專利名稱：來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的basb029多核苷酸和多酞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(這里指“BASB029多核苷酸”)、它們編碼的多肽(這里指“BASB029”或“BASB029多肽”)、重組物質(zhì)以及它們的制備方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸包括抵抗細(xì)菌感染的疫苗的方法。再一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)特定病原體感染的診斷試驗(yàn)。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏球菌(腦膜炎球菌)是一種能經(jīng)常從人的上呼吸道分離到的革蘭氏陰性細(xì)菌。它偶爾能導(dǎo)致侵襲性的細(xì)菌疾病如菌血癥和腦膜炎。腦膜炎疾病的發(fā)生顯示出地理、季節(jié)和年度差異(Schwartz,B.Moore,P.S.,Broome,C.V；《臨床微生物綜述》2(增刊)，S18-S24,1989)。在溫帶國(guó)家，多數(shù)疾病是由血清型B菌株引起的，年發(fā)病率在總?cè)藬?shù)的十萬(wàn)分之一至十萬(wàn)分之十之間變化，有時(shí)會(huì)達(dá)到更高的數(shù)值(Kaczmarski,E.B.(1997),Commun.Dis.Rep.Rev.7:R55-9,1995；Scholten,R.J.P.M.,Bijlmer,H.A.,Poolman,J.T.等《臨床感染性疾病》16:237-246,1993；Cruz,C.,Pavez,G.,Aguilar,E.，等《感染流行病學(xué)》105:119-126,1990)。
由血清型A腦膜炎球菌引起的流行病，主要在中部非洲，有時(shí)能達(dá)到每年十萬(wàn)分之一千(Schwartz,B.,Moore,P.S.,Broome,C.V.《臨床微生物綜述》2(增刊)，S18-S24,1989)。就腦膜炎疾病的整體來(lái)看，幾乎所有的病例都是由血清型A、B、C、W-135和Y腦膜炎球菌引起的，并且可以使用一種4價(jià)A、C、W-135、Y的多糖疫苗(Armand,J.,Arminjon,F.,Mynard,M.C.,Lafaix,C.,《J.Biol.Stand》10:335-339,1982)。多糖疫苗目前正通過(guò)將它們與載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)的方式進(jìn)行改進(jìn)(Lieberman,J.M.,Chiu,S.S.,Wong,V.K.等，JAMA 275:1499-1503,1996)。
尚未獲得一種血清型B的疫苗，因?yàn)锽的莢膜多糖被發(fā)現(xiàn)是非免疫原性的，很可能是由于它與宿主成分具有結(jié)構(gòu)上的相似性(Wyle,F.A.,Artenstein,M.S.,Brandt,M.L.等，《傳染病雜志》126:514-522,1972；Finne,J.M.,Leinonen,M.,Mkel,P.M.《柳葉刀》ⅱ:355-357,1983)。
為開(kāi)發(fā)以腦膜炎球菌外膜為基礎(chǔ)的疫苗，人們已經(jīng)努力了多年(deMoraes,J.C.,Perkins,B.,Camargo,M.C.等《柳葉刀》340:1074-1078,1992；Bjune,G.,Hoiby,E.A.Gronnesby,J.K等，338:1093-1096,1991)。這種疫苗已證明在大兒童(＞4歲)和成年人中的有效性為57％-85％。
這些疫苗中存在許多細(xì)菌外膜組分，例如PorA、PorB、Rmp、Opc、Opa、FrpB，這些成分對(duì)觀察到的保護(hù)作用所作的貢獻(xiàn)仍需進(jìn)一步確定。使用動(dòng)物或人抗體已經(jīng)確定了可能與保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)相關(guān)的其他細(xì)菌外膜組分，例如TbpB和NspA(Martin,D.,Cadieux,N.,Hamel,J.,Brodeux,B.R.，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》185:1173-1183,1997；Lissolo,L.,Maitre-Wilmotte,C.,Dumas,P.等，Inf.Immun.63:884-890,1995)。保護(hù)性免疫的機(jī)制將涉及抗體介導(dǎo)的殺菌活性和吞噬調(diào)理作用。
一種菌血?jiǎng)游锬Ｐ鸵驯挥脕?lái)組合所有的抗體介導(dǎo)機(jī)制(Saukkonen,K.,Leinonen,M.,Abdillahi,H.Poolman,J.T.《疫苗》7:325-328,1989)。一般認(rèn)為，晚期補(bǔ)體組分介導(dǎo)的殺菌機(jī)制對(duì)抵抗腦膜炎疾病的免疫來(lái)說(shuō)至關(guān)重要(Ross,S.C.,Rosenthal P.J.,Berberic,H.M,Densen,P.J.《傳染病雜志》155:1266-1275,1987)。
在過(guò)去幾十年中，腦膜炎奈瑟氏球菌的發(fā)病率有了很大的提高。這已被歸咎為多重抗生素抗性菌株的出現(xiàn)和具有較弱的免疫系統(tǒng)的人群體的增加。分離對(duì)某些或所有標(biāo)準(zhǔn)抗生素具有抗性的菌株不再是異常。這種現(xiàn)象就使我們產(chǎn)生了針對(duì)這種微生物的新型抗微生物試劑、疫苗、藥物篩選方法和診斷試驗(yàn)的永不滿足的需求。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及BASB029特別是BASB029多肽和BASB029多核苷酸、重組物質(zhì)以及它們的制備方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸的方法，包括微生物疾病的預(yù)防與治療及其他。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)與微生物感染有關(guān)的疾病及與這樣的感染有關(guān)的癥狀的診斷試驗(yàn)，例如檢測(cè)BASB029多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的試驗(yàn)。
通過(guò)閱讀下面的描述和本公開(kāi)的其他部分，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易理解在本發(fā)明公開(kāi)的精神和范圍之內(nèi)的各種改變和修飾。
發(fā)明詳述如下文的詳細(xì)介紹，本發(fā)明涉及BASB029多肽和多核苷酸。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB029的多肽和多核苷酸，BASB029與嗜血流感菌的表面原纖(HSF)蛋白在氨基酸序列上具有同源性。本發(fā)明尤其涉及具有分別列于SEQ ID NO:1,3和SEQ ID NO:2,4的核苷酸和氨基酸序列的BASB029。應(yīng)當(dāng)理解，在后面的序列表中列舉為“DNA”的序列代表本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的舉例，因?yàn)槠胀ǖ募夹g(shù)人員就知道，這樣的序列通常被用作多核苷酸，包括多核糖核苷酸。多肽在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了在這里被稱為“BASB029”和“BASB029多肽”的腦膜炎奈瑟氏球菌的多肽，及其在生物學(xué)、診斷、預(yù)防、臨床或治療上有用的變體，以及含有它們的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供(a)含有這樣一種氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；(b)由含有如下一種多核苷酸序列的分離多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸序列分別與SEQ ID NO:1,3的整個(gè)長(zhǎng)度具有至少85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；或者(c)由含有如下一種多核苷酸序列的分離多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸序列編碼這樣一種多肽，這種多肽與SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；SEQ ID NO:2,4中提供的BASB029多肽是來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090和H44/76的BASB029多肽。
本發(fā)明還提供BASB029多肽的一種免疫原性片段，即BASB029多肽的一個(gè)連續(xù)的部分，它與含有SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是說(shuō)，該片段(必要時(shí)可與一種載體偶聯(lián))能夠產(chǎn)生能識(shí)別BASB029多肽的免疫應(yīng)答。這種免疫原性片段可包括諸如缺少N-末端前導(dǎo)序列和/或跨膜區(qū)域和/或C-末端錨定區(qū)域的BASB029多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的BASB029的免疫原性片段包含基本上一種多肽的所有胞外結(jié)構(gòu)域，其中該多肽與SEQ ID NO:2,4在SEQ ID NO:2的整個(gè)長(zhǎng)度上至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性；片段是這樣一種多肽，它具有與本發(fā)明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分而不是全部完全相同的氨基酸序列。就BASB029多肽而言，片段可以是“獨(dú)立存在”，或處于一個(gè)較大的多肽中，在一個(gè)單獨(dú)的較大多肽中組成一個(gè)部分或區(qū)域，優(yōu)選是一種單個(gè)的連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，諸如具有SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列的一個(gè)部分的截短的多肽或其變體，例如包括氨基末端和或羧基末端氨基酸序列的連續(xù)殘基系列。用或在一種宿主細(xì)胞中制備的本發(fā)明的多肽的降解形式也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是具有結(jié)構(gòu)或功能特征的片段，例如含有α螺旋和α螺旋形成區(qū)域、β折疊和β折疊形成區(qū)域、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)域、線團(tuán)和線團(tuán)形成區(qū)域、親水區(qū)域、疏水區(qū)域、α兩親性區(qū)域、β兩親性區(qū)域、柔性區(qū)域、表面形成區(qū)域、底物結(jié)合區(qū)域和高抗原性區(qū)域的片段。
更優(yōu)選的片段包括含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列具有SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸；或含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列具有從SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列截短或缺失的至少15、20、30、40、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明的多肽片段可用于通過(guò)肽合成制備相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此，這些片段可用作制備本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽的中間體。
特別優(yōu)選的是變體，其中以任何組合方式取代、缺失或添加了幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、1-2或1個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一種較大蛋白如前體或融合蛋白的一部分。通常優(yōu)選包含含有分泌或前導(dǎo)序列、前序列、能協(xié)助純化的序列如多組氨酸殘基，或能在重組制備過(guò)程中起穩(wěn)定作用的額外序列。而且，還考慮加入外源性多肽或脂類尾巴或多核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性能力。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及遺傳工程制備的可溶性融合蛋白，這種融合蛋白含有本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的是，免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1的恒定區(qū)部分，而融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可簡(jiǎn)單地通過(guò)引入一個(gè)切割序列而去除，這種切割序列可用血凝因子X(jué)a切割。
而且，本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及涉及它們?cè)谒幬锖Y選、診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可在國(guó)際專利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914中發(fā)現(xiàn)。
蛋白質(zhì)可通過(guò)化學(xué)方法接合，或以重組融合蛋白的形式表達(dá)，這種融合蛋白形式能比非融合蛋白在一種表達(dá)系統(tǒng)以較高水平制備。融合配體可幫助提供T輔助表位(免疫性融合配體)，優(yōu)選的是能被人識(shí)別的T輔助表位；或者能幫助蛋白比原來(lái)的重組蛋白以較高產(chǎn)量進(jìn)行表達(dá)的T輔助表位(表達(dá)增強(qiáng)子)。融合配體優(yōu)選既是一種免疫性融合配體，又是表達(dá)增強(qiáng)子配體。
融合配體包括來(lái)自嗜血流感菌的蛋白D和來(lái)自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。另一種融合配體是被稱為L(zhǎng)ytA的蛋白。優(yōu)選使用該分子的C末端部分。LytA來(lái)自肺炎鏈球菌，它合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶---LytA酰胺酶(由lytA基因編碼{《基因》43(1986)265-272頁(yè)})，后者是一種自溶素，它特異性地降解肽聚糖骨架中的某些鍵。LytA蛋白的C末端區(qū)域負(fù)責(zé)與膽堿或某些膽堿類似物如DEAE的親和性。這種特性已被用于發(fā)展能用于融合蛋白表達(dá)的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。在其氨基端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已經(jīng)有介紹{《生物技術(shù)》10卷(1992)795-798頁(yè)}?？梢允褂肔ytA分子中在C末端發(fā)現(xiàn)的重復(fù)部分，從殘基178開(kāi)始，例如殘基188-305。
本發(fā)明還包括前面提到的多肽的變體，即通過(guò)保守性氨基酸取代與參照物不同的多肽，其中一種殘基被另一種具有相似特征的殘基取代。典型的這種取代在如下氨基酸之間Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性殘基Asp和Glu；Asn和Gln；堿性殘基Lys和Arg；或芳族殘基Phe和Tyr。
本發(fā)明的多肽可以任何合適的方式進(jìn)行制備。這種多肽包括分離的天然產(chǎn)生的多肽、重組制備的多肽、合成制備的多肽、或用這些方法的組合制備的多肽。制備這種多肽的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
本發(fā)明的多肽更優(yōu)選來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌，但它也優(yōu)選可獲自相同分類學(xué)屬的其他生物體。本發(fā)明的多肽還可獲自諸如相同分類學(xué)科或目的生物體。多核苷酸本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼BASB029多肽的多核苷酸，特別是編碼這里被稱為BASB029的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸包含一個(gè)編碼BASB029多肽的區(qū)域，該區(qū)域包含一個(gè)列于SEQ ID NO:1,3的序列，它包括一個(gè)全長(zhǎng)的基因或其變體。
SEQ ID NO:1,3中提供的BASB029多核苷酸是來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090和H44/76的BASB029多核苷酸。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了編碼和/或表達(dá)BASB029多肽和多核苷酸特別是腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB029多肽和多核苷酸的分離核酸分子，包括諸如未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因組DNAs、B-和Z-DNAs。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案包括在生物性、診斷性、預(yù)防性、臨床或治療性有用的多核苷酸和多肽以及含有它們的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及至少包括一個(gè)全長(zhǎng)基因的分離多核苷酸，該基因編碼一種具有SEQ ID NO:2,4的推定氨基酸序列的BASB029，以及與其密切相關(guān)的多核苷酸及其變體。
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB029多肽，它包括或由SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列或其變體組成。
使用這里提供的信息，例如SEQ ID NO:1,3列出的多核苷酸序列，本發(fā)明的編碼BASB029多肽的多核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法獲得，例如使用那些用于從細(xì)菌中克隆和測(cè)序染色體DNA片段的方法以腦膜炎奈瑟氏球菌作為起始物質(zhì)，接著獲得一個(gè)全長(zhǎng)克隆。例如，為獲得本發(fā)明的一種多核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1,3中給出的多核苷酸序列，通常使用一種來(lái)自部分序列的放射性標(biāo)記的寡核苷酸，優(yōu)選17-mer或更長(zhǎng)，對(duì)大腸桿菌或其他合適宿主中的腦膜炎奈瑟氏球菌的染色體DNA克隆文庫(kù)進(jìn)行篩選。攜帶與探針相同DNA的克隆接著用嚴(yán)緊雜交條件進(jìn)行區(qū)分。通過(guò)用根據(jù)原來(lái)的多肽或多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測(cè)序引物對(duì)這樣用雜交方法鑒定的單個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，就有可能在兩個(gè)方向延伸多核苷酸序列，從而確定全長(zhǎng)的基因序列。這種測(cè)序常規(guī)使用諸如由質(zhì)?？寺≈苽涞淖冃缘碾p鏈DNA來(lái)進(jìn)行。合適的技術(shù)見(jiàn)Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)。(具體見(jiàn)雜交篩選1.90和變性雙鏈DNA模板測(cè)序13.70)。也可應(yīng)用直接的基因組DNA測(cè)序來(lái)獲得全長(zhǎng)的基因序列。為說(shuō)明本發(fā)明，SEQ ID NO:1,3列出的每個(gè)多核苷酸都從來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的DNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。
