專利名稱：擬南芥hmp－p激酶和tmp－pp酶及其在除草劑篩選中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選抑制如下酶活性的除草化合物的方法，所述酶為2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶單磷酸激酶(HMP-P激酶)或硫胺素單磷酸焦磷酸化酶(2-甲基-4-氨基-5-(羥甲基)嘧啶二磷酸4-甲基-5-(2-磷酸乙基)噻唑2-甲基-4-氨基嘧啶-5-次甲基轉(zhuǎn)移酶)或TMP-PP酶，這兩種酶在從頭硫胺素生物合成中均有酶促活性。本發(fā)明涉及由此鑒定的除草化合物控制不期望的植被(vegetation)生長的用途。本發(fā)明還可應(yīng)用于除草劑抗性植物、植物組織、植物種子及植物細(xì)胞的開發(fā)。
除草劑用來控制不期望的植被(如作物田間的雜草)的用途已經(jīng)十分普遍。每年除草劑銷售超過150億美元。盡管應(yīng)用這樣廣泛，雜草控制對農(nóng)民而言仍舊為重要的和費(fèi)錢的問題。
有效利用除草劑需要大量的管理工作。例如，應(yīng)用的時(shí)間和方法以及雜草植物生長的階段對于用除草劑取得良好的效果至關(guān)重要。由于多種雜草種類對除草劑有抗性，制備有效除草劑變得日益重要?，F(xiàn)在可利用采取重組DNA技術(shù)的高通量篩選方法發(fā)現(xiàn)新除草劑?？芍亟M生產(chǎn)對植物生長和發(fā)育十分重要的代謝酶類，并用做篩選新型酶活性抑制劑的除草劑靶標(biāo)。通過這樣的篩選發(fā)現(xiàn)的新抑制劑可被用作控制不期望的植被生長的除草劑。
遺憾地是，在土壤中顯示較高效力、較寬的雜草譜劑且降解更快的除草劑也具有更大的作物植物毒性。一種解決此問題的方法是培育抗或耐受除草劑的作物。耐受除草劑的作物雜交品種或變種可允許使用除草劑殺死雜草而無損害作物的風(fēng)險(xiǎn)。耐受的形成使得可向作物應(yīng)用除草劑，而此前由于作物對除草劑的敏感，該除草劑不能應(yīng)用或限制使用(例如在緊急情況前才應(yīng)用)。例如，美國專利4761373(Aderson等)涉及對多種咪唑啉酮或氨磺酰除草劑有抗性的植物。所述抗性通過改變的乙酰羥酸合酶(AHAS)賦予。美國專利4975374(Goodman等)涉及含有編碼突變谷氨酰胺合成酶(GS)基因的植物細(xì)胞和植物，其可抵抗已知抑制GS的除草劑，如phosphinothricin和甲硫氨酸sulfoximine。美國專利5013659(Bedbrook等)涉及表達(dá)突變乙酰乳酸合酶的植物，該酶賦予植物抵抗磺酰尿除草劑類的抑制。美國專利5162602(Somers等)公開了耐受環(huán)己二酮除草劑類及芳氧基苯氧基丙酸除草劑類的植物。通過改變的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)賦予耐受性。定義為明確起見，用于本說明書的一些術(shù)語定義如下可活化DNA序列在基因組尤其是植物基因組中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的DNA序列?？苫罨疍NA序列與基因組內(nèi)源的靶基因互補(bǔ)。當(dāng)可活化DNA序列導(dǎo)入并在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其抑制靶基因的表達(dá)?？膳c本發(fā)明聯(lián)合使用的可活化DNA分子包括那些編碼或起顯性抑制劑作用的分子，如可翻譯或非翻譯有義序列，其能在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物中破壞基因功能，以陽性鑒定一種或多種植物正常生長和發(fā)育必需的基因。一種優(yōu)選的可活化DNA序列是反義DNA序列。靶基因優(yōu)選地編碼一種蛋白質(zhì)，如生物合成酶、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物或植物生長或生存必需的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，靶基因編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。反義序列與靶基因的相互作用的結(jié)果導(dǎo)致靶基因表達(dá)基本上被抑制，從而殺死植物，或至少抑制正常植物生長或發(fā)育。
可活化DNA構(gòu)建體一種重組DNA構(gòu)建體，包含一種與可活化DNA序列有效連接地合成啟動子，當(dāng)其導(dǎo)入細(xì)胞(期望地，植物細(xì)胞)中時(shí)不表達(dá)，即為沉默的，除非存在一種能結(jié)合并活化該合成啟動子的完整雜合轉(zhuǎn)錄因子。將可活化的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞、組織或植物以形成能表達(dá)可活化DNA序列的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因品系。
輔因子酶催化反應(yīng)中所需要的天然反應(yīng)物，如有機(jī)分子或金屬離子。輔因子是例如NAD(P)、核黃素(包括FAD和FMN)、葉酸、鉬蛋白(molybdopterin)、硫胺素、生物素、硫辛酸、泛酸和輔酶A、S-腺苷甲硫氨酸、磷酸吡哆醛、泛醌、甲基萘醌。任選地輔因子可再生和重利用。
偶聯(lián)合成一種酶促生物合成，其中終產(chǎn)物通過兩個或多個順序酶促步驟合成，其中在生物化學(xué)途徑的一個或多個分支中用于第一個酶促步驟的底物補(bǔ)加入反應(yīng)混合物中，通過第一個酶轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物被第二個酶或多個酶轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物而無需添加中間產(chǎn)物。
“嵌合”用于表示一種諸如載體或基因的DNA序列，其由通過重組DNA技術(shù)相互融合的不同來源的一個以上DNA序列構(gòu)成，得到一種非天然存在的、尤其是不存在于待轉(zhuǎn)化的植物中的DNA序列。
“DNA改組.”DNA改組是在DNA分子中導(dǎo)入(優(yōu)選隨機(jī)地)突變或重排的方法，或者優(yōu)選隨機(jī)地產(chǎn)生兩個或多個DNA分子之間的DNA序列交換。得自DNA改組的DNA分子是這樣的改組DNA分子，其是來自至少一個模板DNA分子的非天然存在的DNA分子。改組DNA編碼一種相對由模板DNA編碼的酶而言經(jīng)修飾的酶，優(yōu)選地具有相對于模板DNA編碼的酶而言改變的生物學(xué)活性。
酶活性在此處是指酶催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的能力。一種酶的底物包括酶的天然底物，也包括天然底物的類似物，其也可被酶轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物。酶的活性的測量是通過例如，在一定時(shí)間階段后測定反應(yīng)中產(chǎn)物的量，或是通過測定在一定時(shí)間階段后反應(yīng)混合物中剩余底物的量。也可通過測定一定時(shí)間階段后反應(yīng)混合物中剩余的反應(yīng)未使用之輔因子的量，或通過測定在一定時(shí)間階段后反應(yīng)混合物中使用的輔因子的量的方法測定酶活性。還可通過測定在一定時(shí)間階段后反應(yīng)混合物中剩余自由能或富含能量分子供體的量(ATP，磷酸烯醇式丙酮酸，乙酰磷酸或磷酸肌酸)，或通過測定在一定時(shí)間階段后反應(yīng)混合物中使用的自由能或富含能量分子供體的量(ADP，丙酮酸，乙酸或肌酸)測定酶的活性。
表達(dá)是指植物中內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在反義構(gòu)建體中，例如，表達(dá)可僅指反義DNA的轉(zhuǎn)錄。
基因是指編碼序列和相關(guān)的調(diào)節(jié)序列，其中編碼序列被轉(zhuǎn)錄為RNA，如mRNA、rRNA,、tRNA、snRNA或是反義RNA。調(diào)節(jié)序列的例子是啟動子序列，5’和3’非翻譯序列及終止序列。其它可存在的元件是例如內(nèi)含子。
除草劑一種用于殺死或抑制植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織的生長的化學(xué)物質(zhì)。
異源DNA序列一種DNA序列，其不與將導(dǎo)入該DNA序列的宿主細(xì)胞天然相關(guān)，包括非天然存在的固有DNA序列的多重拷貝。
同源DNA序列一種DNA序列，其與待導(dǎo)入的宿主細(xì)胞天然相關(guān)。
抑制物一種滅活蛋白質(zhì)的酶促活性的化學(xué)物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)如對于植物生長或生存必需的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、生物合成酶、受體、信號轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在本發(fā)明上下文中，抑制物是一種滅活植物HMP-P激酶/TMP-PP酶之酶促活性的化學(xué)物質(zhì)。當(dāng)應(yīng)用于植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織時(shí)，此處所用術(shù)語“除草劑”定義一種抑制物。
等基因的除了可因存在或不存在轉(zhuǎn)基因不同之外遺傳上相同的植物。
分離的在本發(fā)明上下文中，分離的DNA分子或分離的酶是DNA分子或酶，由于人工其離開自身天然環(huán)境而存在，并因此不再是天然產(chǎn)物。一種分離的DNA分子或酶可以純化形式存在或存在于非天然環(huán)境如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
成熟蛋白質(zhì)天然靶定于一種細(xì)胞器如葉綠體且在該處除去轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。
最小啟動子啟動子元件，尤其是TATA元件，其無活性或在無上游活化時(shí)具有大大降低的啟動子活性。存在適當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，最小啟動子起作用以允許轉(zhuǎn)錄。
修飾的酶活性與植物中天然存在不同的酶活性(即在無直接或間接人類對這種活性操作時(shí)天然存在的酶活性)，其耐受抑制天然存在的酶活性的抑制物。
有效連接是指，如果兩個序列如此排列使得調(diào)節(jié)序列可影響編碼DNA序列的表達(dá)，則調(diào)節(jié)DNA序列與編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列可稱為“可操作地連接”或“與之相關(guān)聯(lián)”。
植物是指任何植物，尤其是種子植物。
植物細(xì)胞是指植物的結(jié)構(gòu)和生理單元，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。
植物細(xì)胞可呈分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞形式，或作為高等有序單元如例如植物組織或植物器官的一部分。
植物材料是指葉、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵細(xì)胞、合子、胚、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)、或任一其它部分或植物產(chǎn)物。
前蛋白天然靶定于細(xì)胞器如葉綠體的蛋白質(zhì)，并仍舊含有其轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
重組DNA是指一種利用重組DNA技術(shù)結(jié)合在一起的DNA序列的組合。
重組DNA技術(shù)是指用于將DNA序列連接在一起的方法，如Sambrook等，1989,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press中所述。
顯著增加一種超過測量技術(shù)固有的誤差范圍的酶促活性的增加，優(yōu)選為約兩倍或兩倍以上于抑制物存在下的野生型酶活性的酶活性增加，更優(yōu)選約5倍或5倍以上，更優(yōu)選約10倍或10倍以上。
明顯低于是指酶促反應(yīng)產(chǎn)物的量變化超過測量技術(shù)固有的誤差范圍，優(yōu)選為抑制物不存在下的野生型酶活性的1/2或1/2以下，更優(yōu)選約1/5或1/5以下，更優(yōu)選約1/10或1/10以下。
更廣義講，術(shù)語“基本上相似”當(dāng)用于指核苷酸序列，是指一種相應(yīng)于參比核苷酸序列的核苷酸序列，其中相應(yīng)序列編碼一種與參比核苷酸序列編碼的多肽具有基本上相同結(jié)構(gòu)和功能的多肽，例如，僅存在不影響多肽功能的氨基酸改變。期望的，基本上相似的核苷酸序列編碼由參比核苷酸序列編碼的多肽?；旧舷嗨坪塑账嵝蛄信c參比核苷酸序列之間的相同性百分比期望為至少85％，更期望地至少90％，優(yōu)選至少92％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％，甚至更優(yōu)選至少99％。利用Skmith-Waterman序列排列比較算法進(jìn)行序列比較(見，如Waterman，M.S.計(jì)算機(jī)生物學(xué)導(dǎo)言圖譜、序列和基因組(Introduction to Computational Biology:Maps,sequences andgenomes),Chapman & Hall,London:1995,ISBN 0-412-99391-0,或訪問http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)。以如下參數(shù)使用localS程序(1.16版)匹配1，錯配罰0.33，開區(qū)罰2，延伸區(qū)罰2。一個與參比核苷酸序列“基本上相似”的核苷酸序列可在如下條件下與參比核苷酸序列雜交7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃,用1X SSC,0.1％SDS,65℃洗滌；更期望地，7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃，用0.5X SSC,0.1％SDS,65℃洗滌；甚至更期望地在7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃,用0.2X SSC,0.1％SDS,65℃洗滌；優(yōu)選在7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃,用0.1X SSC,0.1％SDS,65℃洗滌。
術(shù)語“基本上相似”，當(dāng)此處用于蛋白質(zhì)時(shí)，是指相應(yīng)于參比蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)具有與參比蛋白質(zhì)基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能，如例如，僅存在不影響多肽功能的氨基酸改變。當(dāng)用于蛋白質(zhì)或氨基酸序列時(shí)，基本上相似的序列與參比蛋白質(zhì)之間的相同性百分比期望為至少65％，更期望地至少75％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，甚至更優(yōu)選至少99％。
底物底物是一種在其中酶天然行使其功能的生物化學(xué)途徑中酶天然識別并轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的分子，或是該分子的修飾形式，其也能被酶識別并在類似天然存在的反應(yīng)之酶促反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。
合成的是指一種包括不存在于天然序列中的結(jié)構(gòu)特征之核苷酸序列。例如一種G+C含量及單子葉和/或雙子葉基因正常密碼子分布十分相似的人工序列被稱為合成的。
耐受當(dāng)接觸一種抑制物或除草時(shí)劑仍繼續(xù)正常生長或行使功能的能力。
轉(zhuǎn)化一種將異源DNA導(dǎo)入細(xì)胞、組織或植物的方法。應(yīng)理解轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物不僅涵蓋轉(zhuǎn)化方法的終產(chǎn)物，也包括其轉(zhuǎn)基因子代。
轉(zhuǎn)基因用重組DNA分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，所述分子優(yōu)選包含與目標(biāo)DNA序列有效連接的適當(dāng)?shù)膯幼印?br> 本發(fā)明的一個目的是提供鑒定新除草劑或改進(jìn)的除草劑的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供利用這種新或改進(jìn)的除草劑抑制植物(如雜草)生長的方法。本發(fā)明的另一方面是提供改進(jìn)的作物植物，其耐受所述新或改進(jìn)的除草劑。
本發(fā)明首次公開了芥屬(Arabidopsis)HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的正確核苷酸序列。編碼前蛋白的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1，編碼推定的成熟蛋白質(zhì)之核苷酸序列示于SEQ ID NO:3。芥屬HMP-P激酶和TMP-PP酶前蛋白之正確的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2，推定的成熟芥屬HMP-P激酶和TMP-PP酶之正確的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。因此，本發(fā)明包含來源于植物的核苷酸序列，其編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，這類核苷酸序列來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)，在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，這類核苷酸序列與示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似，編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其氨基酸序列與示于SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的氨基酸序列相同或基本上相似。
