專利名稱：編碼與感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的g－蛋白偶聯(lián)受體的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了感覺細胞特異性G-蛋白偶聯(lián)受體的分離的核酸和氨基酸序列，這些受體的抗體，檢測這些核酸和受體的方法，和篩選感覺細胞特異性G-蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)劑的方法。
背景技術(shù)：
味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)是動物化學轉(zhuǎn)導(dǎo)的最復(fù)雜形式之一(見例如，Margolskee，生物學論文15:645-650(1993)；Avenet & Lindemann，膜生物學雜志112:1-8(1989))。整個動物界，從簡單的多細胞動物到最復(fù)雜的脊椎動物都發(fā)現(xiàn)了味覺信號傳遞其主要目的是提供對不揮發(fā)配體的可靠信號傳遞反應(yīng)。認為這些感覺的每一種是由受體或通道介導(dǎo)的獨特信號傳導(dǎo)途徑所介導(dǎo)的，導(dǎo)致受體細胞去極化，產(chǎn)生受體或作用潛能，并在味覺傳入神經(jīng)元突觸處釋放神經(jīng)遞質(zhì)(見例如，Roper，神經(jīng)科學年鑒12:329-353(1989))。
據(jù)信哺乳動物具有5種基本的味覺甜、苦、酸、咸和鮮(谷氨酸鈉的味道)(見例如，Kawamura & Kare，鮮味的介紹一種基本味覺(1987)；Kinnamon & Cummings，生理學年鑒54:715-731(1992)；Lindermann，生理學綜述76:718-766(1996)；Steward等，美國生理學雜志272:1-26(1997))。對人的廣泛精神物理研究已報道，舌頭的不同區(qū)域顯示不同的味偏好(見例如，Hoffmann,Menchen.Arch.Path.Anat.Physio1.62:516-530(1875)；Bradley等，Anatomical Record212:246-249(1985)；Miley & Reedy，生理行為47:1213-1219(1990))。對動物的許多生理學研究也已顯示了味覺受體細胞可選擇性的對不同的味道作出反應(yīng)(見例如Akabas等，科學242:1047-1050(1988)；Gilbertson等，普通生理學雜志100:803-24(1992)；Bernhardt等，生理學雜志490:325-336(1996):Cummings等，神經(jīng)生理學雜志75:1256-1263(1996))。
在哺乳動物中，味覺受體細胞集中于分布在舌上皮不同乳頭中的味蕾中。舌最后部發(fā)現(xiàn)的周緣乳頭含有成百(小鼠)上千(人)個味蕾，而且對苦味物質(zhì)特別敏感。葉狀乳頭(位于舌后側(cè)兩邊緣)含有幾十到幾百個味蕾，對酸和苦味物質(zhì)特別敏感。含有一個或幾個味蕾的蕈狀乳頭位于舌前部，據(jù)認為介導(dǎo)大部分甜味感覺。
每個味蕾視物種的不同，含有50-150個細胞，包括前體細胞、支持細胞和味覺受體細胞(見例如Lindermann生理學綜述76:718-766(1996))。受體細胞受其基底處傳入神經(jīng)末梢支配，這些神經(jīng)末梢通過腦干和丘腦的突觸將信息傳遞給大腦皮質(zhì)的味覺中樞。闡明味覺細胞信號傳導(dǎo)和信息處理的機制，對于理解味覺功能、調(diào)節(jié)和“感覺”是關(guān)鍵的。
雖然對于味覺細胞功能的精神物理學和生理學已有了不少了解，但對于介導(dǎo)這些感覺信號傳遞反應(yīng)的分子和途徑所知很少(Gilbertson綜述，神經(jīng)生物學當前觀點3:532-539(1993))。電生理學研究提出，酸味和咸味由H+和Na+離子通過細胞尖端表面的特殊膜通道直接進入細胞來調(diào)節(jié)味覺細胞功能。就酸性化合物而言，假定H+封閉了K+通道(見例如，Kinnamon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:7023-7027(1988))或pH敏感性通道的活化(見例如，Gilbertson等，遺傳生理學雜志100:803-24(1992))導(dǎo)致味覺細胞去極化；鹽轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是由Na+通過阿米洛利敏感性Na+通道進入而部分介導(dǎo)的(見例如Heck等，科學，223:403-405(1984)；Brand等，大腦研究207-214(1985)；Avenet等，自然331:351-354(1988))。
據(jù)信甜、苦和鮮味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)是由G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號傳遞途徑介導(dǎo)的(見例如，Striem等，生物化學雜志260:121-126(1989)；Chaudhari等，神經(jīng)學雜志16:3817-3826(1996)；Wong等，自然381:796-800(1996))。令人不解的是，甜味覺和苦味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號傳遞途徑模型和GPCR級連反應(yīng)的效應(yīng)物酶(如G蛋白亞基、cGMP磷酸二酯酶、磷脂酶C、腺苷酸環(huán)化酶；見例如，Kinnamon& Margolskee，神經(jīng)生物學當前觀點6:506-513(1996))幾乎一樣多。然而，對于參與味覺傳導(dǎo)的特異性膜受體，或許多受單種味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化的單種胞內(nèi)信號傳遞分子知之甚少。鑒定這些分子對苦味拮抗劑、甜味促效劑和咸與酸味調(diào)節(jié)劑在許多制藥工業(yè)和食品工業(yè)中的應(yīng)用是重要的。
味覺受體(包括味覺離子通道)和味覺信號傳遞分子，如與信號傳遞有關(guān)的G-蛋白亞基和酶的鑒定和分離，將使人們能夠?qū)ξ队X轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作藥物學和遺傳學調(diào)節(jié)。例如，受體和通道分子的獲得將允許我們篩選高親和力的促效劑、拮抗劑、反向促效劑和味覺細胞活性的調(diào)節(jié)劑。然后可將這些味覺調(diào)節(jié)化合物用于制藥工業(yè)和食品工業(yè)，來按需要改變味道。另外，這些味覺細胞特異性分子在產(chǎn)生味覺局部解剖圖上起著無價工具的作用，以闡明舌的味覺細胞和連接大腦味覺中樞的味覺神經(jīng)元之間的關(guān)系。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明首次提供了編碼味覺細胞特異性G-蛋白偶聯(lián)受體的核酸。這些核酸及其編碼的多肽稱為“GPCR-B3”，代表G-蛋白偶聯(lián)受體(“GPCR”)B3。這些味覺細胞特異性GPCR是味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分。
一方面，本發(fā)明提供了一種編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的分離核酸，該受體含有與SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3氨基酸序列約70％以上相同的氨基酸。
在一實施例中，該核酸包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6的核苷酸。在另一個實施例中，用能在嚴格雜交條件下與編碼選自IAWDWNGPKW(SEQ ID NO:7)和LPENYNEAKC(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的簡并引物組相同的序列選擇性雜交的引物，擴增該核酸。
另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的分離核酸，其中該核酸在高度嚴格條件下與具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列的核酸特異性雜交。
另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的分離核酸，該受體含有與具有SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的多肽約70％以上的氨基酸相同，其中該核酸在中度嚴格條件下與SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列特異性雜交。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離核酸，它編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域，該胞外功能域具有與SEQ ID NO:1胞外功能域約70％以上相同的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離核酸，它編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜功能域，該跨膜功能域具有與SEQ ID NO:1跨膜功能域約70％以上相同的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體，該受體含有與SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列約70％以上相同的氨基酸序列。
在一個實施例中，該受體與針對SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合。在另一個實施例中，該受體具有G蛋白交聯(lián)受體的活性。在另一個實施例中，該受體具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的氨基酸序列。在另一個實施例中，該受體來自人、大鼠或小鼠。
一方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，它包含感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的一個胞外功能域，該胞外功能域包含與SEQ ID NO:1的胞外功能域約70％以上相同的氨基酸序列。
在一個實施例中，該多肽編碼SEQ ID NO:1的胞外功能域。在另一個實施例中，該胞外功能域與一異源多肽共價連接，形成嵌合多肽。
一方面，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，它包含感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的一個跨膜功能域，該跨膜功能域包含與SEQ ID NO:1的跨膜功能域約70％以上相同的氨基酸序列。
在一個實施例中，該多肽編碼SEQ ID NO:1的跨膜功能域。在另一個實施例中，該多肽還包含胞質(zhì)功能域，它包含與SEQ ID NO:1的胞質(zhì)功能域約70％以上相同的氨基酸序列。在另一個實施例中，該多肽編碼SEQ ID NO:1的胞質(zhì)功能域。在另一個實施例中，該跨膜功能域與一異源多肽共價連接，形成嵌合多肽。在另一個實施例中，該嵌合多肽具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。
一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其與受體選擇性結(jié)合，該受體包含與SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列約70％以上相同的氨基酸序列。
另一個方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，它包含一種核酸，該核酸編碼包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列約70％以上氨基酸序列相同的多肽。
另一個方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)染了該表達載體的宿主細胞。
另一個方面，本發(fā)明提供了一種鑒定調(diào)節(jié)感覺細胞中感覺信號傳遞的化合物的方法，該方法包括步驟如下(ⅰ)使該化合物和包含感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域的多肽接觸，該胞外功能域包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3胞外功能域約70％以上相同氨基酸序列；和(ⅱ)確定該化合物對胞外功能域的功能作用。
另一個方面，本發(fā)明提供了一種鑒定調(diào)節(jié)感覺細胞中感覺信號傳遞的化合物的方法，該方法包括步驟如下(ⅰ)使該化合物和包含感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域的多肽接觸，該跨膜功能域包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3胞外功能域約70％以上相同的氨基酸序列；和(ⅱ)確定該化合物對跨膜功能域的功能作用。
在一個實施例中，該多肽是感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體，該受體包含與SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽約70％以上相同的氨基酸序列。在另一個實施例中，多肽包含一個與異源多肽共價連接的胞外功能域，形成嵌合多肽。在另一個實施例中，該多肽具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。在另一個實施例中，該胞外功能域與固相共價或非共價連接。在另一個實施例中，通過測量胞內(nèi)cAMP、IP3或Ca2+的變化確定功能作用。在另一個實施例中，該功能作用是化學作用。在另一個實施例中，通過測量該化合物與胞外功能域的結(jié)合確定作用。在另一個實施例中，該多肽是重組的。在另一個實施例中，該多肽在細胞內(nèi)或細胞膜中表達。在另一個實施例中，細胞是真核細胞。
在一個實施例中，該多肽包含與異源多肽共價連接的跨膜功能域，形成嵌合多肽。
一方面，本發(fā)明提供了一種制備感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的方法，該方法包含步驟如下從含有編碼該受體的核酸的重組表達載體中表達該受體，其中該受體的氨基酸序列包含與具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的多肽有約70％以上相同的氨基酸。
一方面，本發(fā)明提供制備一種重組細胞的方法，該重組細胞包含感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體，該方法包括用含編碼該受體的核酸的表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的步驟，其中該受體的氨基酸序列含有與具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的多肽70％以上相同的氨基酸。
一方面，本發(fā)明提供了一種制備重組表達載體的方法，該載體包含編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的核酸，該方法包含步驟如下將編碼該受體的核酸連接于一表達載體，其中該受體的氨基酸序列包含與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的多肽有約70％以上相同的氨基酸。
附圖簡述

圖1顯示了GPCR-B3的預(yù)測形態(tài)，具有從大鼠GPCR-B3的氨基酸序列的氨基酸1延伸到氨基酸580(對應(yīng)大鼠序列的核苷酸殘基1-1740，將ATG起始密碼子甲硫氨酸定為殘基1)的大胞外功能域，和7個跨膜功能域。大胞外功能域可能延伸入第一跨膜功能域。黑色殘基表明GPCR-B3和GPCR-B4之間的相同性(對于GPCR-B4的描述，見例如USSN 60/095,464,1998年6月28日提交，和USSN60/112,747,1998年12月17日提交；也見Hoon等，細胞96:541-551(1990))。