而且，SEQ ID NO:1,3中列出的每個(gè)DNA序列都含有一個(gè)編碼如下蛋白的開(kāi)放閱讀框，該蛋白含有SEQ ID NO:2,4中列出的氨基酸殘基數(shù)目，其推導(dǎo)的分子量可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的氨基酸殘基的分子量數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。
SEQ ID NO:1的多核苷酸位于SEQ ID NO:1的起始密碼子的核苷酸號(hào)碼1和從核苷酸號(hào)碼1783開(kāi)始的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO:2的多肽。
SEQ ID NO:3的多核苷酸位于SEQ ID NO:3的起始密碼子的核苷酸號(hào)碼1和從核苷酸號(hào)碼1774開(kāi)始的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO:4的多肽。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，該核苷酸包括或由以下組成(a)一種多核苷酸序列，它與SEQ ID NO:1,3分別在SEQ ID NO:1，3的整個(gè)長(zhǎng)度上至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；或(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO:2,4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO:2,4的整個(gè)長(zhǎng)度上具有至少85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或100％完全相同。
編碼本發(fā)明的一種多肽的多核苷酸，包括來(lái)自除腦膜炎奈瑟氏球菌以外的種類的同源物或同源進(jìn)化物，可通過(guò)一種包括以下步驟的方法來(lái)獲得在嚴(yán)緊雜交條件下(例如使用45-65℃的溫度范圍，SDS的濃度為0.1-1％)用一種標(biāo)記的或可檢測(cè)的探針對(duì)合適的文庫(kù)進(jìn)行篩選，其中探針包含或由SEQ ID NO:1,3的序列或其一個(gè)片段組成，并分離含有所說(shuō)多核苷酸序列的全長(zhǎng)基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供一種在其整個(gè)長(zhǎng)度上與SEQ ID NO:1,3的編碼序列(開(kāi)放閱讀框)相同的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供單獨(dú)的成熟多肽或其片段的編碼序列以及與另一個(gè)編碼序列在一個(gè)閱讀框內(nèi)的成熟多肽或其片段的編碼序列，另一個(gè)編碼序列的例子為編碼一種前導(dǎo)或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列。本發(fā)明的多核苷酸也可含有至少一種非編碼序列，包括但不限于，諸如至少一種非編碼的5’和3’序列，例如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列、終止信號(hào)(例如rho-依賴和非rho-依賴的終止信號(hào))、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Kozak序列、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)。多核苷酸序列也可包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼一種能促進(jìn)融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是一種6組氨酸肽，由pQE載體提供(Qiagen,Inc.)，見(jiàn)Gentz等《美國(guó)科學(xué)院院刊》86:821-824,(1989)中的介紹；或是一種HA肽尾巴(Wilson等，《細(xì)胞》37:767(1984)；兩種標(biāo)記序列都可用于純化與它們?nèi)诤系亩嚯?。本發(fā)明的多核苷酸還包括但不限于，包含一種結(jié)構(gòu)基因和其天然相連的控制基因表達(dá)的序列。
編碼SEQ ID NO:2,4的BASB029多肽的核苷酸序列可與SEQ IDNO:1的核苷酸1至1782所含的多肽編碼序列或SEQ ID NO:3的核苷酸1至1773所含的多肽編碼序列分別相同。另外，它可以是這樣一種序列，即是遺傳密碼豐余(簡(jiǎn)并性)的結(jié)果，也編碼SEQ ID NO:2,4的多肽。
用于此處，“編碼一種多肽的多核苷酸”一詞涉及包括一種編碼本發(fā)明的多肽的序列的多核苷酸，本發(fā)明的多肽具體說(shuō)是一種細(xì)菌多肽，更具體說(shuō)是腦膜炎奈瑟氏球菌BASB029多肽，它具有SEQ ID NO:2,4所列的氨基酸序列。該詞還涉及這樣一種多核苷酸，它包括編碼該肽的一個(gè)單一的連續(xù)區(qū)域或非連續(xù)區(qū)域(例如被整合的噬菌體、整合的插入序列、整合的載體序列、整合的轉(zhuǎn)座子序列或因RNA編輯或基因組DNA重排所打斷的多核苷酸)以及另外的區(qū)域，這種另外的區(qū)域也可含有編碼和/或非編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及這里介紹的多核苷酸的變體，這種變體能編碼具有SEQ ID NO:2,4的推定氨基酸序列的多肽的變體。本發(fā)明的多核苷酸的片段可用于諸如合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
更加特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼BASB029變體的多核苷酸，該變體具有在SEQ ID NO:2,4中幾個(gè)、少數(shù)、5至10、1至5、1至3、2、1或沒(méi)有氨基酸被以任何組合方式取代、修飾、缺失和/或添加的BASB029多肽的氨基酸序列。在它們中尤其優(yōu)選的是并不改變BASB029多肽的特性和活性的沉默取代、添加和缺失。
本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案是與編碼具有SEQ ID NO:2,4列出的氨基酸序列的BASB029多肽的多核苷酸在其整個(gè)長(zhǎng)度上至少有85％相同的多核苷酸；以及與這種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。就此而言，特別優(yōu)選的是在整個(gè)長(zhǎng)度上至少有90％的同一性的多核苷酸，而在這些特別優(yōu)選多核苷酸中，至少有95％的同一性的多核苷酸更為優(yōu)選，而且在這些至少有95％的同一性的多核苷酸中，至少有97％相同的多核苷酸更優(yōu)選，同樣在它們中，至少有98％和至少有99％相同的多核苷酸尤其更加優(yōu)選，其中至少有99％相同的多核苷酸更優(yōu)選。
優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼基本上保留了SEQ ID NO:1,3的DNA編碼的成熟多肽的相同生物功能或活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供能與BASB029多核苷酸序列例如SEQ ID NO:1,3的多核苷酸序列雜交，尤其是在嚴(yán)緊條件下雜交的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及能與這里提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。就此而言，本發(fā)明特別涉及能在嚴(yán)緊條件下與這里介紹的多核苷酸雜交的多核苷酸。用于此處，“嚴(yán)緊條件”和“嚴(yán)緊雜交條件”的意思是雜交只發(fā)生在序列之間至少有95％優(yōu)選至少有97％相同時(shí)。嚴(yán)緊雜交條件的一個(gè)具體例子是在42℃在一種溶液中溫育過(guò)夜，該溶液包括50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的變性剪切鮭精蛋白，接著在0.1×SSC中在約65℃時(shí)洗滌雜交支持物。雜交和洗滌條件是眾所周知的，并在Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中特別是11章中舉例。溶液雜交也可用本發(fā)明提供的多核苷酸序列進(jìn)行。
本發(fā)明還提供含有或由這樣一種多核苷酸序列組成的多核苷酸，該多核苷酸序列通過(guò)用一種探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選一種合適的文庫(kù)并分離所述多核苷酸序列來(lái)獲得，其中文庫(kù)含有SEQ ID NO:1,3列出的多核苷酸序列的完整基因，而探針具有SEQ ID NO:1,3列出的所說(shuō)多核苷酸序列的序列。可用于獲得這樣一種多核苷酸的片段包括諸如本文的其他部分詳細(xì)介紹的探針和引物。
如本發(fā)明在這里的其他部分對(duì)多核苷酸試驗(yàn)的討論，例如，本發(fā)明的多核苷酸可用作RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針來(lái)分離編碼BASB029的全長(zhǎng)cDNAs和基因組克隆，并分離與BASB029基因具有高同一性特別是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這種探針一般具有至少15個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，這種探針優(yōu)選具有至少30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，也可具有至少50個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。特別優(yōu)選的探針具有至少20個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，并少于至少30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。
BASB029基因的編碼區(qū)可通過(guò)使用SEQ ID NO:1,3提供的DNA序列合成一種寡核苷酸探針進(jìn)行篩選來(lái)分離。然后使用與本發(fā)明的基因序列互補(bǔ)的標(biāo)記寡核苷酸篩選一種cDNA、基因組DNA或mRNA文庫(kù)，來(lái)確定該探針雜交的文庫(kù)成員。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，有幾種方法是可以使用和熟知的，可以用來(lái)獲得全長(zhǎng)DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法為基礎(chǔ)的方法(見(jiàn)諸如Frohman等，《美國(guó)科學(xué)院院刊》85:8998-9002,1988)。這種技術(shù)的最近修改，例如MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)，明顯簡(jiǎn)化了對(duì)較長(zhǎng)cDNAs的尋找。在MarathonTM技術(shù)中，cDNAs用從一種選擇的組織中抽提的mRNA制備，并在每個(gè)末端連上一種“接頭”。然后使用基因特異的和接頭特異的寡核苷酸組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)來(lái)擴(kuò)增“丟失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重復(fù)PCR反應(yīng)，巢式引物即設(shè)計(jì)來(lái)與擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部退火的引物(通常為與接頭序列的3’退火的一種接頭特異性引物和與所選擇的基因序列的5’退火的一種基因特異性引物)。然后用DNA測(cè)序?qū)υ摲磻?yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過(guò)將產(chǎn)物直接與已有的DNA連接產(chǎn)生一個(gè)完整的序列，或者使用設(shè)計(jì)5’引物的新序列信息進(jìn)行一個(gè)單獨(dú)的全長(zhǎng)PCR，來(lái)構(gòu)建一個(gè)全長(zhǎng)的DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用作諸如發(fā)現(xiàn)疾病特別是人疾病的治療和診斷的研究試劑和物質(zhì)，如同這里與多核苷酸試驗(yàn)有關(guān)的討論。
本發(fā)明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO:1-4序列的寡核苷酸，它們可用于這里介紹的方法，但更優(yōu)選用于PCR，用來(lái)確定這里鑒定的多核苷酸是否全部或部分能在細(xì)菌或感染組織中轉(zhuǎn)錄。應(yīng)當(dāng)理解，這種序列也可用于診斷感染的階段和所獲得病原體的感染類型。
本發(fā)明也提供編碼這樣一種多肽的多核苷酸，這種多肽是一種成熟蛋白加上另外的氨基或羧基末端氨基酸、或成熟多肽內(nèi)部的氨基酸(例如，當(dāng)成熟形式含有一個(gè)以上的多肽鏈時(shí))。這種序列可在將一種蛋白從前體加工成成熟形式時(shí)起作用，可允許蛋白運(yùn)輸，可延長(zhǎng)或縮短蛋白的半壽期，或可便于蛋白用于試驗(yàn)或制備時(shí)的操作。通常在體內(nèi)時(shí)，另外的氨基酸可通過(guò)細(xì)胞酶從成熟蛋白上加工除去。
對(duì)于本發(fā)明的每一種和所有的多核苷酸，都提供一種與之互補(bǔ)的多核苷酸。這些互補(bǔ)多核苷酸優(yōu)選與它們互補(bǔ)的每一種多核苷酸完全互補(bǔ)。
一種含有多肽的成熟形式與一種或多種原序列融合的前體蛋白可能是該多肽的無(wú)活性形式。當(dāng)除去原序列時(shí)，這種無(wú)活性的前體一般被激活。在活化前，一些或所有的原序列可被除去。這種前體一般被稱為蛋白原。
核苷酸除了用標(biāo)準(zhǔn)的A、G、C、T/U表示外，“N”也可用來(lái)描述本發(fā)明的特定多核苷酸?！癗”指4種DNA或RNA核苷酸的任何一個(gè)都可出現(xiàn)在DNA或RNA序列的該指定位點(diǎn)，但優(yōu)選N不是一種核酸，當(dāng)它與相鄰的核苷酸位置組合在一起，當(dāng)按正確的閱讀框閱讀時(shí)，在該閱讀框中產(chǎn)生一種成熟前的終止密碼子。
總而言之，本發(fā)明的多核苷酸可編碼一種成熟蛋白、一種成熟蛋白加一種前導(dǎo)序列(它可被稱為一種前蛋白)、含有一種或多種非前蛋白的前導(dǎo)序列的原序列的成熟蛋白的前體、或原蛋白的前體前原蛋白，其具有一種前導(dǎo)序列和一種或多種原序列，它們通常在產(chǎn)生多肽的活性和成熟形式的加工過(guò)程中被除去。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供本發(fā)明的多核苷酸在治療性或預(yù)防性目的特別是遺傳免疫方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的多核苷酸在遺傳免疫方面的應(yīng)用優(yōu)選使用一種合適的傳遞方法，例如直接將質(zhì)粒DNA注射進(jìn)肌肉(Wolff等《人類分子遺傳學(xué)》(1992)1:363,Manthorpe等，《人類基因治療》(1983)4:419)；將DNA與特異性蛋白載體復(fù)合后進(jìn)行傳遞(Wu等，《生物化學(xué)雜志》(1989)264:16985)，將DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty&Reshef,《美國(guó)科學(xué)院院刊》(1986)83:9551)；將DNA用各種形式的脂質(zhì)體包裹(Kaneda等，《科學(xué)》(1989)243:375)；粒子轟擊(Tang等，《自然》(1992)356:152,Eisenbraun等《DNA與細(xì)胞生物學(xué)》(1993)12:791)以及使用克隆的逆轉(zhuǎn)錄載體進(jìn)行體內(nèi)感染(Seeger等，《美國(guó)科學(xué)院院刊》81:5949)。載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體進(jìn)行了遺傳工程改造的宿主細(xì)胞以及通過(guò)重組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽。無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于使用來(lái)自本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)物的RNAs制備這樣的蛋白。
本發(fā)明的重組多肽可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法由含有表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程宿主細(xì)胞進(jìn)行制備。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)、用這種表達(dá)系統(tǒng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞以及用重組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽。
為進(jìn)行本發(fā)明的多肽的重組制備，宿主細(xì)胞可通過(guò)遺傳工程改造來(lái)整合表達(dá)系統(tǒng)或其部分或本發(fā)明的多核苷酸。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)介紹的方法來(lái)完成，例如Davis等《分子生物學(xué)基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、載體轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽(yáng)離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕接種、轟擊導(dǎo)入和感染。
合適宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞如鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、藍(lán)細(xì)菌、枯草芽孢桿菌、粘膜炎莫拉氏菌、嗜血流感菌和腦膜炎奈瑟氏球菌的細(xì)胞；真菌細(xì)胞如克魯維氏酵母、糖酵母等酵母、白色假絲酵母和曲霉等擔(dān)子菌的細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2和草地夜蛾Sf9的細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞如裸子植物或被子植物的細(xì)胞。