HMP-P激酶與TMP-PP酶是從頭硫胺素生物合成途徑(見下)中的酶促步驟。從頭硫胺素生物合成最終導(dǎo)致硫胺素焦磷酸的形成(也稱為硫胺素二磷酸或維生素B1)，此輔因子的形式見于數(shù)種酶中(Schellenberger等，1997，酶學(xué)方法(Meth.Enz.),279,131-146)。此從頭生物合成途徑見于細(xì)菌、酵母和植物中，但人類中不存在。(Begley,T.P.,1996，國家產(chǎn)品報(bào)道(Natl.Prod.Rep.),13,177-186)。HMP-P激酶的酶促活性催化2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶單磷酸(HMP-P)的焦磷酸化，形成2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)。在大腸桿菌中，此步驟由thiD基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行。TMP-PP酶酶促活性相應(yīng)于硫胺素焦磷酸從頭生物合成中的其后至最終步驟，催化4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑單磷酸(THZ-P)和HMP-PP的偶聯(lián)，以形成硫胺素單磷酸(TMP)。在大腸桿菌中，此步驟由thiE基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行。
由HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的正確核苷酸序列的知識，本發(fā)明人顯示，需要提供外源硫胺素以保證生長的硫胺素營養(yǎng)缺陷型突變體在其HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的編碼序列中存在突變。這毫無疑問地在分子水平證明了該基因的重要性。由這類知識，可能開發(fā)出篩選可抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化學(xué)品的篩選方法。由于HMP-P激酶或TMP-PP酶基因編碼的酶的重要性，還期望這類化學(xué)品抑制植物的生長或生存，因此是潛在的優(yōu)良除草劑。因而本發(fā)明的一個目的是提供利用純化的HMP-P激酶或TMP-PP酶鑒定其抑制物的方法，所述抑制物可用作除草劑以抑制不期望的植被生長，例如在作物生長的田間中，尤其是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)上重要的作物，諸如玉米和其它谷物類作物，如小麥、燕麥、黑麥、高粱、稻、大麥、黍、草皮草和飼料草等，以及棉花、甘蔗、甜菜、油籽油菜和大豆等。
本發(fā)明包括一種嵌合基因，其包含與編碼本發(fā)明HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列有效連接的啟動子。本發(fā)明還包括一種重組載體，其包含根據(jù)本發(fā)明的所述嵌合基因，其中所述載體可被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的載體，其中所述核苷酸序列在該細(xì)胞中可表達(dá)。優(yōu)選地是一種根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞。還優(yōu)選地是一種宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是一種原核細(xì)胞。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
還包括的是分離的參與硫胺素生物合成的植物蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。優(yōu)選的是一種分離的蛋白質(zhì)，其中所述植物是擬南芥。更優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有HMP-P激酶活性。尤其優(yōu)選的是一種根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。尤其優(yōu)選的是一種蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有TMP-PP酶活性。更優(yōu)選的是一種根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含與SEQ IDNO:2中所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。尤其優(yōu)選的是一種蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了一種鑒定待測化學(xué)品之抑制植物生長或生存的能力之方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化其產(chǎn)物合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的待測化學(xué)品和酶與用于第一反應(yīng)混合物中的底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中酶的活性低于(期望明顯低于)第一反應(yīng)混合物中酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存的能力。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶來自植物，優(yōu)選為擬南芥。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HMP-P激酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶磷酸(HMP-P)，在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，TMP-PP酶的底物是4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑磷酸(THZ-P)。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，TMP-PP酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測定。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中來自ATP的ADP測定。本發(fā)明還描述了一種檢定方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化其產(chǎn)物合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中待測化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中酶的活性；其中，若第二反應(yīng)混合物中偶聯(lián)的酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中的酶活性，化學(xué)品能抑制酶活性。
本發(fā)明還描述了一種鑒定待測化學(xué)品的抑制植物生長和生存的能力之方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存的能力。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶來自植物，優(yōu)選為擬南芥。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HMP激酶的底物是HMP，在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，TMP-PP酶的底物是THZ-P。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測定。本發(fā)明還描述了一種檢定方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，化學(xué)品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之酶活性。本發(fā)明還描述了一種鑒定待測化學(xué)品的抑制植物生長和生存的能力之方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物和THZ激酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存的能力。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶來自植物，優(yōu)選為擬南芥。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ IDNO:2氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HMP-P激酶的底物是HMP-P，在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，THZ激酶的底物是THZ。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測定。本發(fā)明還描述了一種檢定方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與THZ激酶底物和HMP-P激酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，化學(xué)品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之活性。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了一種鑒定具有抑制植物中HMP-P激酶或TMP-PP酶活性能力的化學(xué)品的方法，包括如下步驟a)獲得轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的，其包含編碼具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶之非天然核苷酸序列，且能過量表達(dá)HMP-P激酶或TMP-PP酶的酶促活性；b)將化學(xué)品應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織或其部分，以及等基因的非轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、組織或其部分；c)測定轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、組織應(yīng)用化學(xué)品后的生長或存活；d)比較轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、組織應(yīng)用化學(xué)品后的生長或存活。期望地，化學(xué)品抑制非轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織或其部分的生長或存活，而不明顯抑制等基因的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織或其部分的生長或存活。在一個實(shí)施方案中，編碼具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶的核苷酸序列來自植物，優(yōu)選為擬南芥，期望地與示于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由編碼示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列之核苷酸序列編碼。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶具有與示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
本發(fā)明還包括具有修飾的HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的植物、植物組織、植物種子和植物細(xì)胞，其因此耐受在正常水平下對天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性為抑制性的除草劑的抑制。
本發(fā)明涵蓋的除草劑耐受植物包括否則可能成為抑制性除草劑潛在靶標(biāo)的那些植物，尤其是上述農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)上重要的作物。根據(jù)本實(shí)施方案，植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞用一種重組DNA分子轉(zhuǎn)化，優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。所述重組DNA分子包含與核苷酸編碼序列有效連接的在植物中有功能的適當(dāng)啟動子，其中核苷酸編碼序列編碼修飾的HMP-P激酶或TMP-PP酶，修飾的酶耐受正常情況下可抑制野生型未修飾的HMP-P激酶或TMP-PP酶活性之濃度的除草劑的抑制作用。修飾的HMP-P激酶或TMP-PP酶活性也可由增加野生型除草劑敏感的HMP-P激酶或TMP-PP酶表達(dá)來賦予植物，表達(dá)的增加是通過向植物提供野生型HMP-P激酶或TMP-PP酶基因的多重拷貝或者是在強(qiáng)度高于野生型啟動子的控制下過量表達(dá)野生型HMP-P激酶或TMP-PP酶基因來實(shí)現(xiàn)的。如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞可通過傳統(tǒng)篩選方法篩選，由此分離、表征并培育了除草劑耐受品系?；蛘?，也可使用隨機(jī)或定點(diǎn)突變產(chǎn)生除草劑耐受品系。
因此，本發(fā)明提供了用含有從植物分離的核苷酸序列的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，所述核苷酸序列編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中該酶具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中DNA分子賦予植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞耐受一定量的除草劑，該除草劑的量正常情況下抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。根據(jù)本實(shí)施方案的一個實(shí)施例，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了抑制植物生長的方法，包括將在植物中抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化學(xué)品應(yīng)用于植物的步驟。在與此相關(guān)的方法，本發(fā)明涉及一種在含有種植的作物種子的作物或植株的田間選擇性抑制雜草生長的方法，包括如下步驟(a)種植除草劑耐受作物或作物種子，其是耐受抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的除草劑之植物或植物種子；以及(b)向田間的作物或作物種子和雜草應(yīng)用一定量的除草劑，所用量抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中，除草劑抑制雜草的生長，而不明顯抑制作物的生長。
通過研究下面的發(fā)明描述及非限制性實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知曉本發(fā)明的其它方面及優(yōu)點(diǎn)。
已經(jīng)從擬南芥中鑒定了一些需要外源硫胺素或硫胺素前體(即4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑(THZ)和/或2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶(HMP))的專性有機(jī)營養(yǎng)缺陷型(organoauxotrophic)突變體，并繪制了4個基因座位置(Li和Redei,1969，生物化學(xué)遺傳學(xué)(Biochemical Genetics),3,163-170)。一個基因座th1作圖位于染色體1(Koomneef和Hanhart,1981，芥屬信息服務(wù)(Arab.Info.Service),18,52-58)。盡管在嘧啶和噻唑前體之間的該區(qū)組及th1突變體中硫胺素的確切位置不能由Koomneef和Hanhart確定，后來通過生物化學(xué)方法顯示th1突變體缺乏TMP-PP酶酶促活性(Komeda等，1988，植物生理(Plant Physiol.),88,248-250)。
近來，覆蓋染色體1的該區(qū)域之BAC序列(BAC F19G10)已提交至GenBank。該BAC上，一個基因具有與大腸桿菌thiD和thiE的氨基酸序列明顯類似的序列(BAC序列上核苷酸位置46133-48657)?；诖诵畔ⅲl(fā)明人分離了芥屬cDNA，其編碼一種具有兩個功能性結(jié)構(gòu)域的新蛋白質(zhì)N-末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(至SEQ ID NO:1中大約核苷酸906，或SEQ ID NO:2的氨基酸302)與HMP-P激酶(thiD)具有同源性，C末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(從SEQ ID NO:1的大約核苷酸925，或SEQ ID NO:2的氨基酸309)與TMP-PP酶(thiE)具有同源性。也在SEQ ID NO:1的前99個核苷酸中預(yù)測了一個推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(SEQ ID NO:2前33個氨基酸)。
