專利名稱：減毒水痘病毒岡株的基因62和利用基因62的減毒水痘活疫苗用病毒株的鑒定方法
技術領域：
本申請是涉及減毒水痘病毒岡株的基因62和利用基因62的減毒水痘活疫苗用病毒株(以下記為“減毒水痘病毒株”)的鑒定方法的申請。再說得詳細些，本申請是有關能夠?qū)⒆鳛闇p毒水痘活疫苗的有效成分使用的減毒水痘病毒岡株和其它容許作為有效成分的減毒水痘病毒株與其它野生型水痘病毒岡株(以下，記為“強毒親株”或“親株”)或其它野生型水痘病毒區(qū)別開的基因62以及根據(jù)該基因62的堿基序列對減毒水痘病毒的鑒定方法等申請。
背景技術：
水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster virus:VZV。以下記為“水痘病毒”或“VZV”)是人水痘以及帶狀皰疹的致病性病毒。以來自該病毒的減毒株“減毒水痘病毒岡株”(特公昭53-41202號公報；Lancet 2:1288-1290,1974)的病毒作為唯一的種株制造活疫苗，在世界各國被廣泛使用[Requirements for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984:WHO Technical Report Series,No.725,pp.102-124,1985]。
目前，該減毒活水痘疫苗的安全性以及有效性是通過控制被批準生產(chǎn)的水痘種病毒的傳代次數(shù)(seed lot system)確保的。即，為了避免由于種病毒連續(xù)傳代減毒病毒遺傳特性發(fā)生變化，使得其病原性恢復帶來的危險性，規(guī)定以種病毒批準時的傳代數(shù)為0代，將由此開始的總傳代數(shù)在10代以內(nèi)的病毒可以用作疫苗。換言之，減毒活疫苗的質(zhì)量管理以及質(zhì)量保證依賴于各個疫苗制造者對seed lot system的遵守。
而對于健康兒童由于接種該減毒活水痘疫苗雖然沒有呈現(xiàn)出臨床反應，但在被接種者免疫功能出現(xiàn)損傷的情況中，偶爾會出現(xiàn)水痘和帶狀皰疹。然而這樣的臨床反應是由于接種疫苗引起的，還是由于野生型水痘病毒的自然感染引起的還不能確定。因此對作為減毒活水痘疫苗的種病毒的減毒水痘病毒岡株和其它的野生型VZV的差別的分析成了流行病學中的重要課題，已經(jīng)提出了完成該課題的幾種方法。即，自VZV基因組的構造被報道以來(Journal of GeneralViralogy,67:1759-1816,1986)，已報道了以下方法根據(jù)VZV株間的DNA堿基序列的差異(Journal of Viralogy,59:660-668,1986)、限制酶PstⅠ位點的有無(Japanese Journal of ExperimentalMedicine,59:233-237,1989)進行判斷、利用PCR(聚合酶鏈反應Polimerase chain reaction)的RFLP(限定片段長度多形性restriction fragment length polymorphism)進行判斷(Journal ofGeneral Viralogy,66:1016-1020,1992)、通過上述限制酶PstⅠ位點的有無和PCR產(chǎn)物的RFLP的組合(Journal of ClinicalMicrobiology,33:658-660,1995)等進行判斷。然而，這些方法無論哪一種單獨使用其可信度都很低，所以正確區(qū)別減毒水痘病毒岡株和其它野生株是很困難的。
為了解決這個問題，本申請人就減毒水痘病毒岡株和其它水痘病毒株(例如，眾所周知的野生株和由自然感染的水痘患者分離出的新鮮野生株等)進行廣泛的基因解析，在確定能夠區(qū)別兩者的8個要素的同時，發(fā)現(xiàn)未知的水痘病毒只要都滿足這8個要素，這些毒株就可以作為活水痘疫苗用的減毒水痘病毒岡株，已經(jīng)申請了專利(WO97/43420號公報。以下記為在先申請發(fā)明)。
按照本申請人在先申請發(fā)明的方法，區(qū)別減毒水痘病毒岡株和其它水痘病毒株成為可能，但還不能區(qū)別減毒水痘病毒岡株和其親株。而由于必須對8個指標都進行檢查，所以在確定之前花費許多時間和手續(xù)也是個問題。
本申請的發(fā)明人就能夠區(qū)別減毒水痘病毒岡株和其親株的方法反復進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過檢測水痘病毒的基因62的變異能夠簡便而且確實地區(qū)別減毒水痘病毒岡株和其親株以及其它野生型水痘病毒株。
本申請的發(fā)明是根據(jù)這樣的新的見解形成的發(fā)明，把提供減毒水痘病毒所特有的基因62作為課題。
另外，本發(fā)明也將提供上述基因62編碼的蛋白質(zhì)和其多肽，通過將它們作為抗原得到的抗體以及細胞毒T淋巴細胞(CTL:cytotoxic Tlymphocyte)、以及具有上述基因62的減毒水痘病毒株作為課題。
發(fā)明的公開本申請?zhí)峁┮韵赂靼l(fā)明作為解決上述課題的發(fā)明。(1)減毒水痘病毒岡株的基因62，序列1給出的堿基序列中，至少包含以下(a)～(d)堿基置換。
(a)2110堿基A置換為G；(b)3100堿基A置換為G；(c)3818堿基T置換為C；和(d)4006堿基A置換為G；(2)上述(1)的減毒水痘病毒岡株的基因62，它除了包含(a)～(d)的堿基置換外，至少還包含以下(e)～(g)中至少一個以上堿基置換。
(e)1251堿基A置換為G；(f)2226堿基A置換為G；和(g)3657堿基A置換為G；(3)上述(2)的減毒水痘病毒岡株的基因62，它除了包含(a)～(d)的堿基置換、以及(e)～(g)中至少一個以上的堿基置換外，還包含以下(h)～(o)中至少一個以上的堿基置換。
(h)162堿基T置換為C；(i)225堿基T置換為C；(j)523堿基T置換為C；(k)1565堿基T置換為C；(l)1763堿基T置換為C；
(m)2652堿基T置換為C；(n)4052堿基T置換為C；和(o)4193堿基T置換為C；(4)編碼上述(1)至(3)中任一個基因62的DNA片段、由含有堿基置換部分的10個以上堿基對的序列構成的DNA片段。(5)上述(1)的減毒水痘病毒岡株的基因62編碼的蛋白質(zhì)，序列1給出的氨基酸序列中，至少包含以下(A)～(D)的氨基酸置換。
(A)628氨基酸殘基Ser置換為Gly；(B)958氨基酸殘基Arg置換為Gly；(C)1197氨基酸殘基Val置換為Ala；和(D)1260氨基酸殘基Ile置換為Val；(6)上述(5)的蛋白質(zhì)，它除了包含(A)～(D)的氨基酸置換外，至少還包含以下(E)～(H)中的至少一個以上的氨基酸置換。