多種表達(dá)系統(tǒng)可用于制備本發(fā)明的多肽。這種載體包括染色體型、游離型、病毒型衍生載體，例如由細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母游離體、插入元件、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒、微小RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和甲型病毒衍生的載體或由它們的組合物衍生的載體，例如由質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件衍生的載體，如粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)物可含有調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的控制區(qū)域。就這個(gè)方面一般來(lái)說(shuō)，任何適合于維持、增殖或表達(dá)多核苷酸和/或在一種宿主中表達(dá)一種多肽的系統(tǒng)或載體都可用于表達(dá)。合適的DNA序列可通過(guò)任何熟知的和常規(guī)的技術(shù)插入到表達(dá)系統(tǒng)中，例如Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(上文)中列出的技術(shù)。
在真核細(xì)胞重組表達(dá)系統(tǒng)中，為使翻譯蛋白分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層中、周質(zhì)間或胞外環(huán)境中，可將合適的分泌信號(hào)整合到表達(dá)的多肽中。這些信號(hào)對(duì)多肽來(lái)說(shuō)可以是內(nèi)源性的，或者也可以是異源性的。
本發(fā)明的多肽可通過(guò)熟知的技術(shù)從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，這些技術(shù)包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。更優(yōu)選將金屬離子親和層析(IMAC)用于純化。熟知的用于蛋白重新折疊的技術(shù)可用于當(dāng)多肽在胞內(nèi)合成、分離和/或純化過(guò)程中變性時(shí)活性構(gòu)象的再生。
表達(dá)系統(tǒng)也可是一種重組的活微生物，例如一種病毒或細(xì)菌。目標(biāo)基因可插入到活的重組病毒或細(xì)菌的基因組中。接種和體內(nèi)感染這種活的載體將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)。用于此目的的病毒和細(xì)菌是諸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、微小RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)、李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌、奈瑟氏菌、BCG。這些病毒和細(xì)菌可以是毒性的、或用各種方法減毒來(lái)獲得一種活疫苗。這種活疫苗也是本發(fā)明的一個(gè)部分。診斷、預(yù)測(cè)、血清分型和突變?cè)囼?yàn)本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的BASB029多核苷酸和多肽用作診斷試劑。在真核細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤其是人細(xì)胞中檢測(cè)BASB029多核苷酸和/或多肽可為診斷疾病、疾病階段或感染生物體對(duì)藥物的應(yīng)答提供一種診斷方法。真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞，特別是那些感染或懷疑感染了含有BASB029基因或蛋白的生物體的細(xì)胞，可在核酸或氨基酸水平通過(guò)多種熟知的技術(shù)以及這里提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。
用于預(yù)測(cè)、診斷或其他分析的多肽和多核苷酸可獲自假定感染和/或感染個(gè)體的機(jī)體物質(zhì)。來(lái)自任何這些來(lái)源的多核苷酸尤其是DNA或RNA可直接用于檢測(cè)，或者可在分析前使用PCR或其他任何擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA特別是mRNA、cDNA和基因組DNA也可以相同方式使用。使用擴(kuò)增方法，通過(guò)對(duì)生物體的所選多核苷酸的基因型進(jìn)行分析，可對(duì)感染性或個(gè)體中存在的定居生物體的種類和菌株進(jìn)行鑒定。缺失和插入可通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物與一種選自相關(guān)生物體的參考序列的基因型相比的大小變化進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選與相同屬的不同種或相同種的不同株進(jìn)行比較。點(diǎn)突變可通過(guò)將擴(kuò)增DNA與標(biāo)記的BASB029多核苷酸序列進(jìn)行雜交來(lái)鑒定。對(duì)于DNA或RNA來(lái)說(shuō)，通過(guò)DNase或RNase消化分別可將非常或明顯匹配的序列與匹配不佳或明顯錯(cuò)配的雙體區(qū)分開(kāi)來(lái)，或者通過(guò)檢測(cè)融解溫度或復(fù)性動(dòng)力學(xué)的差異進(jìn)行區(qū)分。多核苷酸序列差異也可通過(guò)多核苷酸片段在凝膠中與一種參考序列相比的電泳遷移的改變來(lái)檢測(cè)。這可使用或不使用變性試劑。多核苷酸差異也可通過(guò)直接的DNA或RNA測(cè)序來(lái)檢測(cè)。見(jiàn)諸如Myers等，《科學(xué)》230:1242(1985)。特殊位置的序列改變也可通過(guò)核酸酶保護(hù)試驗(yàn)如RNase、V1和S1保護(hù)試驗(yàn)或化學(xué)裂解方法來(lái)顯示。見(jiàn)諸如Cotton等《美國(guó)科學(xué)院院刊》85:4397-4401(1985)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建一系列含有BASB029核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針，來(lái)對(duì)諸如遺傳突變、血清型、分類或鑒定進(jìn)行有效的篩選。平行技術(shù)方法是眾所周知的，具有通用性，可用來(lái)解決分子遺傳學(xué)中的多種問(wèn)題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異(見(jiàn)諸如Chee等《科學(xué)》274:610(1996)。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，它包括(a)本發(fā)明的一種多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO:1,3的核苷酸序列或其片段；(b)與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的一種多肽，優(yōu)選SEQ ID NO:2,4的多肽或其片段；或(d)針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體，優(yōu)選針對(duì)SEQ ID NO:2,4的多肽的抗體。
在任何這樣一種試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可優(yōu)選含有一種基本組分。這種試劑盒可用于疾病或?qū)膊〉囊赘行缘脑\斷或其他。
本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的多核苷酸用作診斷試劑。對(duì)本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選SEQ ID NO:1,3的與一種疾病或致病性相關(guān)的突變形式的檢測(cè)，可提供一種診斷手段，這種診斷手段可增加或限定由于該多核苷酸的低表達(dá)、過(guò)量表達(dá)或表達(dá)改變而引起的一種疾病的診斷、疾病過(guò)程的預(yù)測(cè)、疾病階段、或疾病的易感性的確定。在這樣的多核苷酸中帶有突變的生物體特別是感染性生物體可通過(guò)各種技術(shù)例如這里任何地方介紹的技術(shù)在多核苷酸水平進(jìn)行檢測(cè)。
來(lái)自在本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽中帶有突變或多態(tài)性(等位突變)的生物體的細(xì)胞也可用來(lái)使用多種技術(shù)在多核苷酸或多肽水平進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)行諸如血清學(xué)分型。例如，RT-PCR可用來(lái)檢測(cè)RNA中的突變。優(yōu)選將RT-PCR與自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)如GeneScan結(jié)合起來(lái)進(jìn)行使用。RNA、cDNA或基因組DNA也可用于相同的目的---PCR。例如，與編碼BASB029多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可用來(lái)鑒定和分析突變。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從5’和/或3’末端除去1、2、3或4個(gè)核苷酸的引物。這些引物可與其他材料一起用于擴(kuò)增從個(gè)體獲得的一種樣品如機(jī)體物質(zhì)中分離的BASB029 DNA和/或RNA。這些引物可用于擴(kuò)增從感染個(gè)體中分離的一種多核苷酸，這樣，該多核苷酸可隨后通過(guò)各種技術(shù)來(lái)闡明多核苷酸序列。通過(guò)這種方法，可檢測(cè)多核苷酸序列中的突變，并用于診斷和/或預(yù)測(cè)感染或其階段或過(guò)程，或進(jìn)行感染因子的血清學(xué)分型和/或分類。
本發(fā)明進(jìn)一步提供診斷疾病，優(yōu)選是細(xì)菌感染，更優(yōu)選是由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的方法，這包括在從個(gè)體獲得的樣品如一種機(jī)體物質(zhì)中檢測(cè)具有SEQ ID NO:1,3序列的多核苷酸的表達(dá)水平的提高。BASB029多核苷酸表達(dá)的增加或減少可使用本領(lǐng)域任何已知的用于多核苷酸定量的方法進(jìn)行檢測(cè)，例如擴(kuò)增、PCR、RT-PCR、RNase保護(hù)、Northern印跡、分光光度和其他雜交方法。
此外，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)BASB029多肽與正常對(duì)照組織樣品相比過(guò)量表達(dá)的診斷試驗(yàn)可用來(lái)檢測(cè)例如一種感染的存在。可用來(lái)測(cè)定BASB029多肽在來(lái)自一種宿主如一種機(jī)體物質(zhì)中的水平的試驗(yàn)技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。這種試驗(yàn)方法包括放射免疫試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、Western印跡、抗體夾心試驗(yàn)、抗體檢測(cè)和ELISA試驗(yàn)。
本發(fā)明的多核苷酸可用作多核苷酸列陣優(yōu)選是高密度列陣或載網(wǎng)的組分。這些高密度列陣對(duì)于診斷和預(yù)測(cè)目的特別有用。例如，各含一種不同基因并進(jìn)一步含有本發(fā)明的多核苷酸的一套點(diǎn)可用于探針檢測(cè)，例如使用雜交或核酸擴(kuò)增，使用來(lái)自或衍生自一種機(jī)體樣品的探針，來(lái)檢測(cè)一種特別的寡核苷酸序列或相關(guān)序列在一個(gè)個(gè)體中的存在。這種存在可說(shuō)明一種病原體尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌的存在，并可用來(lái)診斷和/或預(yù)測(cè)疾病或疾病過(guò)程。優(yōu)選的是一種含有多種SEQ ID NO:1,3的核苷酸序列的變體的載網(wǎng)。含有編碼SEQ ID NO:2,4的多肽序列的多核苷酸序列的多種變體的載網(wǎng)也是優(yōu)選的?？贵w本發(fā)明的多肽和多核苷酸或其變體或者表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原來(lái)制備分別針對(duì)這種多肽或多核苷酸的抗體。
在本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施方案中，提供針對(duì)BASB029多肽或多核苷酸的抗體。
針對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸制備的抗體可通過(guò)使用傳統(tǒng)的方法獲得，即將本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸、或它們之一或兩者的攜帶表位的片段、它們之一或兩者的類似物、或表達(dá)它們之一或兩者的細(xì)胞給藥于一種動(dòng)物，優(yōu)選是一種非人類的動(dòng)物。本領(lǐng)域任何能提供用連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)制備的抗體的技術(shù)都可以使用。例子包括各種技術(shù)，例如Kohler,G.和Milstein,C.《自然》256:495-497(1975)；Kozbor等《今日免疫學(xué)》4:72(1983)；Cole等《單克隆抗體和癌癥治療》，Alan R.Liss,Inc.(1985)的77-96頁(yè)。
制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利No.4,946,778)可修改來(lái)制備針對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因鼠或其他生物體或動(dòng)物如其他哺乳動(dòng)物也可用來(lái)表達(dá)對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸免疫特異的人源化抗體。
另外，噬菌體顯示技術(shù)可用來(lái)從含有抗BASB029的人淋巴細(xì)胞的PCR擴(kuò)增的V-基因文庫(kù)或天然文庫(kù)中選擇對(duì)本發(fā)明的多肽具有結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty等(1990)《自然》348:552-554；Marks等(1992)《生物技術(shù)》10:779-783)。這些抗體的親和性也可通過(guò)諸如鏈置換技術(shù)進(jìn)行提高(Clackson等，(1991)《自然》352:628)。
上面介紹的抗體可用來(lái)分離或鑒定能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的克隆，來(lái)通過(guò)諸如親和層析純化這些多肽或多核苷酸。
這些抗體以及其他針對(duì)BASB029多肽或BASB029多核苷酸的抗體可用來(lái)治療感染，特別是細(xì)菌感染。
多肽變體包括抗原性、表位性或免疫性等價(jià)的變體，它們組成了本發(fā)明的一個(gè)特別的方面。
抗體或其片段優(yōu)選通過(guò)修飾，使之在個(gè)體中具有較小的免疫原性。例如，如果個(gè)體是人，抗體可更優(yōu)選是一種“人源化”的抗體，其中雜交瘤來(lái)源抗體的互補(bǔ)決定區(qū)被移植到人單克隆抗體中，例如Jones等(1986)《自然》321,522-525或Tempest等(1991)《生物技術(shù)》9,266-273中的介紹。拮抗劑和激動(dòng)劑---試驗(yàn)和分子本發(fā)明的多肽和多核苷酸還可用來(lái)評(píng)價(jià)小分子底物與配體在諸如細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞抽提物、化學(xué)文庫(kù)和天然產(chǎn)物混合物中的結(jié)合。這些底物和配體可以是天然底物和配體，或者可以是結(jié)構(gòu)或功能模擬物，見(jiàn)諸如Coligan等《當(dāng)代免疫學(xué)方法》1(2):5章(1991)。
篩選方法可通過(guò)一種直接或間接與候選化合物連接的標(biāo)記簡(jiǎn)單地測(cè)量候選化合物與多肽或多核苷酸、或者攜帶多肽或多核苷酸的細(xì)胞或膜、或者多肽的融合蛋白的結(jié)合。此外，篩選方法可包括與一種標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。而且，這些篩選方法可檢測(cè)候選化合物是否導(dǎo)致一種由多肽或多核苷酸的活化產(chǎn)生的信號(hào)，這可使用與含有多肽或多核苷酸的細(xì)胞適宜的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行?；罨囊种苿┮话阍诖嬖谝环N已知激動(dòng)劑的情況下進(jìn)行試驗(yàn)，并觀察候選化合物對(duì)激動(dòng)劑活化作用的影響。組成型活性多肽和/或組成型表達(dá)的多肽和多核苷酸可根據(jù)需要，在沒(méi)有一種激動(dòng)劑或拮抗劑的情況下，用于逆轉(zhuǎn)激動(dòng)劑或抑制劑的篩選方法，這可通過(guò)檢測(cè)候選化合物是否導(dǎo)致多肽或多核苷酸的活化的抑制來(lái)進(jìn)行。而且，篩選方法可簡(jiǎn)單地包括以下步驟，將一種候選化合物與含有本發(fā)明的一種多肽或多核苷酸的溶液混合，形成一種混合物；檢測(cè)混合物中BASB029多肽和/或多核苷酸的活性；將混合物中BASB029多肽和/或多核苷酸的活性與一種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。融合蛋白如這里介紹的Fc部分與BASB029多肽制備的融合蛋白也可用于高通量的篩選試驗(yàn)，用來(lái)鑒定本發(fā)明的多肽的拮抗劑以及系統(tǒng)發(fā)育和/或功能上相關(guān)的多肽(見(jiàn)D.Bennett等《分子識(shí)別雜志》8:52-58(1995)和K.Johanson等《生物化學(xué)雜志》270(16):9459-9471(1995))。
能夠與本發(fā)明的一種多肽結(jié)合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗體也可用于設(shè)計(jì)檢測(cè)加入的化合物對(duì)細(xì)胞中mRNA和/或多肽產(chǎn)生的影響的篩選方法。例如，可以設(shè)計(jì)一種ELISA試驗(yàn)，使用單克隆和多克隆抗體，按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，測(cè)量多肽的分泌或細(xì)胞結(jié)合水平。這可用來(lái)發(fā)現(xiàn)能抑制或增強(qiáng)多肽在合適的操作細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的試劑(分別也被稱為拮抗劑或激動(dòng)劑)。