發(fā)明人還獲得了來自兩種不同th1突變體的HMP-P激酶/TMP-PP酶序列，CS79和CS3530(芥屬保藏中心，諾丁漢，英國)。他們發(fā)現(xiàn)在兩種突變體的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因中均存在突變。CS79在SEQ ID NO:1的位置188處具有由C至T的單核苷酸改變，這將SEQID NO:2中位置63的氨基酸從絲氨酸變?yōu)楸奖彼帷S3530具有在SEQ ID NO:l中位置259-265或位置260-266上的7核苷酸缺失，這將SEQ ID NO:2中位置87的氨基酸從異亮氨酸變?yōu)樘於０贰Ｔ谠撏蛔凅w中，天冬酰胺87的密碼子后跟隨13個氨基酸的密碼子，然后是閱讀框中的TGA終止密碼子。突變應(yīng)導(dǎo)致僅有100個氨基酸的蛋白質(zhì)的翻譯，所述蛋白質(zhì)僅含有一小部分與thiD同源的結(jié)構(gòu)域，缺乏與thiE同源的結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果顯示，硫胺素營養(yǎng)缺陷型表型是由于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因中的突變，毫無疑問地表明HMP-P激酶/TMP-PP酶基因?qū)τ谥参镏陵P(guān)重要，很有可能代表了除草劑的良好靶點(diǎn)。
基于cDNA序列，發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在BAC克隆中預(yù)測的不正確的剪接接頭。第一個預(yù)測的剪接接頭不正確地導(dǎo)致在SEQ ID NO:1位置383處添加了內(nèi)含子序列的24個堿基(圖2)，第二個預(yù)測的剪接接頭不正確地導(dǎo)致在SEQ ID NO:1位置1066和1089之間24個堿基的刪除及9個錯誤堿基的添加。基于此推定，HMP-P激酶/TMP-PP酶基因無操作性(inoperative)，將不能用于本發(fā)明的用途。
HMP-P激酶/TMP-PP酶基因還進(jìn)一步稱為編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。由此優(yōu)選表示編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的單一多肽之HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，由HMP-P激酶/TMP-PP酶基因編碼的單一多肽具有HMP-P激酶活性和TMP-PP酶活性。
已經(jīng)于1998年7月8日將編碼成熟HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO:3所示)保藏于依用于專利程序目的之國際承認(rèn)的微生物保藏單位的布達(dá)佩斯條約建立的國際保藏單位之農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL),1815 N,University Street,Peoria,Illinois 61604，美國，克隆名稱aththiDE-ctp，保藏號NRRL B-30040。
對于在宿主生物中HMP-P激酶/TMP-PP酶的重組生產(chǎn)，將編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列插入一種設(shè)計(jì)用于所選宿主的表達(dá)盒，并導(dǎo)入重組產(chǎn)生其的宿主中。適合所選宿主的特定調(diào)節(jié)序列如啟動子、信號序列、5’和3’非翻譯序列及增強(qiáng)子的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識水平之內(nèi)。所得含有與正確閱讀框連接的各個元件之分子可被插入能轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的載體中。用于蛋白質(zhì)重組產(chǎn)生的合適的表達(dá)載體及方法為本領(lǐng)域周知，對于宿主而言，諸如大腸桿菌、酵母和昆蟲細(xì)胞(見如，Luckow和Summers，生物/技術(shù)(Bio/Technol.),6:47(1988))。特定例子包括質(zhì)粒，諸如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)、pFLAG(InternationalBiotechnologies,Inc.,New Haven,CT)、pTrcHis(Invitrogen,La Jolla,CA)、和桿狀病毒表達(dá)載體，例如那些來自Autographica californica核多角體病毒(AcMNPV)基因組的。一種優(yōu)選的桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)是pVl1l392/Sf21細(xì)胞(Invitrogen,La Jolla,CA)。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列來自真核生物，如酵母，但優(yōu)選來自植物。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸序列與示于SEQ ID NO:1或SEQID NO:3中的核苷酸序列相同或基本上相似，或編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其氨基酸序列與示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似。示于SEQ ID NO:l的核苷酸序列編碼芥屬HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:2，編碼芥屬推定成熟HMP-P激酶/TMP-PP酶的示于SEQ ID NO:3的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ IDNO:4。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸序列來自原核生物，優(yōu)選細(xì)胞，如大腸桿菌。在這種情況中，具有HMP-P激酶活性的酶及具有TMP-PP酶活性或具有TMP-PP酶活性的酶分別由thiD和thiE基因編碼。
利用多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離和純化重組產(chǎn)生的HMP-P激酶/TMP-PP酶。可使用的具體技術(shù)取決于使用的宿主生物，酶是否設(shè)計(jì)為分泌的，以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的這類因素(見，如，Ausubel,F.等，編，第16章，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，John Wiley & Sons,Inc.(1994))。
重組產(chǎn)生的HMP-P激酶/TMP-PP酶可用于多種用途。例如，其可用于體外檢定方法，以篩選其靶位未鑒定的已知除草劑化學(xué)品，用來確定是否其抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。這類體外檢定方法也可用作更一般的篩選，以鑒定抑制這類酶促活性的化學(xué)品，因此其為新除草劑候選物。另外，重組生產(chǎn)的HMP-P激酶/TMP-PP酶可用于闡明這些分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步表征其與已知抑制劑的關(guān)系，以合理設(shè)計(jì)新抑制性除草劑以及除草劑耐受型酶。
一種用于鑒別由必需植物基因編碼的酶(如HMP-P激酶/TMP-PP酶)之抑制物的體外檢定方法，包括步驟a)在懷疑為酶功能抑制物存在時(shí)，將具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與其底物反應(yīng)；b)將存在懷疑的抑制物時(shí)的酶促反應(yīng)速率與同樣條件下不存在懷疑抑制物時(shí)的酶促反應(yīng)速率比較；以及c)測定是否懷疑的抑制物抑制HMP-P激酶的酶促活性或TMP-PP酶的酶促活性。對HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的抑制作用通過檢定方法中TMP合成的降低或完全抑制來確定。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，通過在候選抑制物存在和不存在的條件下，采用熒光檢測比較在體外檢定方法中合成的TMP的量，進(jìn)行這種測定。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，這種測定是通過在候選抑制物存在和不存在的條件下，采用吸光度檢測比較在體外檢定方法中形成的ADP的量。優(yōu)選的HMP-P激酶底物為2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶磷酸(HMP-P)。優(yōu)選的TMP-PP酶底物為2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)和4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑磷酸(THZ-P)。
通過使用偶聯(lián)的HMP激酶/HMP-P激酶/TMP-PP酶檢定方法增加HMP-P激酶可接觸的HMP-P的量，由此增加檢定方法的檢測極限，得到改進(jìn)的篩選抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化學(xué)品的方法。這類偶聯(lián)檢定方法包括步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存的能力。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶來自植物。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HMP激酶的底物是HMP，在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，TMP-PP酶的底物是THZ-P。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酶的活性通過測定反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測量。
另外，通過使用偶聯(lián)的THZ激酶/HMP-P激酶/TMP-PP酶檢定方法增加TMP-PP酶可接觸的THZ-P的量，由此增加檢定方法的檢測極限，得到改進(jìn)的篩選抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化學(xué)品的方法。這類偶聯(lián)檢定方法包括步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物和THZ激酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存的能力。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶來自植物。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，HMP-P激酶的底物是HMP-P，在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，THZ激酶的底物是THZ。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性通過測定反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測量。
在一個實(shí)施方案中，將例如通過體外篩選鑒定之待選除草劑以多種濃度應(yīng)用于植物。待選除草劑優(yōu)選地噴施于植物。待選除草劑應(yīng)用后，記錄其對植物的作用(例如死亡或生長抑制)。
在又一個實(shí)施方案中，一種篩選HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性抑制物的檢定方法使用轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，所述材料能過量表達(dá)具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的核苷酸序列，其中HMP-P激酶和TMP-PP酶在轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞中有酶促活性。核苷酸序列優(yōu)選來自真核生物，諸如酵母，但優(yōu)選來自植物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸序列與示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似，或編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其氨基酸序列與示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸序列來自原核生物，優(yōu)選細(xì)菌，如大腸桿菌。在這種情況下，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶分別由thiD和thiE基因編碼。
然后將化學(xué)品應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，及應(yīng)用于等基因的非轉(zhuǎn)化植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，在應(yīng)用化學(xué)品后測定轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞的生長或生存，并比較。
本發(fā)明還涉及耐受除草劑的植物、植物組織、植物種子和植物細(xì)胞，所述除草劑抑制這些植物中天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中耐受是通過改變的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性賦予的。通過向植物提供額外的野生型除草劑敏感的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因、通過在植物中表達(dá)經(jīng)修飾的除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶或通過這些技術(shù)的組合，增加野生型除草劑敏感型HMP-P激酶/TMP-PP酶，由此改變的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性可賦予本發(fā)明植物。代表性植物包括除草劑以其正常目的向植物應(yīng)用的任何植物。優(yōu)選為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)上重要的作物，如棉花、大豆、油籽油菜、甜菜、玉米、稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高粱、黍、草皮草和飼料草等通過表達(dá)增加實(shí)現(xiàn)改變的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，導(dǎo)致植物細(xì)胞中HMP-P激酶/TMP-PP酶的水平至少足夠克服由除草劑引起的生長抑制。表達(dá)的酶的水平一般至少是天然表達(dá)量的兩倍，優(yōu)選至少5倍，更優(yōu)選至少10倍。表達(dá)增加可由于野生型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的多重拷貝；基因內(nèi)編碼序列的多重出現(xiàn)(即基因擴(kuò)增)或植物細(xì)胞中內(nèi)源基因的非編碼序列、調(diào)節(jié)序列中的突變。具有這類改變的基因活性之植物可通過本領(lǐng)域周知的植物直接篩選得到(見美國專利5162602和美國專利4761373，此處引入作為參考)。這些植物也可通過本領(lǐng)域周知的基因工程方法獲得。通過用重組或嵌合DNA分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞也可實(shí)現(xiàn)除草劑敏感型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的表達(dá)增加，其中所述DNA分子包含能夠在植物細(xì)胞中驅(qū)動相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子，該啟動子與編碼HMP-P激酶/TMP-PP酶的同源或異源結(jié)構(gòu)基因有效連接。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的，由此提供可遺傳的轉(zhuǎn)基因性狀。B．經(jīng)修飾的除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶的表達(dá)根據(jù)本實(shí)施方案，用含有在植物中有功能的、與編碼序列有效連接的適當(dāng)啟動子之重組DNA分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，其中所述編碼序列編碼一種除草劑耐受形式的HMP-P激酶/TMP-PP酶。除草劑耐受形式的酶具有至少一個氨基酸置換、添加或刪除，其賦予對抑制未經(jīng)修飾的天然存在形式的酶之除草劑的耐受。通過常規(guī)篩選技術(shù)可篩選如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，由此可分離、表征和培育除草劑耐受品系。下面描述獲得編碼除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶的基因之方法。