(E)99氨基酸殘基Met置換為Thr；(F)446氨基酸殘基Leu置換為Pro；(G)512氨基酸殘基Val置換為Ala；和(H)1275氨基酸殘基Leu置換為Ser；(7)上述(5)或(6)蛋白質(zhì)的一部分，由含有其中氨基酸置換部分的5個以上氨基酸殘基的序列構成的多肽。(8)通過用上述(5)或(6)蛋白質(zhì)、或上述(7)的多肽作為抗原獲得的抗體或CTL。(9)減毒水痘病毒株，其中病毒基因組的基因62是上述(1)至(3)中的任一個基因62。(10)減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇含有與上述(1)至(3)中的任一個基因62的堿基置換相同的堿基置換的水痘病毒。(11)減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇含有上述(4)的DNA片段雜交的基因組的水痘病毒。(12)減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇產(chǎn)生上述(8)的抗體或CTL識別的抗原的水痘病毒。(13)減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是在序列1的堿基序列中至少從第2107堿基到第2229堿基的DNA序列被限制酶NaeⅠ以及BssHⅡ切斷，選擇該DNA序列被切割為2或3個片段的水痘病毒。(14)上述(13)的鑒定方法中，DNA序列是分別以由序列2的堿基序列構成的寡核苷酸和序列3的堿基序列構成的寡核苷酸作為引物，以水痘病毒的基因62為模板，通過PCR法制備的。(15)通過由上述(10)至(14)中任一個方法鑒定的減毒水痘病毒株。(16)以上述(9)或(15)的減毒水痘病毒株作為種病毒的減毒活水痘疫苗。
圖2是表示對應下面的各個水痘病毒基因62PCR產(chǎn)物的RFLP分析的結果的瓊脂糖凝膠電泳圖。帶1減毒水痘病毒岡株；帶2強毒親株；帶3河口株；帶4-8野生型水痘病毒；帶9-13野生型帶狀皰疹病毒。而兩側帶是大小標準帶。
圖3是減毒水痘病毒岡株和其強毒親株的各個基因62產(chǎn)物(IE62)激活VZV各個基因啟動子的試驗結果。A是表示編碼IE4的基因4的啟動子活性與效應質(zhì)粒量的關系圖。CV1細胞被一定量(0.25μg)的pCAT-IE4和不同量的pVac-G62(□)或pPar-G62(●)共轉染。以下分別表示，B編碼IE62的基因62；C編碼DNA聚合酶的基因28；D編碼主要DNA結合蛋白(major DNA binding protein:MDBP)的基因29；E編碼糖蛋白C(glycoprotein C:gC)的基因14；F編碼gE的基因68的各個啟動子活性與效應質(zhì)粒量的關系圖。
實施發(fā)明的最佳方式水痘病毒的基因62是具有轉染功能(使轉錄反式激活的功能)的基因，是位于水痘病毒基因組全序列(Journal of General Viralogy,67:1759-1816,1986)中的堿基105142-109242區(qū)域內(nèi)的基因。該基因62就象

圖1上面所示那樣，由于從轉錄起始部位開始沿箭頭所指方向進行轉錄，水痘病毒基因組全序列的堿基109242-105142成了“+”鏈。因此序列1的第一個堿基“A”對應于該“+”鏈的5’末端堿基(基因組全序列的第109242堿基)。在以下的說明中，有時堿基號被當作基因組全序列的堿基號，但由于該基因組全序列中基因62的序列是“-”鏈，所以與序列1所示的堿基互補。
本發(fā)明的減毒水痘病毒岡株的基因62是在序列1的堿基序列中，包含表1所示(a)～(d)的堿基置換的基因。另外，該減毒水痘病毒岡株的基因62是除了包含上述(a)-(d)的堿基置換外，而且還包含表1(e)～(g)中的至少一個以上的堿基置換的基因，甚至還包含表1(h)～(o)中的至少一個以上的堿基置換的基因。
另外本發(fā)明的減毒水痘病毒的蛋白質(zhì)是上述基因62編碼的蛋白質(zhì)，是在序列1的氨基酸序列中，包含表1所示(A)～(D)的氨基酸置換的蛋白質(zhì)。而該蛋白質(zhì)是除了包含上述(A)～(D)的氨基酸置換外，還包含表1所示(E)～(H)中至少一個以上的氨基酸置換的蛋白質(zhì)。
表1堿基置換 氨基酸置換(a)2110 A→G(A)661 Ser→Gly(b)3100 A→G(8)958 Arg→Gly(c)3818 T→C(C)1197 Val→Ala(d)4006 A→G(D)1260 Ile→Val(e)1251 A→G(f)2226 A→G(g)3657 A→G(h)162 T→C(i)225 T→6(j)523 T→C(E)99 Met→Thr(k)1565 T→C(F)446 Leu→Pro(l)1763 T→C(G)512 Val→Ala(m)2652 T→C(n)4052 T→C(H)1275 Leu→Ser(o)4193 T→C人們也認為帶有造成這樣氨基酸置換的堿基置換的基因62的水痘病毒岡株由于反式激活功能缺損或減弱使病毒粒子形成所必需蛋白質(zhì)的表達整體降低，其結果使之毒性降低了。
這樣的減毒水痘病毒岡株基因62，例如可以利用常規(guī)的方法從從眾所周知的減毒水痘病毒岡株(BIKEN Lot-65(財)阪大微生物病研究會，或ATCC VR-795)分離。這樣的減毒水痘病毒岡株基因62也可以從經(jīng)后面記載的方法鑒定的減毒水痘病毒中分離出。
本發(fā)明的DNA片段是對上述基因62進行編碼的DNA片段，是含有堿基置換部分的10個以上堿基對的DNA片段。該DNA片段可以通過適當?shù)南拗泼盖懈顪p毒水痘病毒岡株或利用本發(fā)明的方法新鑒定的減毒水痘病毒株的基因組DNA等方法得到。該DNA片段例如可以用作為區(qū)別減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株與強毒親株或其它的野生型病毒株的DNA探針等。
而本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過使上述的基因62在諸如大腸桿菌或酵母等微生物中表達獲得。即將含有上述基因62編碼區(qū)的DNA片段插入到含有在微生物中可能復制的起點、啟動子、核糖體結合部位、DNA序列克隆部位、終止子等的表達載體，并連接，作成表達載體，用該表達載體轉化宿主細胞后，如果培養(yǎng)得到的轉化體，在微生物中就可以大量生產(chǎn)基因62編碼的蛋白質(zhì)?；蛘?，以與其它蛋白質(zhì)融合的融合蛋白形式使其表達。將得到的融合蛋白用適當?shù)牡鞍酌盖校部梢灾猾@得目的蛋白部分。
這些蛋白質(zhì)可以用作制作例如抗體或CTL的抗原。
本發(fā)明的多肽是在上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中含有其氨基酸置換部分的5個以上氨基酸殘基的序列。這些多肽也可以用作制作抗體或CTL的抗原。
本發(fā)明的抗體是以上述蛋白質(zhì)本身、或其部分肽段作為抗原，通過眾所周知的方法可以獲得多克隆抗體或單克隆抗體。而本發(fā)明的CTL也以上述蛋白質(zhì)本身、或其部分肽段作為抗原，通過眾所周知的方法可以獲得。這些抗體和CTL可以用在新分離的減毒水痘病毒株的鑒定方法中。
本發(fā)明的減毒水痘病毒株是其基因62具有與上述的減毒水痘病毒岡株基因62同樣的堿基置換的水痘病毒株，是容許作為減毒活疫苗用的病毒株。這樣的新的減毒水痘病毒株可以通過選擇帶有含有上述堿基置換的基因62的水痘病毒來鑒定。具體來說，例如通過使用上述的DNA片段或抗體或CTL的方法從野生型水痘病毒株中進行鑒別。