本發(fā)明還提供一種篩選化合物的方法，用來(lái)鑒定能夠增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或阻斷(拮抗劑)BASB029多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是能夠抑菌和/或殺菌的化合物。這種篩選方法可使用高通量技術(shù)。例如，為篩選激動(dòng)劑或拮抗劑，將一種合成反應(yīng)混合物、一種細(xì)胞組分如膜、細(xì)胞包膜或細(xì)胞壁、或者它們的任何制備物、包括BASB029多肽和一種標(biāo)記底物或這種多肽的配體，在一種可能是BASB029激動(dòng)劑或拮抗劑的候選分子存在或不存在的條件下，進(jìn)行溫育。候選化合物激動(dòng)或拮抗BASB029多肽的能力反映于標(biāo)記配體的結(jié)合降低或這種底物的產(chǎn)物的產(chǎn)生減少。無(wú)效結(jié)合即不誘導(dǎo)BASB029多肽的效果的分子很可能是優(yōu)秀的拮抗劑。根據(jù)情況，結(jié)合良好并增加產(chǎn)物由底物產(chǎn)生的速率、增加信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或增加化學(xué)通道活性的的分子即是激動(dòng)劑。根據(jù)情況，產(chǎn)物由底物產(chǎn)生、信號(hào)傳導(dǎo)或化學(xué)通道活性的速率或水平的檢測(cè)可通過(guò)使用一種報(bào)告系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)。可用于此目的報(bào)告系統(tǒng)包括但不限于比色、標(biāo)記底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物、一種對(duì)BASB029多核苷酸或多肽的變化應(yīng)答的報(bào)告基因以及本領(lǐng)域熟知的結(jié)合試驗(yàn)。
BASB029激動(dòng)劑試驗(yàn)的另一個(gè)例子是一種競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，該試驗(yàn)將BASB029和一種可能的激動(dòng)劑與BASB029結(jié)合分子、重組BASB029結(jié)合分子、天然底物或配體、或底物或配體的模擬物組合在一起，在合適的條件下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)。BASB029可進(jìn)行標(biāo)記，例如用放射活性或比色化合物標(biāo)記，使結(jié)合到一種結(jié)合分子上或轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的BASB029分子的數(shù)目可以精確測(cè)定，來(lái)評(píng)價(jià)可能的拮抗劑的作用。
可能的拮抗劑包括能與本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽結(jié)合并因而抑制或壓制其活性或表達(dá)的小有機(jī)分子、肽、多肽以及抗體及其他?？赡艿霓卓箘┮部梢允沁@樣的小有機(jī)分子、肽、多肽如密切相關(guān)的蛋白或抗體，它們結(jié)合在結(jié)合分子的相同位點(diǎn)，例如一種結(jié)合分子，但不誘導(dǎo)BASB029誘導(dǎo)的活性，從而通過(guò)阻止BASB029多肽和/或多核苷酸結(jié)合來(lái)抑制BASB029多肽和/或多核苷酸的活化或表達(dá)。
可能的拮抗劑包括這樣的小分子，它們結(jié)合和占據(jù)多肽的結(jié)合位點(diǎn)，因而阻止其與細(xì)胞結(jié)合分子結(jié)合，從而抑制正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有機(jī)分子、肽或肽樣分子。其他可能的拮抗劑包括反義分子(見(jiàn)Okano，《神經(jīng)化學(xué)雜志》56:560(1991)；《寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑》CRC Press,Boca Raton,FL(1988)，對(duì)這些分子的介紹)。優(yōu)選的可能的拮抗劑包括與BASB029及其變體有關(guān)的化合物。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及遺傳工程的可溶性融合蛋白，這種蛋白包括本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各種亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1重鏈的恒定區(qū)部分，其中融合發(fā)生于鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可通過(guò)以下方法簡(jiǎn)單地除去引入一個(gè)切割序列，該序列可用血液凝集因子X(jué)a。而且，本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，并涉及將其用于藥物篩選、診斷和治療。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可見(jiàn)于國(guó)際專利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914。
這里提供的每個(gè)多核苷酸序列可用于發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)抗菌化合物。編碼蛋白通過(guò)表達(dá)可用作篩選抗菌藥物的靶。此外，編碼所編碼蛋白的氨基末端區(qū)域或相應(yīng)mRNA的SD或其他翻譯促進(jìn)區(qū)域的多核苷酸序列可用于構(gòu)建反義序列來(lái)控制目標(biāo)編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明還提供將本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動(dòng)劑或拮抗劑用于干擾一種病原體或多種病原體與一種對(duì)感染繼發(fā)癥敏感的真核生物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物宿主之間的最初生理相互作用。具體地說(shuō)，本發(fā)明的分子可用于抑制細(xì)菌具體說(shuō)是革蘭氏陽(yáng)性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌粘附于真核生物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物的深埋裝置的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或粘附于傷口的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；阻斷真核生物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)菌BASB029蛋白之間的細(xì)菌性粘附，后者介導(dǎo)組織損傷；和/或阻斷不管是深埋裝置植入還是其他外科技術(shù)引起的感染的正常致病過(guò)程。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供BASB029激動(dòng)劑和拮抗劑，優(yōu)選是抑菌或殺菌性激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑和激動(dòng)劑可用于例如阻止、抑制和/或治療疾病。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽的模擬型。模擬型是一種肽序列，與天然肽足夠相似(序列上或結(jié)構(gòu)上)，它能被識(shí)別天然肽的抗體識(shí)別，或在與一種合適載體偶聯(lián)時(shí)能夠產(chǎn)生識(shí)別天然肽的抗體。
肽模擬型可通過(guò)添加、缺失或取代所選擇的氨基酸用于特別的目的。因此，肽可被修飾以易于與一種蛋白載體連接。例如，對(duì)于某些化學(xué)結(jié)合方法，需要含有一個(gè)末端半胱氨酸。此外，對(duì)于肽與一種蛋白載體結(jié)合，需要包含一個(gè)遠(yuǎn)離肽結(jié)合末端的疏水末端，使肽的未結(jié)合的游離末端保持與載體蛋白表面的相互作用。從而使肽具有一種構(gòu)象，這種構(gòu)象與肽在整個(gè)天然分子結(jié)構(gòu)中具有的構(gòu)象非常相似。例如，肽可被修改來(lái)具有一個(gè)N末端半胱氨酸和一個(gè)C末端疏水的酰胺化的尾巴。另外，可以進(jìn)行一種或多種氨基酸的D立體異構(gòu)體的添加或取代，來(lái)制備一種有用的衍生物，用來(lái)例如增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性。
此外，肽模擬型可通過(guò)諸如噬菌體顯示技術(shù)(EP 0 552 267 B1)使用能與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體來(lái)鑒定。這種技術(shù)產(chǎn)生大量的模擬天然肽的結(jié)構(gòu)的肽序列，這些肽序列因此能夠結(jié)合抗天然肽的抗體，但可能不足以與天然多肽具有明顯的序列同源性。疫苗本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在個(gè)體特別是哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，這種方法包括用BASB029多核苷酸和/或多肽或其片段或變體接種個(gè)體，它們足以產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)個(gè)體不被感染，特別是細(xì)菌感染，尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌感染。本發(fā)明還提供產(chǎn)生這種免疫應(yīng)答以延緩細(xì)菌復(fù)制的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括給予這種個(gè)體一種指導(dǎo)BASB029多核苷酸和/或多肽表達(dá)或其片段或變體表達(dá)的核酸載體、序列或核酶，來(lái)在體內(nèi)表達(dá)BASB029多核苷酸和/或多肽表達(dá)或其片段或變體，從而誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答，例如產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括諸如產(chǎn)細(xì)胞因子T細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞，來(lái)保護(hù)所述個(gè)體，優(yōu)選是人免于患病，而不管這種疾病是已經(jīng)在個(gè)體中存在還是不存在?；蚪o藥的一個(gè)例子是將其作為顆?；蚱渌镔|(zhì)的包被物來(lái)促進(jìn)其進(jìn)入所需的細(xì)胞。這種核酸載體可包括DNA、RNA、核酶、修飾的核酸、DNA/RNA雜合體、DNA蛋白復(fù)合物或RNA-蛋白復(fù)合物。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及一種免疫組合物，該組合物在導(dǎo)入個(gè)體優(yōu)選是人時(shí)，能夠誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答，即在該個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)BASB029多核苷酸和/或由其編碼的多肽的免疫應(yīng)答。其中組合物包含重組的BASB029多核苷酸和/或由其編碼的多肽；和/或包含能夠編碼和表達(dá)所述BASB029多核苷酸、由其編碼的多肽或本發(fā)明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫應(yīng)答可用于治療或預(yù)防目的，并且可采用抗體免疫和/或細(xì)胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫。
因此，BASB029多肽或其片段可與輔助蛋白或化學(xué)半分子融合，輔助蛋白或化學(xué)半分子能夠或不能自身產(chǎn)生抗體，但能夠使第一種蛋白穩(wěn)定，并產(chǎn)生一種融合的或修飾的蛋白，后者具有抗原性和/或免疫原性，優(yōu)選是保護(hù)性。這樣的融合重組蛋白優(yōu)選進(jìn)一步含有一種抗原性輔助蛋白，例如來(lái)自嗜血流感菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或β-半乳糖苷酶或其他任何能夠穩(wěn)定蛋白并促進(jìn)其制備和純化的大輔助蛋白。而且，輔助蛋白在對(duì)接受該蛋白的生物體的免疫系統(tǒng)提供一種標(biāo)準(zhǔn)刺激時(shí)，可用作一種佐劑。輔助蛋白可連接在第一種蛋白的氨基端或羧基端。
本發(fā)明提供含有本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及免疫調(diào)節(jié)DNA序列如Sato,Y《科學(xué)》273:352(1996)中介紹的DNA序列的組合物，特別是疫苗組合物，以及方法。
本發(fā)明還提供在腦膜炎奈瑟氏球菌感染的動(dòng)物模型的這種遺傳免疫實(shí)驗(yàn)中所用的多核苷酸結(jié)構(gòu)物中使用所介紹的多核苷酸或其特殊片段的方法，其中多核苷酸或其特殊片段已經(jīng)顯示編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的非可變區(qū)。這種實(shí)驗(yàn)可特別用于鑒定能夠激發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的蛋白表位?？梢韵嘈?，這種方法將能夠用于隨后由成功地抵抗或清除了感染的動(dòng)物的必需的器官，制備有特殊價(jià)值的單克隆抗體，用于發(fā)展哺乳動(dòng)物特別是人的治療細(xì)菌性感染特別是奈瑟氏球菌感染的預(yù)防性試劑或治療性試劑。
本發(fā)明還包括疫苗制劑，這種制劑包括本發(fā)明的一種免疫原性重組多肽和/或多核苷酸以及一種合適的載體，例如一種可藥用載體。因?yàn)槎嚯暮投嗪塑账峥赡茉谖钢袝?huì)被打斷，它們都優(yōu)選經(jīng)腸道外給藥，包括諸如皮下、肌肉、靜脈或皮內(nèi)，適用于腸道外給藥的制劑包括水和非水的無(wú)菌注射溶液，它們可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和能夠使制劑與個(gè)體的體液優(yōu)選是血液等滲的溶劑，以及可包含懸浮劑或增稠劑的水和非水無(wú)菌懸液。制劑可置于單劑量或多劑量的容器內(nèi)，例如密封的安瓶和小瓶，并可貯存于冷凍干燥的環(huán)境，只需在使用前加入無(wú)菌的液體載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也可包括佐劑系統(tǒng)，用來(lái)增強(qiáng)制劑的免疫原性。優(yōu)選佐劑系統(tǒng)優(yōu)先引發(fā)TH1型應(yīng)答。
免疫應(yīng)答可廣泛地分為兩個(gè)典型的種類，即體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(一般分別用其保護(hù)作用的抗體和細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制來(lái)區(qū)分)。這些應(yīng)答種類被稱為T(mén)H1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
典型的TH1型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生抗原特異的單元型限制的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和自然殺傷型細(xì)胞應(yīng)答。在小鼠中，TH1型應(yīng)答的特征通常是產(chǎn)生IgG2a亞型的抗體，而在人中，它們的對(duì)應(yīng)物是IgG1型抗體。TH2型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生廣譜的免疫球蛋白同種型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。
可以想象得到，這兩種類型的免疫應(yīng)答之后的驅(qū)動(dòng)力是細(xì)胞因子。高水平的TH1型細(xì)胞因子優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)所給抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的TH2型細(xì)胞因子優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1和TH2型免疫應(yīng)答的區(qū)分不是絕對(duì)的。事實(shí)上，一個(gè)個(gè)體可以支持一種被描述為T(mén)H1優(yōu)勢(shì)或TH2優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中的介紹來(lái)考慮細(xì)胞因子的家族(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1989),TH1和TH2細(xì)胞淋巴因子的不同分泌模式導(dǎo)致不同的功能特性?！睹庖邔W(xué)年鑒》7卷，145-173頁(yè))。通常，TH1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)。其他通常直接與TH1型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)有關(guān)的細(xì)胞因子如IL-12不由T細(xì)胞產(chǎn)生。相反，TH2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有關(guān)。
已知特定的疫苗佐劑特別適合于刺激TH1或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。疫苗接種或感染后免疫應(yīng)答的TH1∶TH2平衡的最佳指標(biāo)通常包括在體外用抗原再刺激后直接測(cè)量T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子，和/或測(cè)量抗原特異的抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1型佐劑是在體外用抗原再刺激時(shí)優(yōu)先刺激分離的T細(xì)胞群體產(chǎn)生高水平的TH1型細(xì)胞因子和促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和與TH1型同種型相關(guān)的抗原特異的免疫球蛋白應(yīng)答產(chǎn)生的佐劑。
能夠優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑在國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO94/00153和WO95/17209中介紹。
3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這可由GB2220211(Ribi)知道。它在化學(xué)上是3 De-O?；瘑瘟柞ｎ愔珹與4、5或6?；湹幕旌衔铮⒂蒖ibi Immunochem,Montana制造。3 De-O-酰化單磷酰類脂A的一種優(yōu)選形式在歐洲專利0 689 454(SmithKlineBeecham Biologicals SA)中公開(kāi)。
3D-MPL顆粒優(yōu)選小到足以通過(guò)一個(gè)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌(歐洲專利0 689 454)。