一種一般方法包括對微生物的直接或間接誘變方法。例如，一種遺傳可操作的微生物如大腸桿菌或釀酒酵母(S.cerevisiae)可通過用如UV光或甲磺酸乙基酯或甲基酯進(jìn)行體內(nèi)隨機(jī)誘變。誘變方法例如Miller,分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(Experiments in Molecular Genetics),ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1972)；Davis等，高等細(xì)菌遺傳學(xué)(Advanced Bacterial Genetics),Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY(1980)；Sherman等，酵母遺傳學(xué)方法(Methods in Yeast Genetics),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1983)；和美國專利4,975,374中所述。選擇用于誘變的微生物含有正常的抑制物敏感型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，且依賴與該基因賦予的活性。于抑制未修飾基因的濃度之抑制物存在下突變的細(xì)胞生長。篩選在抑制物存在下比未突變微生物的菌落生長好的突變微生物菌落(即，顯示對抑制物的抗性)，用于進(jìn)一步分析。通過克隆或PCR擴(kuò)增分離來自這些克隆的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，闡明其序列。編碼改變的基因產(chǎn)物的序列然后被克隆回微生物中，以證實(shí)其賦予抑制物耐受的能力。
一種獲得含有植物HMP-P激酶/TMP-PP酶基因之突變除草劑耐受等位基因的方法包括植物中直接篩選。例如，通過將以本領(lǐng)域周知的方法滅菌之種子種在含有濃度遞增的抑制物之簡單基本鹽培養(yǎng)基的平板上，測定突變的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因?qū)χ参锶缃鎸佟⒋蠖够蛴衩椎纳L抑制作用。這種濃度在每100萬份中0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、110、300、1000和3000份的范圍內(nèi)?？芍貜?fù)性檢測到明顯抑制生長的最低濃度用于隨后的實(shí)驗(yàn)。對本領(lǐng)域人員而言最低濃度的測定是常規(guī)操作。
利用植物材料的誘變增加在篩選群體中出現(xiàn)抗性等位基因的頻率。突變的種子材料來自多種來源，包括化學(xué)或物理誘變種子，或化學(xué)或物理誘變花粉(Neuffer,用于生物研究的玉米，Sheridan編.Univ.Press,Grand Forks,ND,pp.61-64(1982))，其然后用來對植物傳粉，并收集得到的M1突變體種子。一般地，對于芥屬，由用化學(xué)方法(如甲磺酸乙酯)或用物理方法(γ射線或快中子)突變的種子生長得到的植物之后代種子-M2種子(Lehle Seeds,Tucson,AZ)以最多10000種子/平板(10cm直徑)，在含有用于篩選耐受型之適當(dāng)濃度抑制物的基本鹽培養(yǎng)基上種板。持續(xù)生長并在種板后7-21天保持綠色的幼苗被移植入土壤，生長至成熟并結(jié)籽。測試這些種子的子代對除草劑的耐受。如果耐受性狀為顯性，其種子分離為3∶1/抗性∶敏感型的植物被假定為在M2代抗性雜合。產(chǎn)生全部抗性種子的植物被假定為在M2代抗性純合。這種對完整種子和其M2子代種子篩選的突變也可對其它種屬進(jìn)行，例如大豆(見如美國專利5084082)?；蛘?，待篩選除草劑抗性的突變種子可通過用經(jīng)化學(xué)或物理手段誘變的花粉傳粉而獲得。
除草劑耐受的遺傳基礎(chǔ)是修飾的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因這一理論的證實(shí)通過如下所示進(jìn)一步確立。首先。以基于SEQ ID NO:？所示芥屬cDNA編碼序列的引物，或更優(yōu)選地基于來自用于產(chǎn)生耐受等位基因的植物之未改變HMP-P激酶/TMP-PP酶基因序列的引物，利用PCR分離來自顯示對抑制物抗性的植物之HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的等位基因。在對等位基因測定序列以確定編碼序列中存在突變后，測試等位基因其賦予植物對抑制物抗性的能力，該植物中已用推定的賦予耐受性的等位基因轉(zhuǎn)化。這類植物可為芥屬植物或其生長對HMP-P激酶/TMP-PP酶抑制物敏感的任何其它植物。第二，相對于已知限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)繪制插入的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因圖譜(見，例如Chang等，美國國家科學(xué)院院報(bào)85:6856-6860(1988)；Nam等，植物細(xì)胞(Plant Cell)1:699-705(1989))。利用相同標(biāo)記獨(dú)立地繪制HMP-P激酶/TMP-PP酶抑制物耐受性狀圖譜。當(dāng)耐受是由于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因中的突變時(shí)，耐受性狀繪制在與HMP-P激酶/TMP-PP酶基因位置不可區(qū)分的位置。
另一種獲得HMP-P激酶/TMP-PP酶基因除草劑耐受型等位基因的方法是通過在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中篩選。將植物組織外植體如，胚、葉盤等，或活躍生長的愈傷組織，或目標(biāo)植物的懸浮培養(yǎng)物于存在濃度遞增的抑制性除草劑(或適用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的抑制物類似物)之培養(yǎng)基中生長。在不同培養(yǎng)物中記錄到不同的生長程度。在某些培養(yǎng)物中，長出的快速生長變體集落甚至在正常抑制性濃度的抑制物存在下仍持續(xù)生長。在用抑制物接觸組織或細(xì)胞之前，用化學(xué)或物理方法處理可增加這類快速生長變體出現(xiàn)的幾率。如前述分離并測試推定的賦予耐受性的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的等位基因。然后將這些鑒定為賦予除草劑耐受性之等位基因進(jìn)行基因工程改造，以利于表達(dá)及轉(zhuǎn)化入植物?；蛘?，可從含有這些等位基因的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中再生植物。
還有一種方法包括，在細(xì)菌或酵母中誘變野生型除草劑敏感的植物HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，隨后在含有抑制性濃度抑制物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，然后篩選在抑制物存在下生長的那些菌落。更具體地，將一種植物cDNA，例如編碼HMP-P激酶/TMP-PP酶的芥屬cDNA克隆入否則會缺乏所選基因活性的微生物。然后通過數(shù)種本領(lǐng)域已知的化學(xué)或酶學(xué)方法將轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行體內(nèi)誘變或體外誘變，例如亞硫酸氫鈉(Shortle等，酶學(xué)方法(Methods Enzymoi.)100:457-468(1983)；甲氧基氨(Kadonaga等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)13:1733-1745(1985)；寡核苷酸定向飽和誘變(Hutchinson等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，83:710-714(1986)；或多種聚合酶錯誤摻入方法(見，如，Shortle等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，79:1588-1592(1982)；Shiraishi等，基因64:313-319(1988)；和Leung等，技術(shù)(Technique)1:11-15(1989)。挑選在正常抑制性濃度的抑制物存在下生長的菌落，重復(fù)劃線加以純化。純化其質(zhì)粒，并通過將其重新轉(zhuǎn)化入缺乏HMP-P激酶/TMP-PP酶基因活性的微生物，測試賦予抑制物耐受性的能力。由此確定通過此測試之質(zhì)粒cDNA插入片段的DNA序列。
也可利用包括體外重組(也稱為DNA改組)的方法獲得除草劑抗性HMP-P激酶/TMP-PP酶。通過DNA改組，將突變(優(yōu)選隨機(jī)突變)導(dǎo)入HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。DNA改組也導(dǎo)致HMP-P激酶/TMP-PP酶基因內(nèi)序列的重組和重排，或者兩個或多個不同HMP-P激酶/TMP-PP酶基因之間序列的重組和交換。這些方法使得產(chǎn)生以百萬計(jì)的突變HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。篩選突變基因或改組基因中是否存在期望的性質(zhì)，如對除草劑改進(jìn)的耐受性，以及賦予對不同種類的抑制物化學(xué)的廣譜耐受性。這樣的篩選在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作范圍內(nèi)。
本發(fā)明涵蓋了一種改組DNA分子，其中所述DNA分子編碼具有增強(qiáng)的除草劑耐受性之HMP-P激酶/TMP-PP酶，所述除草劑抑制由模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，所述改組DNA分子由此模板DNA分子衍生。此外，還涵蓋一種由改組模板DNA分子獲得的突變DNA分子，所述模板DNA分子編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中，所述突變DNA分子編碼具有增強(qiáng)的除草劑耐受性之HMP-P激酶/TMP-PP酶，該除草劑抑制由所述模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，由至少一種模板HMP-P激酶/TMP-PP酶基因形成突變HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，其中模板HMP-P激酶/TMP-PP酶基因已被切割成期望大小的雙鏈隨機(jī)片段，并包含將所得雙鏈隨機(jī)片段群體加入一種或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸的步驟，其中所述寡核苷酸包括一個與雙鏈隨機(jī)片段相同區(qū)和一個與雙鏈隨機(jī)片段異源的區(qū)域；將所得雙鏈隨機(jī)片段和寡核苷酸變性成為單鏈分子；將所得單鏈分子群體與聚合酶在這樣的條件下溫育，該條件可導(dǎo)致所述單鏈分子在該相同區(qū)域退火，以形成退火片段對，所述相同區(qū)域足以使退火片段對的一方引發(fā)另一方的復(fù)制，由此形成一種突變的雙鏈多核苷酸；再重復(fù)第二和第三步至少兩個循環(huán)，其中進(jìn)一步循環(huán)的第二步中所得混合物包括來自在先循環(huán)第三步驟中的突變雙鏈多核苷酸，進(jìn)一步的循環(huán)形成又一突變的雙鏈多核苷酸；其中，突變的雙鏈多核苷酸是具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶基因，所述除草劑抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，由至少兩種非相同的編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之模板DNA分子形成突變的編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之DNA分子，包含如下步驟向模板DNA分子加入至少一種含有與各個模板DNA分子相同的區(qū)域之寡核苷酸；將所得混合物變性成為單鏈分子；將所得單鏈分子群體與聚合酶在這樣的條件下溫育，該條件可導(dǎo)致寡核苷酸與模板DNA分子退火，其中用于聚合酶起聚合作用的條件是獲得相應(yīng)于模板DNA分子的一部分的聚合化產(chǎn)物；再重復(fù)第二和第三步至少兩個循環(huán)，其中第三步中獲得的延伸產(chǎn)物能引發(fā)模板DNA分子在下一循環(huán)中用于聚合作用；由此形成突變的雙鏈多核苷酸，其包含來自不同模板DNA分子的序列；其中，突變的雙鏈多核苷酸編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由該模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在雙鏈隨機(jī)片段群體中雙鏈隨機(jī)片段單一種類的濃度小于總DNA的1％(重量)。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，模板雙鏈多核苷酸包含至少約100種多核苷酸。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，雙鏈隨機(jī)片段的大小從約5bp至5kb。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，方法的第四步包括重復(fù)第二和第三步的步驟至少10個循環(huán)。這種方法在例如Stemmer等，(1994)自然，370:389-391，美國專利5,605,793和Crameri等，(1998)自然391:288-291以及WO 97/20078中有描述，此處引入作為參考。
在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，任何兩個或多個不同HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的組合通過例如Zhao等，(1998)自然雜志生物工程分冊(Nature Biotechnology)16:258-261中所述，由參差延伸方法(StEP)體外誘變。兩種或多種HMP-P激酶/TMP-PP酶基因用作PCR擴(kuò)增的模板，PCR反應(yīng)的延伸循環(huán)優(yōu)選地在低于聚合酶最佳聚合溫度的溫度下進(jìn)行。例如，當(dāng)使用最佳溫度約為72℃的熱穩(wěn)定聚合酶時(shí)，延伸反應(yīng)的溫度期望低于72℃，更優(yōu)選地低于65℃，優(yōu)選低于60℃，更優(yōu)選地延伸反應(yīng)的溫度是55℃。此外，延伸反應(yīng)的PCR反應(yīng)循環(huán)持續(xù)時(shí)間期望地少于通常本領(lǐng)域所用時(shí)間，更期望地少于30秒，優(yōu)選其少于15秒，更優(yōu)選地延伸反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間為5秒。在每一次延伸反應(yīng)中僅有短DNA片段被聚合，使得延伸產(chǎn)物的模板開關(guān)在每次變性和退火循環(huán)后的起始DNA分子之間，由此在延伸產(chǎn)物中產(chǎn)生多種不同形式。PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)目取決于待誘變的HMP-P激酶/TMP-PP酶編碼區(qū)長度，優(yōu)選地多于40個循環(huán)，更優(yōu)選多于60個循環(huán)，優(yōu)選使用高于80個循環(huán)。如使用本領(lǐng)域周知的方法測定每一HMP-P激酶/TMP-PP酶基因組合的最佳延伸條件和最佳PCR循環(huán)數(shù)目。其它PCR反應(yīng)參數(shù)基本上與本領(lǐng)域常用的相同。擴(kuò)增反應(yīng)的引物優(yōu)選地設(shè)計(jì)為與位于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因編碼序列外的DNA序列退火，例如與含有HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的載體之DNA序列退火，由此，用于PCR反應(yīng)的不同HMP-P激酶/TMP-PP酶基因優(yōu)選地包含在分別的載體中。引物期望地與位于和HMP-P激酶/TMP-PP酶編碼序列距離不超過500bp的序列退火，優(yōu)選與位于和HMP-P激酶/TMP-PP酶編碼序列距離不超過200bp的序列退火，更優(yōu)選地與位于和HMP-P激酶/TMP-PP酶編碼序列距離不超過120bp的序列退火。優(yōu)選地，HMP-P激酶/TMP-PP酶編碼序列由限制性位點(diǎn)包圍，所述位點(diǎn)包括在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的DNA序列，由此可方便擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入適當(dāng)?shù)妮d體。
在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，具有粘性末端的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因片段如WO98/05765所述制備。粘性末端由如下方法制備，通過將相應(yīng)于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的一部分之第一種寡核苷酸與第二種寡核苷酸連接，所述第二種寡核苷酸不存在于該基因或相應(yīng)于如下基因的一部分，所述基因不和相應(yīng)于第一種寡核苷酸的基因相鄰，其中第二種寡核苷酸含有至少一種核糖核苷酸。利用第一種寡核苷酸作為模板，第二種寡核苷酸作為引物制備雙鏈DNA。切除核糖核苷酸。位于核糖核苷酸5’側(cè)的核苷酸也被去除，導(dǎo)致雙鏈片段具有粘性末端。通過與所得新基因序列組合的連接隨機(jī)重新裝配這類片段。