圖2是蛋白質(zhì)印跡，顯示GPCR-B3在味蕾而不在非味組織中表達。使用PCR實驗，檢測了下列非舌組織的GPCR-B3表達——腦、肝、嗅上皮、CNO和心臟。GPCR-B3僅在舌組織中表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖3顯示了舌組織切片的原位雜交，顯示味蕾味受體細胞中的GPCR-B3標記，但不在鄰近的非味組織中。
圖4顯示了含有小鼠mGluR1受體的整個胞外功能域小鼠GPCR-B3的7個跨膜區(qū)及其相應(yīng)的胞質(zhì)環(huán)、和小鼠GPCR-B3的C-末端構(gòu)成的嵌合受體。
圖5顯示了用圖4描述的嵌合谷氨酸/GPCR-B3受體轉(zhuǎn)染的HEK細胞。圖5顯示了對谷氨酸的鈣反應(yīng)，證明嵌合受體與磷脂酶C緊密結(jié)合。這些結(jié)果表明嵌合谷氨酸/GPCR-B3可與混雜G蛋白Gα15偶聯(lián)，并引發(fā)用指示劑Fura-2可檢測的鈣反應(yīng)。
發(fā)明詳述1．介紹本發(fā)明首次提供了編碼味覺細胞特異性G-蛋白偶聯(lián)受體的核酸。這些核酸及其編碼的受體稱為“GPCR”，代表G-蛋白偶聯(lián)受體，并被命名為GPCR-B3。這些味覺細胞特異性GPCR是味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分。這些核酸提供了用于鑒定味覺細胞的有價值探針，因為這些核酸在味覺細胞中特異性表達。例如，可用GPCR多肽和蛋白質(zhì)的探針鑒定味覺細胞各亞組，如葉狀細胞和周緣細胞，或特異性味覺受體細胞，如甜、酸、咸和苦。它們也可作為工具，產(chǎn)生味覺局部解剖圖，闡明舌頭的味覺細胞和與大腦味覺中樞連接的味覺神經(jīng)元之間的關(guān)系。另外，可用這些核酸及其編碼的蛋白作為探針來研究味覺誘導(dǎo)行為。
本發(fā)明還提供了篩選這些新穎味覺細胞GPCR的調(diào)節(jié)劑，如活化劑、抑制劑、刺激劑、增強劑、促效劑和拮抗劑的方法。這些味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑可用于味覺信號傳遞途徑的藥物學和遺傳學調(diào)節(jié)?？捎眠@些篩選方法鑒定味覺細胞活性的高親和力促效劑和拮抗劑。然后可將這些調(diào)節(jié)性化合物用于食品和制藥工業(yè)，來按要求改變味道。因此，本發(fā)明提供了味覺調(diào)節(jié)的試驗方法，其中GPCR-B3作為調(diào)節(jié)劑對味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的直接或間接報告分子?？稍谝恍嶒灒鐪y量離子濃度、膜電勢、電流、離子流、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體配體相互反應(yīng)、體外、體內(nèi)和活體外的第二信使?jié)舛葴y定中使用GPCR。在一個實施例中，可用GPCR-B3作為間接報道物，通過其與第二報道分子，如綠色熒光蛋白結(jié)合(見例如，Mistili & Spector，自然生物技術(shù)15:961-964(1997))。在另一個實施例中，在細胞中重組表達GPCR-B3，并測量Ca2+水平的變化檢測通過GPCR作用的味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)(見實施例Ⅱ)。
檢測味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑的方法包括用GPCR-B3，其部分如胞外功能域、或含有GPCR-B3的一個或多個功能域的嵌合蛋白的體外配體結(jié)合試驗，卵母細胞GPCR-B3表達；組織培養(yǎng)細胞GPCR-B3表達；GPCR-B3的轉(zhuǎn)錄活化；GPCR的磷酸化和去磷酸化；G-蛋白和GPCR的結(jié)合；配體結(jié)合試驗；電壓、膜電勢和電導(dǎo)變化；離子流試驗；胞內(nèi)第二信使如cAMP和三磷酸肌醇的變化；胞內(nèi)鈣水平的變化；和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的體外配體結(jié)合試驗。
最后，本發(fā)明提供了檢測GPCR-B3核酸和蛋白質(zhì)表達的方法，可實現(xiàn)對味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的研究和對味覺受體細胞的特異性鑒定。GPCR-B3還提供了可用于親子鑒定和法醫(yī)調(diào)查的核酸探針。GPCR-B3作為核酸探針，可鑒定味覺受體細胞，如葉狀、蕈狀和周緣味覺受體細胞亞群。還可用GPCR-B3受體產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體，用于鑒定味覺受體細胞?？捎梅崔D(zhuǎn)錄和mRNA擴增，分離總RNA或聚腺苷酸RNA,RNA印跡、斑點印跡、原位雜交、RNase保護、S1消化、探測DNA微芯片陣列、蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)鑒定味覺受體細胞。
功能上，GPCR-B3代表與味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的一種7次跨膜G-蛋白偶聯(lián)載體，其與G-蛋白相互反應(yīng)，介導(dǎo)味覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(見例如，F(xiàn)ong，細胞信號8:217(1996)；Baldwin，細胞生物學當前觀點6:180(1994))。
結(jié)構(gòu)上，GPCR-B3的核苷酸序列(見例如SEQ ID NO:4-6，分別分離自大鼠、小鼠和人)編碼一個約840個氨基酸的多肽，具有約97kDa的預(yù)測分子量，和92-102kDa的預(yù)測范圍(見例如SEQ ID NO:1-3)。其它動物的相關(guān)GPCR-B3基因在長度至少約25個氨基酸，可任選在長度為50-100個氨基酸的區(qū)域中具有至少約70％相同的氨基酸。GPCR-B3細胞在葉狀和蕈狀細胞中特異性表達，在舌周緣味覺受體細胞中表達較低。GPCR-B3是較稀有的序列，在oligo-dT引導(dǎo)的周緣cDNA文庫的150,000個cDNA中發(fā)現(xiàn)1個(見實施例Ⅰ)。
本發(fā)明還提供了SEQ ID NO:1中描述的GPCR-B3多態(tài)變體變體#1，其中氨基酸位置33的亮氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代；變體#2，其中氨基酸位置84的谷氨酸殘基被天門冬氨酸殘基取代；和變體#3，其中氨基酸位置90的丙氨酸殘基被甘氨酸殘基取代。
可用GPCR-B3核苷酸和氨基酸序列的特定區(qū)域來鑒定GPCR-B3的多態(tài)變體、種間同系物、和等位基因?？稍隗w外，如嚴格雜交條件下或PCR(用編碼SEQ ID NO:7-8的引物)和測序，或使用計算機系統(tǒng)中的序列信息與其它核苷酸序列比較，進行該鑒定。通常，通過比較約25個氨基酸或更多，如50-100個氨基酸的氨基酸序列來進行對GPCR-B3的多態(tài)變體和等位基因的鑒定。約至少70％或以上，可任選80％或90-95％或以上相同的氨基酸通常證明一個蛋白質(zhì)是GPCR-B3的多態(tài)變體、種間同系物、或等位基因。可用任何一種下文討論的序列比較算法進行序列比較。還可用特異性結(jié)合GPCR-B3或其保守區(qū)域的抗體鑒定等位基因、種間同系物和多態(tài)變體。
通過檢測味覺細胞特異性表達的推定GPCR-B3多肽證實了GPCR-B3的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因。通常，用具有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的GPCR-B3作為與推定GPCR-B3蛋白比較的陽性對照，來證明GPCR-B3多態(tài)變體或等位基因的身份。希望多態(tài)變體、等位基因和種間同系物保留G-蛋白偶聯(lián)受體的7次跨膜結(jié)構(gòu)。
還可用GPCR-B3核苷酸和氨基酸序列信息在計算機系統(tǒng)中構(gòu)建味覺細胞特異性多肽的模型。然后用這些模型來鑒定能活化或抑制GPCR-B3的化合物?？捎眠@些調(diào)節(jié)GPCR-B3活性的化合物研究GPCR-B3在味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。
GPCR-B3的分離首次提供了檢驗G-蛋白偶聯(lián)受體味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑和激活物的方法。生物學活性的GPCR-B3用于測試作為味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)物的GPCR-B3的抑制劑和激活物，使用體內(nèi)和體外表達，測量如GPCR-B3的轉(zhuǎn)錄活化；配體結(jié)合；磷酸化和去磷酸化；與G-蛋白的結(jié)合；G-蛋白活化；調(diào)控分子結(jié)合；電壓、膜電勢和電導(dǎo)改變；離子流；胞內(nèi)第二信使，如cAMP和三磷酸肌醇；胞內(nèi)鈣水平；和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。用GPCR-B3鑒定的這些激活劑和抑制劑可用于進一步研究味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)和鑒定特異性味覺促效劑和拮抗劑。這些激活劑和抑制劑可用于藥物和食品制劑來按要求改變味覺。
檢測GPCR B3核酸和表達GPCR-B3的方法也可用來鑒定味覺細胞，并建立舌的局部解剖圖和舌味覺受體細胞和大腦中味覺神經(jīng)元之間的關(guān)系。可用編碼人GPCR-B3基因的染色體定位，來鑒定由GPCR-B3導(dǎo)致或相關(guān)的疾病、突變和性狀。
Ⅱ．定義如本文所用，下列術(shù)語除非另外指定，具有賦予它們的意義。
“味覺受體細胞”是神經(jīng)上皮細胞，其組成若干組，形成舌頭的味蕾，如葉狀、蕈狀和周緣細胞(見例如，Roper等，神經(jīng)科學年鑒12:329-353(1989))。
“GPCR-B3”，也稱為“TR1”，指G-蛋白偶聯(lián)受體，在味覺受體細胞，如葉狀、蕈狀和周緣細胞中特異性表達(見例如Hoon等，細胞96:541-551(1999)，在此完全引入以供參考)?？设b定這些味覺細胞，因為其表達特異性分子，如Gustducin味轉(zhuǎn)導(dǎo)素，一種味覺細胞特異性G蛋白(McLaughin等，自然357:563-569(1992))。還可根據(jù)形態(tài)學鑒定味覺受體細胞(見例如Roper，見上)。
GPCR-B3編碼具有7個跨膜區(qū)的，具有“G-蛋白偶聯(lián)受體活性”的GPCR，例如，它們在對胞外刺激的反應(yīng)中，與G-蛋白結(jié)合，并通過磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶等酶的刺激促使產(chǎn)生第二信使，如IP3、cAMP和Ca2+(對于GPCR的結(jié)構(gòu)和功能的描述，見例如Fong，見上，和Baldwin，見上)。
因此，術(shù)語GPCR-B3指多態(tài)變體、等位基因、突變物和種間同系物，它們(1)在一個約25個氨基酸，可任選50-100個氨基酸的窗口上具有和SEQ ID NO:1-3約70％相同的氨基酸序列，可任選的約75、80、85、90或95％相同的氨基酸序列；(2)能與針對含有選自SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列及其保守修飾變化的免疫原的抗體結(jié)合；(3)在嚴格雜交條件下，與選自SEQ ID NO:4-6及其保守修飾變化的序列特異性雜交(大小至少約500，可任選至少約900個核苷酸)；或(4)可被在嚴格雜交條件下能與編碼SEQ ID NO:7-8的簡并引物組相同的序列特異性雜交的引物擴增。
拓撲形態(tài)上，感覺GPCR具有N-末端的“胞外功能域”，含有7個跨膜區(qū)和對應(yīng)胞質(zhì)和胞外環(huán)的“跨膜功能域”，和C-末端“胞質(zhì)功能域”(見例如Hoon等，細胞96:541-551(1999)；Buck & Axel，細胞65:175-187(1991))?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從結(jié)構(gòu)上鑒定這些功能域，如鑒定疏水和親水功能域的序列分析程序(見例如Kyte & Doolittle，分子生物學雜志157:105-132(1982))。這些功能域?qū)τ谥苽浔景l(fā)明的嵌合蛋白和體外試驗是有用的。
因此，“胞外功能域”指GPCR-B3的突出于細胞膜，并與胞外配體結(jié)合的功能域。該功能域從N-末端開始，大約終止于氨基酸位置563加減約20個氨基酸的保守谷氨酸位置。對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸1-580(核苷酸1-1740，核苷酸1始于ATG起始甲硫氨酸密碼子，也見圖1)的該區(qū)域是略延伸入跨膜功能域的胞外功能域的一個例子。該例子用于液相和固相的體外配體結(jié)合試驗。
“跨膜功能域”包含7個跨膜區(qū)域，加上對應(yīng)的胞質(zhì)和胞外環(huán)，指GPCR-B3的大約始于氨基酸位置563的保守谷氨酸加減約20個氨基酸的保守谷氨酸位置，并大約終止于氨基酸位置812的保守酪氨酸加減約20個氨基酸的保守酪氨酸位置的功能域。
“胞質(zhì)功能域”指GPCR-B3的始于約氨基酸位置812加減約20個氨基酸的保守酪氨酸位置，持續(xù)到多肽C-末端的功能域。
本文所用的“生物學樣品”是含有GPCR-B3或編碼GPCR-B3蛋白質(zhì)的核酸的生物組織或液體樣品。這些樣品包括但不限于分離自人、小鼠和大鼠，具體是舌組織。生物學樣品還包括供組織學研究目的的組織切片，如冰凍切片。通常生物學樣品獲自真核生物，如昆蟲、原生動物、鳥類、魚類、爬行類和優(yōu)選哺乳動物，如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠、或家兔，和最優(yōu)選的是靈長類，如黑猩猩或人。組織包括舌組織、分離的味蕾和睪丸組織。
“GPCR活性”指GPCR轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的活性?？稍诋愒醇毎?，通過將GPCR(或嵌合性GPCR)與G-蛋白或混雜G-蛋白(如Gα15)和PLC等酶偶聯(lián)，并用(0ffermans & Simon生物化學雜志270:15175-15180(1995))測量胞內(nèi)鈣的升高，來測量這種活性?？捎脽晒釩a2+-指示物染料和熒光顯像記錄配體誘導(dǎo)的[Ca2+]i變化，有效測量受體活性?？扇芜x的，本發(fā)明的多肽與感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)，可任選的，味覺細胞中的味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。
在測試調(diào)節(jié)GPCR-B3介導(dǎo)的味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物試驗中，詞組“功能作用”包括測定任何在該受體直接或間接影響下的參數(shù)，如功能、物理和化學作用。它包括配體結(jié)合、離子流變化、膜電勢、電流、轉(zhuǎn)錄、G-蛋白結(jié)合、GPCR磷酸化和去磷酸化，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體-配體相互作用，第二信使?jié)舛?如cAMP、IP3、或胞內(nèi)Ca2+)體外、體內(nèi)、和活體外的變化，還包括增加或降低神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放等其它生理學作用。