或者利用本申請?zhí)峁┑姆椒?，即用在序?的堿基序列中至少是從第2107堿基到第2229堿基的DNA序列用限制酶NaeⅠ和BssHⅡ切，選擇該片段被切成2段或3段的水痘病毒的方法來鑒定。象上述那樣，減毒水痘病毒岡株的基因62是第2110堿基A被置換成了G的產(chǎn)物。而有時第2226堿基A被置換為G。其結果，通過第2110堿基A-G的置換，在序列1的2107-2112堿基序列中形成了限制酶NaeⅠ識別部位(GCCGGC)，而通過第2226堿基A-G的置換在序列1的2224-2229序列形成了BssHⅡ的識別部位(GCGCGC)。因此至少序列1的2107-2229堿基用上述兩種限制酶切，如果該DNA序列是來自減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒，應當被切成2段或3段。而來自野生型水痘病毒或減毒水痘病毒岡株的強毒親株的DNA序列由于沒有上述那樣的堿基置換，用上述兩種限制酶切沒有用，仍然是一個片段。而用限制酶切斷的DNA序列，例如可以通過分別以由序列2構成的寡核苷酸和序列3的堿基序列構成的寡核苷酸為引物，以作為鑒定對象的水痘病毒基因62為模板的PCR法制備。
本發(fā)明的減毒活水痘疫苗是通過使用經(jīng)上述方法鑒定的新的減毒水痘病毒株作為種病毒制造的疫苗。這樣的活疫苗可以用減毒水痘病毒岡株作種病毒與已有的減毒活水痘疫苗一樣地制備。
實施例以下給出實施例進一步詳細而且具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于以下的例子。
具體來說，按照在先申請的發(fā)明(WO97/43420公報)中實施例1記載的方法，從減毒水痘病毒岡株和強毒親株提取DNA，使用根據(jù)Dumas株堿基序列(J.Gen.Virol.,67:1759-1816,1986)設計的引物通過PCR法對各個基因進行擴增?；?2的全長用3組引物(表2所示的有意義引物G62N1、G62N2、G62N3和反意義引物G62R1、G62R2、G62R3)，擴增出3個都重疊的片段。而各個有意義引物在其5’末端處連接著M13正向(-38)序列(G62N1-3的1-19堿基)。而反意義引物在其5’末端處連接著M13反向序列(G62R1-3的1-20堿基)。
表2

PCR反應液使用各個脫氧核苷三磷酸200mM、各個引物0.3μM、極微量的模板DNA、含有2.5U的ExTaq(寶酒造公司制造)的50μL的ExTaq緩沖液。當使用序列3和8的引物時，在上述組成中加入6％DMSO。使用PCR自動化裝置(美國Perkin-Elmer公司制造)進行擴增，共進行30循環(huán)，每一循環(huán)為變性(94℃1分鐘)、退火(55℃1.5分鐘)、延伸(72℃2分鐘)。
然后利用PCR純化試劑盒(德國QIAGEN GmbH公司制造)對PCR擴增產(chǎn)物和引物進行分離，使用測序試劑盒(英國Amersham公司制造)確定序列，用DNA測序儀Model 4000L(美國U-COR公司制造)進行分析。而在確定序列時，使用熒光色素IRO-40標記的M13正向引物或反向引物。
減毒水痘病毒岡株和強毒親株的基因4、14、61的序列也通過同樣的方法進行確定。
其結果，就基因4、14、61在減毒水痘病毒岡株和強毒親株之間沒有看出堿基序列之間的差別。另外就象表3所示的那樣，就基因62來說，減毒水痘病毒岡株與強毒親株之間有15處堿基不同。這些堿基置換是T-C或A-G,8處堿基置換是由于在單一一個堿基位置可摻雜兩類堿基造成的，導致編碼不同的氨基酸殘基(表3中的R)。而減毒水痘病毒岡株和強毒親株與Dumas株的基因62之間有9處堿基不同。
從以上結果可以看出，減毒水痘病毒岡株和強毒親株可以通過它們各自的基因62序列的差異來區(qū)別。
表3基因組位置疫苗株 親株 Dumas株105169R(nonooding) A(norrccding)A105310R(Ser/Leu) A(Leu) A105356C(Val) T(Ile) T105451GGA105512CCA105544G(Ala) A(Ala) A105705C(Ala) T(Ala) T106262C(Gly) T(Arg) T106710R(Ala) A(Ala) A107136C(Ala) T(Ala) T107165TTC107252C(Gly) T(Ser) T107203CCT107599R(Ala/Val) A(Val) A107607AAC107715CCT107797R(Pro/Leu) A(Leu) A108111C(Pro) T(Pro) T108747GGA108838R(Thr/Met) A(Met) A10895lAAG109044GGC109137R(silent)A(silenT)A109200R(silent)A(silent)A
作為引物可以使用表1的G62N和G62R的寡核苷酸，反應液中加入6％DMSO，利用PCR法(除了延伸反應為6分鐘外，其它條件與實施例1相同)對基因62的全長進行擴增。
引物由于分別含有限制酶XbaⅠ和PstⅠ識別部位，純化的PCR產(chǎn)物用這些限制酶切后，克隆于用同樣的酶預先切的pUC19中。然后將重組的質(zhì)粒導入E.coli JM109中，就減毒水痘病毒岡株和強毒親株的基因62從各個轉化體中提取9個質(zhì)粒，確定插入的序列。
結果就象圖1所示的那樣。圖1表明，減毒水痘病毒岡株的9個克隆的每個克隆的15處堿基中有多個堿基都與強毒親株不同。特別是所有克隆中的第1251、2110、2226、3100、3667、3818和4008 7處堿基都與親株的同一位置的堿基不同。另外強毒親株的9個克隆，包括上述15處堿基在內(nèi)，序列都相同。
減毒水痘病毒岡株和強毒親株與實施例1中使用的一樣。另外作為水痘病毒野生株，使用河口株以及從未接種疫苗的5例水痘患者和5例帶狀皰疹患者的水泡液中分離出的10個新鮮野生型病毒株檢測樣品。而從河口株和患者分離出的野生型水痘病毒株通過人HEL細胞或MRC-5細胞傳2-3代后，再使用。
各個水痘病毒的基因62通過以序列2和序列3的寡核苷酸為引物的PCR法進行擴增。序列2的寡核苷酸是對應于水痘病毒基因62(序列1)的1846-1863堿基的反向引物，而序列3的寡核苷酸是對應于2609-2620堿基的正向引物。PCR條件除了延伸時間為1分鐘外，其它與實施例1一樣。將得到的PCR產(chǎn)物3μL用4U的NaeⅠ(寶酒造公司制造)于37℃下切1.5小時，然后再用4U的BssHⅡ(寶酒造公司制造)于50℃下切1.5小時。酶切后的DNA片段走4％瓊脂糖凝膠(NuSieve 3:1.FMC BioProducts公司制造)電泳，經(jīng)溴乙錠染色后進行分析。
結果如圖2所示。圖2表明，來自減毒水痘病毒岡株的基因62的PCR產(chǎn)物(帶1)被NaeⅠ和BssHⅡ切成3個片段(402bp、264bp、116bp)。而來自從強毒親株和患者分離出的新鮮野生型病毒株的PCR產(chǎn)物(帶2-帶3)沒有被這些限制酶切斷，仍然是一個片段。
從以上結果可以確認，至少是從水痘病毒基因62的第2107堿基到2229堿基為止的DNA片段可被限制酶NaeⅠ和BssHⅡ切，經(jīng)鑒定，帶有可被切成2個或3個片段的DNDA序列的水痘病毒可作為減毒水痘病毒岡株或容許作為減毒水痘病毒的病毒株。
