占總的種子油含量的大約35％至45％之間的油。
從這樣的轉(zhuǎn)基因事件產(chǎn)生的高含硬脂酸和油酸的玉米油可以以混合或不混合的形式被用作人造黃油或者使面點(diǎn)變得疏松的油脂，它也可以被與高含棕櫚酸的脂肪混合以形成可可脂的替代品。
序列表<110>Shen,Jennie B.
E.I.du Pont de Nemours and company<120>用于改變玉米脂質(zhì)特征的去飽和酶的基團(tuán)<130>BB-1137-A<140><141><150>60/088,987<151>6月11日，1998<160>59<170>Microsoft Office 97<210>1<211>1790<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<400>1cggcctctcc cctccctcct ccctgcaaat cctgcagaca ccaccgctcg tttttctctc60cgggacagga gaaaagggga gagagaggtg aggcgcggtg tccgcccgat ctgctctgcc 120ccgacgcagc tgttacgacc tcctcagtct cagtcaggag caagatgggt gccggcggca 180ggatgaccga gaaggagcgg gagaagcagg agcagctcgc ccgagctacc ggtggcgccg 240cgatgcagcg gtcgccggtg gagaagcctc cgttcactct gggtcagatc aagaaggcca 300tcccgccaca ctgcttcgag cgctcggtgc tcaagtcctt ctcgtacgtg gtccacgacc 360tggtgatcgc cgcggcgctc ctctacttcg cgctggccat cataccggcg ctcccaagcc 420cgctccgcta cgccgcctgg ccgctgtact ggatcgcgca ggggtgcgtg tgcaccggcg 480tgtgggtcat cgcgcacgag tgcggccacc acgccttctc ggactactcg ctcctggacg 540acgtggtcgg cctggtgctg cactcgtcgc tcatggtgcc ctacttctcg tggaagtaca 600gccaccggcg ccaccactcc aacacggggt ccctggagcg cgacgaggtg ttcgtgccca 660agaagaagga ggcgctgccg tggtacaccc cgtacgtgta 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1．一種經(jīng)過分離的含有玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的核酸，其中上述的啟動(dòng)子可以是全長(zhǎng)或者是部分，而且其中上述的啟動(dòng)子含有一個(gè)與序列編號(hào)19或者38-49中的任一核酸序列基本對(duì)應(yīng)的核酸序列或者上述的啟動(dòng)子含有一個(gè)與序列編號(hào)19或者38-49中的任一核酸序列基本相似并且功能等同的片段或者亞片段。
2．如權(quán)利要求1中所述的亞片段，其中上述的片段或者亞片段在中等嚴(yán)格條件下與序列編號(hào)19或者38-49中所述的核酸序列雜交。
3．一種經(jīng)過分離的編碼玉米δ-9硬脂酰-脂?；d體蛋白去飽和酶的核酸片段，該片段基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)8和10中所述的核酸序列或其任何功能等同的亞片段。
4．一種經(jīng)過分離的編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段，該片段基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2中所述的核酸序列或其任何功能等同的亞片段。
5．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求3中的核酸片段或者是權(quán)利要求3中的核酸片段的反向互補(bǔ)序列，可操作地與合適的調(diào)控序列相連接，其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米硬脂酸表現(xiàn)型。
6．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求4中的核酸片段或者是權(quán)利要求4中的核酸片段的反向互補(bǔ)序列，可操作地與合適的調(diào)控序列相連接，其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米油酸表現(xiàn)型。
7．如權(quán)利要求5中所述的嵌合基因，進(jìn)而包含權(quán)利要求1或2中所述的核酸片段。
8．如權(quán)利要求6中所述的嵌合基因，進(jìn)而包含權(quán)利要求1或2中所述的核酸片段。
9．如權(quán)利要求5中所述的嵌合基因，進(jìn)而包含一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子。
10．如權(quán)利要求6中所述的嵌合基因，進(jìn)而包含一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子。
11．如權(quán)利要求7中所述的嵌合基因，進(jìn)而包含一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子。
12．如權(quán)利要求8中所述的嵌合基因，進(jìn)而包含一個(gè)皺縮1內(nèi)含子/外顯子。
13．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求3中的核酸片段或者其反向互補(bǔ)序列，以及一個(gè)編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段或者其任何一種功能等同的亞片段或者是上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列，其中上述的片段是可操作地連接的，而且其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油表現(xiàn)型。
14．一種如權(quán)利要求13中所述的嵌合基因，其中編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2中所述的核酸序列或者該序列的任何一種功能等同的亞片段。
15．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求1或2中所述的核酸片段、權(quán)利要求3中所述的核酸片段或者其反向互補(bǔ)序列、以及一種編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸序列，或者該序列的功能等同的亞片段或者是上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列，其中上述的片段是可操作連接的，而且其中該嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致了一種被改變的玉米油表現(xiàn)型。
16．如權(quán)利要求15中所述的嵌合基因，其中編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2中所述的核酸序列或者該序列的任何一種功能等同的亞片段。
17．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求3中所述的核酸片段、一種編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸序列，或者該序列的任何一種功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列、以及一種皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中上述的片段可操作地連接，而且其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油表現(xiàn)型。
18．一種如權(quán)利要求17中所述的嵌合基因，其中編碼δ-12去飽和酶的核酸基因基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列或任何它的功能等同的亞片段。
19．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求1或2中所述的核酸片段、權(quán)利要求3中所述的核酸片段或其反向互補(bǔ)序列、一種編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸序列，或者該序列的任何一種功能等同的亞片段、或者上述片段或亞片段的互補(bǔ)序列、以及一種皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中上述的片段可操作地連接，而且其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油表現(xiàn)型。