通過“測定功能作用”指測試能提高或降低間接或直接受GPCR-B3影響的，如功能性、物理和化學作用的參數(shù)的化合物。這些功能性作用可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一方法測量，如光譜特征(如熒光、吸光度、折射指標)、流體動力學(如形狀)、色譜分析、或可溶性能的變化，膜片鉗、電壓敏感性染料、全細胞電流、放射性同位素射流、可誘導(dǎo)標記、卵母細胞GPCR-B3表達；配體結(jié)合試驗；電壓、膜電勢和電導(dǎo)的變化；離子流試驗；胞內(nèi)第二信使，如cAMP和三磷酸肌醇(IP3)的變化胞內(nèi)鈣水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放等。
可互換的使用GPCR-B3的“抑制劑”、“激活物”和“調(diào)節(jié)劑”，指抑制、活化或調(diào)節(jié)味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)用體外和體內(nèi)試驗鑒定的分子，如配體、促效劑、拮抗劑及其同類物和模仿物。抑制劑是能與刺激物結(jié)合，而部分或完全封閉刺激，降低，防止，延緩活化，滅活，脫敏，或下調(diào)味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，如拮抗劑。激活物是例如結(jié)合、刺激、提高、打開、活化、促進、增強活化、致敏或上調(diào)味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，如促效劑。調(diào)節(jié)劑包括例如改變受體與胞外蛋白質(zhì)(其與激活物或抑制劑結(jié)合)(如舌腺蛋白和其它疏水載體家族的成員)相互反應(yīng)；G-蛋白；激酶(如視紫紅質(zhì)激酶和β-腎上腺素受體激酶，其與受體滅活和脫敏有關(guān))；和視紫紅質(zhì)樣抑制蛋白(它也滅活和脫敏受體)的相互作用。調(diào)節(jié)劑包括GPCR-B3的遺傳修飾形式，如改變的活性，以及天然存在和合成的配體，拮抗劑，促效劑，小化學分子等。抑制劑和激活劑的這些試驗包括例如在細胞或細胞膜中表達GPCR-B3，應(yīng)用推定的調(diào)節(jié)劑化合物，然后如上所述測定對味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能性作用。將包含用可能的激活劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的GPCR-B3的試驗樣品，與不含抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑的對照樣品比較，來檢測抑制程度。將對照樣品(未用抑制劑處理)指定為相對GPCR-B3活性值100％。當相對對照的GPCR-B3活性值是大約80％時，可任選50％或25-0％，即實現(xiàn)了GPCR-B3的抑制。當相對于對照的GPCR-B3活性值是約110％，可任選150％或200-500％，或1000-3000％以上時，即實現(xiàn)了GPCR-B3的活化。
“生物學活性”GPCR-B3，指具有如上所述GPCR活性的GPCR-B3，與味覺受體細胞的味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。
術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物學純的”指某物質(zhì)基本或根本沒有其天然狀態(tài)下通常伴隨它的成分。通常用分析化學技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相層析測定純度或均一性。在制備物中是主要物質(zhì)的某蛋白質(zhì)是基本純化的。具體說，分離的GPCR-B3核酸是與GPCR-B3基因旁側(cè)編碼GPCR-B3以外的蛋白質(zhì)的開放閱讀框相分開。術(shù)語“純化的”指核酸或蛋白在電泳凝膠上基本只產(chǎn)生一條條帶。特別是，它指核酸或蛋白質(zhì)是至少85％純的，可任選至少95％純的，和可任選至少99％純的。
“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。術(shù)語包括含有已知核苷酸同類物或修飾的骨架殘基或連接鍵，或合成的、天然存在的、和非天然存在的核酸，它們具有參比核酸相似的結(jié)合性能。它們以參比核苷酸相似的方式代謝。這些同類物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有注明，特定核酸序列還包含其保守性修飾的變體(如簡并密碼子取代物)和互補序列，以及明確標出的序列。特別是，可通過產(chǎn)生在一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三個位置以混合的堿基和/或脫氧次黃嘌呤殘基取代的序列，而實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等，核酸研究19:5081(1991)；Ohtsuka等，生物化學雜志260:2605-2608(1995)；Rossolini等，分子細胞探針8:91-98(1994))。術(shù)語核酸與基因，cDNA,mRNA，寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。
本文可互換使用術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語用于以下氨基酸聚合物，即其中一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
術(shù)語“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸同類物和氨基酸模擬物，它們的功能在某方面和天然存在的氨基酸相似。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的，以及后來被修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、γ-羰基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸。氨基酸同類物指和天然存在的氨基酸具有相同基礎(chǔ)化學結(jié)構(gòu)的化合物，即，一個與氫結(jié)合的α碳，一個羧基、一個氨基和一個R基團，例如同絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些同類物具有修飾的R基團(如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留天然存在的氨基酸的相同基礎(chǔ)化學結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有和氨基酸的一般化學結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但功能與天然存在的氨基酸相似的化合物。
本文的氨基酸可用它們的公知三字母符號或用IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號相稱。同樣，核苷酸可用它們普遍接受的單字母密碼相稱。
“保守性修飾變體”同時用于氨基酸和核酸序列。對于特定核酸序列，保守性修飾變體指那些編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或其中核酸不編碼基本相同序列的一個氨基酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，許多功能相同的核酸編碼了一給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA,GCC,GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸密碼子的每一個位置，可將該密碼子變成上述相應(yīng)密碼子的任何一個而不改變編碼的多肽。這種核酸變化是“沉默變化”，它是一種保守性修飾變化。對本文編碼多肽的每一核酸序列還描述了該核酸的每個可能的沉默變體。技術(shù)人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，它是色氨酸的唯一密碼子)可被修飾，得到功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸中的每個沉默變體隱含在各所述序列中。
對于氨基酸序列，技術(shù)人員將認識到對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單個取代、缺失或添加(在編碼的序列中改變、添加或除去一個氨基酸或一小百分比的氨基酸)是“保守性修飾變體”，其中改變的結(jié)果是用化學上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。這類保守性修飾變化是補充，而不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種間同系物、和等位基因。
下列8組各含有彼此可保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天門冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天門冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(P)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見例如，Creighton，蛋白質(zhì)(1984))。
多肽結(jié)構(gòu)等大分子結(jié)構(gòu)可用多種結(jié)構(gòu)水平的術(shù)語描述。關(guān)于結(jié)構(gòu)的一般描述，見例如，Alberts等，細胞分子生物學(第3版，1994)和Cantor和Schimmel，生物物理化學第Ⅰ部分生物大分子的構(gòu)象(1980)?！耙患壗Y(jié)構(gòu)”指某特定肽的氨基酸序列?！岸壗Y(jié)構(gòu)”指某肽中局部排序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)一般稱為功能域。功能域是多肽的部分，形成該多肽的緊密單元，通常長50-350個氨基酸。典型的功能域是由較短的結(jié)構(gòu)，如β-折疊和α-螺旋伸展片段構(gòu)成?！叭壗Y(jié)構(gòu)”指多肽單體的完整三維結(jié)構(gòu)?！八募壗Y(jié)構(gòu)”指獨立的三級單元非共價結(jié)合形成的三維結(jié)構(gòu)。各向異性的術(shù)語也被稱為能量術(shù)語。
“標記”或“可檢測分子”指可被分光光度、光化學、生物化學、免疫化學或化學方法檢測的組合物、例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(如ELISA中常用的)、生物素、異羥基洋地黃甙元、或半抗原，而且可通過在該肽中摻入放射性標記，并檢測和該肽特異性反應(yīng)的抗體，來檢測蛋白質(zhì)。
“標記的核酸探針或寡核苷酸”是共價通過接頭或化學鍵、或非共價通過離子，范德華力、靜電或氫鍵與標記結(jié)合的核酸探針或寡核苷酸，從而可通過檢測與探針結(jié)合的標記的存在，來檢測該探針的存在。
本文所用的“核酸探針或寡核苷酸”指能與互補序列的靶核酸通過一種或多種化學鍵，通常通過互補堿基形成氫鍵配對而結(jié)合的核酸。本文所用的探針可包括天然(即A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷等)。另外，探針內(nèi)的堿基可通過除磷酸二酯鍵外的鍵連接，只要其不受雜交干擾。因此，例如探針可以是肽核酸，其中組成堿基通過肽鍵連接，而不是通過磷酸二酯鍵連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，取決于雜交條件的嚴格度，探針可結(jié)合與序列不完全互補的靶序列。探針可任選的直接用放射性同位素、發(fā)色團、發(fā)光團、色原標記，或間接用生物素標記，然后與鏈霉親和素復(fù)合物結(jié)合。通過檢驗探針的存在與否，可檢測所選擇序列或亞序列的存在與否。
當對細胞或核酸、蛋白或載體使用術(shù)語“重組”時，指該細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過引入異源核酸或蛋白，或改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或該細胞衍生自如此修飾的細胞。因此例如，重組細胞表達了在細胞的天然(非重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的基因，或異常表達、表達低下或根本不表達天然基因。
術(shù)語“異源”和核酸部分相關(guān)使用時，指該核酸含有的兩個或多個亞序列，發(fā)現(xiàn)它們在自然情況下相互之間無相同關(guān)系。例如，通常重組產(chǎn)生的核酸具有兩個或多個來自無關(guān)基因的序列，排列形成新的功能性核酸，如來自一種來源的啟動子和來自另一種來源的編碼區(qū)。類似的，異源蛋白質(zhì)表明蛋白質(zhì)含有兩種或多種在天然情況下彼此無相同關(guān)系的亞序列(如融合蛋白)。
“啟動子”定義為核酸控制序列的陣列，它直接轉(zhuǎn)錄一種核酸。本文所用的啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列，如就聚合酶Ⅱ型啟動子而言，是一TATA元件。啟動子還可任選的包括遠端增強子或抑制子元件，它們可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點多達幾千個堿基對。“組成型”啟動子是一種在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動子。“可誘導(dǎo)”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下活性的啟動子。術(shù)語“可操縱連接”指核酸表達控制序列(如啟動子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的陣列)和第二核酸序列之間的功能性鍵連接，其中表達控制序列指導(dǎo)了對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
“表達載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，具有一系列允許特定核酸在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件。表達載體可以是質(zhì)粒、病毒、或核酸片段的一部分。通常，表達載體包含與啟動子可操縱性連接的待轉(zhuǎn)錄的核酸。
關(guān)于兩種或多種核酸或多肽序列，術(shù)語“相同”或百分數(shù)“相同性”指兩條或多條序列或亞序列，當在比較窗口或指定區(qū)域上如用下列序列比較算法之一或手工排列和目測，比較并排列對比尋找最大對應(yīng)性時它們是相同的，或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在一特定區(qū)域內(nèi)有70％相同性，可任選75％、80％、85％、90％或95％相同性)。這樣的序列稱為“基本相同”。該定義還指對測試序列評價、可任選的，相同性存在于至少長度為50個氨基酸和核苷酸的區(qū)域中，或更優(yōu)選的存在于長度為75-100個氨基酸和核苷酸的區(qū)域中。
對于序列比較，通常將一條序列作為參照序列，與測試序列比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機，如需要，指定亞序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J程序參數(shù)，或指定另外的參數(shù)。然后序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計算出測試序列相對于參照序列的序列相同性百分數(shù)。
本文所用的“比較窗”包括參比選自包含20-600、一般約50-200，更一般約100-150個毗鄰位置數(shù)之一的片段，其中在將兩條序列最佳排列后，可將一條序列和毗鄰位置數(shù)相同的參比序列作比較。排列序列作比較的方法是本領(lǐng)域熟知的。可通過例如，Simth & Waterman，高級應(yīng)用數(shù)學，2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch，分子生物學，48:443(1970)的同源排列算法，Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的類似方法，這些算法的計算機化操作(Wisconsin Genetics Software Package的GAP,BESTFIT,FASTA，和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)，或手工排列和目測(見例如分子生物學現(xiàn)有方案(Ausubel等，編1995增訂))來進行序列的最佳排列，作比較。