任何HMP-P激酶/TMP-PP酶基因或任何HMP-P激酶/TMP-PP酶基因組合可用于本發(fā)明的體外重組。例如，HMP-P激酶/TMP-PP酶基因來自植物，如擬南芥，例如HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如SEQID NO:1或SEQ ID NO:3中所示。其它適合體外重組的基因有來自細(xì)菌如大腸桿菌thiD或thiE基因的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因(Vander Horn等，(1993)細(xì)菌學(xué)雜志，175,982-992；Backstrom等，(1995)美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)117,2351-2352)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)thiD基因(Petersen和Downs(1997)細(xì)菌學(xué)雜志，179,4894-4900)、粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)thiD gene(Akiyama和Nakashima(1996)，當(dāng)代遺傳學(xué)(Curr.Genet.)30,62-67；Ouzonis和Kyrpides(1997)分子進(jìn)化雜志(J.Mol.Evol.)45,708-711)或釀酒酵母thiE基因(Nosaka等，(1994)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)269,30510-30516)，在此引入作為參考。在本發(fā)明中使用完整HMP-P激酶/TMP-PP酶基因或其部分。如上述獲得的突變HMP-P激酶/TMP-PP酶基因文庫被克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，所得載體轉(zhuǎn)化入適當(dāng)宿主，例如藻類，如衣藻類，酵母或細(xì)菌中。適當(dāng)?shù)厮拗鲀?yōu)選為原本缺乏HMP-P激酶活性的宿主，如大腸桿菌菌株NI500(遺傳學(xué)貯藏中心(Genetic Stock Center),New Haven,美國)，或缺乏TMP-PP酶活性的宿主，例如大腸桿菌菌株NI400(Nakayama和Hayashi(1972)細(xì)菌學(xué)雜志，112:1118-1126)。用含有突變HMP-P激酶/TMP-PP酶基因文庫的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在含有抑制性濃度的抑制物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選擇在抑制物存在下生長的菌落。挑選在正常情況下抑制性濃度的抑制物存在下生長的菌落，重復(fù)劃線加以純化。純化其質(zhì)粒，測定通過此測試的質(zhì)粒cDNA插入片段之DNA序列。
一種鑒定耐受抑制物的經(jīng)修飾的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因之檢定方法可以如鑒定HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性抑制物相同的檢定方法(抑制物檢定方法，見上)進(jìn)行，除了進(jìn)行如下修改第一，突變的HMP-P激酶/TMP-PP酶在一個反應(yīng)混合物中替代抑制物檢定方法中的野生型HMP-P激酶/TMP-PP酶。第二，各反應(yīng)混合物中均存在野生型酶的抑制物。第三，比較突變活性(存在抑制物和突變酶的活性)及未突變活性(存在抑制物和野生型酶的活性)，測定當(dāng)與未突變活性相比，是否觀察到突變活性中酶活性顯著增加。突變活性是存在適當(dāng)?shù)孜锛耙种莆飼r(shí)任何突變酶的測量活性。未突變活性是存在適當(dāng)?shù)孜锛耙种莆飼r(shí)任何野生型酶的測量活性。顯著增加定義為一種超過測量技術(shù)固有的誤差范圍的酶促活性的增加，優(yōu)選為約兩倍或兩倍以上于在抑制物存在下的野生型酶活性的活性增加，更優(yōu)選約5倍或5倍以上，更優(yōu)選約10倍或10倍以上的增加。
除了用于產(chǎn)生除草劑耐受型植物，編碼除草劑耐受HMP-P激酶/TMP-PP酶的基因也可用作植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法中的選擇標(biāo)記。例如，用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞也可用編碼一種能被植物表達(dá)的、改變的HMP-P激酶/TMP-PP酶的基因轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被移入培養(yǎng)基中，其中含有足以抑制不表達(dá)經(jīng)修飾的酶之植物細(xì)胞生存的量的酶抑制物，在此，僅有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可存活。此方法適用于任何能用經(jīng)修飾的HMP-P激酶/TMP-PP酶編碼基因轉(zhuǎn)化的任何植物細(xì)胞，并能與任何目標(biāo)轉(zhuǎn)基因一起使用。轉(zhuǎn)基因及修飾的基因之表達(dá)可由在植物細(xì)胞中有功能的相同啟動子或分別的啟動子驅(qū)動。
優(yōu)選的是形成突變的本發(fā)明HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的方法。
還優(yōu)選的是形成所述突變HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的方法。
更優(yōu)選的是形成突變的本發(fā)明突變的DNA分子的方法，其中一個模板DNA分子來自真核生物。尤其優(yōu)選的是本發(fā)明的方法，其中所述真核生物是植物。
更優(yōu)選的是本發(fā)明的方法，其中所述模板DNA分子的種類與SEQID NO:1所示的核苷酸序列相同或基本上類似。
更優(yōu)選的是由本發(fā)明方法獲得的編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之突變DNA分子，其中所述突變DNA分子編碼具有增強(qiáng)的除草劑耐受性的HMP-P激酶/TMP-PP酶，所述除草劑抑制由所述模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
利用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可將一種野生型或除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因整合入植物或細(xì)菌細(xì)胞中。通常，這包括利用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)克隆方法將編碼HMP-P激酶/TMP-PP酶的DNA分子插入一種對于該DNA分子而言為異源(即非正常存在)的表達(dá)系統(tǒng)。載體含有對于插入的蛋白質(zhì)編碼序列在含有所述載體的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件?？墒褂么罅勘绢I(lǐng)域已知的載體系統(tǒng)，例如質(zhì)粒、噬菌體病毒和其它修飾的病毒。表達(dá)系統(tǒng)的組分也可被修飾以增加表達(dá)。例如，可利用截短的序列、核苷酸置換或其它修飾?？衫帽绢I(lǐng)域已知的表達(dá)系統(tǒng)在適當(dāng)條件下轉(zhuǎn)化任何作物的植物細(xì)胞。含有野生型或除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的轉(zhuǎn)基因優(yōu)選被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化并整合入宿主細(xì)胞的基因組。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，含有野生型或除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的轉(zhuǎn)基因位于自主復(fù)制的載體上。自主復(fù)制的載體例子為病毒，尤其是雙生(gemini)病毒。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可再生為完整植物，使得HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的所選形式賦予轉(zhuǎn)基因植物除草劑耐受性。A．構(gòu)建植物表達(dá)盒的要求首先在表達(dá)盒中于可在植物中表達(dá)的適當(dāng)啟動子之后裝配準(zhǔn)備在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因序列。這些表達(dá)盒也可包含轉(zhuǎn)基因表達(dá)所需或選擇的其他任何序列。這些序列包括但不限于，例如，轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)表達(dá)的外部序列，如內(nèi)含子、關(guān)鍵序列和用于將基因產(chǎn)物導(dǎo)向至特定細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的序列。然后可將這些表達(dá)盒容易地轉(zhuǎn)移至上述植物轉(zhuǎn)化載體中。下面是典型表達(dá)盒的不同成分的描述。1．啟動子在表達(dá)盒中使用的啟動子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時(shí)間表達(dá)模式。選擇的啟動子將在特定的細(xì)胞型(如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮細(xì)胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，此選擇將反映基因產(chǎn)物積累的希望的位置?；蛘撸x的啟動子可在多種誘導(dǎo)條件下引導(dǎo)基因表達(dá)。啟動子在其強(qiáng)度即促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力方面不同。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可使用本領(lǐng)域所知的多種適當(dāng)啟動子中的任一種。例如，CaMV 35S啟動子、稻肌動蛋白啟動子或遍在蛋白啟動子可用于組成型表達(dá)。例如，來源于煙草或擬南芥的化學(xué)誘導(dǎo)型PR-1啟動子可用于調(diào)節(jié)型表達(dá)(見，例如，美國專利號5,689,044)。2．轉(zhuǎn)錄終止子多種轉(zhuǎn)錄終止子均可在表達(dá)盒中使用。它們負(fù)責(zé)超出轉(zhuǎn)基因之外的轉(zhuǎn)錄終止及其正確的聚腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是已知在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止子，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉及雙子葉植物中。3．增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已發(fā)現(xiàn)許多序列能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，這些序列可與本發(fā)明的基因結(jié)合使用而增強(qiáng)其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。例如，多種內(nèi)含子序列如玉米Adh1基因的內(nèi)含子，顯示能增強(qiáng)表達(dá)，尤其是在單子葉植物細(xì)胞中。另外，已知多種由病毒衍生的非翻譯前導(dǎo)序列也可增強(qiáng)表達(dá)，且其在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。4．編碼序列優(yōu)化通過改變用于在目的作物種類中最佳表達(dá)的編碼序列，可以遺傳改造所選基因的編碼序列。修飾編碼序列以實(shí)現(xiàn)在特定作物種中最佳表達(dá)的方法是眾所周知的(見，例如，Perlak等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:3324(1991)；Koziel等人，生物技術(shù)(Bio/technol.)11:194(1993))。
5．細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的導(dǎo)向已知存在于植物中的多種用于導(dǎo)向基因產(chǎn)物的機(jī)制，已或多或少表征了控制這些機(jī)制發(fā)揮功能的序列。例如，基因產(chǎn)物向葉綠體的導(dǎo)向由見于多種蛋白質(zhì)氨基末端的信號序列控制，其在葉綠體輸入過程中被切割，以產(chǎn)生突變蛋白質(zhì)(如Comai等，生物化學(xué)雜志，263:15104-15109)(1988)。其它基因產(chǎn)物定位于其它細(xì)胞器，如線粒體和過氧化物酶體如Unger等，植物分子生物學(xué)，13:411-418(1989)。編碼這些產(chǎn)物的cDNA也可被操縱，以影響異源基因產(chǎn)物向這些細(xì)胞器的導(dǎo)向。此外，已表征了引起基因產(chǎn)物向其它細(xì)胞元件的導(dǎo)向之序列。氨基末端序列負(fù)責(zé)向ER、質(zhì)外體的定向，以及從糊粉細(xì)胞的胞外分泌(Kohlar和Co)植物細(xì)胞2:769-783(1990)。此外，氨基末端序列及羧基末端序列負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物的液泡產(chǎn)物(Shinshi等，植物分子生物學(xué)，14:357-368，(1990))。通過上述適當(dāng)導(dǎo)向序列與目標(biāo)轉(zhuǎn)基因序列的融合，可能將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物導(dǎo)向任何細(xì)胞器或細(xì)胞單元。B．植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建可用于植物轉(zhuǎn)化的多種轉(zhuǎn)化載體為植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知，并且與本發(fā)明有關(guān)的基因可與任何這些載體結(jié)合使用。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)種。對于某些目標(biāo)種，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素及相關(guān)抗生素抗性的nptⅡ基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19:259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304:184-187(1983))、賦予除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等人，核酸研究18:1062(1990),Spencer等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.)79:625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細(xì)胞生物學(xué)4:2929-2931)、允許在甘露糖存在下進(jìn)行正選擇的manA基因(Miles和Guest(1984)基因32:41-48；美國專利號5,767,378)、賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7):1099-1104(1983))、和賦予草甘膦抗性的EPSPS基因(美國專利號4,940,935和5,188,642)。1．適用于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的載體許多載體可用于應(yīng)用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉(zhuǎn)化。它們一般帶有至少一個T-DNA邊界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))的載體和pXYZ。適用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括二元載體pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB10及其潮霉素選擇衍生物。(見，例如，美國專利號5,639,949)。2．適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體不使用根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化避免了對所選的轉(zhuǎn)化載體中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的載體外，也可應(yīng)用缺少這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇主要取決于待轉(zhuǎn)化的種類的優(yōu)選。適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(見，例如，美國專利號5,639,949)。C．轉(zhuǎn)化技術(shù)目的編碼序列被克隆到表達(dá)系統(tǒng)中后，即被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。植物轉(zhuǎn)化和再生的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。例如，Ti質(zhì)粒載體已用于外源DNA的送遞，以及直接DNA攝取、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射和微粒轟擊。另外，也可用農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌的技術(shù)包括原生質(zhì)體或細(xì)胞對外源遺傳物質(zhì)的直接攝取。這可通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、粒子轟擊介導(dǎo)的送遞、或顯微注射來完成。在所有情況中，都用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為整個植物。