3D-MPL以每劑10μg-l00μg，優(yōu)選是20-25μg的范圍存在，而抗原通常以每劑2-50μg的范圍存在。
另一個(gè)優(yōu)選的佐劑包含QS21，它是一種來(lái)自Quillaja Saponaria Molina的莖的Hplc純化的無(wú)毒組分。它可選用來(lái)與3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)混合，并可與一種載體一起使用。
制備QS21的方法在美國(guó)專利No.5,057,540中公開(kāi)。
含有QS21的非反應(yīng)性的佐劑制劑在以前已有介紹(WO96/33739)。含有QS21和膽甾醇的這種制劑在與抗原一起配制時(shí)已顯示是成功的TH1刺激佐劑。
優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的進(jìn)一步的佐劑包括免疫調(diào)節(jié)性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO96/02555中的公開(kāi)。
不同TH1刺激性佐劑如上文所介紹的佐劑的組合也被認(rèn)為是能提供一種優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的佐劑。例如，QS21可與3D-MPL組合配制。OS21∶3D-MPL的比率通常為1∶10至10∶1，優(yōu)選為1∶5至5∶1，并且通常為大約1∶1。優(yōu)選的最佳組合范圍是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物還優(yōu)選含有一種載體。載體可以是一種水包油乳劑，或一種鋁鹽如磷酸鋁或氫氧化鋁。
水包油乳劑優(yōu)選包含一種可代謝的油，例如角鯊烯、α-生育酚和Tween80。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物中的抗原與QS21和3D-MPL在這樣一種乳劑中組合。另外，該水包油乳劑可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在對(duì)人給藥時(shí)，疫苗中QS21和3D-MPL的范圍是每劑量1μg-200μg，例如10-100μg，優(yōu)選是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鯊烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween80。在以更穩(wěn)定的乳劑形式提供時(shí)，角鯊烯α-生育酚Tween80的比例優(yōu)選相同或少于1。還可包含1％水平的Span85。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗優(yōu)選進(jìn)一步含有一種穩(wěn)定劑。
非毒性的水包油乳劑優(yōu)選在一種水載體中含有一種非毒性的油如角鯊?fù)榛蚪酋徬?、一種乳化劑如Tween80。水載體可以是例如磷酸緩沖鹽水。
WO95/17210中介紹了一種特別強(qiáng)有力的佐劑制劑，它含有在一種水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本發(fā)明還提供一種多價(jià)的疫苗組合物，它含有本發(fā)明的疫苗制劑以及其他抗原，特別是對(duì)治療癌癥、自身免疫疾病和相關(guān)病癥有用的抗原。這樣一種多價(jià)疫苗組合物可包括一種如前所述的TH1誘導(dǎo)型佐劑。
雖然本發(fā)明對(duì)特定的BASB029多肽和多核苷酸進(jìn)行了介紹，但應(yīng)當(dāng)理解它們覆蓋了天然產(chǎn)生的多肽和多核苷酸以及含有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，這些添加、缺失或取代基本上不影響重組多肽或多核苷酸的免疫原特征。
抗原也可以完整細(xì)菌(死的或活的)或亞細(xì)胞組分的形式進(jìn)行傳遞，這些可能性包括腦膜炎奈瑟氏球菌自身。組合物、試劑盒和給藥在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供含有用于對(duì)一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)多細(xì)胞生物體給藥的BASB029多核苷酸和/或BASB029多肽的組合物。
本發(fā)明還涉及含有這里討論的多核苷酸和/或多肽或它們的激動(dòng)劑或拮抗劑的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可與一種非無(wú)菌或無(wú)菌載體或用于細(xì)胞、組織或生物體的載體，例如一種適用于對(duì)個(gè)體給藥的藥用載體組合使用。這種組合物包括例如一種介質(zhì)添加劑或一種治療有效劑量的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及一種可藥用載體或賦形劑。這種載體可包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。制劑應(yīng)適合于給藥模式。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷和藥用包裝和試劑盒，它們含有一種或多種容器，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的上面提到的成分。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨(dú)或與其他化合物例如治療性化合物一起使用。
藥用組合物可通過(guò)任何有效、傳統(tǒng)的方式進(jìn)行給藥，包括諸如通過(guò)局部、口、肛門(mén)、陰道、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑及其他途徑進(jìn)行給藥。
在用于治療或預(yù)防時(shí)，活性試劑可以一種可注射的組合物的形式給藥于個(gè)體，例如以無(wú)菌水分散物優(yōu)選是等滲的形式給藥。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供藥用組合物，它包含一種治療有效劑量的多肽和/或多核苷酸例如本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式、激動(dòng)劑或拮抗劑或小分子化合物、以及一種可藥用載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥用包裝和試劑盒，它們含有一種或多種容器，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的上面提到的成分。本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨(dú)或與其他化合物例如治療性化合物一起使用。
組合物應(yīng)采用一種給藥途徑，例如通過(guò)一種全身性或經(jīng)口途徑。全身性給藥的優(yōu)選形式包括注射，通常通過(guò)靜脈注射。其他的注射途徑例如皮下、肌肉或腹膜都可以采用。全身性給藥的其他方法包括使用滲透劑如膽鹽或梭鏈孢酸或其他去污劑經(jīng)粘膜和皮膚給藥。此外，如果本發(fā)明的一種多肽或其他化合物可配制成一種腸溶或一種膠囊制劑，經(jīng)口途徑也可以使用。這些化合物的給藥也可經(jīng)表皮和/或局部，以藥膏、帖膏、凝膠、溶液、粉末等形式使用。
為對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人進(jìn)行給藥，活性試劑的每日劑量水平應(yīng)從0.01mg/kg至10mg/kg，通常為1mg/kg左右。在任何情況下，醫(yī)生應(yīng)確定最適合于個(gè)體的實(shí)際劑量，并根據(jù)年齡、體重和特殊個(gè)體的應(yīng)答而不同。當(dāng)然，在個(gè)體情況時(shí)，可以使用更高或更低的劑量范圍，這些也都在本所需的劑量范圍依賴于所選擇的肽、給藥途徑、制劑的性質(zhì)、用藥者病癥的性質(zhì)以及醫(yī)師的判斷。但合適的劑量為每kg 0.1-100μg的范圍。
疫苗組合物一般采用注射形式。傳統(tǒng)的佐劑可用來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。疫苗接種的合適單位劑量為0.5-5μg/kg的抗原，這樣的劑量?jī)?yōu)選給藥1-3次、間隔1-3周。對(duì)于指定的劑量范圍，本發(fā)明的化合物在給藥于合適的個(gè)體時(shí)，不會(huì)觀察到毒副作用。
但考慮到可以使用不同的化合物以及不同給藥途徑可產(chǎn)生不同的效果，所需的劑量有廣泛的變化。例如，口服途徑比靜脈注射需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可按照本領(lǐng)域熟知的方法使用標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化實(shí)踐途徑進(jìn)行調(diào)整。序列數(shù)據(jù)庫(kù)、有形介質(zhì)中的序列以及算法多核苷酸和多肽序列組成了有價(jià)值的信息來(lái)源，用來(lái)確定它們的二維和三維結(jié)構(gòu)以及進(jìn)一步鑒定相似同源的序列。這些方法可很方便地通過(guò)下述步驟來(lái)進(jìn)行，即將它們存入計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，然后將數(shù)據(jù)存入一個(gè)已知的大分子結(jié)構(gòu)程序或使用熟知的搜索工具如GCG程序包搜索一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。
本發(fā)明還提供分析特征序列或鏈特別是基因序列或編碼蛋白序列的方法。優(yōu)選的序列分析的方法包括諸如序列同源性分析方法如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白結(jié)構(gòu)分析、序列排列、進(jìn)化分析、序列基元分析、開(kāi)放閱讀框確定、核酸堿基召喚、密碼子使用分析、核酸堿基整理、和序列層析峰分析。
本發(fā)明提供了一種以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的方法，用于進(jìn)行同源性鑒定。此方法包括以下步驟提供在一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的含有本發(fā)明的一種多核苷酸序列的第一個(gè)多核苷酸序列，將所述第一個(gè)多核苷酸與至少一種第二個(gè)多核苷酸或多肽序列比較，來(lái)確定同源性。
本發(fā)明提供了一種以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的方法，用于進(jìn)行同源性鑒定。所述方法包括以下步驟提供在一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的含有本發(fā)明的一種多肽序列的第一個(gè)多肽序列，將所述第一個(gè)多肽序列與至少一種第二個(gè)多核苷酸或多肽序列比較，來(lái)確定同源性。
本申請(qǐng)書(shū)中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，在這里都全文引入作為參考，如同它們各自都特別地和個(gè)別地在此全文列出。本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的任何專利申請(qǐng)也以與上面對(duì)出版物和參考所介紹的相同方式在此全文引入作為參考。定義“同一性”如同本領(lǐng)域所熟知的，是兩種或多種多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列之間的相關(guān)性，根據(jù)具體情況，可通過(guò)序列比較來(lái)確定。在本領(lǐng)域，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)的程度，根據(jù)具體情況，可通過(guò)這些序列的鏈的匹配來(lái)確定?！巴恍浴笨墒褂靡阎姆椒ǚ奖愕赜?jì)算，包括但不限于(《計(jì)算分子生物學(xué)》，Lesk,A.M.編輯，Oxford University Press,New York,1988；《生物計(jì)算機(jī)信息和基因組計(jì)劃》Smith,D.W.編輯，Academic Press,New York,1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》Ⅰ部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編輯，Humana Press,New Jersey,1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》vonHeine,G.,Academic Press,1987；和《序列分析引物》Gribskov,M.和Devereux,J.編輯，M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,《SIAM J.Applied Math》48:1073(1988)。測(cè)定同一性的方法被設(shè)計(jì)來(lái)給出檢測(cè)序列之間的最大匹配。而且，測(cè)定同一性的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼。用來(lái)測(cè)定兩種序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux,.J.等《核酸研究》12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.等《分子生物學(xué)雜志》215:403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美國(guó)科學(xué)院院刊》85:2444-2448(1988)。BLAST程序家族可從NCBI和其他來(lái)源獲得(《BLAST手冊(cè)》Altschul,S.等，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等《分子生物學(xué)雜志》215:403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用來(lái)測(cè)定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48:443-453(1970)比較矩陣Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62《美國(guó)科學(xué)院院刊》89:10915-10919(1992)缺口補(bǔ)償8缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償2使用這些參數(shù)的程序可以從Genetics Computer Group,Madison WI以“缺口”程序的形式獲得。上述參數(shù)是多肽比較的缺省參數(shù)(對(duì)末端缺口無(wú)補(bǔ)償)。
多核苷酸序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48:443-453(1970)比較矩陣匹配=+10，不匹配=0缺口補(bǔ)償50缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償3
來(lái)源Genetics Computer Group,Madison WI的“缺口”程序。上述參數(shù)是核酸比較的缺省參數(shù)。
多核苷酸和多肽的“同一性”的優(yōu)選含義根據(jù)情況在下面(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸實(shí)施方案進(jìn)一步包括含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列與SEQ ID NO:1的參考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多核苷酸序列可以與SEQID NO:1的參考序列相同，或者與參考序列相比，可包括一定數(shù)量的核苷酸改變，其中這種改變可以選自至少一個(gè)核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中，其中核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO:1中的總核苷酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO:1的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO:1中的核苷酸總數(shù)，y對(duì)50％來(lái)說(shuō)是0.50，對(duì)60％來(lái)說(shuō)是0.60，對(duì)70％來(lái)說(shuō)是0.70，對(duì)80％來(lái)說(shuō)是0.80，對(duì)85％來(lái)說(shuō)是0.85，對(duì)90％來(lái)說(shuō)是0.90，對(duì)95％來(lái)說(shuō)是0.95，對(duì)97％來(lái)說(shuō)是0.97，對(duì)100％來(lái)說(shuō)是1.00，而·是乘法運(yùn)算的符號(hào)，對(duì)xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再?gòu)膞n中減除。編碼SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸的改變可能在該編碼序列中產(chǎn)生無(wú)義、錯(cuò)義或移碼突變，因此改變后的多核苷酸編碼的多肽會(huì)發(fā)生變化。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO:1的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的核苷酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中。核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO:1中的總核苷酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO:1的總核苷酸數(shù)中減除，或者
nn≤xn-(xn·y)其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn為SEQ ID NO:1的總核苷酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，·為乘法運(yùn)算的符號(hào)，其中若xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再?gòu)膞n中減除。
(2)多肽實(shí)施方案進(jìn)一步包括含有如下多肽序列的分離多肽，該多肽序列與SEQ ID NO:2的參考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多肽序列可以與SEQ ID NO:2的參考序列相同，或者與參考序列相比，可包括一定數(shù)量的氨基酸改變，其中所述改變選自至少一個(gè)氨基酸缺失、取代(包括保守性或非保守性取代)或插入，而且所述改變可發(fā)生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何地方、分別散布在參考序列的氨基酸中或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參考序列中，并且所述氨基酸改變的數(shù)目如下確定SEQ ID NO:2中的總氨基酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO:2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO:2中的氨基酸總數(shù)，y對(duì)50％來(lái)說(shuō)是0.50，對(duì)60％來(lái)說(shuō)是0.60，對(duì)70％來(lái)說(shuō)是0.70，對(duì)80％來(lái)說(shuō)是0.80，對(duì)85％來(lái)說(shuō)是0.85，對(duì)90％來(lái)說(shuō)是0.90，對(duì)95％來(lái)說(shuō)是0.95，對(duì)97％來(lái)說(shuō)是0.97，對(duì)100％來(lái)說(shuō)是1.00，而·是乘法運(yùn)算的符號(hào)，若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再?gòu)膞a中減除。