一種有用算法的例子是PILEUP。PILEUP創(chuàng)立了一組相關(guān)序列的多條序列排列，使用推進的、成對排列對比來顯示相互關(guān)系和序列相同性百分數(shù)。它還繪出了樹狀圖或枝狀圖來顯示用于建立排列對比的分類歸并關(guān)系。PILEUP使用Feng &Doolittle，分子進化雜志35:351-360(1987)的推進排列方法的簡化形式。使用的方法和Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)描述的方法相似。該程序可排列多達300條序列，各自最大長度為5,000個核苷酸或氨基酸。該多重排列程序始于兩條最相似序列的成對排列對比，產(chǎn)生一個兩條排列序列的組。然后將該組和下一條最相關(guān)的序列或排列序列的組排列對比。通過簡單延伸兩條獨立序列的配對排列，對兩組序列進行排列對比。通過一系列推進的成對排列來實現(xiàn)最終的排列對比。通過指定特定序列及其與序列比較區(qū)域同等的氨基酸或核苷酸，并指定程序參數(shù)來運行該程序。使用PILEUP，將參照序列和其它測試序列作比較，用下列參數(shù)測定序列相同性百分數(shù)默認缺口加權(quán)值(3.00)、默認缺口長度加權(quán)值(0.10)、和加權(quán)的末端缺口。PILEUP可從GCG序列分析軟件包，如7.0版(Devereaux等，核酸研究12:387-395(1984))獲得。
另一個適用于測定序列相同性百分數(shù)和序列相似性的算法例子是BLAST和BLAST2.0算法，Altschul等，核酸研究25:3389-3402(1977)和Altschul等，分子生物學雜志215:403-410(1990)分別描述了它們。通過生物技術(shù)信息國家中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公眾可獲得進行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度為W的字，以鑒定高評分的配對(HSP)，當與數(shù)據(jù)庫序列中同樣長度的字排列對比時，匹配或滿足某個正值的閾評分T。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，見上)。找到這些起始的相鄰字作為引發(fā)尋找含有它們的更長HSP的搜索的出發(fā)點。將找到的字沿著各序列雙向延伸，直到能增加累計的排列對比評分。對于核苷酸序列，用參數(shù)M(一對匹配殘基的加分；總是＞0)和N(錯配殘基的減分，總是＜0)計算累計評分。對于氨基酸序列，用評分矩陣來計算累計評分。當累計的排列對比評分從其最大達到值處下落數(shù)量X；由于一個或多個負評分殘基排列對比的累計，該累計評分達到0或以下；或達到兩序列之一的末端時，找到的字延伸被停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定了排列對比的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)用作默認值的句長(W)為11，預(yù)期值(E)為10,M=5,N=-4，比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序用作默認值的句長為3，預(yù)期值(E)為10，和BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff& Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))排列(B)為50，預(yù)期值(E)為10,M=5,N=-4，并比較雙鏈。
BLAST算法還進行兩條序列間相似性的統(tǒng)計學分析(見例如Karlin &Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性測量方法是最小可能性之和(P(N))，其提供了可能性的指示，通過它可碰巧發(fā)生兩條核苷酸或氨基酸序列之間的匹配。例如，如果在測試核酸的和參考核酸的比較中，最小可能性之和小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，和最優(yōu)選小于約0.001，將核酸視為和參照序列相似。
兩條核酸序列或多肽基本相同的指示是，第一條核酸編碼的多肽與針對第二條核酸編碼的多肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫性交叉反應(yīng)(如下所述)。因此，如果兩條肽僅在保守取代上有不同，該多肽通常與第二條多肽基本相同。另一個兩條核酸序列基本相同的指示是兩個分子或其互補分子在嚴格條件下相互雜交(如下所述)。而另一個兩條核酸序列基本相同的指示是可用同樣的引物擴增該序列。
詞組“與…選擇性(或特異性)雜交”指當某序列存在于復(fù)雜混合物中(如總細胞或文庫DNA或RNA)時，該分子僅和特定的核苷酸序列在嚴格條件下結(jié)合、形成雙體或雜交。
詞組“嚴格雜交條件”指在該條件下，通常在核酸的復(fù)雜混合物中，一種探針將與其靶亞序列雜交，但不和其它序列雜交。嚴格條件是序列依賴性的，而且視不同環(huán)境而不同。越長的序列在越高的溫度下特異性雜交。在Tijssen，生物化學和分子生物學技術(shù)與核酸探針雜交，“雜交原理縱覽和核酸試驗策略”(1993)中可找到核酸雜交的一般指南。一般，所選的嚴格條件比在限定離子強度的pH下，特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10℃。Tm是在平衡時，有50％與靶互補的探針與靶序列雜交的(特定離子濃度、pH和核酸的濃度下)溫度(當靶序列過量，在Tm下平衡時50％探針被使用)。嚴格條件將是鹽濃度小于約1.0M鈉離子，通常約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0-8.3，對于短探針(如10-50個核苷酸)溫度至少約30℃，和對于長探針(如50個核苷酸以上)至少約60℃的條件?？杉尤肴シ€(wěn)定劑，如甲酰胺來達到嚴格條件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是至少兩倍于背景，可任選10倍于背景雜交。示范性嚴格條件可如下50％甲酰胺，5×SSC，和1％SDS,42℃培育，或5×SSC,1％SDS,65℃培育，用0.2×SSC和0.1％SDS65℃洗滌。
如果核酸編碼的肽基本相同，在嚴格條件下不互相雜交的核酸仍是基本相同的。例如這發(fā)生在當用基因密碼允許的最大密碼子簡并性建立核酸拷貝時。就此而言，核酸通常在中等嚴格雜交條件下雜交。示范性“中等嚴格雜交條件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的緩沖液中37℃雜交，并以1×SSC 45℃洗滌。陽性雜交是至少背景的兩倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將輕易認識到，可用其它雜交和洗滌條件來提供嚴格性相似的條件。
“抗體”指含有免疫球蛋白基因編碼的框架區(qū)的多肽或其片段，其能特異性結(jié)合并識別一種抗原。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其進而分別定義為免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE類。
典型的免疫球蛋白(抗體)的結(jié)構(gòu)單元是四聚體。各四聚體由相同的兩對多肽鏈構(gòu)成，每對具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的N-末端定義為約100-110或以上的氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原識別。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體可以完整的免疫球蛋白或各種肽酶消化產(chǎn)生的，特性明確的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵下方消化抗體，產(chǎn)生F(ab)’2，一種Fab的二聚物，它自身是一條通過二硫鍵與VH-CH1結(jié)合的輕鏈。F(ab)’2可在溫和條件下還原而打斷鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將F(ab)’2二聚物轉(zhuǎn)化成Fab’單體。Fab’單體本質(zhì)上是帶有部分鉸鏈區(qū)的Fab(見基礎(chǔ)免疫學(Paul編，第三版，1993))。雖然各種抗體片段被定義為完整抗體的消化物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這些片段可用化學方法或用重組DNA方法合成。因此，本文使用的術(shù)語抗體還包括，修飾完整抗體產(chǎn)生的，或用重組DNA方法(如單鏈Fv)從頭合成的，或用噬菌體展示文庫鑒定的抗體片段(見例如，McCafferty等自然348:552-554(1990))。
為了制備單克隆或多克隆抗體，可使用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)(見例如，Kohler & Milstein，自然256:495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫學4:72(1983)；Cole等，單克隆抗體和癌癥治療77-96頁(1985))?？墒褂卯a(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)，來產(chǎn)生抗本發(fā)明多肽的抗體。還可用轉(zhuǎn)基因小鼠，或其它生物體，如其它哺乳動物來表達人源化抗體。另外，可用噬菌體展示技術(shù)來鑒定能與所選抗原特異性結(jié)合的抗體和異聚Fab片段(見例如McCafferty等，自然348:552-554(1990)；Marks等，生物技術(shù)10:779-783(1992))。
“嵌合抗體”是一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、置換或交換，使抗原結(jié)合位點(可變區(qū))與不同的或另一類抗體的有效應(yīng)器功能的和/或動物的恒定區(qū)連接，或與賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子，如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等連接；或(b)用具有不同的或抗原特異性改變的可變區(qū)來改變、置換或交換其可變區(qū)或其部分。
“抗-GPCR-B3”抗體是能與GPCR-B3基因、cDNA、或其亞序列編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體或抗體片段。
術(shù)語“免疫試驗”是用抗體與抗原特異性結(jié)合的試驗。免疫試驗的特征是用特定抗體的特異性結(jié)合性能來分離、靶向、和/或定量測定抗原。
當指蛋白質(zhì)或肽時，詞組“特異性(或選擇性)結(jié)合”于抗體或“與抗體起特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)”指一種結(jié)合反應(yīng)，其對于蛋白質(zhì)或其它生物制劑的異質(zhì)性群體中該蛋白質(zhì)的存在有確定作用。因此，在指定的免疫試驗條件下，特定抗體與一特定蛋白質(zhì)的結(jié)合至少是背景的兩倍，而且和樣品中存在的其它蛋白質(zhì)基本上不以顯著量結(jié)合。在這種條件下與抗體特異性結(jié)合需要選出一種抗體，其對與具體蛋白質(zhì)有特異性。例如，可選用特殊動物，如大鼠、小鼠或人產(chǎn)生的抗GPCR-B3多克隆抗體，來獲得只與GPCR-B3起特異性免疫反應(yīng)，但不和其它蛋白質(zhì)(除了GPCR-B3的多態(tài)性變體和等位基因外)起反應(yīng)的多克隆抗體?？赏ㄟ^除去與其它動物的GPCR-B3分子起交叉反應(yīng)的抗體，來實現(xiàn)該選擇?？捎酶鞣N形式免疫試驗選擇能與特定蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)使用固相ELISA免疫試驗選擇能與蛋白質(zhì)起特異性免疫反應(yīng)的抗體(見例如，Harlow &Lane，抗體，實驗手冊(1988)，對用于測定特異免疫反應(yīng)性的免疫試驗形式和條件的描述)。通常特異性或選擇性反應(yīng)將至少是背景信號或噪聲的兩倍，更通常是背景的10-100倍。
詞組“與…選擇性聯(lián)系”指一核酸與以上定義的另一核酸“選擇性雜交”的能力，或一抗體與以上定義的一種蛋白質(zhì)“選擇性(或特異性)結(jié)合”的能力。
“宿主細胞”意味覺著含有一表達載體并支持該表達載體復(fù)制或表達的細胞。宿主細胞可以是大腸桿菌等原核細胞，或酵母、昆蟲、兩棲類或CHO、HeLa等哺乳動物細胞等真核細胞，如培養(yǎng)的細胞、外植體和體內(nèi)細胞。
Ⅲ．編碼GPCR-B3的核酸的分離A．一般重組DNA方法本發(fā)明依據(jù)重組遺傳學領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開本發(fā)明所用一般方法的基礎(chǔ)文章包括Sambrook等，分子克隆，實驗手冊(第二版，1989)；Kriegler，基因轉(zhuǎn)移和表達實驗手冊(1990)；和分子生物學現(xiàn)有方案(Ausubel等編，1994)。
對于核酸，以千堿基(kb)或堿基對(bp)給出了大小。這些是從瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳，從測序的核酸，或從出版的DNA序列得到的估計。對于蛋白質(zhì)，以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)給出了大小。可從凝膠電泳，從測序的蛋白質(zhì)，從衍生的氨基酸序列，或從出版的蛋白質(zhì)序列估計蛋白質(zhì)大小。
不能商品購得的寡核苷酸可根據(jù)eaucage & Caruthers，四面體通信22:1859-1862(1981)首選描述的固相亞磷酰胺三酯方法，使用自動合成儀，如VanDevanter等，核酸研究，12:6159-6168(1984)所述來化學合成。寡核苷酸的純化可采用天然丙烯酰胺凝膠電泳或Pearson & Reanier,J.Chrom 255:137-149(1983)所述的陰離子交換HPLC。
克隆后，可用例如Wallace等，基因16:21-26(1981)的用于測序雙鏈模板的鏈終止方法驗證克隆的基因和合成的寡核苷酸序列。
B．分離編碼GPCR-B3的核苷酸序列的克隆方法。
一般從cDNA和基因組DNA文庫，通過和探針雜交來克隆，或用寡核苷酸探針通過擴增技術(shù)來分離編碼GPCR-B3的核酸序列和相關(guān)核酸序列同系物。例如，通常從哺乳動物核酸(基因組或cDNA)文庫，和核酸探針(其序列可衍生自SEQ IDN0:4-6)雜交，來分離GPCR-B3序列。可分離得到GPCR-B3 RNA和cDNA的合適組織是舌組織，可任選味蕾組織或單個味覺細胞。
還可用使用引物的擴增技術(shù)，從DNA或RNA擴增并分離GPCR-B3。還可用編碼下列氨基酸序列的簡并引物擴增GPCR-B3的序列SEQ ID NO:7-8(見例如，Dieffenfach & Dveksler,PCR引物實驗手冊(1995))。可用這些引物來擴增全長序列或一到數(shù)百個核苷酸的探針，然后可用其篩選哺乳動物文庫中的全長GPCR-B3。
還可用抗體作為探針從表達文庫中分離編碼GPCR-B3的核酸?？捎肧EQ IDNO:1-3的序列來產(chǎn)生這類多克隆和單克隆抗體。
可用GPCR-B3核酸探針和寡核苷酸在嚴格條件下，通過篩選文庫來分離與GPCR-B3基本相同的GPCR-B3多態(tài)變體、等位基因和種間同系物。另外，可用表達文庫通過檢測表達的同系物(其能和針對GPCR-B3制備的抗血清或純化的抗體(它們也識別并與GPCR-B3同系物選擇性結(jié)合)起免疫反應(yīng))，來克隆GPCR-B3和GPCR-B3多態(tài)變體、等位基因和種間同系物。