效應質(zhì)粒pPar-G62用強毒親株的基因62的克隆構建。另外從減毒岡株的基因62獲得的9個克隆中選擇圖1的克隆9(含有13個堿基置換和8個氨基酸置換的克隆)，構建效應質(zhì)粒pVac-G62。1.2.轉染將CV1細胞于35mm塑料皿中以105細胞/dish的比例進行培養(yǎng)，通過利用了SuperFect(QIAGEN GmbH)的脂(質(zhì))轉染法使各個質(zhì)粒共轉染CV1細胞。在共轉染的各個反應液中含有0.25μg的報告質(zhì)粒和不同量(0-1μg)的效應質(zhì)粒。而在共轉染中，通過添加載體pUC19，可將DNA的總量保持在2.5μg。所有實驗(對于各個DNA共轉染)都至少重復3次。1.3.CAT分析共轉染44小時后，測定細胞總蛋白和CAT量。將細胞用磷酸緩沖生理鹽水洗3次，用溶解緩沖液(德國Boehringer Mannheim公司制造)溶解。各個提取物的CAT濃度通過CAT ELISA試劑盒(德國Boehringer Mannheim公司制造)確定，相對于通過Bio-Rad蛋白質(zhì)試劑(美國Bio-Rad公司制造)確定的蛋白質(zhì)質(zhì)量進行標準化。2．結果進行試驗的VZV基因的所有啟動子都幾乎沒有顯示出背景活性。即、在沒有對效應質(zhì)粒進行共轉染時，幾乎沒有觀察到CAT的表達。
來自減毒岡株的基因4啟動子通過強毒親株和減毒岡株的各個基因62表達產(chǎn)物(IE62)反向激活(圖3A)。但當效應質(zhì)粒的量低時，強毒親株的IE62表現(xiàn)出比減毒岡株的IE62更強的轉錄活性。即當效應質(zhì)粒的量最低(0.25μg)時，強毒親株IE62的轉錄活性是減毒岡株IE62的7.8倍。隨著效應質(zhì)粒量的增加，兩者活性之間的差距變小。
另外從對報告質(zhì)粒pCAT-IE62進行轉染的細胞幾乎沒有檢測出CAT活性(圖3B)。
另外含有VZV基因28和29的各個啟動子區(qū)的pCAT-Pol和pCAT-MDBP(圖3 C和D)以及含有基因68的啟動子序列的pCAT-gE(圖3E)被強毒親株和減毒岡株的IE62激活。這些CAT活性與效應質(zhì)粒量的依賴曲線類似于pCAT-IE4，而強毒親株IE62比減毒岡株IE62表現(xiàn)出更強的活性。特別是當效應質(zhì)粒量為最低時，強毒親株IE62的活性分別為減毒岡株的7.6倍、5.6倍和1.8倍。然而在對含有基因14的啟動子區(qū)的pCAT-gC進行轉染的細胞中，檢測不出CAT活性(圖3F)。
從以上結果可以看出，VZV基因62的表達產(chǎn)物(IE62)激活前早期基因4(ORF4)、早期基因28(DNA聚合酶Pol)和基因29(主要DNA結合蛋白MDBP)、和后期的基因68(糖蛋白E:gE)的啟動子。而更重要的是減毒岡株IE62的轉錄活性往往比強毒親株IE62更低。即在減毒岡株的基因62中的變異影響病毒復制，這可使VZV減毒。
工業(yè)實用性利用本申請的發(fā)明可以簡便而且正確地區(qū)別減毒水痘病毒岡株或容許作為減毒水痘病毒的水痘病毒株和其它的野生型水痘病毒和減毒水痘病毒的強毒親株。另外利用本申請的發(fā)明可以大量制造活疫苗用的減毒水痘病毒抗原。利用這些發(fā)明疫苗制造和疫苗接種的安全性以及有效性可以通過更可靠的方式獲得。
序列表<110>財團法人阪大微生物病研究會<120>減毒水痘病毒岡株的基因62和利用基因62的減毒水痘活疫苗用病毒株的鑒定方法<140>PCT/JP99/05476<141>1999-10-05<150>JP11-48964<151>1999-02-25<160>3<210>1<211>4226<212>DNA<213>水痘帶狀皰疹病毒<220><221>CDS<222>229..4158<400>1ATACTATGGT CCATGAACTT CCCGCCTCGA GTCTCGTCCA ATCACTACAT CGTCTTATCA 60TTAAGAATAT TTACACGGTG ACGACACGGG GAGGAAATAT GCGGTCGAGG GGGGGGCACA 120ACACGTTTTA AGTACTGTTG GAACTCCCTC ACCAACCGCA ATCGCAATCC TTTGAAGGCT 180GCGAGAGCGT TTGGAAAACT CGGGTACGTC TAAATTCACC CCAGTGCG ATG GAT 234Met Asp1ACG CCG CCG ATG CAG CGC TCT ACA CCC CAA CGC GCG GGG TCG CCT GAT 282Thr Pro Pro Met Gln Arg Ser Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser Pro Asp5 10 15ACT TTG GAG TTA ATG GAC CTG TTG GAC GCG GCC GCC GCG GCC GCC GAA 330Thr Leu Glu Leu Met Asp Leu Leu Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu
20 25 30CAC AGG GCC CGG GTG GTC ACC TCG AGT CAG CCT GAC GAT CTA CTA TTT378His Arg Ala Arg Val Val Thr Ser Ser Gln Pro Asp Asp Leu Leu Phe35 40 45 50GGA GAG AAC GGG GTC ATG GTG GGA CGG GAA CAT GAG ATC GTT TCA ATT426Gly Glu Asn Gly Val Met Val Gly Arg Glu His Glu Ile Val Ser Ile55 60 65CCC TCC GTA TCG GGA CTT CAA CCA GAA CCC AGA ACG GAA GAT GTT GGC474Pro Ser Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Pro Arg Thr Glu Asp Val Gly70 75 80GAA GAG CTA ACA CAA GAC GAC TAC GTA TGC GAG GAC GGT CAG GAT CTA521Glu Glu Leu Thr Gln Asp Asp Tyr Val Cys Glu Asp Gly Gln Asp Leu85 90 95ATG GGC TCG CCT GTA ATC CCG CTG GCC GAG GTC TTC CAC ACC CGA TTC570Met Gly Ser Pro Val Ile Pro Leu Ala Glu Val Phe His Thr Arg Phe100 105 110TCG GAG GCC GGC GCG CGA GAA CCA ACA GGA GCC GAT CGC TCC GTC GAG618Ser Glu Ala Gly Ala Arg Glu Pro THr Gly Ala Asp Arg Ser Leu Glu115 120 125 130ACA GTC TCT CTC GGA ACG AAG CTT GCT AGG TCT CCA AAA CCA CCG ATG666Thr Val Ser