大多數(shù)單子葉植物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)也已成為常規(guī)。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)向原生質(zhì)體中直接轉(zhuǎn)移基因，對愈傷組織的粒子轟擊，以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明野生型或改變形式的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因可用來向植物細(xì)胞的多種變體賦予除草劑耐受性，包括那些裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。盡管基因可被插入任何落入本發(fā)明范圍的植物細(xì)胞，尤其是在作物植物細(xì)胞，如稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴著、胡蘿卜、甜馬鈴薯、甜菜、豌豆、豆、菊苣、萵苣、卷心菜、菜花、花莖甘藍(lán)、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、西葫蘆、南瓜、倭瓜、黃瓜、蘋果、梨、榅桲、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
野生型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的高水平表達(dá)和/或除草劑耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的表達(dá)賦予植物的除草劑耐受性，以及其它對生產(chǎn)和質(zhì)量重要的特征，均可通過本領(lǐng)域周知的育種方法和技術(shù)摻入到植物品系中。
當(dāng)除草劑耐受性HMP-P激酶/TMP-PP酶基因等位基因通過在作物植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的直接篩選獲得時(shí)，其中由所述植物細(xì)胞培養(yǎng)物可再生作物植物，可利用傳統(tǒng)育種技術(shù)將其移入商品化的變體中，以培育除草劑耐受性作物，而無需遺傳工程化等位基因并將其轉(zhuǎn)化入植物。序列表中的序列簡述SEQ ID NO:1，芥屬HMP-P激酶/IMP-PP酶前蛋白的DNA序列SEQ ID NO:2，芥屬HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:3，推定的成熟芥屬HMP-P激酶/TMP-PP酶的DNA序列SEQ ID NO:4，推定的成熟芥屬HMP-P激酶/TMP-PP酶的氨基酸序列SEQ ID NO:5，寡核苷酸aththiDEforSEQ ID NO:6，寡核苷酸aththiDErevSEQ ID NO:7，寡核苷酸aththiDEfor-ctp保藏克隆 保藏號 保藏日期aththiDE-ctpNRRL B-300401998年7月8日將參照下列詳細(xì)的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例的目的僅僅是說明，除非另外指明而不意在限制。
或者，通過偶聯(lián)反應(yīng)方法定量ADP的形成。在這種情況中，加入3.5單位丙酮酸激酶，4.7單位的乳酸脫氫酶，1.0mM磷酸烯醇式丙酮酸和0.2mM NADH，于340nm測量吸光度。實(shí)施例3偶聯(lián)HMP激酶與HMP-P激酶和TMP-PP酶活性檢定分析HMP激酶檢定分析通過檢測同時(shí)形成的ADP跟蹤HMP向HMP-P的轉(zhuǎn)化。利用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶(試劑酶)，檢測在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)存在下NADH向NAD+的轉(zhuǎn)化，跟蹤ADP的形成。在340nm監(jiān)測。丙酮酸激酶和PEP促進(jìn)ATP由ADP的再生。ATP是HMP激酶和HMP-P激酶均需要的底物。檢定分析緩沖液為添加了10 mM MgCl2的50 mM Tris-HCl,pH 7.5(緩沖液A)。HMP-P激酶和TMP-PP酶為檢定分析HMP-P激酶和TMP-PP酶，需要提供底物HMP-P和THZ-P。HMP-P由在相同反應(yīng)混合物中HMP向HMP-P的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。如果加入NADH，利用HMP激酶檢定分析可跟蹤這種轉(zhuǎn)化。當(dāng)HMP向HMP-P轉(zhuǎn)化進(jìn)行充分時(shí)(約50mM)，加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和THZ-P。在HMP-P產(chǎn)生后加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和THZ-P，確保在所有反應(yīng)孔中初始HMP-P濃度恒定。通過Kawasaki等，(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172,6145-6147的方法鑒定形成的TMP的量。在TMP產(chǎn)生足夠的時(shí)間后(一般15分鐘)，用偏磷酸或TCA終止酶反應(yīng)。在堿性條件下氧化TMP。用激發(fā)波長360±10nm和發(fā)射波長430±10nm測量所得thiachrome衍生物的熒光。檢定方法無論酶的來源均用相同方法進(jìn)行檢定分析。在300ml的96孔微滴板中進(jìn)行檢定分析?？倷z定分析反應(yīng)體積為100ml。以比例混合底物使得終濃度為(微滴板中)HMP(100 mM),ATP(1000 mM),PEP(1000 mM)，及NADH(200 mM)。10X底物混合物可以10ml/孔移入。也可混合試劑酶和HMP激酶以同時(shí)加入。每個反應(yīng)的ADP檢測/再生混合物的推薦量為1.0單位丙酮酸激酶和1.0單位乳酸脫氫酶。這可用作指導(dǎo)，并依經(jīng)驗(yàn)調(diào)整酶量。在HMP激酶反應(yīng)以約5mM/分鐘的速度反應(yīng)完成后(在10-15分鐘之內(nèi))，加入THZ-P至終濃度50mM，并加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。一定間隔后(由HMP-P激酶和TMP-PP酶的活性決定)，加入50 mL 10％(w/v)偏磷酸或20％(w/v)三氯乙酸(pH 1.4)終止反應(yīng)。離心培養(yǎng)板，沉淀蛋白質(zhì)，將上清液移入另外的微滴板。加入50ml的0.3M溴化氰，混合，隨后加入100ml的1M NaOH。用激發(fā)波長360±10nm和發(fā)射波長430±10nm通過熒光光度微滴板讀數(shù)計(jì)讀取孔板值。使用單磷酸硫胺素為標(biāo)準(zhǔn)。
單磷酸硫胺素、ATP、PEP、NADH、偏磷酸、三氯乙酸、溴化氰和NaOH可得自Sigma Chemicals。利用Schellenberger等，(Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.(1967)348,501-505)的方法合成HMP，依照Leder等，(1970)酶學(xué)方法，18A,166-167的方法合成THZ-P。實(shí)施例4偶聯(lián)的THZ激酶和HMP-P激酶與TMP-PP酶活性檢定分析A．THZ激酶檢定分析通過檢測同時(shí)形成的ADP跟蹤THZ向THZ-P的轉(zhuǎn)化。利用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶(試劑酶)，檢測在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)存在下NADH向NAD+的轉(zhuǎn)化，跟蹤ADP的形成。在340nm監(jiān)測。丙酮酸激酶和PEP促進(jìn)ATP由ADP的再生。ATP是THZ激酶和HMP-P激酶均需要的底物。檢定分析緩沖液為添加了10 mM MgCl2的緩沖液A。B．HMP-P激酶和TMP-PP酶為檢定分析HMP-P激酶和TMP-PP酶，需要提供底物HMP-P和THZ-P。THZ-P由在相同反應(yīng)混合物中THZ向THZ-P的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。如果加入NADH，利用THZ激酶檢定分析可跟蹤這種轉(zhuǎn)化。當(dāng)THZ向THZ-P轉(zhuǎn)化進(jìn)行充分時(shí)(約20mM)，加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和HMP-P。在THZ-P產(chǎn)生后加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和HMP-P，確保在所有反應(yīng)孔中初始THZ-P濃度恒定。通過Kawasaki等，(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172,6145-6147的方法鑒定形成的TMP的量。在TMP產(chǎn)生足夠的時(shí)間后(一般15分鐘)，用偏磷酸或TCA終止酶反應(yīng)。在堿性條件下氧化TMP。用激發(fā)波長360±10nm和發(fā)射波長430±10nm測量所得thiachrome衍生物的熒光。C．檢定方法無論酶的來源均用相同方法進(jìn)行檢定分析。在300ml的96孔微滴板中進(jìn)行檢定分析?？倷z定分析反應(yīng)體積為100ml。依比例混合底物使得終濃度為(微滴板中)THZ(50 mM),ATP(5mM),PEP(1000mM)，和NADH(200 mM)。10X底物混合物可以10ml/孔移入。也可混合試劑酶和HMP激酶以同時(shí)加入。每個反應(yīng)的ADP檢測/再生混合物的推薦量為1.0單位丙酮酸激酶和1.0單位乳酸脫氫酶。這可用作指導(dǎo)，并依經(jīng)驗(yàn)調(diào)整酶量。在THZ激酶反應(yīng)以約5mM/分鐘的速度反應(yīng)完成后(在5-10分鐘之內(nèi))，加入HMP-P至終濃度100mM，并加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。一定間隔后(由HMP-P激酶和TMP-PP酶的活性決定)，加入50 mL 10％(w/v)偏磷酸或20％(w/v)三氯乙酸(pH 1.4)終止反應(yīng)。離心培養(yǎng)板，沉淀蛋白質(zhì)，將上清液移入另外的微滴板。加入50ml的0.3M溴化氰，混合，隨后加入100ml的1M NaOH。用激發(fā)波長360±10nm和發(fā)射波長430±10nm通過熒光光度微滴板讀數(shù)計(jì)讀取孔板值。使用單磷酸硫胺素為標(biāo)準(zhǔn)。
單磷酸硫胺素、ATP、PEP、NADH、偏磷酸、三氯乙酸、溴化氰和NaOH可得自Sigma Chemicals.利用Schellenberger等，(Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.(1967)348,501-505)的方法合成HMP，依照Leder等，(1970)酶學(xué)方法，18A,166-167的方法合成THZ-P。實(shí)施例5偶聯(lián)的HMP激酶、THZ激酶和HMP-P激酶和TMP-PP酶活性檢定分析HMP激酶和THZ激酶檢定分析通過檢測同時(shí)形成的ADP跟蹤HMP向HMP-P以及THZ向THZ-P的轉(zhuǎn)化。利用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶(試劑酶)，檢測在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)存在下NADH向NAD+的轉(zhuǎn)化，跟蹤ADP的形成。在340nm監(jiān)測。丙酮酸激酶和PEP促進(jìn)ATP由ADP的再生。ATP是HMP激酶和HMP-P激酶均需要的底物。檢定分析緩沖液為添加了10 mM MgCl2的緩沖液A。HMP-P激酶和TMP-PP酶為檢定分析HMP-P激酶和TMP-PP酶，需要提供底物HMP-P和THZ-P。HMP-P和THZ-P由在相同反應(yīng)混合物中HMP向HMP-P的轉(zhuǎn)化以及THZ向THZ-P的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。如果加入NADH，利用HMP激酶和THZ激酶檢定分析可跟蹤這種轉(zhuǎn)化。當(dāng)HMP向HMP-P轉(zhuǎn)化以及THZ向THZ-P轉(zhuǎn)化進(jìn)行充分時(shí)(分別為約50mM和20mM)，加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。在HMP-P和THZ-P產(chǎn)生后加入HMP-P激酶和TMP-PP酶，確保在所有反應(yīng)孔中這些底物的初始濃度恒定。通過Kawasaki等，(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172,6145-6147的方法鑒定形成的TMP的量。在TMP產(chǎn)生足夠的時(shí)間后(一般15分鐘)，用偏磷酸或TCA終止酶反應(yīng)。在堿性條件下氧化TMP。用激發(fā)波長360+10nm和發(fā)射波長430±10nm測量所得thiachrome衍生物的熒光。檢定方法無論酶的來源均用相同方法進(jìn)行檢定分析。在300ml的96孔微滴板中進(jìn)行檢定分析?？倷z定分析反應(yīng)體積為100ml。依比例混合底物使得終濃度為(微滴板中)HMP(100mM),THZ(50 mM),ATP(5mM),PEP(1000 mM)，和NADH(200 mM)。10X底物混合物可以10ml/孔移入。也可混合試劑酶和HMP激酶以同時(shí)加入。每個反應(yīng)的ADP檢測/再生混合物的推薦量為1.0單位丙酮酸激酶和1.0單位乳酸脫氫酶。這可用作指導(dǎo)，并依經(jīng)驗(yàn)調(diào)整酶量。在HMP激酶和THZ激酶反應(yīng)以約5mM/分鐘的速度反應(yīng)完成后(在10-15分鐘之內(nèi))，加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。一定間隔后(由HMP-P激酶和TMP-PP酶的活性決定)，加入50 mL 10％(w/v)偏磷酸或20％(w/v)三氯乙酸(pH 1.4)終止反應(yīng)。離心培養(yǎng)板，沉淀蛋白質(zhì)，將上清液移入另外的微滴板。加入50ml的0.3M溴化氰，混合，隨后加入100ml的1M NaOH。用激發(fā)波長360±10nm和發(fā)射波長430±10nm通過熒光光度微滴板讀數(shù)計(jì)讀取孔板值。使用單磷酸硫胺素為標(biāo)準(zhǔn)。
單磷酸硫胺素、ATP、PEP、NADH、偏磷酸、三氯乙酸、溴化氰和NaOH可得自Sigma Chemicals。利用Schellenberger等，(Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.(1967)348,501-505)的方法合成HMP，依照Leder等，(1970)酶學(xué)方法，18A,166-167的方法合成THZ-P。實(shí)施例6通過DNA改組體外重組HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如實(shí)施例6所述通過PCR擴(kuò)增編碼前蛋白的擬南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因?；旧先鏢temmer所述(1994)PNAS 91:10747-10751用DNaseⅠ處理得到的DNA片段，從反應(yīng)混合物中除去PCR引物。無引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，隨后是帶引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，均如Stemmer et al.(1994)PNAS 91:10747-10751所述。將所得DNA片段克隆入pTRC99a (Pharmacia,Cat no:27-5007-01)，利用Biorad基因脈沖儀按制造商指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株NI500(遺傳學(xué)貯藏中心，New Haven，美國)或大腸桿菌菌株NI400(Nakayama和Hayashi(1972)細(xì)菌學(xué)雜志，112:1118-1126)。在含有抑制性濃度的抑制物存在的培養(yǎng)基中生長轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，挑選在有抑制物存在時(shí)生長的菌落。挑取在正常抑制性濃度的抑制物存在下生長的菌落，反復(fù)劃線純化。純化其質(zhì)粒，確定通過此測試的質(zhì)粒cDNA插入片段的DNA序列。實(shí)施例7參差延伸方法體外重組HMP-P激酶/TMP-PP酶基因各自將編碼成熟蛋白質(zhì)的擬南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因及大腸桿菌thiD克隆入pBluescript載體的多接頭。基本上如Zhao等，(1998)自然雜志生物工程分冊，16:258-261所述，利用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶瘮U(kuò)增的PCR片段，并克隆入pTRC99a，突變的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如實(shí)施例6所述篩選。B．各自將編碼成熟蛋白質(zhì)的擬南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因及大腸桿菌thiE克隆入pBluescript載體的多接頭?；旧先鏩hao等，(1998)自然雜志生物工程分冊，16:258-261所述，利用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶瘮U(kuò)增的PCR片段，并克隆入pTRC99a，突變的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如實(shí)施例6所述篩選。C．各自將編碼成熟蛋白質(zhì)的擬南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因及大腸桿菌thiD和thiE克隆入pBluescript載體的多接頭?；旧先鏩hao等，(1998)自然雜志生物工程分冊，16:258-261所述，利用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶瘮U(kuò)增的PCR片段，并克隆入pTRC99a，突變的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如實(shí)施例6所述篩選。實(shí)施例8稻胚胎發(fā)生細(xì)胞懸浮液的起始和維持將Japonica水稻品種“Taipei 309”的具有乳狀胚乳的未成熟小穗脫殼，用70％(v/v)乙醇表面消毒1分鐘，6％次氯酸鈣20分鐘，隨后用無菌蒸餾水洗三次。在含有3％蔗糖、2mg/l 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D),pH5.8的0.35％瓊脂糖固化MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,1962)上28℃培養(yǎng)分離的未成熟胚。一周后，通過每周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上分開并培養(yǎng)由盾蓋(scntella)產(chǎn)生的愈傷組織物質(zhì)。開始4周后，將3-4個愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有20ml R2培養(yǎng)基(R2鹽和維生素[Ohira等人，1973]、lmg/l 2,4-D、500mg/l 2-嗎啉代乙烷磺酸[MES]、3％蔗糖，pH5.8)的50ml培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)物在暗光下28℃保存于220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)式搖床上，每周將培養(yǎng)基替換為等量的新鮮培養(yǎng)基。選擇快速分裂、脆的愈傷組織，通過將2ml細(xì)愈傷組織懸液轉(zhuǎn)移到20ml R2培養(yǎng)基中將其傳代培養(yǎng)到一個新容器中。