為了制備cDNA文庫，應(yīng)選擇富含GPCR-B3 mRNA的來源，如舌組織或分離的味蕾。然后用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA變成cDNA，連接入重組載體，轉(zhuǎn)染入重組宿主來增殖、篩選并克隆。制備和篩選cDNA的方法是熟知的(見例如，Gubler &Hoffmann，基因25:263-269(1983)；Sambrook等，見上；Ausubel等，見上)。
對于基因組文庫，從組織中抽提DNA，機械剪切或用酶消化，得到約12-20kb的片段。然后用梯度離心將該片段與不需要的片段分開，構(gòu)建入λ噬菌體載體。體外包裝這些載體和噬菌體。用Benton & Davis，科學196:180-182(1977)所述的噬斑雜交分析重組噬菌體。如Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72:3961-3965(1975)中所述進行集落雜交。
另一種分離GPCR-B3核酸及其同系物的方法，聯(lián)合使用合成的寡核苷酸引物和RNA或DNA模板擴增(見美國專利4,683,195和4,683,202；PCR方法方法和應(yīng)用指南(Innis等編，1990))?？捎镁酆厦告準椒磻?yīng)(PCR)和連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)直接從mRNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫擴增GPCR-B3的核酸序列?？稍O(shè)計簡并寡核苷酸用本文提供的序列擴增GPCR-B3的同系物?？蓪⑾拗菩詢?nèi)切酶位點摻入引物，聚合酶鏈式反應(yīng)或其它體外擴增的方法也可用來，例如，克隆編碼待表達蛋白質(zhì)的核酸序列，來制備核酸，用作檢測生理學樣品中編碼GPCR-B3的mRNA的存在與否，用于核酸測序或其它目的。可從瓊脂糖凝膠中純化PCR反應(yīng)擴增的基因，并克隆入合適的載體。
還可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如反轉(zhuǎn)錄和mRNA擴增，總RNA或poly A+RNA分離，RNA印跡法、斑點印跡法、原位雜交、RNase保護、探測DNA微芯片陣列等，來分析GPCR-B3基因的表達。在一個實施例中，用高密度寡核苷酸分析技術(shù)(如GeneChipTM)來鑒定本發(fā)明GPCR的同系物和多態(tài)變體。就被鑒定的同系物與已知疾病的聯(lián)系而言，可用它們和GeneChipTM作為診斷工具，來檢測生物學樣品中的疾病，見例如，Gunthand等，AIDS研究，人逆轉(zhuǎn)錄病毒14:869-876(1998)；Kozal等，天然藥物2:753-759(1996)；Matson等，生物化學年鑒224:110-106(1995)；Lockhart等，天然生物技術(shù)14:1675-1680(1996)；Gingeras等，基因組研究8:435-448(1998)；Hacia等，核酸研究26:3865-3866(1988)。
可用合成的寡核苷酸構(gòu)建重組GPCR-B3基因，用作探針或表達蛋白質(zhì)。用一系列重疊寡核苷酸，一般長40-120bp，代表基因的有義和反義鏈來進行該方法。然后將這些DNA片段退火、連接并克隆。另外，可用擴增技術(shù)和精密引物來擴增GPCR-B3核酸的特定亞序列。然后將該特異性亞序列連接入表達載體。
通常在轉(zhuǎn)化入原核或真核細胞中，用于復(fù)制和/或表達前，將編碼GPCR-B3的核酸克隆入中間載體。這些中間載體通常是原核載體，如質(zhì)?；虼┧筝d體。
可任選的，根據(jù)標準技術(shù)制備編碼含有GPCR-B3或其功能域的嵌合蛋白質(zhì)的核酸。例如，可將配體結(jié)合域等功能域、胞外功能域、跨膜功能域(如含有7個跨膜區(qū)域和對應(yīng)的胞外和胞質(zhì)環(huán))、跨膜功能域和細胞質(zhì)功能域、活性位點、亞基結(jié)合區(qū)域等與異源蛋白質(zhì)共價連接。例如，可將胞外功能域與異源GPCR跨膜功能域連接，或異源GPCR胞外功能域可與跨膜功能域連接。其它所選異源蛋白質(zhì)包括例如，綠色熒光蛋白質(zhì)，β-半乳糖苷酶、谷氨酸受體和視紫紅質(zhì)前序列。
C．原核細胞和真核細胞中的表達為了獲得一克隆的基因或核苷酸，如編碼GPCR-B3的cDNA的高水平表達，通常將GPCR-B3亞克隆入含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，和(如果核酸編碼蛋白)引發(fā)翻譯的核糖體結(jié)合位點的表達載體。合適的細菌啟動子是本領(lǐng)域熟知的，而且在Sambrook等和Ausubel等中有所描述。表達GPCR-B3蛋白質(zhì)的細菌表達系統(tǒng)是在如大腸桿菌，芽胞桿菌亞種和沙門氏菌中可得到的(Palva等，基因22:229-235(1983)；Mosbach等，自然302:543-545(1983))。這些表達系統(tǒng)的試劑盒是可商業(yè)購得的。哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，而且也可商業(yè)購得。在一個實施例中，真核表達載體是腺病毒載體，一種腺伴隨病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
用來指導(dǎo)異源核酸表達的啟動子由特定用途決定?？蓪幼又糜诰嚯x異源轉(zhuǎn)錄起始位點與離其天然位置中轉(zhuǎn)錄起始位點相同部位。然而如本領(lǐng)域已知，該距離可容納一些變化，而啟動子功能不喪失。
除了啟動子，通常表達載體還含有一種轉(zhuǎn)錄單元或表達盒，其含有編碼GPCR-B3的核酸在宿主細胞中表達所需的所有其它元件。因此，典型的表達盒含有與編碼GPCR-B3的核酸序列可操縱性連接的啟動子，和轉(zhuǎn)錄物有效聚腺苷酸化，核糖體結(jié)合位點，和翻譯終止所需的信號。編碼GPCR-B3的核酸序列通常與可切割信號肽序列連接，以促進轉(zhuǎn)化細胞分泌編碼蛋白質(zhì)。這些信號肽將包括組織纖維蛋白溶酶原激活物、胰島素和神經(jīng)生長因子、和煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)的保幼激素酯酶的信號肽。其它盒元件可包括增強子，和(如果用基因組DNA作為結(jié)構(gòu)基因)，帶有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。
除了啟動子序列，表達盒還應(yīng)含有在結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以提供有效終止?？蓮膯幼有蛄械南嗤蚧驈牟煌颢@得該終止區(qū)。
用來將遺傳信息轉(zhuǎn)運入細胞的特定表達載體不是特別關(guān)鍵的?？捎萌魏斡糜谠谡婧嘶蛟思毎斜磉_的常規(guī)載體。標準的細菌表達載體包括質(zhì)粒，如pBR322為基礎(chǔ)的質(zhì)粒、pSKF、pET23D和融合表達系統(tǒng)，如GST和LacZ。還可將表位標記加到重組蛋白質(zhì)中，以提供便利的分離方法，如c-myc。
通常在真核表達載體，如SV40載體、乳頭瘤病毒載體，和衍生自Epstein-Barr病毒的載體中使用真核病毒的，含有調(diào)控元件的表達載體。其它示范性真核載體包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE、和其它使蛋白質(zhì)在SV40早啟動子、SV40晚啟動子、金屬硫蛋白啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、Rous肉瘤病毒啟動子、多角體啟動子或其它在真核細胞中顯示表達效果的啟動子的指導(dǎo)下，使蛋白表達的載體。
某些表達系統(tǒng)含有提供基因擴增的標記，如胸腺嘧啶激酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶和二氫葉酸還原酶。另外，與基因擴增無關(guān)的高產(chǎn)量表達系統(tǒng)也是適合的，如在昆蟲細胞中使用桿狀病毒載體，和在多角體啟動子或其它強桿狀病毒啟動子指導(dǎo)下的編碼GPCR-B3的序列。
通常包含于表達載體中的元件還包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制子、能選擇含有重組質(zhì)粒的細菌的編碼抗生素抗性的基因、和質(zhì)粒非必需區(qū)中能插入真核序列的獨特限制性位點。所選的特定抗生素抗性基因不是關(guān)鍵的，許多本領(lǐng)域已知的抗性基因中的任一種都是適合的。可選擇原核序列，如需要，使它們不干涉DNA在真核細胞中的復(fù)制。
用標準轉(zhuǎn)染方法來產(chǎn)生表達大量GPCR-B3蛋白質(zhì)(其然后可用標準技術(shù)純化)的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系(見例如，Colley等，生物化學雜志，264:17619-17622(1989)；酶學方法中的蛋白質(zhì)純化指南，182卷(Deutscher編，1990))。根據(jù)標準技術(shù)進行真核和原核細胞的轉(zhuǎn)化(見例如，Morrison，細菌雜志132:349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，酶學方法101:347-362(Wu等編，1983))。
可使用任何將外源核苷酸引入宿主細胞的熟知程序。這些包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、Polybrene，原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、顯微注射、血漿載體、病毒載體和其它用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳材料引入宿主細胞的熟知方法(見例如，Sambrook等，見上)。只是需要所用的特定基因工程程序能將至少一個基因成功引入能表達GPCR-B3的宿主細胞。
表達載體被引入細胞后，在適合表達GPCR-B3的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞，用下文所述的標準技術(shù)從培養(yǎng)物中回收GPCR-B3。
Ⅳ．GPCR-B3的純化可純化天然存在或重組的GPCR-B3，用于功能性試驗?？扇芜x的，純化重組GPCR-B3。從哺乳動物組織，如舌組織，或其它GPCR-B3同系物來源中純化天然存在的GPCR-B3。從任何合適細菌或真核表達系統(tǒng)，如CHO細胞或昆蟲細胞中純化重組GPCR-B3。
可將GPCR-B3用標準技術(shù)，包括用硫酸銨等物質(zhì)選擇性沉淀；柱層析；免疫純化方法等純化至基本純(見例如，Scopes，蛋白質(zhì)純化原理和實踐(1982)；美國專利號4,673,641；Ausubel等，見上；和Sambrook，見上)。
當純化重組GPCR-B3時，可使用許多程序。例如，可將具有分子粘合性能的蛋白質(zhì)與GPCR-B3可逆融合。用合適配體，可將GPCR-B3選擇性吸附于純化柱，然后以相對純的形式從柱上脫離。然后可用酶作用除去融合的蛋白質(zhì)。最后可用免疫親和柱純化GPCR-B3。
A．從重組細胞中純化GPCR-B3通常在啟動子誘導(dǎo)后，用轉(zhuǎn)化的細菌或真核細胞，如CHO細胞或昆蟲細胞大量表達重組蛋白質(zhì)；但表達可以是組成性的。用IPTG啟動子誘導(dǎo)是可誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)的一個例子。按本領(lǐng)域標準程序培養(yǎng)細胞。用新鮮或凍結(jié)的細胞分離蛋白質(zhì)。
在細菌中表達的蛋白可能形成可溶性積聚物(“包含體”)。幾種方案適用于純化GPCR-B3包含體。例如，包含體的純化包括破壞細菌細胞，如通過在50mMTRIS/HCl pH 7.5,50mM NaCl,5mM MgCl2,1mM DTT,0.1mM ATP，和1mM PMSF的緩沖液中培育，抽提、分離和/或純化包含體?？赏ㄟ^弗氏壓碎器2-3次，裂解細胞懸液，用Polyton(Brinkman Instruments)或冰上超聲進行勻漿。其它裂解細菌的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的(見例如，Sambrook等，見上；Ausubel等，見上)。
如需要，溶解包含體，通常離心裂解的細胞懸液，來除去不需要的不溶物。形成包含體的蛋白質(zhì)可用兼容緩沖液稀釋或透析復(fù)性。合適的溶劑包括但不限于尿素(約4M-8M)、甲酰胺(至少約80％體積/體積成分)和胍基鹽酸(約4M-8M)。能溶解形成的積聚蛋白質(zhì)的某些溶劑，如SDS(十二烷基磺酸鈉)，70％甲酸在該程序中由于可能使蛋白質(zhì)不可逆變性而伴有免疫原性和/或活性的缺乏，所以是不適合用于該程序的。雖然鹽酸胍和相似的試劑是變性劑，但該變性不是不可逆的，而且可在除去(例如通過透析)或稀釋變性劑后復(fù)性，重新形成免疫原性和/或生物學活性的蛋白質(zhì)。其它合適的緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？蓮钠渌毦鞍踪|(zhì)中，通過標準分離技術(shù)，如Ni-NTA瓊脂糖樹脂分離GPCR-B3。
另外，可從細菌周質(zhì)中純化GPCR-B3。細菌裂解后，當GPCR-B3被輸入到細菌周質(zhì)中時，可通過冷低滲休克和其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)來分離細菌的周質(zhì)組分。為了從周質(zhì)中分離重組蛋白質(zhì)，離心細菌細胞，形成沉淀。將沉淀重新懸浮在含有20％蔗糖的緩沖液中。為了裂解細胞，離心細菌，將沉淀重新懸浮在冰冷的5mM MgSO4中，保存在冰浴中約10分鐘。離心細胞懸液，倒出上清液并保存?？蓮乃拗鞯鞍踪|(zhì)中通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準分離技術(shù)分離出上清液中的重組蛋白質(zhì)。
B．純化GPCR-B3的標準蛋白質(zhì)分離技術(shù)溶解度分級通常作為起始步驟，尤其如果蛋白質(zhì)混合物是復(fù)雜的，初步鹽分級可從感興趣的重組蛋白中分離除去許多不需要的宿主細胞蛋白質(zhì)(或衍生自細胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì))。在一個實施例中，該鹽是硫酸銨。硫酸銨通過有效減少蛋白質(zhì)混合物中的水量來沉淀蛋白質(zhì)。然后依據(jù)其溶解度沉淀蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的疏水性越強，它就更可能在較低的硫酸鹽濃度下沉淀出來。典型的方案包括在蛋白質(zhì)溶液中加入飽和硫酸銨，從而使得到的硫酸銨濃度在20-30％之間。該濃度將沉淀最疏水的蛋白質(zhì)。然后丟棄沉淀物(除非感興趣的蛋白質(zhì)是疏水的)，在上清液中加入硫酸銨，至能沉淀感興趣的蛋白質(zhì)的濃度。然后將沉淀溶于緩沖液，如需要，通過透析或滲濾除去過量的鹽。其它依靠蛋白質(zhì)溶解度的方法，如冷乙醇沉淀，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可用于級分復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。
大小差異性過濾可利用GPCR-B3的分子量從更大或更小尺寸的蛋白質(zhì)中，通過不同孔徑的膜(例如Amicon或Millipore膜)超過濾分離該蛋白質(zhì)。作為第一步，通過孔徑能截斷比感興趣的蛋白質(zhì)分子量小的膜超濾該蛋白質(zhì)混合物。然后通過孔徑能截斷比感興趣的蛋白質(zhì)分子量大的膜超濾上次超濾的保留物。重組蛋白質(zhì)將穿過膜進入濾液。然后可如下層析濾液。
柱層析可從其它蛋白質(zhì)中，依據(jù)其大小、凈表面電荷、疏水性、和對配體的親和性分離GPCR-B3。另外，可將針對蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體與柱基質(zhì)偶聯(lián)，免疫純化該蛋白質(zhì)。所有這些方法都是本領(lǐng)域熟知的。技術(shù)人員清楚的是，可以任何規(guī)模，使用許多不同廠商(如Pharmacia Biotech)的器具進行層析技術(shù)。