Leu Gly Thr Lys Leu Ala Arg Ser Pro Lys Pro Pro Met135 140 145AAC GAT GGG GAA ACG GGC AGA GGT ACG ACC CCT CCG TTC CCG CAG GCC714Asn Asp Gly Glu Thr Gly Arg Gly Thr Thr Pro Pro Phe Pro Gln Ala150 155 160TTC TCC CCT GTA TCC CCC GCG TCT CCT GTT GGA GAC GCC GCC GGG AAC762Phe Ser Pro Val Ser Pro Ala Ser Pro Val Gly Asp Ala Ala Gly Asn165 170 175GAT CAA CGG GAA GAC CAG CGG TCT ATA CCC CGA CAA ACG ACG AGA GGA810Asp Gln Arg Glu Asp Gln Arg Ser Ile Pro Arg Gln Thr Thr Arg Gly180 185 190AAT TCA CCA GGT TTG CCG TCG GTG GTC CAT CGA GAC AGA CAA ACT CAG858Asn Ser Pro Gly Leu Pro Ser Val Val His Arg Asp Arg Gln Thr Gln195 200 205 210TCC ATC TCG GGT AAA AAG CCG GGC GAT GAG CAA GCG GGT CAT GCG CAT906Ser Ile Ser Gly Lys Lys Pro Gly Asp Glu Gln Ala Gly His Ala His215 220 225GCA TCG GGG GAC GGA GTA GTT CTC CAG AAA ACT CAA CGG CCC GCT CAG 954Ala Ser Gly Asp Gly Val Val Leu Gln Lys Thr Gln Arg Pro Ala Gln230 235 240GGA AAG AGC CCG AAG AAA AAG ACT TTG AAG GTT AAG GTC CCA CTC CCG 1002Gly Lys Ser Pro Lys Lys Lys Thr Leu Lys Val Lys Val Pro Leu Pro245 250 255GCG CGG AAA CCC GGT GGA CCT GTA CCC GGC CCG GTT GAG CAA TTG TAC 1050Ala Arg Lys Pro Gly Gly Pro Val Pro Gly Pro Val Glu Gln Leu Tyr260 265 270CAC GTC CTT TCG GAC AGC GTT CCC GCT AAG GGG GCA AAG GCG GAC CTG 1098His Val Leu Ser Asp Ser Val Pro Ala Lys Gly Ala Lys Ala Asp Leu275 280 285 290CCG TTT GAG ACC GAT GAT ACC CGC CCA AGG AAA CAT GAT GCC CGG GGT 1146Pro Phe Glu Thr Asp Asp Thr Arg Pro Arg Lys His Asp Ala Arg Gly295 300 305ATA ACA CCT CGC GTC CCT GGA CGT TCG TCG GGG GGC AAA CCT AGA GCG 1194Ile Thr Pro Arg Val Pro Gly Arg Ser Ser Gly Gly Lys Pro Arg Ala310 315 320TTT TTG GCC CTG CCG GGA AGA TCC CAC GCA CCA GAC CCG ATT GAG GAT 1242Phe Leu Ala Leu Pro Gly Arg Ser His Ala Pro Asp Pro Ile Glu Asp325 330 335GAC AGC CCA GTG GAG AAA AAG CCA AAG AGT CGT GAG TTT GTT TCG TCT 1290Asp Ser Pro Val Glu Lys Lys Pro Lys Ser Arg Glu Phe Val Ser Ser340 345 350TCA TCC TCT TCC TCG TCG TGG GGA TCG TCA TCG GAG GAT GAA GAC GAT 1338Ser Ser Ser Ser Ser Ser Trp Gly Ser Ser Ser Glu Asp Glu Asp Asp355 360 365 370GAA CCC CGG CGC GTT TCG GTG GGA AGT GAA ACT ACA GGC AGC AGG TCC 1386Glu Pro Arg Arg Val Ser Val Gly Ser Glu Thr Thr Gly Ser Arg Ser375 380 385GGA CGC GAA CAC GCC CCT TCC CCG TCA AAT TCG GAT GAT TCG GAC TCA 1434Gly Arg Glu His Ala Pro Ser Pro Ser Asn Ser Asp Asp Ser Asp Ser390 395 400AAT GAT GGT GGG TCG ACG AAA CAA AAT ATC CAA CCG GGA TAT CGA TCC 1482Asn Asp Gly Gly Ser Thr Lys Gln Asn Ile Gln Pro Gly Tyr Arg Ser405 410 415ATC AGC GGT CCC GAT CCG AGG ATT CGT AAG ACC AAA CGT CTT GCG GGG 1530Ile Ser Gly Pro Asp Pro Arg Ile Arg Lys Thr Lys Arg Leu Ala Gly420 425 430GAA CCG GGG CGC CAG AGA CAG AAA TCA TTT TCC CTG CCG CGA TCC AGA 1578Glu Pro Gly Arg Gln Arg Gln Lys Ser Phe Ser Leu Pro Arg Ser Arg435 440 445 450ACC CCG ATA ATT CCC CCG GTG TCG GGG CCG CTC ATG ATG CCC GAC GGA 1626Thr Pro Ile Ile Pro Pro Val Ser Gly Pro Leu Met Met Pro Asp Gly455 460 465AGC CCT TGG CCC GGA TCG GCG CCC CTC CCA TCC AAC AGG GTG CGG TTT 1674Ser Pro Trp Pro Gly Ser Ala Pro Leu Pro Ser Asn Arg Val Arg Phe