使細(xì)胞覆蓋500μm網(wǎng)狀隔板，將其置于含有顆粒的過濾單元之下14cm。在部分真空(2×104pa)下用50毫秒的單次8巴壓力脈沖釋放顆粒。
如下培養(yǎng)原生質(zhì)體。室溫下將樣品鋪板于6cm培養(yǎng)皿中。再過5-15分鐘，加入含有1.2％SeaPlaque瓊脂糖和mg/l 2,4-D的3mlKM-8p培養(yǎng)基。充分混合瓊脂糖和原生質(zhì)體，使培養(yǎng)基成凝膠。B．以一個或多個如下改變重復(fù)上述方法(1)將原生質(zhì)體制品的電阻調(diào)節(jié)至0.5-0.7K；(2)使用的PEG是具有MW4000的PEG。
(3)不加入PEG，或加入一半體積的12％PEG。
(4)以3秒間隔進(jìn)行脈沖。
(5)在電穿孔后將原生質(zhì)體在碟中種板，置于冷卻至室溫16℃的碟上。
(6)在電穿孔步驟后將原生質(zhì)體置于試管中，用10ml的6/7強(qiáng)度的KMC溶液或用W5溶液(包含380 mg/l KCl,18.375 g/l CaCl2x2H2O,9g/l NaCl；9g/l葡萄糖，pH 6.0)洗滌，然后于60xg離心10分鐘，于0.3ml KM培養(yǎng)基中重懸，如A所述種板。
(7)不加胎牛胸腺載體DNA。實(shí)施例15用PEG處理轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體A．在上述最后一步中將原生質(zhì)體重懸于含有12-30 mM MgCl2的0.5M甘露醇溶液。如上述進(jìn)行45℃熱休克5分鐘。將原生質(zhì)體分配入用于在離心管中轉(zhuǎn)化的等份中，每管0.3ml懸浮原生質(zhì)體。在隨后10分鐘內(nèi)加入DNA和PEG溶液(MW6000,40％含有0.1MCa(NO3)2和0.4M甘露醇；用KOH調(diào)至pH8-9)，終濃度達(dá)到20％PEG。將等份樣品不時(shí)溫和振搖，溫育30分鐘，然后將原生質(zhì)體種板于培養(yǎng)皿中(每個直徑6cm培養(yǎng)皿0.3ml初始原生質(zhì)體懸浮液)，如所述培養(yǎng)。
B．重復(fù)此步驟，在上述PEG溶液中溫育30分鐘后洗滌原生質(zhì)體，方法是以2-3分鐘間隔加入0.3ml W5溶液洗滌5次。離心原生質(zhì)體懸浮液，除去上清液，如所述培養(yǎng)原生質(zhì)體。
C．重復(fù)上述步驟，將PEG終濃度修飾為13-25％之間。實(shí)施例16由原生質(zhì)體再生愈傷組織在瓊脂糖中含有原生質(zhì)體的平板于26℃置于黑暗中。14天后，從原生質(zhì)體得到集落。將含有集落的瓊脂糖轉(zhuǎn)移至9cm直徑培養(yǎng)皿的表面，所述培養(yǎng)皿含有帶2mg/l 2,4-D用0.24％Gelrite酸化的N6培養(yǎng)基30ml。該培養(yǎng)基稱為2N6。再次在26℃于黑暗中培養(yǎng)愈傷組織，每兩周將愈傷組織小片傳代至新鮮固體2N6培養(yǎng)基上。實(shí)施例17轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織篩選重復(fù)上面的實(shí)施例，為了篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，將100mg/l或200mg/l潮霉素B加至2N6培養(yǎng)基。實(shí)施例18玉米植物的再生A．將愈傷組織置于2N6培養(yǎng)基上維持，置于ON6(含有N6培養(yǎng)基，不含2,4-D)和N61培養(yǎng)基(含有N6培養(yǎng)基，含0.25mg/l 2,4-D和10mg/l細(xì)胞分裂素)以引發(fā)再生。在光照下(用白色熒光燈16小時(shí)/日光以840-8400 lx)培養(yǎng)ON6和N61培養(yǎng)基上生長的愈傷組織。兩周后將在N61培養(yǎng)基上生長的愈傷組織轉(zhuǎn)移到ON6培養(yǎng)基，因?yàn)樵贜61培養(yǎng)基上延長生長是有害的。每兩周傳代愈傷組織，即使愈傷組織將再次轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基配方上。在約4-8周出現(xiàn)小植物。一旦小植物至少有2cm高，將其轉(zhuǎn)移到GA7容器的ON6培養(yǎng)基上。在2-4周形成根，當(dāng)根充分形成足以支持生長時(shí)，將小植物移入泥炭罐中的土壤，前4-7天在陰影中生長。通常在移植體上倒扣一透明塑料杯2-3天是有益的，以幫助硬化。一旦形成植物，如正常玉米植物處理，在溫室中生長至成熟。為了獲得子代植物，自花傳粉或與野生型雜交。
B．重復(fù)上述實(shí)施例，為維持愈傷組織加入培養(yǎng)基中100mg/l或200mg/l潮霉素B。實(shí)施例19將DNA導(dǎo)入雙色高粱(Sorghum bicolor)原生質(zhì)體基本如上面的玉米所述，制備高粱懸浮液FS 562的原生質(zhì)體，最后一次洗滌后在如下溶液中以107/ml重懸0.2 M甘露醇，0.1％MES,72 mM NaCl,70 mM CaCl2,2.5 mM KCl,2.5 mM葡萄糖，用KOH調(diào)節(jié)pH為5.8，以1.6-2×106/ml的密度。以1ml等份將原生質(zhì)體懸浮液分配入塑料一次性小管中，如所述加入10μg DNA。當(dāng)測量下述電穿孔儀471電極裝置之間該點(diǎn)的溶液電阻時(shí)范圍在6內(nèi)。為了轉(zhuǎn)化，將DNA加入10微升無菌蒸餾水中，用如Paszkowski等，1984所述除菌。溫和混勻溶液，于室溫(24-28℃)經(jīng)歷400V/cm的脈沖，利用471電極裝置BTX-Transfector300電穿孔儀，衰減指數(shù)常數(shù)為10ms。B．重復(fù)上述步驟，進(jìn)行如下一個或多個修改(1)使用電壓為200 Vcm-1，或在100 Vcm-1與800 Vcm-1之間。(2)指數(shù)衰減常數(shù)為5 ms、15 ms或20 ms。(3)25μl無菌水中50μg剪切的胎牛胸苷DNA與質(zhì)粒DNA一起加入。(4)在使用前用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?如BamHⅠ)處理，使質(zhì)粒DNA線性化。
轉(zhuǎn)化后以2×106/ml的密度將原生質(zhì)體培養(yǎng)于KM-8p培養(yǎng)基中，不加固化劑。實(shí)施例20將DNA導(dǎo)入Glycine max的原生質(zhì)體如Tricoli等，(1986)、或Chowhury和Widholm(1985)或Klein等，(1981)所述的方法制備Glycine max原生質(zhì)體?；旧先缟纤鰧NA導(dǎo)入這些原生質(zhì)體。如Tricoli等，(1986)、或Chowhury和Widholm(1985)或Klein等，(1981)所述培養(yǎng)原生質(zhì)體，不加入藻酸固化培養(yǎng)基。
上述公開的實(shí)施方案為闡明性的。本發(fā)明的公開將使本領(lǐng)域技術(shù)人員擁有本發(fā)明的多種變形。所有這些顯而易見的和可預(yù)見的變形均由所附的權(quán)利要求所涵蓋。
序列表<110>Novartis AG<120>篩選除草化合物的方法及其用途<130>PH/5-30565/A/CGC2013<140><141><150>US 09/109,254<151>1998-06-30<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1569<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(1566)<223>芥屬HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白的cDNA編碼序列<400>1atg aat agc tta gga gga att agg agt tgg ccg gcg aat tgg aga agt48Met Asn Ser Leu Gly Gty Ile Arg Ser Trp Pro Ala Asn Trp Arg Ser1 5 10 15acg acg gcg tca atg acg acg acg gag agc gtt aga aag gta ccg caa96Thr Thr Ala Ser Met Thr Thr Thr Glu Ser Val Arg Lys Val Pro Gln20 25 30gtt tta aca gtg gcg gga tca gat tcc ggc gcc gga gct gga att caa144Val Leu Thr Val Ala Gly Ser Asp Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gln35 40 45gcc gac ctt aaa gtc tgc gca gct cgt ggt gtg tat tgc gct tcc gtc192Ala Asp Leu Lys Val Cys Ala Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ala Ser Val50 55 60ata acc gca gtc act gct cag aac act cga gga gtt caa tct gtt cat240Ile Thr Ala Val Thr Ala Gln Asn Thr Arg Gly Val Gln Ser Val His65 70 75 80ctt crt cct ccg gaa ttt arc tct gaa cag ctc aaa tcc gtc crc tct288Leu Leu Pro 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30Val Leu Thr Val Ala Gly Ser Asp Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gln35 40 45Ala Asp Leu Lys Val Cys Ala Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ala Ser Val50 55 60Ile Thr Ala Val Thr Ala Gln Asn Thr Arg Gly Val Gln Ser Val His65 70 75 80Leu Leu Pro Pro Glu Phe Ile Ser Glu Gln Leu Lys Ser Val Leu Ser85 90 95Asp Phe Glu Phe Asp Val Val Lys Thr Gly Met Leu Pro Ser Thr Glu100 105 110Ile Val Glu Val Leu Leu Gln Asn Leu Ser Asp Phe Pro Val Arg Ala115120 125Leu Val Val Asp Pro Val Met Val Ser Thr Ser Gly His Val Leu Ala130 135 140Gly Ser Ser Ile Leu Ser Ile Phe Arg Glu Arg Leu Leu Pro Ile Ala145 150 155 160Asp Ile Ile Thr Pro Asn Val Lys Glu Ala Ser Ala Leu Leu Asp Gly165 170 175Phe Arg Ile Glu Thr Val Ala Glu Met Arg Ser Ala Ala Lys Ser Leu180 185 190His Glu Met Gly Pro Arg Phe Val Leu Val Lys Gly Gly Asp Leu Pro195 200 205Asp Ser Ser Asp Ser Val Asp Val Tyr Phe Asp Gly Lys Glu Phe His210 215 220Glu Leu Arg Ser Pro Arg Ile Ala Thr Arg Asn Thr His Gly Thr Gly225 230 235 240Cys Thr Leu Ala Ser Cys Ile Ala Ala 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455 460Leu Pro Val Val Ala Ile Gly Gly Ile Gly Ile Ser Asn Ala Gly Ser465 470 475 480Val Met Gln Ile Asp Ala Pro Asn Leu Lys Gly Val Ala Val Val Ser
485 490 495Ala Leu Phe Asp Gln Asp Cys Val Leu Thr Gln Ala Lys Lys Leu His500 505 510Lys Thr Leu Lys Glu Ser Lys Arg Gly Ile515 520<210>3<211>1473<212>DNA<213>擬南芥<220><221>CDS<222>(1)..(1470)<223>推定成熟芥屬HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白的cDNA編碼序列<400>3atg tta aca gtg gcg gga tca gat tcc ggc gcc gga gct gga att caa48Met Leu Thr Val Ala Gly Ser Asp Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gln1 5 10 15gcc gac ctt aaa gtc tgc gca gct cgt ggt gtg tat tgc gct tcc gtc96Ala Asp Leu Lys Val Cys Ala Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ala Ser Val20 25 30ata acc gca gtc act gct cag aac act cga gga gtt caa tct gtt cat144Ile Thr Ala Val Thr Ala Gln Asn Thr Arg Gly Val Gln Ser Val His35 40 45ctt ctt cct ccg gaa ttt atc tct gaa cag ctc aaa tcc gtc ctc tct192Leu Leu Pro Pro Glu Phe Ile Ser Glu Gln Leu Lys Ser Val Leu Ser50 55 60gac ttc gaa ttc gac gtc gtg aag act ggg atg ctt cct tct act gag240Asp Phe Glu Phe Asp Val Val Lys Thr Gly Met Leu Pro Ser Thr Glu65 70 75 80atc gtt gag gtt ctt ctt caa aat cta tca gat ttt cca gtt cgt gct288Ile Val Glu 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1．一種編碼參與硫胺素生物合成的酶的核苷酸序列，其中所述酶具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
2．權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中所述酶含有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
3．權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中所述酶含有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
4．權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列與示于SEQ IDNO:1的核苷酸序列相同或基本上相似。
5．權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列示于SEQ IDNO:1。
6．一種含有與權(quán)利要求1的核苷酸序列有效連接的啟動子之嵌合基因。
7．一種含有權(quán)利要求7的嵌合基因之重組載體，其中所述載體能被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞。
8．一種含有權(quán)利要求14的載體的宿主細(xì)胞，其中所述核苷酸序列在所述細(xì)胞中可表達(dá)。
9．一種參與硫胺素生物合成的植物蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
10．權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)，其中所述酶含有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