例如，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO:2的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中。同一性百分?jǐn)?shù)一定時(shí)氨基酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO:2中的總氨基酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO:2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中nn為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO:2的總氨基酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，而·是乘法運(yùn)算的符號(hào)，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再?gòu)膞a中減除。
“個(gè)體”在用于此處指示一種生物體時(shí)，是指一種多細(xì)胞真核生物，包括但不限于后生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、卵生動(dòng)物、?？啤⒃?、靈長(zhǎng)動(dòng)物和人。
“分離的”表示“通過(guò)人工”改變其天然狀態(tài)，即如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)從其原始環(huán)境改變或取出或者已經(jīng)取出并改變。例如，在本文中使用該術(shù)語(yǔ)時(shí)，在活動(dòng)物體內(nèi)存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經(jīng)與天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)分開(kāi)的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。而且，一種多核苷酸或多肽在通過(guò)轉(zhuǎn)化、遺傳操作或任何其他重組方法導(dǎo)入一種生物體時(shí)，即使它仍然存在于所述生物體中，它也是“分離”的，該生物體可以是活的或死的。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它可以是修飾或非修飾的RNA或DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過(guò)誘變技術(shù)或直接合成制備。
“疾病”是指任何由細(xì)菌感染導(dǎo)致或與之有關(guān)的疾病，包括諸如上呼吸道感染、侵襲性細(xì)菌疾病如菌血癥和腦膜炎。
實(shí)施例下面的實(shí)施例使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的和常規(guī)的，除非它們?cè)谄渌胤皆敿?xì)介紹。實(shí)施例是說(shuō)明性的，不能限制本發(fā)明。實(shí)施例1來(lái)自兩株腦膜炎奈瑟氏球菌的BASB029基因的發(fā)現(xiàn)和DNA測(cè)序證明A腦膜炎奈瑟氏血清型B菌株ATCC13090中的BASB029SEQ ID NO:1中公開(kāi)的BASB029基因首先發(fā)現(xiàn)于Incyte Pathoseq數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)含有腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的未完成的基因組DNA序列。SEQ ID NO:2中所示的BASB029多核苷酸序列的翻譯結(jié)果與嗜血流感菌的表面原纖(HSF)蛋白顯示有明顯的相似性(在582個(gè)氨基酸重疊上有52％的同一性)。BASB029基因的序列用實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。為達(dá)到這一目的，使用QIAGEN基因組DNA抽提試劑盒(Qiagen Gmbh)從1010腦膜炎奈瑟氏球菌細(xì)胞(菌株ATCC13090)中抽提基因組DNA，將1μg的此物質(zhì)用于聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，使用含有內(nèi)部NdeⅠ位點(diǎn)(下劃線)的引物Hsf1(5’-GGG GCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAA-3’)[SEQ ID NO:5]和含有內(nèi)部XhoⅠ位點(diǎn)(下劃線)的引物Hsf2(5’-GGGGCT CGA GCC ACT GAT AAC CGA CAG ATG CGG TGA A-3’)[SEQ ID NO:6]。將此PCR產(chǎn)物凝膠純化，并使用Big Dye Cycle測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)和ABI 373/PRISM DNA測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序。DNA測(cè)序在兩條鏈上進(jìn)行，使用2的冗余，全長(zhǎng)序列使用DNASTAR Lasergene軟件包的SeqMan程序拼接，所獲得的DNA序列被證明與SEQ ID NO:1 100％相同。B腦膜炎奈瑟氏血清型B菌株H44/76中的BASB029BASB029基因的序列也在另一株腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株H44/76中進(jìn)行了測(cè)定。為了這一目的，使用實(shí)施例1中所列的實(shí)驗(yàn)條件從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76中抽提基因組DNA。然后將此物質(zhì)(1μg)用于聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，使用BASB029基因特異的Hsf1和Hsf2引物。獲得了一個(gè)4389bp的DNA片段，用NdeⅠ/XhoⅠ限制性內(nèi)切核酸酶消化，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版》，編輯Sambrook,Fritsch & Maniatis,Cold Spring Harbor press 1989)將其插入pET-24b克隆/表達(dá)載體(Novagen)的相應(yīng)位點(diǎn)。然后將重組的pET-24b/BASB029使用Big Dyes試劑盒(Applied biosystems)進(jìn)行測(cè)序，并在ABI 373/A DNA測(cè)序儀上按廠商介紹的條件進(jìn)行分析。結(jié)果獲得了多核苷酸和推導(dǎo)的多肽序列，分別被稱為SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4。使用來(lái)自GCG軟件包的PILEUP程序，對(duì)SEQ ID NO:1和3的多核苷酸序列進(jìn)行了排列，并示于

圖1，通過(guò)GAP程序測(cè)定，它們的同源性水平為96.8％。使用相同的PILEUP程序，對(duì)SEQ ID NO:2和4的多肽序列進(jìn)行了排列比較，并示于圖2，用GAP程序測(cè)定的它們的同一性水平為94.2％。
總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，BASB029基因在兩種腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株中有很高的序列保守性。
實(shí)施例2重組BASB029蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化實(shí)施例1B中介紹了pET-24b/BASB029克隆/表達(dá)載體的構(gòu)建。該載體攜帶了分離自菌株H44/76的BASB029基因，其中BASB029基因融合了6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基，并處于噬菌體T7基因10強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下。為了進(jìn)行表達(dá)研究，將該載體導(dǎo)入大腸桿菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中，其中T7聚合酶基因被置于異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)調(diào)節(jié)的lac啟動(dòng)子的控制之下。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB029]大腸桿菌重組菌株的液體培養(yǎng)物(100ml)在37℃振蕩培養(yǎng)直至600nm處的光密度(OD600)達(dá)到0.6。在該時(shí)間點(diǎn)上，加入IPTG至終濃度為1mM，并使培養(yǎng)物再生長(zhǎng)另外4小時(shí)。然后將培養(yǎng)物在10000rpm離心，將沉淀在-20℃至少冷凍10小時(shí)。融化后，將沉淀在25℃在緩沖液A(6M鹽酸胍、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH8.0)中重懸30分鐘，從針頭中通過(guò)3次，離心(20000rpm、15分鐘)澄清。然后將樣品上樣于流速為1ml/min的Ni2+Hitrap柱(Pharmacia Biotech)。當(dāng)流出物通過(guò)后，柱用40ml的緩沖液B(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH8.0)、40ml的緩沖液C(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH6.3)連續(xù)洗滌。然后用30ml含有500mM咪唑的緩沖液D(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH6.3)從柱中將重組蛋白BASB029/His6洗脫，并收集大小為3ml的級(jí)份。如圖3所示(泳道1)，從柱中洗脫了高度富集(在考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)，純度估計(jì)大于90％)的BASB029/His6蛋白，遷移位置為66kDa(估計(jì)的相對(duì)分子量)。該多肽與一種針對(duì)5組氨酸基元的鼠單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)(見(jiàn)圖3，泳道2)?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明，BASB029基因能夠以重組形式(BASB029/His6)在大腸桿菌中表達(dá)和純化。
實(shí)施例3用重組BASB029免疫小鼠部分純化的在大腸桿菌中表達(dá)的重組BASB029蛋白在第0天、14天和29天三次注射給BALB/C小鼠(8只動(dòng)物/組)。動(dòng)物通過(guò)皮下途徑注射，每劑量為5μg左右抗原，所述抗原有兩種不同的制劑形式或者吸收于100μg磷酸鋁上，或者配制在SBAS2乳劑(含有5μg MPL和1μg QS21的SB62乳劑)中。在實(shí)驗(yàn)中也加入陰性對(duì)照組，其由僅用SBAS2乳劑免疫的小鼠組成。小鼠在第29天(15天PostⅡ)和35天(6天PostⅢ)放血，以檢測(cè)特異性的抗BASB029抗體。特異性抗BASB029抗體通過(guò)western印跡在混合的血清(來(lái)自10小鼠/組)和6株不同的腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株上進(jìn)行測(cè)量(圖4和5)。通過(guò)western印跡對(duì)不同腦膜炎奈瑟氏菌株上的BASB029表位進(jìn)行識(shí)別在此試驗(yàn)中，通過(guò)western印跡檢測(cè)經(jīng)免疫小鼠的血清(混合血清)以對(duì)6株不同的腦膜炎奈瑟氏B菌株以及部分純化的重組BASB029蛋白上的BASB029表位進(jìn)行識(shí)別，6株B菌株為H44/76(B:15:P1.7，譜系ET-5)、M97 250987(B:4:P1.15)、BZ10(B:2b:P1.2，譜系A(chǔ)4)、BZ198(B:NT*:-，譜系3)和EG328(B:NT*，譜系ST-18)和ATCC 13090Men B菌株(*:NT未分型)。
簡(jiǎn)而言之，將用樣品緩沖液處理(95℃ 10分鐘)的每種樣品的10μl(＞108細(xì)胞/泳道)置于SDS-PAGE梯度凝膠(Tris-甘氨酸4-20％，Novex,code n°EC60252)。在125伏電泳90分鐘。然后使用Bio-rad轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(code n°170-3930)在100伏經(jīng)過(guò)1小時(shí)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(0.45μm,code n°162-0114)。濾膜用PBS-0.05％Tween 20在室溫封閉過(guò)夜，然后與含有抗BASB029抗體的小鼠血清溫育，所述血清源自磷酸鋁和SBAS2制劑。這些血清在PBS-0.05％Tween 20中稀釋100倍，并在硝酸纖維素膜上在室溫下溫育2小時(shí)，并使用微轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Miniprotean,Bio-rad code n°170-4017)，輕輕振蕩。將硝酸纖維素膜在PBS-0.05％Tween20中洗滌5分鐘，重復(fù)此步驟3次，然后將硝酸纖維素膜與在相同洗滌緩沖液中按1/500稀釋的合適接合劑(生物素化的山羊抗小鼠Ig抗體，Amersham code n°RPN1001)在室溫下輕輕振蕩溫育1小時(shí)。按前面的介紹將膜洗滌3次，并與在洗滌緩沖液中按1/1000稀釋的鏈親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(Amersham code n°1051)振蕩溫育30分鐘。經(jīng)過(guò)最后3次重復(fù)的洗滌步驟，在含有30mg 4-氯-1-萘酚(Sigma)、10ml甲醇、40ml PBS和30μl H2O2的50ml溶液中溫育20分鐘進(jìn)行顯色。將膜在蒸餾水中洗滌數(shù)次終止顯色。
圖4和5中的結(jié)果顯示，所有檢測(cè)菌株都有一條65-70kDa左右的預(yù)期條帶，另外兩條主要的條帶為55和90kDa左右，這顯然與BASB029蛋白相關(guān)(聚合物，降解產(chǎn)物)。這說(shuō)明BASB029蛋白可能在多數(shù)(如果不是全部)腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株中表達(dá)。在圖4中，重組BASB029蛋白顯示為4種不同的蛋白質(zhì)，其中的兩種蛋白質(zhì)為預(yù)期分子量大小，即65-70kDa，另外兩種蛋白質(zhì)的分子量很大(＞200kDa)，它們可能是重組BASB029蛋白的聚集物。
實(shí)施例4恢復(fù)期病人血清中抗BASB029抗體的存在在本試驗(yàn)中，恢復(fù)期病人的血清通過(guò)western印跡來(lái)檢測(cè)對(duì)純化的重組BASB029蛋白的識(shí)別。
簡(jiǎn)而言之，將5μg部分純化的BASB029腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B蛋白上樣于SDS-PAGE梯度凝膠(4-20％,Novex,code n°EC60252)進(jìn)行電泳。然后使用Bio-rad轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(code n°170-3930)在100伏經(jīng)過(guò)1小時(shí)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(0.45μm,code n°162-0114)。然后濾膜用PBS-0.05％Tween20在室溫封閉過(guò)夜，與人血清溫育。這些血清在PBS-0.05％Tween20中稀釋100倍，并在硝酸纖維素膜上在室溫下溫育2小時(shí)，并使用微轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Miniprotean,Bio-rad code n°170-4017)，輕輕振蕩。將硝酸纖維素膜在PBS-0.05％Tween 20中洗滌5分鐘，重復(fù)此步驟3次，然后將硝酸纖維素膜與在相同洗滌緩沖液中按1/500稀釋的合適接合劑(生物素化的山羊抗人Ig抗體，Amersham code n°RPN1003)在室溫下輕輕振蕩溫育1小時(shí)。按前面的介紹將膜洗滌3次，并與在洗滌緩沖液中按1/1000稀釋的鏈親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(Amersham coden°1051)振蕩溫育30分鐘。經(jīng)過(guò)最后3次重復(fù)的洗滌步驟，在含有30mg4-氯-1-萘酚(Sigma)、10ml甲醇、40ml超純水和30μl H2O2的50ml溶液中溫育20分鐘進(jìn)行顯色。將膜在蒸餾水中洗滌數(shù)次終止顯色。
圖6和7中的結(jié)果顯示，所有7個(gè)恢復(fù)期血清都與65-70kDa左右的重組BASB029蛋白反應(yīng)，而較上方的兩條帶(＞200kDa)能被大多數(shù)血清識(shí)別，但與幾個(gè)血清的反應(yīng)較弱。與高M(jìn)W蛋白質(zhì)的反應(yīng)性證實(shí)這兩條帶與BASB029蛋白密切相關(guān)，可能是聚集形式的BASB029蛋白。在圖6和7的A部分中，用經(jīng)免疫小鼠的血清觀察到針對(duì)這4條帶的相同反應(yīng)。這清楚地表明所有這4條帶都與重組BASB029蛋白相關(guān)。圖7中也表明陰性小鼠血清不與重組蛋白反應(yīng)。保藏材料含有腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株的保藏物已于1997年6月22日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(這里表示為“ATCC”)進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為13090。該保藏物為腦膜炎奈瑟氏球菌(Albrecht和Ghon)，是一種從腦膜炎奈瑟氏球菌分離物構(gòu)建的1.5-2.9kb插入文庫(kù)的凍干物。該保藏物在《Int.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.》8:1-15(1958)中介紹。
該腦膜炎奈瑟氏球菌菌株保藏物在此被稱為“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。