470 475 480GGA CCG TCC GGG GAG ACC AGA GAG GGT CAC TGG GAG GAT GAG GCT GTG 1722Gly Pro Ser Gly Glu Thr Arg Glu Gly His Trp Glu Asp Glu Ala Val485 490 495AGA GCG GCG CGG GCT CGT TAC GAG GCC TCA ACT GAA CCC GTG CCG CTT 1770Arg Ala Ala Arg Ala Arg Tyr Glu Ala Ser Thr Glu Pro Val Pro Leu500 505 510TAC GTG CCG GAG TTG GGA GAT CCG GCT AGA CAG TAC CGC GCG CTG ATT 1818Tyr Val Pro Glu Leu Gly Asp Pro Ala Arg Gln Tyr Arg Ala Leu Ile515 520 525 530AAC CTG ATC TAC TGT CCA GAC AGA GAC CCT ATA GCA TGG CTC CAG AAC 1866Asn Leu Ile Tyr Cys Pro Asp Arg Asp Pro Ile Ala Trp Leu Gln Asn535 540 545CCC AAG CTG ACC GGT GTC AAC TCG GCC CTG AAC CAG TTC TAC CAA AAG 1914Pro Lys Leu Thr Gly Val Asn Ser Ala Leu Asn Gln Phe Tyr Gln Lys550 555 560CTG TTG CCA CCG GGA CGG GCG GGT ACC GCC GTT ACG GGG AGC GTA GCG 1962Leu Leu Pro Pro Gly Arg Ala Gly Thr Ala Val Thr Gly Ser Val Ala565 570 575TCT CCC GTT CCG CAT GTA GGC GAA GCC ATG GCC ACG GGG GAG GCC CTC 2010Ser Pro Val Pro His Val Gly Glu Ala Met Ala Thr Gly Glu Ala Leu580 585 590TGG GCT CTC CCC CAC GCG GCC GCG GCC GTG GCT ATG AGC CGT CGG TAC 2058Trp Ala Leu Pro His Ala Ala Ala Ala Val Ala Met Ser Arg Arg Tyr595 600 605 610GAC CGG GCC CAA AAA CAC TTT ATC CTA CAG AGT CTC CGC AGA GCC TTT 2106Asp Arg Ala Gln Lys His Phe Ile Leu Gln Ser Leu Arg Arg Ala Phe615 620 625GCC AGC ATG GCA TAC CCC GAG GCA ACG GGC TCC AGT CCG GCG GCG CGG 2154Ala Ser Met Ala Tyr Pro Glu Ala Thr Gly Ser Ser Pro Ala Ala Arg630 635 640ATC TCC CGC GGT CAC CCT TCT CCA ACA ACC CCG GCC ACA CAG ACT CCC 2202Ile Ser Arg Gly His Pro Ser Pro Thr Thr Pro Ala Thr Gln Thr Pro645 650 655GAC CCT CAG CCG TCG GCC GCC GCA CGC TCT CTT TCT GTG TGT CCA CCG 2250Asp Pro Gln Pro Ser Ala Ala Ala Arg Ser Leu Ser Val Cys Pro Pro660 665 670GAT GAT CGT TTA CGA ACT CCG CGC AAG CGC AAG TCC CAG CCA GTC GAG 2298Asp Asp Arg Leu Arg Thr Pro Arg Lys Arg Lys Ser Gln Pro Val Glu675 680 685 690AGC AGA AGC CTC CTC GAC AAG ATT AGG GAG ACA CCC GTC GCG GAC GCC 2346Ser Arg Ser Leu Leu Asp Lys Ile Arg Glu Thr Pro Val Ala Asp Ala695 700 705CGG GTT GCA GAC GAT CAT GTG GTT TCC AAG GCC AAG AGG CGG GTA TCC 2394Arg Val Ala Asp Asp His Val Val Ser Lys Ala Lys Arg Arg Val Ser710 715 720GAG CCC GTG ACC ATC ACC TCG GCC CCT GTG GTG GAT CCC CCC GCC GTA 2442Glu Pro Val Thr Ile Thr Ser Gly Pro Val Val Asp Pro Pro Ala Val725 730 735ATA ACG ATG CCA CTT GAC GGA CCG GCC CCA AAC GGG GGA TTT CGG CGT 2490Ile Thr Met Pro Leu Asp Gly Pro Ala Pro Asn Gly Gly Phe Arg Arg740 745 750ATT CCC CGG GGG GCC CTG CAT ACC CCG GTC CCG TCG GAC CAG GCT CGC 2538Ile Pro Arg Gly Ala Leu His Thr Pro Val Pro Ser Asp Gln Ala Arg755 760 765 770AAG GCG TAC TGT ACC CCC GAA ACC ATC GCC CGT CTG GTC GAC GAC CCA2586Lys Ala Tyr Cys Thr Pro Glu Thr Ile Ala Arg Leu Val Asp Asp Pro775 780 785TTG TTT CCC ACG GCC TGG CGC CCT GCG CTA AGC TTT GAT GCC GGC GCC 2634Leu Phe Pro Thr Ala Trp Arg Pro Ala Leu Ser Phe Asp Pro Gly Ala790 795 800TTG GCG GAA ATC GCC GCT CGG CGT CCG GGC GGA GGA GAC CGA CGG TTT 2682Leu Ala Glu Ile Ala Ala Arg Arg Pro Gly Gly Gly Asp Arg Arg Phe805 810 815GGT CCA CCC AGC GCA GTG GAG GCG CTG CGA CGG AGG TGC GCC TGG ATG 2730Gly Pro Pro Ser Gly Val Glu Ala Leu Arg Arg Arg Cys Ala Trp Met820 825 830CGG CAG ATC CCA GAC CCG GAG GAT GTG AGG CTT CTG ATC ATC TAC GAT 2778Arg Gln Ile Pro Asp Pro Glu Asp Val