11．權(quán)利要求9的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)含有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
12．一種鑒定待測化學(xué)品的抑制植物生長和生存能力之方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化其產(chǎn)物合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的待測化學(xué)品和酶與用于第一反應(yīng)混合物中的底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中酶的活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存能力。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
14．權(quán)利要求12的方法，其中所述HMP-P激酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶磷酸(HMP-P)。
15．權(quán)利要求12的方法，其中所述TMP-PP酶的底物是4-甲基-5-(β-羥乙基)噻唑磷酸(THZ-P)。
16．權(quán)利要求12的方法，其中所述TMP-PP酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羥甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)。
17．權(quán)利要求12的方法，其中所述酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測定。
18．一種抑制非期望植被生長的方法，包括向非期望的植被應(yīng)用由權(quán)利要求12的方法鑒定的化學(xué)品的步驟。
19．一種植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織，其包含編碼具有HMP-P激酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述核苷酸序列賦予植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞耐受一定量的由權(quán)利要求12的方法鑒定的化學(xué)品，所述一定量為正常情況下抑制野生型植物中HMP-P激酶活性的量。
20．一種可通過如下方法獲得的植物，包括用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化植物或植物的親本，其中分離的DNA分子包含編碼HMP-P激酶活性的酶之核苷酸序列，且能夠在所述植物中表達(dá)核苷酸序列，從而賦予該植物對由權(quán)利要求12方法鑒定的化學(xué)品的耐受性。
21．一種包含如下步驟的檢定方法(a)于酶能夠催化其產(chǎn)物合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中酶的活性；其中，若第二反應(yīng)混合物中偶聯(lián)的酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中的酶活性，則化學(xué)品能抑制酶活性。
22．一種鑒定待測化學(xué)品的抑制植物生長和生存能力之方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存能力。
23．權(quán)利要求22的方法，其中具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶來自植物。
24．權(quán)利要求22的方法，其中具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
25．權(quán)利要求22的方法，其中HMP激酶的底物是HMP。
26．權(quán)利要求22的方法，其中TMP-PP酶的底物是THZ-P。
27．權(quán)利要求22的方法，其中具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測定。
28．一種用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述DNA分子賦予植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織對一定量的由權(quán)利要求22方法鑒定的化學(xué)品的耐受性，所述一定量為正常情況下抑制植物中HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的量。
29．一種可通過如下方法獲得的植物，包括用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化植物或植物的親本，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，且能夠在所述植物中表達(dá)核苷酸序列，從而賦予該植物對由權(quán)利要求22方法鑒定的化學(xué)品的耐受性。
30．一種包括如下步驟的檢定方法(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，則化學(xué)品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之酶活性。
31．一種鑒定待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存能力之方法，包括如下步驟(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與HMP-P激酶底物和THZ激酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)當(dāng)在第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性時(shí)，選擇待測化學(xué)品的抑制植物生長或生存能力。
32．權(quán)利要求31的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶來自植物。
33．權(quán)利要求31的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
34．權(quán)利要求31的方法，其中HMP-P激酶的底物是HMP-P。
35．權(quán)利要求31的方法，其中THZ激酶的底物是THZ。
36．權(quán)利要求31的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性通過測量反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的TMP測定。
37．一種抑制非期望植被生長的方法，包括向非期望的植被應(yīng)用由權(quán)利要求31的方法鑒定的化學(xué)品的步驟。
38．一種用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性和/或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述DNA分子賦予植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織對一定量的由權(quán)利要求31的方法鑒定的化學(xué)品之耐受性，所述一定量為正常情況下抑制植物中HMP-P激酶活性和/或TMP-PP酶活性的量。
39．一種可通過如下方法獲得的植物，包括用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化植物或植物的親本的步驟，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性和/或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，且能夠在所述植物中表達(dá)核苷酸序列，從而賦予該植物對由權(quán)利要求31方法鑒定的化學(xué)品的耐受性。
40．一種包括如下步驟的檢定方法(a)于酶能夠催化TMP偶聯(lián)合成的條件下，將第一反應(yīng)混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶與THZ激酶底物和HMP-P激酶底物混合；(b)在相同條件下，將第二反應(yīng)混合物中的化學(xué)品和酶與底物混合，保持如在第一反應(yīng)混合物中的相同時(shí)間；(c)測定在第一和第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明顯低于第一反應(yīng)混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，則化學(xué)品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之活性。
41．一種鑒定具有除草劑活性的化學(xué)品的方法，其中所述化學(xué)品抑制植物中HMP-P激酶或TMP-PP酶活性，包括如下步驟(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，其中包含一種編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的分離的核苷酸序列，且能過量表達(dá)HMP-P激酶活性或TMP-PP酶的酶促活性；(b)將化學(xué)品應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物、植物組織、植物種子或植物細(xì)胞，以及等基因的非轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、組織或其部分；(c)測定轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、組織應(yīng)用化學(xué)品后的生長或存活；(d)比較轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、組織應(yīng)用化學(xué)品后的生長或存活；其中，化學(xué)品抑制轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織或其部分的生長或存活，而不明顯抑制等基因的非轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織或其部分的生長或存活。
42．權(quán)利要求41的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由與示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列編碼，或具有與示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
43．一種抑制非期望植被生長的方法，包括向非期望的植被應(yīng)用由權(quán)利要求22或41中任一種方法鑒定的化學(xué)品。
44．一種用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述DNA分子賦予植物、植物細(xì)胞、植物種子或植物組織對一定量的由權(quán)利要求41的方法鑒定的化學(xué)品的耐受性，所述一定量為正常情況下抑制植物中HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的量。
45．一種可通過如下方法獲得的植物，包括用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化植物或植物的親本的步驟，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，且能夠在所述植物中表達(dá)核苷酸序列，從而賦予該植物對由權(quán)利要求41方法鑒定的化學(xué)品耐受性。
46．一種在含有種植的作物種子的作物或植株的田間選擇性抑制雜草生長的方法，包括如下步驟(a)種植除草劑耐受作物或作物種子，其是用分離的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物或植物種子，其中分離的DNA分子包含編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在所述植物或植物種子中表達(dá)；以及(b)向田間的作物或作物種子和雜草應(yīng)用一定量的除草劑，所用量抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中，除草劑抑制雜草的生長，而不明顯抑制作物的生長。
47．一種改組DNA分子，其中所述改組DNA分子編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由一種模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，所述改組DNA分子由該模板DNA分子衍生。
48．一種通過改組編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的模板DNA分子獲得的突變DNA分子，其中所述突變DNA分子編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由該模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
49．一種從編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的模板DNA分子形成編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的突變DNA分子的方法，其中所述模板DNA分子已被切割為雙鏈隨機(jī)片段，所述方法包括如下步驟(a)向所得雙鏈隨機(jī)片段群體中加入至少一種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一個與模板DNA分子相同的區(qū)域以及一個與模板DNA分子異源的區(qū)域；(b)將所得雙鏈隨機(jī)片段和寡核苷酸變性成為單鏈分子；(c)將所得單鏈分子群體與聚合酶在這樣的條件下溫育，該條件可導(dǎo)致所述單鏈分子在所述相同區(qū)域退火，以形成退火片段對，所述相同區(qū)域足以使退火片段對的一方引發(fā)另一方的復(fù)制，由此形成一種突變的雙鏈多核苷酸；(d)再重復(fù)第二和第三步至少兩個循環(huán)，其中進(jìn)一步循環(huán)的第二步中所得混合物包括來自在先循環(huán)第三步驟中的突變雙鏈多核苷酸，進(jìn)一步的循環(huán)形成進(jìn)一步突變的雙鏈多核苷酸；其中，突變的雙鏈多核苷酸編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由該模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
50．權(quán)利要求49的方法，其中一種模板DNA分子來自真核生物。
51．權(quán)利要求49的方法，其中所述真核生物是植物。
52．權(quán)利要求49的方法，其中所述模板DNA分子的種類與SEQ IDNO:1所示核苷酸序列相同或基本上相似。
53．由權(quán)利要求49的方法獲得的突變DNA分子，其編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中所述突變的DNA分子編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由該模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
54．一種從編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的至少兩種不相同模板DNA分子形成編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之突變DNA分子的方法，包括如下步驟(a)向模板DNA分子中加入至少一種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一與各個模板DNA分子相同的區(qū)域；(b)將所得混合物變性成為單鏈分子；(c)將所得單鏈分子群體與聚合酶在這樣的條件下溫育，該條件可導(dǎo)致寡核苷酸與模板DNA分子退火，其中用于聚合酶的聚合作用的條件是獲得相應(yīng)于模板DNA分子的一部分的聚合化產(chǎn)物；(d)再重復(fù)第二和第三步至少兩個循環(huán)，其中第三步中獲得的延伸產(chǎn)物能引發(fā)模板DNA分子在下一循環(huán)中用于聚合作用；由此形成突變的雙鏈多核苷酸，其包含來自不同模板DNA分子的序列；其中，突變的雙鏈多核苷酸編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由該模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
55．權(quán)利要求54的方法，其中一種模板DNA分子來自真核生物。
56．權(quán)利要求54的方法，其中所述真核生物是植物。
57．權(quán)利要求54的方法，其中所述模板DNA分子的種類與SEQ IDNO:1所示核苷酸序列相同或基本上相似。
58．由權(quán)利要求54的方法獲得的突變DNA分子，其編碼具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中所述突變的DNA分子編碼具有對除草劑增強(qiáng)的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草劑抑制由該模板DNA分子編碼的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用重組產(chǎn)生的具有HMP－P激酶活性或TMP－PP酶活性的酶篩選除草劑活性的化學(xué)品的方法，所述化學(xué)品用于鑒定抑制不期望植被生長的用途。此外，本發(fā)明提供了利用編碼具有HMP－P激酶活性或TMP－PP酶活性的酶之基因在植物、植物組織、植物種子和植物細(xì)胞中培育除草劑耐受性的方法，以及利用這類轉(zhuǎn)基因植物選擇性抑制作物田間中雜草的生長之方法。
文檔編號C12N9/12GK1317051SQ99808108
公開日2001年10月10日 申請日期1999年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月30日
發(fā)明者J·Z·勒文, S·L·波特, M·W·鮑爾 申請人:辛根塔參與股份公司