Ⅴ．GPCR-B3的免疫學檢測除了用核酸雜交技術(shù)檢測GPCR-B3基因和基因表達，還可用免疫試驗法來檢測GPCR-B3，如鑒定味覺受體細胞和GPCR-B3變體?？捎妹庖咴囼瀬矶ㄐ曰蚨糠治鯣PCR-B3?？墒褂玫募夹g(shù)的綜述可見Harlow & Lane，抗體實驗手冊(1988)。
A．GPCR-B3的抗體產(chǎn)生與GPCR-B3特異性反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見例如，Coligan，免疫學現(xiàn)有方法(1991)；Harlow & Lane，見上；和Kohler & Milstein，自然256:495-497(1975))。這些技術(shù)包括從噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫選擇抗體，以及免疫家兔或小鼠制備多克隆和單克隆抗體，來制備抗體(見例如Huse等，科學246:1275-1281(1989)；Ward等，自然341:544-546(1989))。
可用許多含有GPCR-B3的免疫原來產(chǎn)生與GPCR-B3特異性反應(yīng)的抗體。例如，如本文所述分離了重組GPCR-B3或其抗原性片段?？扇缟纤鲈谡婧思毎蛟思毎斜磉_重組蛋白質(zhì)，并如上所述純化。重組蛋白質(zhì)是用于產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體的免疫原的例子。另外，衍生自本文公開的序列，并與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的合成肽可用作免疫原。還可使用天然存在的蛋白質(zhì)，無論純或不純的形式。然后將產(chǎn)物注射入能嚴生抗體的動物?？僧a(chǎn)生單克隆或多克隆的抗體，隨后用于免疫試驗，以測定該蛋白質(zhì)。
產(chǎn)生多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用蛋白質(zhì)和一種標準佐劑，如Freund’s佐劑，和標準免疫方案免疫近交系小鼠(如BALB/C小鼠)或家兔。抽取測試血樣，并測定對GPCR-B3的反應(yīng)性滴度，監(jiān)測動物對免疫原制備物的免疫應(yīng)答。當獲得對免疫原的合適的抗體高滴度時，從動物收集血液，并制備抗血清。如需要，可進一步級分該抗血清，來濃縮與該蛋白質(zhì)起反應(yīng)的抗體(見Harlow& Lane，見上)。
可通過各種與本領(lǐng)域技術(shù)人員相似的技術(shù)獲得單克隆抗體。簡單說，無限增殖用所需抗原免疫的動物脾細胞(常通過與骨髓瘤細胞融合)(見Kohler &Milstein，歐洲免疫學雜志6:511-519(1976))。其它無限增殖的方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化或其它本領(lǐng)域熟知的方法。篩選從單個無限增殖細胞產(chǎn)生的集落，以產(chǎn)生對抗原具有所需特異性和親和性的抗體，而且這些細胞產(chǎn)生的單克隆抗體產(chǎn)量可用各種技術(shù)增強，包括注射入脊椎動物宿主的腹腔。另外，可根據(jù)Huse等，科學246:1275-1281(1989)描述的通用方法，從人B細胞中篩選DNA文庫，分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
在免疫試驗法，例如免疫原固定在固相載體上的固相免疫試驗法中收集單克隆抗體體和多克隆血清，滴定其對免疫原蛋白質(zhì)的滴度。通常，選擇滴度為104或更大的多克隆抗血清，并使用競爭性結(jié)合免疫試驗測試其對非GPCR-B3蛋白質(zhì)或其它生物的其它相關(guān)蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體結(jié)合的Kd值一般至少約0.1mM，更常至少約1μM，可任選至少約0.1μM或更大，或可任選0.01μM或更大。
一旦得到GPCR-B3特異性抗體，可通過各種免疫試驗方法檢測GPCR-B3。對于免疫學和免疫試驗程序的綜述，見基礎(chǔ)和臨床免疫學(Stites & Terr編，第7版，1991)。另外，可用數(shù)種配置中的任一種進行本發(fā)明的免疫試驗，在“酶免疫試驗”一節(jié)中廣泛描述(Maggio編，1980)；和Harlow & Lane，見上。
B．免疫結(jié)合試驗可用許多熟知的免疫學結(jié)合試驗來檢測和定量測定GPCR-B3(見例如，美國專利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。對于一般免疫試驗的綜述，也見“細胞生物學方法細胞生物學中的抗體”，37卷(Asai編，1993)；“基礎(chǔ)和臨床免疫學”(Stitier & Terr編，第7版，1991)。免疫學結(jié)合試驗(或免疫試驗)通常使用與所選蛋白質(zhì)或抗原特異性結(jié)合的抗體(就GPCR-B3或其抗原性亞序列而言)?？赏ㄟ^許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，或如上所述的方法產(chǎn)生該抗體(如抗GPCR-B3)。
免疫試驗也常用標記試劑，來特異性結(jié)合或標記抗體和抗原形成的復(fù)合物。標記試劑自身可以是含有抗體/抗原復(fù)合物的分子之一。因此，標記試劑可以是標記的GPCR-B3多肽，或標記的抗GPCR-B3抗體。另外，標記試劑可以是第三種分子，例如第二抗體，其與抗體/GPCR-B3復(fù)合物特異性結(jié)合(第二抗體通常對產(chǎn)生第一抗體的動物的抗體是特異性的)。其它能與免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)合的蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G也可用作標記試劑。這些蛋白質(zhì)顯示對不同動物的免疫球蛋白恒定區(qū)的非免疫性強反應(yīng)性(見例如Kronval等，免疫學雜志111:1401-1406(1973)；Akerstrom等，免疫學雜志135:2589-2542(1985))?？捎每蓹z測分子，如生物素(可與另一種分子特異性結(jié)合，如鏈霉親和素)修飾標記試劑。各種可檢測分子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在試驗中，在各試劑結(jié)合后可能需要培育和/或洗滌步驟。培育步驟可從5秒到數(shù)小時而不同，可任選從約5分鐘到約24小時。然而，培育時間將由試驗方案、抗原、溶液體積、濃度等決定。通常，試驗將在環(huán)境溫度下進行，雖然可在一定溫度范圍內(nèi)進行，如10℃到40℃。
非競爭性試驗檢測樣品中GPCR-B3的免疫試驗可以是競爭性的或非競爭性的。非競爭性免疫試驗是直接測量抗原量的試驗。在一優(yōu)選的“夾心”試驗中，例如抗GPCR-B3抗體可與固相基質(zhì)直接結(jié)合，固定在其上。然后這些固定化抗體可捕獲存在于測試樣品中的GPCR-B3。因此固定的GPCR-B3被標記劑，如帶有標記的第二GPCR-B3抗體結(jié)合。另外，第二抗體可缺少標記，但它可以被標記的第三抗體結(jié)合，該第三抗體對產(chǎn)生第二抗體的動物的抗體是特異性的。第二或第三抗體通常被可檢測分子，如生物素(另一種分子與其特異性結(jié)合，如鏈霉親和素)修飾，來提供可檢測分子。
競爭性試驗在競爭性試驗中，測量已知加入的(外源)GPCR-B3被樣品中存在的未知GPCR-B3從抗GPCR-B3抗體上取代(競爭)的量，來間接測量樣品中存在的GPCR-B3量。在一競爭性試驗中，在一樣品中加入已知量的GPCR-B3，然后使該樣品與特異性結(jié)合GPCR-B3的抗體接觸。與抗體結(jié)合的外源GPCR-B3量和樣品中存在的GPCR-B3濃度成反比。在一實施例中，抗體被固定在固相基質(zhì)上。與抗體結(jié)合的GPCR-B3量可通過測量在GPCR-B3/抗體復(fù)合物中存在的GPCR-B3量，或通過測量剩余未復(fù)合的蛋白質(zhì)量來確定。可提供標記的GPCR-B3分子來檢測GPCR-B3量。
半抗原抑制試驗是另一種競爭性試驗。在該試驗中，將已知的GPCR-B3固定在固相基質(zhì)上。在樣品中加入已知量的抗GPCR-B3抗體，然后使該樣品與固定化的GPCR-B3接觸。與已知固定化GPCR-B3結(jié)合的抗GPCR-B3抗體量，與樣品中存在的GPCR-B3量成反比。另外，可通過檢測抗體的固定化組分或剩余在溶液中的抗體組分來檢測固定化抗體的量?？贵w被標記時，檢測可以是直接的，或隨后加入與上述抗體特異性結(jié)合的分子間接檢測。
交叉反應(yīng)性決定簇還可將競爭性結(jié)合形式中的免疫試驗用于交叉反應(yīng)性決定簇。例如，可將至少部分由SEQ ID NO:1-3編碼的蛋白質(zhì)固定在固相載體上。在試驗中加入與固定化抗原競爭結(jié)合抗血清的蛋白質(zhì)(如GPCR-B3蛋白質(zhì)和同源物)。比較加入的蛋白質(zhì)與固定的蛋白質(zhì)競爭結(jié)合抗血清的能力與SEQ ID NO:1-3編碼的GPCR-B3與其自身競爭的能力。使用標準算法計算上述蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)性百分數(shù)。選擇并合并與各種上述加入的蛋白質(zhì)具有小于10％的交叉反應(yīng)性的抗血清?？扇芜x的通過加入所考慮的蛋白質(zhì)(如遠親同系物)，來免疫吸附，以除去合并抗血清中的交叉反應(yīng)抗體。
然后將免疫吸附的合并抗血清用于上述競爭性結(jié)合免疫試驗，來比較第二蛋白質(zhì)(考慮其可能是GPCR-B3的等位或多態(tài)變體)和免疫原蛋白質(zhì)(即SEQ IDNO:1-3的GPCR-B3)。為了進行該比較，以廣泛濃度各檢測了兩種蛋白質(zhì)，并確定抑制50％抗血清與固定化蛋白質(zhì)結(jié)合所需的各蛋白質(zhì)量。如果抑制50％結(jié)合所需的第二種蛋白質(zhì)的量比SEQ ID NO:1-3編碼的蛋白質(zhì)抑制50％結(jié)合所需的量少10倍，則說第二種蛋白質(zhì)能與針對GPCR-B3免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合。
其它試驗用蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)分析檢測并定量樣品中GPCR-B3的存在。該技術(shù)一般包括用凝膠電泳根據(jù)分子量分離樣品蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適固相載體(如硝酸纖維素濾膜、尼龍濾膜、或衍生的尼龍濾膜)上，并培育樣品和與GPCR-B3特異性結(jié)合的抗體。抗GPCR-B3抗體與固相載體上的GPCR-B3特異性結(jié)合。這些抗體可直接標記或隨后用標記抗體(如標記的綿羊抗小鼠抗體，其與抗GPCR-B3抗體特異性結(jié)合)檢測。
其它試驗包括脂質(zhì)體免疫試驗(LIA)，它用設(shè)計的脂質(zhì)體結(jié)合特異性分子(如抗體)，并釋放包裹的試劑或標記物。然后根據(jù)標準技術(shù)檢測釋放的化學物質(zhì)(見Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.5:34-41(1986))。
非特異性結(jié)合的還原本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，常需要使免疫試驗中非特異性結(jié)合最小化。特別是，當試驗涉及固定在固相基質(zhì)上的抗原或抗體時，需要使與基質(zhì)的非特異性結(jié)合量最小化是理想的。減少這些非特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常該技術(shù)涉及用蛋白質(zhì)組合物包被基質(zhì)。具體說，廣泛使用牛血清清蛋白(BSA)、脫脂粉末狀牛奶和明膠等蛋白質(zhì)組合物，而粉末狀牛奶是最優(yōu)選的。
標記在試驗中使用的特定標記或可檢測基團不是本發(fā)明的關(guān)鍵部分，只要它不顯著影響試驗中使用的抗體的特異性結(jié)合。可檢測基團可以是任何具有可檢測的物理或化學性能的材料。這些可檢測標記已在免疫試驗領(lǐng)域中良好開發(fā)，而且，一般這些方法中的大部分標記都可用于本發(fā)明。因此，標記是分光光度、光化學、生物化學、免疫化學、電子學、光學或化學方法可檢測的任何組合物。本發(fā)明中可用的標記包括磁珠(如DYNABEADTM)、熒光染料(如異硫氰酸熒光素、Texas red、羅丹明等)、放射性標記(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它ELISA中常用的酶)、和顯色標記，如膠體金或著色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)。
根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，可直接或間接將標記與所需試驗成分偶聯(lián)。如上所示，可使用各種各樣的標記，選擇標記由所需靈敏度、和化合物偶聯(lián)的容易度、穩(wěn)定性要求、可得儀器和處理準備而定。
常用間接方法來結(jié)合非放射性標記。通常配體分子(如生物素)與該分子共價結(jié)合。然后該配體與另一種分子(如鏈霉親和素)結(jié)合，另一種分子本身可被檢測或可與一種信號系統(tǒng)，如可檢測的酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物共價結(jié)合。可將配體及其靶與識別GPCR-B3的抗體，或識別抗GPCR-B3的第二抗體適當聯(lián)合使用。
可直接將分子與產(chǎn)生信號的化合物偶聯(lián)，如與酶或熒光蛋白偶聯(lián)。作為標記的感興趣的酶主要是水解酶，特別是磷酸酯酶，酯酶和糖苷酶，氧化物酶(oxidotase)，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光黃及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹(磺)酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光化合物包括熒光素和2,3-二氫酞嗪二酮，如魯米諾。關(guān)于可使用的各種標記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，見美國專利號4,391,904。
檢測標記的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此例如，當標記是放射性標記時，檢測儀器包括閃爍計數(shù)器或放射性自顯影中的照相膠片。當標記是熒光標記時，可用合適波長的光激發(fā)熒光色素，并檢測產(chǎn)生的熒光來檢測。熒光可以目測，通過感光膠片，用電子探測器如電荷偶聯(lián)裝置(CCD)或光電倍增管等。類似的，可提供合適的酶底物并檢測產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物，來檢測酶標記。最后，可觀察與標記相關(guān)的顏色，來簡單檢測顯色標記。因此，在各種測量尺試驗中，偶聯(lián)的金常呈粉紅色，而各種偶聯(lián)的珠呈珠的顏色。
一些試驗不需要使用標記的組分。例如，可用凝集試驗檢測靶抗體的存在。就此而言，抗原包裹的顆粒被含有靶抗體的樣品凝集。在該試驗中，沒有任何成分需要標記，可簡單目測靶抗體的存在。
Ⅵ．GPCR-B3調(diào)節(jié)劑的試驗A．GPCR-B3活性試驗GPCR-B3及其等位和多態(tài)變體是參與味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的G-蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體。可用不同的體外和體內(nèi)試驗評估GPCR-B3多肽的活性，來測定功能、化學和物理作用，如測量配體結(jié)合(如放射性配體結(jié)合)、第二信使(如cAMP、cGMP、IP3、DAG、或Ca2+)、離子流、磷酸化水平、轉(zhuǎn)錄水平、神經(jīng)遞質(zhì)水平等。另外，可用這些試驗檢測GPCR-B3的抑制物和激活物。調(diào)節(jié)劑還可以是GPCR-B3的遺傳改變版本。這些味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)劑可用來按要求改變味覺。