20．一種如權(quán)利要求19中所述的嵌合基因，其中編碼δ-12去飽和酶的核酸基因基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)2中所述的核苷酸序列或任何它的功能等同的亞片段。
21．一種嵌合基因，包含權(quán)利要求1或2中所述的核酸片段、權(quán)利要求3中所述的核酸片段或其反向互補(bǔ)序列、權(quán)利要求4中所述的核酸片段或其互補(bǔ)序列、以及一種皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中上述的片段可操作地連接，而且其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種改變的玉米油表現(xiàn)型。
22．一種嵌合基因，包含一段基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1中所述的核酸序列的經(jīng)過分離的編碼玉米8-12去飽和酶的核酸片段、其功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列、或者是一段基本對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)58或59中所述的核苷酸序列的經(jīng)過分離的編碼玉米δ-12去飽和酶的核酸片段、其功能等同的亞片段或者上述片段或亞片段的反向互補(bǔ)序列、權(quán)利要求1或2中所述的核酸片段以及皺縮1內(nèi)含子/外顯子，其中上述的片段是可操作連接的，而且其中嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致一種被改變的玉米油酸表現(xiàn)型。
23．一種包含權(quán)利要求5中所述的嵌合基因的玉米植物或植物部分。
24．一種從權(quán)利要求23中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中硬脂酸的含量不少于總的油含量的大約20％，或者其中飽和脂肪酸的總含量不少于總的油含量的大約35％。
25．一種包含權(quán)利要求6中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
26．一種從權(quán)利要求25中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中油酸的含量不少于總的油含量的大約60％。
27．一種包含權(quán)利要求7中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
28．一種從權(quán)利要求27中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中硬脂酸的含量不少于總的油含量的大約20％，或者其中飽和脂肪酸的總含量不少于總的油含量的大約35％。
29．一種包含權(quán)利要求8中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
30．一種從權(quán)利要求29中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中油酸的含量不少于總的油含量的大約60％。
31．一種包含權(quán)利要求9中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
32．一種從權(quán)利要求31中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中硬脂酸的含量不少于總的油含量的大約20％，或者其中飽和脂肪酸的總含量不少于總的油含量的大約35％。
33．一種包含權(quán)利要求10中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
34．一種從權(quán)利要求33中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中油酸的含量不少于總的油含量的大約60％。
35．一種包含權(quán)利要求11中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
36．一種從權(quán)利要求35中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中硬脂酸的含量不少于總的油含量的大約20％，或者其中飽和脂肪酸的總含量不少于總的油含量的大約35％。
37．一種包含權(quán)利要求12中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
38．一種從權(quán)利要求37中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中油酸的含量不少于總的油含量的大約60％。
39．一種包含權(quán)利要求13中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
40．一種從權(quán)利要求39中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
41．一種包含權(quán)利要求14中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
42．一種從權(quán)利要求41中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
43．一種包含權(quán)利要求15中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
44．一種從權(quán)利要求43中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
45．一種包含權(quán)利要求16中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
46．一種從權(quán)利要求45中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
47．一種包含權(quán)利要求17中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
48．一種從權(quán)利要求47中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
49．一種包含權(quán)利要求18中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
50．一種從權(quán)利要求49中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
51．一種包含權(quán)利要求19中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
52．一種從權(quán)利要求51中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
53．一種包含權(quán)利要求20中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
54．一種從權(quán)利要求53中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
55．一種包含權(quán)利要求21中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
56．一種從權(quán)利要求55中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
57．一種玉米植物或其植物部分，包含一種選自權(quán)利要求5、7、9以及11中所述的嵌合基因的嵌合基因以及一種選自權(quán)利要求6、8、10、以及12中所述的嵌合基因的嵌合基因。
58．一種從權(quán)利要求57中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中飽和脂肪酸的含量不少于總的油含量的大約30％，油酸的含量不少于總的油含量的大約30％。
59．一種包含權(quán)利要求22中所述的嵌合基因的玉米植物或其植物部分。
60．一種從權(quán)利要求59中所述的植物獲得的玉米籽粒，其中上述的籽粒中油酸的含量不少于總的油含量的大約60％。
61．權(quán)利要求23或25中所述玉米植物的種子。
62．權(quán)利要求27中所述玉米植物的種子。
63．權(quán)利要求29中所述玉米植物的種子。
64．權(quán)利要求31中所述玉米植物的種子。
65．權(quán)利要求33中所述玉米植物的種子。
66．權(quán)利要求35中所述玉米植物的種子。
67．權(quán)利要求37中所述玉米植物的種子。