Arg Leu Leu Ile Ile Tyr Asp835 840 845 850CCG TTG CCC GGA GAG GAC ATC AAC GGC CCC CTC GAG AGC ACC CTC GCG 2826Pro Leu Pro Gly Glu Asp Ile Asn Gly Pro Leu Glu Ser Thr Leu Ala855 860 865ACA GAT CCG GGA CCG TCA TGG AGT CCA TCC CGA GGG GGA CTG TCT GTG 2874Thr Asp Pro Gly Pro Ser Trp Ser Pro Ser Arg Gly Gly Leu Ser Val870 875 880GTC CTG GCA GCC CTG AGT AAC CGG TTG TGC CTG CCG AGC ACT CAT GCC 2922Val Leu Ala Ala Leu Ser Asn Arg Leu Cys Leu Pro Ser Thr His Ala885 890 895TGG GCC GGG AAC TGG ACC GGC CCG CCG GAC GTG TCC GCT TTG AAC GCC 2970Trp Ala Gly Asn Trp Thr Gly Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Asn Ala900 905 910CGG GGC GTT TTA TTA CTG TCG ACC CGA GAC CTG GCC TTT GCC GGG GCC 3018Arg Gly Val Leu Leu Leu Ser Thr Arg Asp Leu Ala Phe Ala Gly Ala915 920 925 930GTC GAG TAT CTA GGC TCG CGG TTG GCC TCT GCC CGG CGC CGG TTG CTG 3066Val Glu Tyr Leu Gly Ser Arg Leu Ala Ser Ala Arg Arg Arg Leu Leu925 940 945GTG TTG GAC GCG GTG GCC CTC GAG AGG TGG CCC AGG GAT GGA CCC GCT 3114Val Leu Asp Ala Val Ala Leu Glu Arg Trp Pro Arg Asp Gly Pro Ala950 955 960TTG TCT CAG TAT CAC GTG TAC GTC CGG GCC CCG GCG CGA CCG GAC GCC 3162Leu Ser Gln Tyr His Val Tyr Val Arg Ala Pro Ala Arg Pro Asp Ala965 970 975CAG GCC GTC GTC CGA TGG CCA GAC TCG GCG GTC ACA GAA GGA CTC GCC 3210Gln Ala Val Val Arg Trp Pro Asp Ser Ala Val Thr Glu Gly Leu Ala980 985 990CGG GCC GTG TTT GCA TCG TCG CGC ACC TTT GGG CCA GCG AGT TTT GCT 3258Arg Ala Val Phe Ala Ser Ser Arg Thr Phe Gly Pro Ala Ser Phe Ala995100010051010CGT ATC GAG ACT GCG TTT GCC AAC CTG TAC CCG GGC GAA CAA CCC CTG 3306Arg Ile Glu Thr Ala Phe Ala Asn Leu Tyr Pro Gly Glu Gln Pro Leu101510201025TGT TTG TGC CGC GGT GGG AAC GTC GCA TAC ACC GTG TGT ACC CGC GCG 3354Cys Leu Cys Arg Gly Gly Asn Val Ala Tyr Thr Val Cys Thr Arg Ala103010351040GGC CCC AAG ACC CGC GTC CCC CTG TCG CCC CGT GAA TAC CGG CAG TAC 3402Gly Pro Lys Thr Arg Val Pro Leu Ser Pro Arg Glu Tyr Arg Gln Tyr104510501055GTG CTG CCG GGT TTT GAC GGT TGC AAG GAC CTC GCG CGA CAG TCT CGG 3450Val Leu Pro Gly Phe Asp Gly Cys Lys Asp Leu Ala Arg Gln Ser Arg106010651070GGT CTG GGG CTC GGG GCA GCC GAC TTT GTG GAC GAG GCG GCA CAT AGC 3498Gly Leu Gly Leu Gly Ala Ala Asp Phe Val Asp Glu Ala Ala His Ser1075 108010851090CAC CGC GCA GCA AAC CGA TGG GGC CTG GGT GCC GCG CTT CGA CCC GTC 3546His Arg Ala Ala Asn Arg Trp Gly Leu Gly Ala Ala Leu Arg Pro Val109511001105TTC CTT CCC GAG GGA CGG AGA CCG GGG GCC GCC GGG CCG GAG GCC GGC 3594Phe Leu Pro Glu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Ala Gly Pro Glu Ala Gly111011151120GAC GTA CCC ACC TGG GCG AGG GTG TTT TGC CGC CAC GCC CTG CTG GAA 3642Asp Val Pro Thr Trp Ala Arg Val Phe Cys Arg His Ala Leu Leu Glu112511301135CCC GAC CCT GCC CCA GAA CCA CTC GTG CTT CCA CCC GTG GCC GGT CGG 3690Pro Asp Pro Ala Ala Glu Pro Leu Val Leu Pro Pro Val Ala Gly Arg114011451150TCG GTG GCG CTG TAT GCG TCG GCG GAC GAG GCT CGG AAT GCC CTC CCC 3738Ser Val Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Asp Glu Ala Arg Asn Ala Leu Pro1155 116011651170CCG ATT CCC AGA GTA ATG TGG CCG CCC GGT TTT GGG GCC GCG GAG ACG 3786Pro Ile Pro Arg Val Met Trp Pro Pro Gly Phe Gly Ala Ala Glu Thr117511801185GTG TTG GAG