從具有SEQ ID NO:1-3的序列的多肽，或其保守性修飾的變體中選出試驗用的GPCR-B3。另外，試驗用的GPCR-B3可衍生自真核生物，并包括具有氨基酸序列相同性的SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列。一般氨基酸序列相同性是至少70％，可任選至少85％，最優(yōu)選至少90-95％?？扇芜x的，試驗用的多肽可含有GPCR-B3的一個功能域，如胞外功能域、跨膜功能域、細胞質(zhì)功能域、配體結(jié)合功能域、亞基結(jié)合功能域、活化位點等。GPCR-B3或其功能域可與異源蛋白共價連接，產(chǎn)生用于本文所述試驗的嵌合蛋白質(zhì)。
可用上述GPCR-B3多肽，不論是重組的或天然的，測試GPCR-B3的調(diào)節(jié)劑。重組或天然存在的蛋白質(zhì)可以分離，在細胞中表達，在衍生自細胞的膜中表達，在組織或動物中表達。例如，可使用舌切片、從舌上脫下的細胞，轉(zhuǎn)化的細胞或膜……。用本文所述的體外或體內(nèi)試驗之一檢測調(diào)節(jié)?？稍隗w外用可溶性或固態(tài)反應(yīng)，用嵌合分子，如與異源信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域共價連接的受體的胞外功能域，或與受體的跨膜和/或胞質(zhì)功能域共價連接的異源胞外功能域來檢測味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，可在體外可溶性或固態(tài)反應(yīng)中使用感興趣蛋白質(zhì)的配體結(jié)合功能域來測定配體結(jié)合。
可在溶液中、與固相結(jié)合的雙層膜中，脂單層中，或在囊泡中測試與GPCR-B3、功能域或嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的配體。可用例如，分光光度特性的變化(熒光、吸光度、折射指數(shù))水動力學(如形狀)、色譜或溶解特性的變化測試調(diào)節(jié)劑的結(jié)合。
還可檢測受體-G-蛋白相互反應(yīng)。例如，可檢測G蛋白與受體的結(jié)合或其從受體上的釋放。例如，不存在GTP的情況下，活化劑將導(dǎo)致G蛋白(所有三個亞基)與受體形成緊密的復(fù)合物?？捎蒙鲜霾煌椒z測該復(fù)合物?？尚薷倪@些試驗，來搜索抑制劑。在GTP不存在時在受體和G蛋白中加入激活劑，形成緊密復(fù)合物，然后通過觀察受體-G蛋白復(fù)合物的解離來篩選抑制劑。GTP存在下，G蛋白α亞基從其它兩個G蛋白亞基上釋放可作為活化的指標。
活化的或抑制的G蛋白將進而改變靶酶、通道和其它效應(yīng)蛋白的性能。經(jīng)典的例子是在視覺系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)素活化cGMP磷酸二酯酶。刺激性G蛋白活化腺嘌呤核苷酸環(huán)化酶，Gq和其它同源G蛋白對磷脂酶的活化，和Gi與其它G蛋白對多種通道的調(diào)節(jié)。也可檢測下游共有序列，如磷脂酶C產(chǎn)生二酰甘油和IP3，和進而IP3使鈣遷移。
活化的GPCR受體成為激酶的底物，激酶磷酸化受體的C-端尾(以及其它可能的位點)。因此，激活劑將啟動32p從γ-標記的GTP向受體轉(zhuǎn)移，這可用閃爍計數(shù)器測定。C-末端尾的磷酸化將啟動視紫紅質(zhì)抑制蛋白樣蛋白的結(jié)合，并將干擾G-蛋白的結(jié)合。該激酶/視紫紅質(zhì)抑制蛋白通路在許多GPCR受體的脫敏中起了關(guān)鍵作用。例如，調(diào)節(jié)味覺受體保持活化持續(xù)時間的化合物，可被用作延長所需味道或切斷不好味道的工具。關(guān)于GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和檢驗信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法的綜述，見例如，“酶學方法”，237卷和238卷(1994)和96卷(1983)；Bourne等，自然10:349:117-27(1991)；Bourne等，自然348:125-32(1990)；Pitcher等，生物化學年鑒67:653-92(1998)。
將用潛在的GPCR-B3抑制劑或激活劑處理的樣品或試驗，與不含測試化合物的對照樣品比較，來檢測調(diào)節(jié)的程度。對照樣品(未用激活劑或抑制劑)被指定相對GPCR-B3活性值為100。當與對照比較，GPCR-B3活性值是約90％，可任選50％，可任選25-0％時，實現(xiàn)對GPCR-B3的抑制。當GPCR-B3活性值相對于對照是110％，可任選150％，200-500％，或1000-2000％時，實現(xiàn)了對GPCR-B3的活化。
通過測定表達GPCR-B3的細胞或膜的極化(即電勢)的變化，來評估離子流的變化。一種測定細胞極化中的變化的方法是用電壓鉗和膜片鉗技術(shù)，如“細胞結(jié)合”模式，“外翻”模式，和“全細胞”模式測量電流的變化(從而測量極化的變化)(見例如，Ackerman等，新英格蘭醫(yī)學雜志336:1575-1595(1997))。用標準方法可方便的測定全細胞電流(見例如，Hamil等，PFlugers.Archiv.391:85(1981))。其它已知試驗包括放射性標記離子流試驗和使用電壓-敏感性染料的熒光試驗(見例如Vestergarrd-Bogind等，膜生物學雜志88:67-75(1988)；Gonzales & Tsien，化學生物學4:269-277(1997)；Daniel等，藥物學方法雜志25:185-193(1991)；Holevinsky等，膜生物學雜志137:59-70(1994))。一般要測試的化合物存在范圍是1pM到100mM。
可檢測上述任一參數(shù)來測量測試化合物對該多肽功能的作用?？捎萌魏魏线m的影響GPCR活性的生理學變化來評估測試化合物對本發(fā)明多肽的影響。當用完整細胞或動物測定功能性結(jié)果時，還可測量不同作用，如遞質(zhì)釋放、激素釋放、已知的和未確定特征的基因標記物(如RNA印跡)的轉(zhuǎn)錄變化，細胞代謝的變化，如細胞生長或pH的變化，和胞內(nèi)第二信使，如Ca2+、IP3和cAMP的變化。
G蛋白偶聯(lián)受體的試驗包括負載有離子或電壓敏感性染料，能報告受體活性的細胞。測定這些受體活性的試驗還可使用已知的作為陰性或陽性對照的G-蛋白偶聯(lián)受體的刺激劑和拮抗劑，來評估測試化合物的活性。在鑒定調(diào)節(jié)性化合物(如刺激劑、拮抗劑)的試驗中，細胞質(zhì)離子水平或膜電壓的變化將分別用離子敏感性指示劑或膜電壓熒光指示劑監(jiān)測。在可使用的離子敏感性指示劑和電壓探針中，可使用“分子探針1997”目錄中公開的那些。對于G-蛋白偶聯(lián)受體，可在所選試驗中使用混合G-蛋白如Gα15和Gα16(Wilkie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10049-10053(1991))。這些混合G-蛋白能偶聯(lián)大量受體。
受體活化通常引發(fā)隨后的胞內(nèi)活動，如第二信使，如IP3的增加，其釋放胞內(nèi)鈣離子的儲藏。某些G-蛋白偶聯(lián)受體的活化通過磷脂酶C-介導(dǎo)的磷脂酰肌醇的水解，刺激肌醇三磷酸(IP3)的形成(Berridge & Irvine，自然312:315-21(1984))。IP3進而刺激胞內(nèi)鈣離子儲藏的釋放。因此，細胞質(zhì)中鈣離子水平的變化，或第二信使水平，如IP3的變化，可用來評估G-蛋白偶聯(lián)受體的功能。表達這些G-蛋白偶聯(lián)受體的細胞可能是顯示提高的細胞質(zhì)鈣水平，是胞內(nèi)鈣儲藏和離子通道活化產(chǎn)生的結(jié)果，此時雖然不一定要在無鈣緩沖液中進行這種試驗，但理想的是可在任選補充了EGTA等螯合劑的緩沖液中進行這些試驗，來甄別從內(nèi)部儲藏釋放的鈣產(chǎn)生的熒光反應(yīng)。
其它試驗可能涉及測定受體活性，其當被活化時，通過活化或抑制腺苷酸環(huán)化酶等酶，導(dǎo)致胞內(nèi)環(huán)化核苷酸，如cAMP或cGMP水平的變化。存在環(huán)化核苷酸閥門離子通道，如視桿光受體細胞通道和嗅神經(jīng)元通道，它們在與cAMP或cGMP結(jié)合活化后，對陽離子是可通透的(見例如，Altenhofen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9868-9872(1991)和Dhallan等，自然347:184-187(1990))。就受體的活化導(dǎo)致環(huán)化核苷酸水平降低的情況而言，優(yōu)選使細胞暴露于能提高胞內(nèi)環(huán)化核苷酸水平的試劑，如毛喉素，然后在試驗的細胞中加入受體激活化合物。可用編碼環(huán)化核苷酸閥門離子通道、GPCR磷酸酶的DNA和編碼(如某些谷氨酸受體、毒蠅堿性乙酰膽堿受體、多巴胺受體、血清緊張素受體等)受體(當被活化時，導(dǎo)致胞質(zhì)環(huán)化核苷酸水平的變化)的DNA共轉(zhuǎn)染宿主細胞，來制備用于該類試驗的細胞。
在一個實施例中，在具有將受體與磷脂酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑連接的混雜G-蛋白的異源細胞中，表達GPCR-B3，測量了GPCR-B3活性(見Offermanns & Simon，生物化學雜志270:15175-15180(1995))?？扇芜x的細胞系是HEK-293(它不天然表達GPCR-B3)而混雜G-蛋白是Gα15(Offermanns & Simon，見上)。測量胞內(nèi)Ca2+水平的變化(該變化是對給予與GPCR-B3結(jié)合的分子，調(diào)節(jié)了GPCR-B3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的反應(yīng))，以檢測味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。用熒光Ca2+指示染料和熒光顯影任選的測量了Ca2+水平的變化。
在一實施例中，可用免疫試驗測量胞內(nèi)cAMP或cGMP的變化。Offermann &Simon，生物化學雜志270:15175-15180(1995)描述的方法可用來測定cAMP的水平。另外，可用Felley-Bosco等，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.11:159-164(1994)描述的方法測定cGMP的水平。另外，美國專利4,115,538中描述了一種用于測量cAMP和/或cGMP的試劑盒，在此引入以供參考。
在另一個實施例中，可根據(jù)美國專利5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)的水解，在此引入以供參考。簡單說，試驗涉及用3H-肌醇標記細胞48小時或以上。用測試化合物處理細胞1小時。溶解處理的細胞，用氯仿-甲醇-水抽提，然后用離子交換層析分離肌醇磷酸酯，并用閃爍計數(shù)定量。計算促效劑存在時的cpm與緩沖對照cpm的比值，確定刺激倍數(shù)。同樣，計算拮抗劑存在時的cpm與緩沖液對照(可含可不含促效劑)cpm的比值，確定抑制倍數(shù)。
在另一個實施例中，可測量轉(zhuǎn)錄水平，來評估測試化合物對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。使測試化合物與含有感興趣蛋白質(zhì)的宿主細胞接觸足夠時間，來影響任何相互反應(yīng)，然后測量基因表達的水平?？蓱{經(jīng)驗確定影響這種相互反應(yīng)的時間量，如通過運行一段時間并測量作為時間的轉(zhuǎn)錄水平?？捎萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適方法測量轉(zhuǎn)錄量。例如，可用RNA印跡檢測感興趣的蛋白質(zhì)的mRNA表達，或用免疫試驗鑒定其多肽產(chǎn)物。另外，可如美國專利5,436,128描述的那樣，用報道基因進行基于轉(zhuǎn)錄的試驗。報道基因可以是，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲熒光素酶、細菌熒光素酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。另外，可將感興趣的蛋白質(zhì)通過與第二報道子，如綠色熒光蛋白結(jié)合，用作間接報道子(見例如，Mistili & Spector，自然生物技術(shù)15:961-964(1997))。
然后將轉(zhuǎn)錄量與不存在測試化合物的相同細胞中的轉(zhuǎn)錄量作比較，或與缺乏感興趣的蛋白質(zhì)的基本相同的細胞中的轉(zhuǎn)錄量作比較。基本相同的細胞可衍生自這樣的相同細胞，即從它制備了重組細胞但未因引入異源DNA而改變。任何轉(zhuǎn)錄量的差異表明測試化合物以某種方式改變了固相蛋白質(zhì)的活性。
B．調(diào)節(jié)劑測試的作為GPCR-B3調(diào)節(jié)劑的化合物可以是任何小化合物或生物分子，如蛋白質(zhì)、糖、核酸或脂類。另外，調(diào)節(jié)劑可以是GPCR-B3的遺傳學改變形式。通常測試化合物將是小化學分子和肽。實質(zhì)上任何化合物可被用作本發(fā)明試驗潛在的調(diào)節(jié)劑或配體，雖然大多數(shù)化合物可溶于水或有機(尤其是基于DMSO的)溶液。設(shè)計一種試驗，其可通過自動化檢驗步驟，并為試驗提供來源方便的化合物(通常平行進行，如在機器人試驗中的微量滴定板上的微量滴定試驗)，來篩選龐大的化學藥品文庫。可理解，有許多化學藥品供應(yīng)商，包括Sigma(St.Louis,MO)、Aldrich(St.Louis,MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)等。
在一實施例中，高通量篩選方法涉及提供一種含有許多潛在治療化合物(可能的調(diào)節(jié)劑或配體化合物)的組合性化學藥品或肽文庫。然后在一個或多個本文所述的試驗中篩選這些“組合性化學藥品文庫”或“配體文庫”，來鑒定那些顯示理想特征活性的文庫成員(具體化學藥品種類或亞類)。如此鑒定的化合物可作為常規(guī)“前導(dǎo)化合物”或本身能作為潛在的或?qū)嶋H的治療劑。
組合性化學藥品文庫是由化學合成或生物學合成，通過組合許多化學“建筑構(gòu)件”如試劑，產(chǎn)生的多樣化合物的集合。例如，線性組合性化學藥品文庫，如多肽文庫是通過以各種可能方式針對給定化合物長度(即多肽化合物中的氨基酸數(shù))組合一組化學建筑構(gòu)件(氨基酸)形成的?？赏ㄟ^這種化學建筑構(gòu)件的組合性混合合成數(shù)以百萬計的化合物。
制備和篩選組合性化學藥品文庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些組合性化學藥品文庫包括但不限于肽文庫(見例如，美國專利5,010,175,Furka,Int.T.Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)和Houghton等，自然354:84-88(1991))。也可采用其它產(chǎn)生化學多樣性文庫的化學。這些化學包括但不限于肽(如PCT出版號WO91/19735)、編碼的肽(如PCT出版號WO93/20242)、隨機生物寡聚物(如PCT出版號WO92/00091)、苯并二吖庚因(如美國專利號5,288,514)、多樣體(diversome)如乙內(nèi)酰脲、苯并二吖庚因和二肽(Hobbs等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909-6913(1993))、乙烯基類多肽(Hagihara等，美國化學協(xié)會雜志114:6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽肽模擬物(Hirschmann等，美國化學協(xié)會雜志114:9217-9218(1992))、小化合物文庫的類似有機合成(Chan等，美國化學協(xié)會雜志116:2661(1994))、寡氨基甲酸鹽(Cho等，科學261:1303(1993))，和/或肽基磷酸酯(Campbell等，有機化學雜志59:658(1994))、核酸文庫(見Ausubel Berger和Sambrook，同上)、肽核酸文庫(見專利5,539,083)、抗體文庫(見例如Vaughn等，自然生物技術(shù)，14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖類文庫(見例如Liang等，科學274:1520-1522(1996)和美國專利5,593,853)、小有機分子文庫(見例如苯并二吖庚因，Baum C & EN,an18,33頁(1993)；異戊二烯化合物，美國專利5,569,588；噻唑啉酮和間噻唑酮，美國專利5,549,974；吡咯啉酮，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利5,506,337；苯并二吖庚因，5,288,514等)。