68．權(quán)利要求39中所述玉米植物的種子。
69．權(quán)利要求41中所述玉米植物的種子。
70．權(quán)利要求43中所述玉米植物的種子。
71．權(quán)利要求45中所述玉米植物的種子。
72．權(quán)利要求47中所述玉米植物的種子。
73．權(quán)利要求49中所述玉米植物的種子。
74．權(quán)利要求51中所述玉米植物的種子。
75．權(quán)利要求53中所述玉米植物的種子。
76．權(quán)利要求55中所述玉米植物的種子。
77．權(quán)利要求57中所述玉米植物的種子。
78．權(quán)利要求59中所述玉米植物的種子。
79．從權(quán)利要求23或25中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
80．從權(quán)利要求27中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
81．從權(quán)利要求29中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
82．從權(quán)利要求31中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
83．從權(quán)利要求33中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
84．從權(quán)利要求35中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
85．從權(quán)利要求37中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
86．從權(quán)利要求39中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
87．從權(quán)利要求41中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
88．從權(quán)利要求43中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
89．從權(quán)利要求45中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
90．從權(quán)利要求47中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
91．從權(quán)利要求49中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
92．從權(quán)利要求51中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
93．從權(quán)利要求53中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
94．從權(quán)利要求55中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
95．從權(quán)利要求57中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
96．從權(quán)利要求59中所述的玉米植物的籽粒中獲得的油。
97．從權(quán)利要求61中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
98．從權(quán)利要求62中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
99．從權(quán)利要求63中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
100．從權(quán)利要求64中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
101．從權(quán)利要求65中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
102．從權(quán)利要求66中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
103．從權(quán)利要求67中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
104．從權(quán)利要求68中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
105．從權(quán)利要求69中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
106．從權(quán)利要求70中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
107．從權(quán)利要求71中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
108．從權(quán)利要求72中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
109．從權(quán)利要求73中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
110．從權(quán)利要求74中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
111．從權(quán)利要求75中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
112．從權(quán)利要求76中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
113．從權(quán)利要求77中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
114．從權(quán)利要求78中所述的玉米植物的籽粒加工而得的動(dòng)物飼料。
115．將權(quán)利要求79中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
116．將權(quán)利要求80中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
117．將權(quán)利要求81中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
118．將權(quán)利要求82中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
119．將權(quán)利要求83中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
120．將權(quán)利要求84中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
121．將權(quán)利要求85中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
122．將權(quán)利要求86中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
123．將權(quán)利要求87中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
124．將權(quán)利要求88中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
125．將權(quán)利要求89中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
126．將權(quán)利要求90中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
127．將權(quán)利要求91中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
128．將權(quán)利要求92中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
129．將權(quán)利要求93中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
130．將權(quán)利要求94所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
131．將權(quán)利要求95中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
132．將權(quán)利要求96中所述的油用于食物、動(dòng)物飼料、烹飪或者工業(yè)應(yīng)用中。
133．通過將從權(quán)利要求23或25中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