GGG AGC GAC GGA ACA CGG TTC GTG TTC GGA CAC CAC GGG 3834Val Leu Glu Gly Ser Asp Gly Thr Arg Phe Val Phe Gly His His Gly119011951200GGC TCG GAA CGG CCG GCA GAA ACC CAG GCG GGG CGA CAG CGG CGC ACC 3882Gly Ser Glu Arg Pro Ala Glu Thr Gln Ala Gly Arg Gln Arg Arg Thr120512101215GCA GAC GAC AGA GAA CAC GCT TTG GAG CCG GAC GAT TGG GAG GTG GGG 3930Ala Asp Asp Arg Glu His Ala Leu Glu Pro Asp Asp Trp Glu Val Gly122012251230TGT GAA GAC GCG TGG GAC AGC GAG GAG GGG GGC GGG GAC GAC GGG GAC 3978Cys Glu Asp Ala Trp Asp Ser Glu Glu Gly Gly Gly Asp Asp Gly Asp1235 124012451250GCA CCG GGG TCA TCC TTT GGG GTG AGC ATC GTG TCG GTG GCC CCG GGT 4026Ala Pro Gly Ser Ser Phe Gly Val Ser Ile Val Ser Val Ala Pro Gly125512601265GTG CTG CGA GAC CGC CGG GTG GGC TTG CGC CCG GCG GTC AAG GTG GAG 4074Val Leu Arg Asp Arg Arg Val Gly Leu Arg Pro Ala Val Lys Val Glu127012751280CTG TTG TCC TCG TCC TCG TCC TCC GAG GAC GAG GAC GAT GTG TGG GGA 4122Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Glu Asp Asp Val Trp Gly128512901295GGG CGC GGG GGG AGG AGC CCC CCG CAG AGT CGG GGG TGACGGAGTC4168Gly Arg Gly Gly Arg Ser Pro Pro Gln Ser Arg Gly130013051310CCCTCCTTTT CTCGTGAGCG CCACTGGCGC GCGGACTGTT TGTTGTTTGT TAATAAAA 4226<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<400>2GATCAAAGCT TAGCGCAG 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工合成序列<400>3CCTATAGCAT GGCTCCAG 18
權利要求
1．減毒水痘病毒岡株的基因62，序列1給出的堿基序列中，至少包含以下(a)～(d)的堿基置換(a)2110堿基A置換為G；(b)3100堿基A置換為G；(c)3818堿基T置換為C；和(d)4006堿基A置換為G。
2．權利要求1的減毒水痘病毒岡株的基因62，它除了包含(a)～(d)堿基置換外，還包含以下(e)～(g)中至少一個以上的堿基置換(e)1251堿基A置換為G；(f)2226堿基A置換為G；和(g)3657堿基A置換為G。
3．權利要求2的減毒水痘病毒岡株的基因62，它除了包含(a)～(d)堿基置換、以及(e)～(g)中至少一個以上的堿基置換外，還包含以下(h)～(o)中的至少一個以上的堿基置換(h)162堿基T置換為C；(i)225堿基T置換為C；(j)523堿基T置換為C；(k)1565堿基T置換為C；(l)1763堿基T置換為C；(m)2652堿基T置換為C；(n)4052堿基T置換為C；和(o)4193堿基T置換為C。
4．對權利要求1至3中任一個基因62進行編碼的DNA片段、由含有堿基置換部分的10個以上堿基對的序列構成的DNA片段。
5．權利要求1的的減毒水痘病毒岡株的基因62編碼的蛋白質(zhì)，序列1給出的氨基酸序列中至少包含以下(A)～(D)的氨基酸置換(A)628氨基酸殘基Ser置換為Gly；(B)958氨基酸殘基Arg置換為Gly；(C)1197氨基酸殘基Val置換為Ala；和(D)1260氨基酸殘基Ile置換為Val。
6．權利要求5的蛋白質(zhì)，它除了包含(A)～(D)的氨基酸置換外，至少還包含以下(E)～(H)中至少一個以上的氨基酸置換。(E)99氨基酸殘基Met置換為Thr；(F)446氨基酸殘基Leu置換為Pro；(G)512氨基酸殘基Val置換為Ala；和(H)1275氨基酸殘基Leu置換為Ser。
7．權利要求5或6的蛋白質(zhì)的一部分，是由包含氨基酸置換部分的5個以上氨基酸殘基的序列構成的多肽。
8．以權利要求5或6的蛋白質(zhì)、或權利要求7的多肽作為抗原獲得的抗體或細胞毒T淋巴細胞。
9．減毒水痘病毒株，其中病毒基因組的基因62是權利要求1至3中的任一個基因62。
10．減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇含有與權利要求1至3中的任一個的基因62的堿基置換相同的堿基置換的水痘病毒。
11．減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇含有權利要求4的DNA片段進行雜交的基因組的水痘病毒。
12．減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇產(chǎn)生權利要求8抗體或細胞毒T淋巴細胞識別的抗原的水痘病毒。
13．減毒水痘病毒岡株或減毒水痘病毒株的鑒定方法，其特征是選擇在序列1的堿基序列中至少從第2107堿基到第2229堿基的DNA序列被限制酶NaeⅠ以及 BssHⅡ切斷，該DNA序列被切割為2或3個片段的水痘病毒。
14．權利要求13的鑒定方法中，DNA序列是分別以由序列2的堿基序列構成的寡核苷酸和序列3的堿基序列構成的寡核苷酸作為引物，以水痘病毒的基因62為模板，通過PCR法制備的。
15．通過由權利要求10至14中任一個方法鑒定的減毒水痘病毒株。
16．以權利要求9或15的減毒水痘病毒株作為種病毒的減毒活水痘疫苗。
全文摘要
本申請?zhí)峁p毒水痘病毒岡株的基因62,序列1給出的堿基序列中至少包含以下(a)～(d)的堿基置換:(a)2110堿基A置換為G;(b)3100堿基A置換為G;(c)3818堿基T置換為C;(d)4006堿基A置換為G。另外本申請還提供通過利用基因62鑒別用作減毒水痘活疫苗的減毒水痘病毒岡株和其它容許用作減毒水痘活疫苗的病毒株的方法。
文檔編號C12N7/04GK1306574SQ9980758
公開日2001年8月1日 申請日期1999年10月5日 優(yōu)先權日1999年2月25日
發(fā)明者五味康行, 今川忠, 納壽一郎, 高橋理明, 山西弘一 申請人:財團法人阪大微生物病研究會