保藏菌株含有全長(zhǎng)的BASB029基因。保藏菌株中所含的多核苷酸以及編碼的任何多肽的氨基酸序列與本文的序列描述不一致時(shí)，以前者為準(zhǔn)。
保藏菌株的保藏是根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行的。在專利被授予時(shí)，該菌株即可不受限制地?zé)o條件向公眾發(fā)放。該保藏菌株僅提供給本領(lǐng)域的技術(shù)人員，但專利權(quán)的授予并不以保藏為條件，如同35U.S.C.ξ112.的要求。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals S.A.<120>新化合物<130>BM45321<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1785<212>DNA<213>細(xì)菌<400>1atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgagt actaccgatg acgacgattt atatttagaa 180cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa 240aaagaagtta cagaagattc aaattgggga gtatatttcg acaagaaagg agtactaaca 300gccggaacaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360aacaccaatg ccagtagctt cacctactcg ctgaaaaaag acctcacaga tctgaccagt 420gttggaactg aaaaattatc gtttagcgca aacagcaata aagtcaacat cacaagcgac 480accaaaggct tgaatttcgc gaaacaaacg gctgagacca acggcgacac cacggttcat 540ctgaacggta tcggttcgac tttgaccgat acgctgctga acgctgctga gaccacaaac 600gtaaccaacg acaacgttac cgatgacgag aaaaaacgtg cggcaagcgt taaagacgta 660ttaaacgcag gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt 720gatttcgtcc gcacttacga cacagtcgag ttcttgagcg cagatacgaa aacaatgact 780gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag agaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact 840tctgttatca aagaaaaaga cggtaagttg gttactggta aagacaaagg cgagaatgat 900tcttctacag acaaaggcga aggcttagtg actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac 960aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag 1020tttgaaaccg ttacatcagg cacaaatgta acctttgcta gtggtaaagg tacaattgcg 1080actgtaagta aagatgatca aggcaacatc actgttatgt atgatgtaaa tgtcggcgat 1140gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc ggttggaatt tggattccaa agcggttgca 1200ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa 1260accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc gagattaccc gcaacggcaa aaatatcgac 1320atcgccactt cgatgacccc gcaattttcc agcgtttcgc tcggcgcggg ggtggatgcg 1380cccactttaa gcgtggatga cgagggcgcg ttgaatgtcg gcagcaagga tgccaacaaa 1440cccgttcgca ttaccaatgt cgccccgggc gttaaagagg gggatgttac aaacgtcgca 1500caacttaaag gcgtggcgca aaacttgaac aaccacatcg acaatgtgga cggcaacgcg 1560cgtgcgggca tcgcccaagc gattgcaacc gcaggtctgg ttcaggcgta tctgcccggc 1620aagagtatga tggcgatcgg cggcggcact tatcgcggcg aagccggtta tgccatcggc 1680tactcaagca tttccgacgg cggaaattgg attatcaaag gcacggcttc cggcaattcg 1740cgcggccatt tcggtgcttc cgcatctgtc ggttatcagt ggtaa 1785<210> 2<211>594<212>PRT<213>細(xì)菌<400>2Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile I1e Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp15 10 15Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala20 25 30Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln35 40 45Ala Ser Thr Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gln Arg50 55 60Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu65 70 75 80Lys Glu Val Thr Glu Asp Ser Asn Trp Gly Val Tyr Phe Asp Lys Lys85 90 95Gly Val Leu Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu100 105 110Lys Ile Lys Gln Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr115 120 125Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu130 135 140Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Ser Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp145 150 155 160Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Lys Thr Ala Glu Thr Asn Gly Asp165170175Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu180 185 190Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp195 200 205Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Lau Asn Ala Gly210 215 220Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val225 230 235 240Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr245 250 255Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr260 265 270Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly275 280 285Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Asp Ser Ser Thr Asp290 295 300Lys Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn305 310315 320Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly325 330 335Gln Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe340 345 350Ala Ser Gly Lye Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly355 360 365Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val370 375 380Asn Gln Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala385 390 395 400Gly Ser Ser Gly Lys Val ILe Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly405 410 415Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile420 425 430Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp lle Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln435 440 445Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser450 455 460Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys465 470 475 480Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val485 490 495Thr Asn Val Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn His500 505 510Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile515 520 525Ala Thr Ala Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met530 535 540Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly545 550 555 560Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala565 570 575Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr580 585 590Gln Trp<210>3<211>1776<212>DNA<213>細(xì)菌<400>3atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120acactgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga agaagattta 180tatttagacc ccgtacaacg cactgttgcc gtgttgatag tcaattccga taaagaaggc 240acgggagaaa aagaaaaagt agaagaaaat tcagattggg cagtatattt caacgagaaa 300ggagtactaa cagccagaga aatcaccctc aaagccggcg acaacctgaa aatcaaacaa 360aacggcacaa acttcaccta ctcgctgaaa aaagacctca cagatctgac cagtgttgga 420actgaaaaat tatcgtttag cgcaaacggc aataaagtaa acatcacaag cgacaccaaa 460ggcttgaatt ttgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccacggt tcacctgaac 540ggtattggtt cgactttgac cgatacgctg ctgaataccg gagcgaccac aaacgtaacc 600aacgacaacg ttaccgatga cgagaaaaaa cgtgcggcaa gcgttaaaga cgtattaaac 660gcaggctgga acattaaagg cgttaaaccc ggtacaacag cttccgataa cgttgatttc 720gtccgcactt acgacacagt cgagttcttg agcgcagata cgaaaacaac gactgttaat 780gtggaaagca aagacaacgg caagaaaacc gaagttaaaa tcggtgcgaa gacttctgtt 840attaaagaaa aagacggtaa gttggttact ggtaaagaca aaggcgagaa tggttcttct 900acagacgaag gcgaaggctt agtgactgca aaagaagtga ttgatgcagt aaacaaggct 960ggttggagaa tgaaaacaac aaccgctaat ggtcaaacag gttaagctga caagtttgaa 1020accgttacat caggcacaaa tgtaaccttt gctagtggta aaggtacaac tgcgactgta 1080agtaaagatg atcaaggcaa catcactgtt atgtatgatg taaatgtcgg cgatgcccta 1140aacgtcaatc agctgcaaaa cagcggttgg aatttggatt ccaagctggt tgcaggttct 1200tcgggcaaag tcatcagcgg caatgtttcg ccgagcaagg gaaagatgga tgaaaccgtc 1260aacattaatg ccggcaacaa catcgagatt acccgcaacg gtaaaaatat cgacatcgcc 1320acttcgatga ccccgcagtt ttccagcgtt tcgctcggcg cgggggcgga tgcgcccact 1380ttgagcgtgg atggggacgc attgaatgtc ggcagcaaga aggacaacaa acccgtccgc 1440attaccaatg tcgccccggg cgttaaagag ggggatgtta caaacgtcgc acaacttaaa 1500ggcgtggcgc aaaacttgaa caaccgcatc gacaatgtgg acggcaacgc gcgtgcgggc 1560atcgcccaag cgattgcaac cgcaggtctg gttcaggcgt atttgcccgg caagagtatg 1620atggcgatcg gcggcggcac ttatcgcggc gaagccggtt acgccatcgg ctactccagt 1680atttccgacg gcggaaattg gattatcaaa ggcacggctt ccggcaattt gcgcggccat 1740ttcggtgctt ccgcatccgt cggttatcag tggtaa 1776<2L0>4<211>591<212>PRT<213>細(xì)菌<400>4Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ila Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp15 10 15Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Lys Arg Ala Ser Ala20 25 30Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln35 40 45Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gln Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro50 55 60Val Gln Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly65 70 75 80Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr85 90 95Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala100 105 110Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser115 120 125Leu Lys Lys Asp Lau Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu130 135 140Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys145 150 155 160Gly Leu Asn Pha Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr165 170 175Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn160 185 190Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu195 200 205Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn210 215 220Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe225 230 235 240Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr245 250255Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val260 265 270Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu275 280 285Val Thr Gly Lye Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly290 295 300Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala305 310 315 320Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala325 330 335Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser340 345 350Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile355 360 365Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln370 375 380Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser385 390 395 400Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met405 