134．通過將從權(quán)利要求27中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
135．通過將從權(quán)利要求29中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
136．通過將從權(quán)利要求31中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
137．通過將從權(quán)利要求33中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
138．通過將從權(quán)利要求35中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
139．通過將從權(quán)利要求37中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
140．通過將從權(quán)利要求39中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
141．通過將從權(quán)利要求41中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
142．通過將從權(quán)利要求43中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
143．通過將從權(quán)利要求45中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
144．通過將從權(quán)利要求47中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
145．通過將從權(quán)利要求49中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
146．通過將從權(quán)利要求51中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
147．通過將從權(quán)利要求53中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
148．通過將從權(quán)利要求55中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
149．通過將從權(quán)利要求57中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
150．通過將從權(quán)利要求59中所述的植物的籽粒獲得的油進(jìn)行氫化、分餾、交換酯化或者水解所制造的產(chǎn)品。
151．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求97中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
152．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求98中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
153．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求99中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
154．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求100中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
155．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求101中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
156．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求102中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
157．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求103中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
158．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求104中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
159．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求105中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
160．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求106中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
161．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求107中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
162．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求108中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
163．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求109中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
164．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求110中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
165．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求111中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
166．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求112中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
167．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求113中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
168．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求114中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
169．一種在其基因組中含有權(quán)利要求22中所述的嵌合基因的玉米籽粒，其中上述的玉米籽粒的油含量占干物質(zhì)的大約6％至10％之間，而且其中上述的油中油酸的含量不少于種子總的油含量的大約60％。
170．對(duì)權(quán)利要求169中所述的玉米籽粒進(jìn)行加工所獲得的動(dòng)物飼料。
171．一種通過給動(dòng)物飼養(yǎng)其數(shù)量足以改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的如權(quán)利要求170中所述的動(dòng)物飼料來改善動(dòng)物胴體質(zhì)量的方法。
全文摘要
本發(fā)明描述了含有一個(gè)玉米油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的全部或者基本上全部、一個(gè)硬脂酰－?；d體蛋白去飽和酶以及一個(gè)δ—12去飽和酶的核酸片段的制備和應(yīng)用,上述核酸可以被單個(gè)或者結(jié)合使用以改變玉米脂質(zhì)的特征。整合有此類核酸片段以及合適的調(diào)控序列的嵌合基因可以被用于創(chuàng)造具有被改變的脂質(zhì)特征的轉(zhuǎn)基因玉米植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1305532SQ99807225
公開日2001年7月25日 申請(qǐng)日期1999年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月11日
發(fā)明者J·B·J·沈 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司