410 415Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg420 425 430Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser435 440 445Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp450455460Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Sar Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg465 470475 480Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val485 490 495Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn500 505 510Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala515 520 525Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly530 535 540Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser545 550555 560Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn565 570 575Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp580 585 590<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>5ggggcatatg aacaaaatat accgcatcat ttggaa 36<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>6ggggctcgag ccactgataa ccgacagatg cgga 34BASB029多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO:1腦膜炎奈瑟氏球菌BASB029多核苷酸序列ATGAACAAAATATACCGCATCATTTGGAATAGTGCCCTCAATGCCTGGGTCGCCGTATCCGAGCTCACACGCAACCACACCAAACGCGCCTCCGCAACCGTGGCGACCGCCGTATTGGCGACACTGTTGTTTGCAACGGTTCAGGCGAGTACTACCGATGACGACGATTTATATTTAGAACCCGTACAACGCACTGCTGTCGTGTTGAGCTTCCGTTCCGATAAAGAAGGCACGGGAGAAAAAGAAGTTACAGAAGATTCAAATTGGGGAGTATATTTCGACAAGAAAGGAGTACTAACAGCCGGAACAATCACCCTCAAAGCCGGCGACAACCTGAAAATCAAACAAAACACCAATGAAAACACCAATGCCAGTAGCTTCACCTACTCGCTGAAAAAAGACCTCACAGATCTGACCAGTGTTGGAACTGAAAAATTATCGTTTAGCGCAAACAGCAATAAAGTCAACATCACAAGCGACACCAAAGGCTTGAATTTCGCGAAAAAAACGGCTGAGACCAACGGCGACACCACGGTTCATCTGAACGGTATCGGTTCGACTTTGACCGATACGCTGCTGAATACCGGAGCGACCACAAACGTAACCAACGACAACGTTACCGATGACGAGAAAAAACGTGCGGCAAGCGTTAAAGACGTATTAAACGCAGGCTGGAACATTAAAGGCGTTAAACCCGGTACAACAGCTTCCGATAACGTTGATTTCGTCCGCACTTACGACACAGTCGAGTTCTTGAGCGCAGATACGAAAACAACGACTGTTAATGTGGAAAGCAAAGACAACGGCAAGAGAACCGAAGTTAAAATCGGTGCGAAGACTTCTGTTATCAAAGAAAAAGACGGTAAGTTGGTTACTGGTAAAGACAAAGGCGAGAATGATTCTTCTACAGACAAAGGCGAAGGCTTAGTGACTGCAAAAGAAGTGATTGATGCAGTAAACAAGGCTGGTTGGAGAATGAAAACAACAACCGCTAATGGTCAAACAGGTCAAGCTGACAAGTTTGAAACCGTTACATCAGGCACAAATGTAACCTTTGCTAGTGGTAAAGGTACAACTGCGACTGTAAGTAAAGATGATCAAGGCAACATCACTGTTATGTATGATGTAAATGTCGGCGATGCCCTAAACGTCAATCAGCTGCAAAACAGCGGTTGGAATTTGGATTCCAAAGCGGTTGCAGGTTCTTCGGGCAAAGTCATCAGCGGCAATGTTTCGCCGAGCAAGGGAAAGATGGATGAAACCGTCAACATTAATGCCGGCAACAACATCGAGATTACCCGCAACGGCAAAAATATCGACATCGCCACTTCGATGACCCCGCAATTTTCCAGCGTTTCGCTCGGCGCGGGGGCGGATGCGCCCACTTTAAGCGTGGATGACGAGGGCGCGTTGAATGTCGGCAGCAAGGATGCCAACAAACCCGTCCGCATTACCAATGTCGCCCCGGGCGTTAAAGAGGGGGATGTTACAAACGTCGCACAACTTAAAGGCGTGGCGCAAAACTTGAACAACCACATCGACAATGTGGACGGCAACGCGCGTGCGGGCATCGCCCAAGCGATTGCAACCGCAGGTCTGGTTCAGGCGTATCTGCCCGGCAAGAGTATGATGGCGATCGGCGGCGGCACTTATCGCGGCGAAGCCGGTTATGCCATCGGCTACTCAAGCATTTCCGACGGCGGAAATTGGATTATCAAAGGCACGGCTTCCGGCAATTCGCGCGGCCATTTCGGTGCTTCCGCATCTGTCGGTTATCAGTGGTAASEQ ID NO:2由SEQ ID NO:1的多核苷酸序列推定的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB029多肽序列MNKIYRIIWNSALNAWVAVSELTRNHTKRASATVATAVLATLLEATVQASTTDDDDLYLEPVQRTAVVLSFRSDKEGTGEKEVTEDSNWGVYFDKKGVLTAGTITLKAGDNLKIKQNTNENTNASSFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANSNKVNITSDTKGLNFAKKTAETNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGVKPGTTASKNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKRTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENDSSTDKGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSLGAGADAPTLSVDDEGALNVGSKDANKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNHIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGHAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHPGASASVGYQWSEQ ID NO:3得自菌株H44/76的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB029多核苷酸序列ATGAACAAAATATACCGCATCATTTGGAATAGTGCCCTCAATGCCTGGGTCGCCGTATCCGAGCTCACACGCAACCACACCAAACGCGCCTCCGCAACCGTGAAGACCGCCGTATTGGCGACACTGTTGTTTGCAACGGTTCAGGCAAGTGCTAACAATGAAGAGCAAGAAGAAGATTTATATTTAGACCCCGTACAACGCACTGTTGCCGTGTTGATAGTCAATTCCGATAAAGAAGGCACGGGAGAAAAAGAAAAAGTAGAAGAAAATTCAGATTGGGCAGTATATTTCAACGAGAAAGGAGTACTAACAGCCAGAGAAATCACCCTCAAAGCCGGCGACAACCTGAAAATCAAACAAAACGGCACAAACTTCACCTACTCGCTGAAAAAAGACCTCACAGATCTGACCAGTGTTGGAACTGAAAAATTATCGTTTAGCGCAAACGGCAATAAAGTCAACATCACAAGCGACACCAAAGGCTTGAATTTTGCGAAAGAAACGGCTGGGACGAACGGCGACACCACGGTTCACCTGAACGGTATTGGTTCGACTTTGACCGATACGCTGCTGAATACCGGAGCGACCACAAACGTAACCAACGACAACGTTACCGATGACGAGAAAAAACGTGCGGCAAGCGTTAAAGACGTATTAAACGCAGGCTGGAACATTAAAGGCGTTAAACCCGGTACAACAGCTTCCGATAACGTTGATTTCGTCCGCACTTACGACACAGTCGAGTTCTTGAGCGCAGATACGAAAACAACGACTGTTAATGTGGAAAGCAAAGACAACGGCAAGAAAACCGAAGTTAAAATCGGTGCGAAGACTTCTGTTATTAAAGAAAAAGACGGTAAGTTGGTTACTGGTAAAGACAAAGGCGAGAATGGTTCTTCTGGTTGGAGAATGAAAACAACAACCGCTAATGGTCAAACAGGTCAAGCTGACAAGTTTGAAACCGTTACATCAGGCACAAATGTAACCTTTGCTAGTGGTAAAGGTACAACTGCGACTGTAAGTAAAGATGATCAAGGCAACATCACTGTTATGTATGATGTAAATGTCGGCGATGCCCTAAACGTCAATCAGCTGCAAAACAGCGGTTGGAATTTGGATTCCAAAGCGGTTGCAGGTTCTTCGGGCAAAGTCATCAGCGGCAATGTTTCGCCGAGCAAGGGAAAGATGGATGAAACCGTCAACATTAATGCCGGCAACAACATCGAGATTACCCGCAACGGTAAAAATATCGACATCGCCACTTCGATGACCCCGCAGTTTTCCAGCGTTTCGCTCGGCGCGGGGGCGGATGCGCCCACTTTGAGCGTGGATGGGGACGCATTGAATGTCGGCAGCAAGAAGGACAACAAACCCGTCCGCATTACCAATGTCGCCCCGGGCGTTAAAGAGGGGGATGTTACAAACGTCGCACAACTTAAAGGCGTGGCGCAAAACTTGAACAACCGCATCGACAATGTGGACGGCAACGCGCGTGCGGGCATCGCCCAAGCGATTGCAACCGCAGGTCTGGTTCAGGCGTATTTGCCCGGCAAGAGTATGATGGCGATCGGCGGCGGCACTTATCGCGGCGAAGCCGGTTACGCCATCGGCTACTCCAGAATTTCCGACGGCGGAAATTGGATTATCAAAGGCACGGCTTCCGGCAATTCGCGCGGCCATTTCGGTGCTTCCGCATCTGTCGGTTATCAGTGGTAASEQ ID NO:4由SEQ ID NO:3的多核苷酸序列推定的腦膜炎奈瑟氏球菌BASB029多肽序列MNKIYRIIWNSALNAWVAVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDQVQRTVAVLIVNSDKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTARBITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNKVNITSDTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGVKPGTTASDNVDFVRTYKTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVRIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSIGAGADAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQWSEQ ID NO:5GGG GCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAASEQ ID NO:6GGG GCT CGA GCC ACT GAT AAC CGA CAG ATG CGG A
權(quán)利要求
1．含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與選自SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
2．權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列與選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
3．權(quán)利要求1的分離多肽，它含有選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
4．SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的分離多肽。
5．權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽相同。
6．含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列編碼這樣一種多肽，該多肽與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的氨基酸序列的全長(zhǎng)序列分別具有至少85％的同一性；或與所述分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
7．含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列與編碼SEQID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽的核苷酸序列在全部編碼區(qū)上至少有85％的同一性；或與所述分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
8．含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列與SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3的全長(zhǎng)序列分別具有至少85％的同一性；或與所述分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
9．權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的分離多核苷酸，其中與SEQ ID NO:1,3的同一性至少為95％。
10．含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列編碼SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4的多肽。
11．含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的多核苷酸序列的分離多核苷酸。
12．含有編碼SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸，它可通過(guò)在嚴(yán)緊雜交條件下，用具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或其片段的序列的標(biāo)記探針篩選合適的文庫(kù)獲得。
13．含有權(quán)利要求6-12任一項(xiàng)的分離多核苷酸的表達(dá)載體或重組的活微生物。
14．含有權(quán)利要求13的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞或一種亞細(xì)胞組分，或所述宿主細(xì)胞的膜，其中宿主細(xì)胞表達(dá)一種分離多肽，該多肽含有一種與選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
15．制備一種多肽的方法，其中該多肽含有一種與選自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，這種方法包括將權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)基中回收多肽。
16．表達(dá)權(quán)利要求6-12任一項(xiàng)的多核苷酸的方法，包括用含有至少一種所述多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在足以表達(dá)任何一種所說(shuō)多核苷酸的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
17．含有有效量的權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的多肽和可藥用載體的疫苗組合物。
18．含有有效量的權(quán)利要求6至12任一項(xiàng)的多核苷酸和可藥用載體的疫苗組合物。
19．權(quán)利要求17或18任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中所述組合物至少含有一種另外的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原。
20．對(duì)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的多肽或免疫性片段具有免疫特異性的抗體。
21．診斷腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，包括鑒定在來(lái)自懷疑具有這種感染的動(dòng)物的生物樣品中存在的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽、或?qū)λ龆嚯木哂忻庖咛禺愋缘目贵w。
22．含有免疫有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
23．含有免疫有效量的權(quán)利要求6-12任一項(xiàng)的多核苷酸在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
24．用于治療患有腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的人的治療組合物，它包括至少一種抗權(quán)利要求1-5的多肽的抗體以及合適的藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明提供BASB029多肽和編碼BASB029多肽的多核苷酸以及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。本發(fā)明還提供診斷性、預(yù)防性和治療性的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1309707SQ99808606
公開(kāi)日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月13日
發(fā)明者J·L·呂勒 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司