制備組合文庫的裝置是可商業(yè)購得的(見例如，357MPS,390MPS,AdvancedChem Tech,Louisville KY,Symphony,Rainin,Woburn,MA,433A AppliedBiosystems,Foster City,CA,9050 Plus,Millipore,Bedford,MA)。另外，許多組合文庫自身是可商業(yè)購得的(見例如，ComGenex,Princeton,N.J.Tripos,Inc.,St.Louis,MO,3D Pharmaceuticals,Exton,PA,Martek Biosciences,Columbia,MD，等)。
C．固態(tài)和可溶性高通量試驗在一個優(yōu)選例中本發(fā)明提供了的可溶性試驗采用分子，如功能域，配體結(jié)合功能域、胞外功能域、跨膜功能域(如含有含有7個跨膜區(qū)和胞質(zhì)環(huán))，跨膜功能域和胞質(zhì)功能域、活化位點、亞基結(jié)合區(qū)等；與異源蛋白質(zhì)共價連接，形成嵌合分子的功能域；GPCR-B3；表達天然存在或重組GPCR-B3的細胞或組織。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了基于體外試驗的高通量形式的固相，其中功能域、嵌合分子、GPCR-B3或表達GPCR-B3的細胞或組織與固相底物結(jié)合。
在本發(fā)明的高通量試驗中，可能在一天中篩選上千種不同的調(diào)節(jié)劑或配體。具體說，可用微量滴定板的各孔進行針對所選潛在調(diào)節(jié)劑的獨立試驗，或如果要觀察濃度或培育時間的作用，每5-10個孔可測試一個調(diào)節(jié)劑。因此，一個標準微量滴定板可檢驗約100(如96)種調(diào)節(jié)劑。如果使用1536孔板，則一塊板可容易的檢驗從約100-1500種不同化合物。每天檢驗幾塊不同的板是可能的；用本發(fā)明的整合系統(tǒng)試驗篩選約6000-20,000種不同化合物是可能的。最近，已由例如Caliper Technologies(Palo alto,CA)開發(fā)了試劑操縱的微流體方法。
可將感興趣的分子與固態(tài)組分直接或間接通過共價或非共價鍵，如通過標記結(jié)合。標記可以是不同組分的任一種。一般與標記結(jié)合(標記粘合劑)的分子固定于固相載體，而感興趣的加標記的分子(如感興趣的味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)分子)通過標記和標記粘合劑的相互作用結(jié)合于固相載體。
可采用許多標記和標記粘合劑，可根據(jù)文獻中詳述的已知分子的相互作用。例如，當標記是天然粘合劑，如生物素、蛋白A、蛋白G時，可與合適的標記粘合劑聯(lián)用(親和素、鏈霉親和素、中性親和素(neotravidin)、免疫球蛋白的Fc區(qū)等)。具有天然粘合劑如生物素的分子的抗體也是廣泛可得的；合適的標記粘合劑，見SIGMA immunochemicals 1998 catagolue SIGMA,St.Louis MO)。
類似的，可聯(lián)合合適的抗體使用任何半抗原或抗原化合物形成標記/標記粘合劑對。數(shù)以千計的特異性抗體是商品可購得的，而且許多其它抗體在文獻中有所描述。例如，在一種常用配置中，標記是第一抗體，而標記結(jié)合劑是第二抗體，它識別第一抗體。除了抗體-抗原相互作用外，受體-配體相互作用也適合作為標記和標記-結(jié)合劑配對。例如，細胞膜受體促效劑和拮抗劑(如細胞受體-配體相互作用，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白細胞介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整合素家族、選擇素家族等；見如Pigott & Power，結(jié)合分子調(diào)查書I(1993))。類似的，毒素和毒物、病毒表位、激素(如鴉片制劑、類固醇等)、胞內(nèi)受體(如介導(dǎo)各種小配體，包括類固醇、甲狀腺激素、類視色素和維生素D；肽的作用)、藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環(huán)化聚合物構(gòu)象的)、寡糖、蛋白質(zhì)、磷脂和抗體都可與不同細胞受體相互作用。
合成聚合物，如聚氨基甲酸乙酯、聚酯、聚羧酸、聚脲、聚酰胺、聚乙亞胺、聚硫化丙烯、聚硅氧烷、聚亞酰胺和聚乙酸酯也可形成合適的標記或標記結(jié)合劑。許多其它標記/標記結(jié)合劑配對在本文描述的試驗系統(tǒng)中也是有用的，而且對于技術(shù)人員參考本公開后將是清楚的。
常用接頭如肽、聚酯等也可作為標記，并包括多肽序列，如約5-200個氨基酸之間的聚甘氨酸序列。這些柔性接頭對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，聚(乙二醇)接頭可得自Shearwater Polymers,Inc.Huntsville,Alabama。這些接頭可任選具有酰胺鍵、巰基鍵、或雜官能鍵。
使用任何現(xiàn)有的不同方法將標記結(jié)合劑固定在固相基質(zhì)上。通過將全部或部分基質(zhì)與一化學試劑(該試劑能將與標記結(jié)合劑的部分反應(yīng)的化學基團固定到表面上)接觸，衍生或官能化固相基質(zhì)。例如，適合與較長鏈部分結(jié)合的基團包括胺、羥基、巰基和羧基?？捎冒蓖榛柰楹土u烷基硅烷官能化各種表面，如玻璃表面。這些固相生物聚合物陣列的構(gòu)建在文獻中被詳細描述。見例如，Merrifield，美國化學協(xié)會雜志85:2149-2154(1963)(描述了肽的固相合成)；Geysen等，免疫學方法雜志102:259-274(1987)(描述了固相組分在針上的合成)；Frank & Doring，四面體44:60316040(1988)(描述了不同肽序列在纖維素盤上的合成)；Fodor等，科學，251:767-777(1991)；Sheldon等，臨床化學39(4):718-719(1993)；和Kozal等，天然醫(yī)藥2(7):753759(1996)(全都描述了固定在固相基質(zhì)上的生物聚合物陣列)。用于將標記結(jié)合劑固定在基質(zhì)上的非化學方法包括其它常用方法，如加熱、UV輻照交聯(lián)等。
D．基于計算機的試驗還有另一種研究調(diào)節(jié)GPCR-B3活性的化合物的試驗涉及計算機輔助藥物設(shè)計，其中使用計算機系統(tǒng)來產(chǎn)生GPCR-B3的三維結(jié)構(gòu)，根據(jù)其氨基酸序列編碼的結(jié)構(gòu)信息。輸入的氨基酸序列直接和活躍的與計算機程序中預(yù)先設(shè)定的算法相互作用，得到蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)模型。然后檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，來鑒定具有結(jié)合例如配體的能力的結(jié)構(gòu)區(qū)域。然后用這些區(qū)域鑒定與該蛋白質(zhì)結(jié)合的配體。
將至少10個氨基酸殘基的序列或編碼GPCR-B3多肽的相應(yīng)核酸序列輸入計算機系統(tǒng)，產(chǎn)生了該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。從含有SEQ ID NO:1-3，或SEQ IDNO:4-6，及其保守修飾形式選出編碼多肽的核酸或多肽的氨基酸序列。氨基酸序列代表該蛋白質(zhì)的初級序列或亞序列，其編碼該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。用計算機鍵盤將該氨基酸序列(或編碼10個氨基酸的核苷酸序列)的至少10個殘基輸入計算機系統(tǒng)，計算機可讀底物包括但不限于電子儲存媒體(如磁盤、磁帶、盒式磁盤和芯片)，光學媒介(如CD ROM)，因特網(wǎng)站點散布的信息，和RAM。然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的軟件從氨基酸序列和計算機系統(tǒng)的相互作用產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。
氨基酸序列代表編碼形成感興趣的蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)所需的信息的初級結(jié)構(gòu)。軟件觀察某些一級結(jié)構(gòu)編碼的參數(shù)來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)模型。這些參數(shù)被稱為“能量條款”，主要包括靜電電勢、疏水性能、溶劑可接近表面和氫鍵、二級能量條款包括范德華力。生物分子形成以累計形式使能量條款最小化的結(jié)構(gòu)。因此，計算機程序用這些一級結(jié)構(gòu)或氨基酸序列編碼的條件建立二級結(jié)構(gòu)模型。
然后根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的能量條款，形成二級結(jié)構(gòu)編碼的蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。在此時用戶可輸入其它變量，如是否蛋白質(zhì)是膜結(jié)合的或可溶的，它在體內(nèi)的位置，及其細胞位置，如細胞質(zhì)、表面或核。用這些變量和二級結(jié)構(gòu)的能量條款形成三級結(jié)構(gòu)的模型。在三級結(jié)構(gòu)建模中，計算機程序使二級結(jié)構(gòu)的疏水表面和類似的匹配，使二級結(jié)構(gòu)的親水表面和類似的匹配。
一旦結(jié)構(gòu)已產(chǎn)生，用計算機系統(tǒng)鑒定可能的配體結(jié)合區(qū)域。如上所述輸入氨基酸或核苷酸序列，或化合物的化學式，產(chǎn)生可能的配體的三維結(jié)構(gòu)。然后將該可能的配體的三維結(jié)構(gòu)與GPCR-B3蛋白的結(jié)構(gòu)比較，來鑒定與GPCR-B3結(jié)合的配體。用能量條款確定蛋白質(zhì)和配體之間的結(jié)合親和力，來確定哪些配體具有增強的結(jié)合該蛋白質(zhì)的可能性。
還可用計算機系統(tǒng)篩選GPCR-B3基因的突變、多態(tài)變體、等位基因和種間同系物。可將這些突變與疾病情況或基因性狀相聯(lián)系。如上所述，可用GeneChipTM和相關(guān)技術(shù)篩選突變、多態(tài)變體、等位基因和種間同系物。一旦鑒定到了變體，可用診斷試驗來鑒定具有這些突變基因的病人。突變的GPCR-B3基因的鑒定涉及接受輸入編碼GPCR-B3的第一核酸或氨基酸序列(選自SEQ ID NO:1-3，或SEQ IDNO:4-6及其保守修飾形式)。如上所述將該序列輸入計算機系統(tǒng)。然后將第一核酸或氨基酸序列與第二核酸或氨基酸序列(與第一序列基本相同)比較。將第二序列以上述方式輸入計算機系統(tǒng)。一旦比較第一和第二序列，鑒定了序列之間的核苷酸或氨基酸差異。這些序列可代表GPCR-B3基因中的等位基因差異，和與疾病狀態(tài)和基因性狀有關(guān)的突變。
Ⅷ．試劑盒GPCR-B3及其同系物是鑒定味覺受體細胞，法醫(yī)學和親子鑒定，和測定味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)的有用工具。用與GPCR-B3核酸特異性雜交的GPCR-B3特異性試劑，如GPCR-B3探針和引物，和與GPCR-B3蛋白質(zhì)特異性結(jié)合GPCR-B3抗體等GPCR-B3特異性試劑，檢測味覺細胞表達和味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。
檢測樣品中GPCR-B3 DNA和RNA的存在的核酸試驗包括許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，如DNA分析、RNA分析、斑點印跡、RNase保護、S1分析、擴增技術(shù)，如PCR和LCR，和原位雜交。例如在原位雜交中，靶核酸是從其細胞周質(zhì)中釋放出來的，從而能在細胞內(nèi)雜交，而同時保存細胞形態(tài)，利于隨后翻譯和分析。下列文章提供了對原位雜交技術(shù)的縱覽Singer等，生物技術(shù)4:230-250(1986)；Haase等，病毒學方法，Ⅶ卷，189-226(1984)；和核酸雜交實踐方法(Hames等編，1987)。另外，可用上述各種免疫試驗技術(shù)檢測GPCR-B3蛋白質(zhì)。通常將測試樣品同時與陽性對照(如表達重組GPCR-B3的樣品)和陰性對照比較。
本發(fā)明還提供了試劑盒，來篩選GPCR-B3調(diào)節(jié)劑。可從易得的材料和試劑制備這些試劑盒。例如，這些試劑盒可包含下列任一或多種材料GPCR-B3、反應(yīng)試管和測試GPCR-B3活性的說明書?？扇芜x的，該試劑盒含有生物學活性GPCR-B3?？筛鶕?jù)本發(fā)明，根據(jù)需要試劑盒的用戶和用戶的具體需求，來制備各式各樣的試劑盒和組分。
Ⅸ．施藥和藥物組合物可直接將味覺調(diào)節(jié)劑施給哺乳動物，在體內(nèi)調(diào)節(jié)味道。施藥可通過通常用于將調(diào)節(jié)劑化合物引入，待治療的組織與其最終接觸的任何途徑，如舌或口接觸途徑施藥。以任何合適方式，可任選的與藥物學上可接受的載體一起施用味覺調(diào)節(jié)劑。合適的施用這些調(diào)節(jié)劑的方法是現(xiàn)成的，而且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且，雖然可使用一種以上途徑施用一種具體組合物，但一條特定途徑常比其它途徑提供更迅速和更有效的反應(yīng)。
藥物學上可接受的載體部分由待施用的具體組合物，以及施用該組合物使用的特定方法所確定。因此，有各式各樣本發(fā)明藥物組合物的合適制劑(見例如，Remington’s藥物科學，17版，1985)。
味覺調(diào)節(jié)劑，單獨或聯(lián)合其它合適成分，可制成氣霧制劑(即它們可以是“噴霧狀”)，以通過吸入施用?？蓪忪F制劑置于壓縮的可接受噴霧劑中，如二氯甲烷、丙烷、氮氣等。
適合施用的制劑包括水或非水溶劑、等滲無菌溶液，它們可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑等滲的溶劑，和水和非水無菌懸液，它可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實施中，可口腔、外用、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或鞘內(nèi)施用該組合物?？扇芜x的，口腔或鼻內(nèi)施用該組合物?；衔镏苿┛芍糜趩蝿┗蚨鄤┟芊馊萜?，如安瓿和試管中?？蓮纳鲜龅臒o菌粉末、顆粒和片劑制備溶劑和懸液。還可作為制備食品或藥物的一部分施用調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明產(chǎn)品施給病人的劑量應(yīng)足夠能在一段時間內(nèi)在病人體內(nèi)產(chǎn)生有益反應(yīng)。該劑量將由所用的具體味覺調(diào)節(jié)劑和病人的情況，以及體重或待治療區(qū)域的表面積決定。劑量大小還將由具體病人施用具體化合物或載體后伴隨發(fā)生的不良副作用、其性質(zhì)和程度決定。
在確定要施用的調(diào)節(jié)劑的有效量時，醫(yī)師可評估調(diào)節(jié)劑的循環(huán)血漿水平，調(diào)節(jié)劑的毒性，以及抗-調(diào)節(jié)劑抗體的產(chǎn)生。一般，相當于調(diào)節(jié)劑的劑量對于一般個體是約1ng/kg-10mg/kg。
為了施用，本發(fā)明的味覺調(diào)節(jié)劑可以根據(jù)該調(diào)節(jié)劑的LD-50，和抑制劑在不同濃度的副作用(如對病人的質(zhì)量和總體健康)來確定施藥速度。可通過單劑或分劑量完成施藥。
本說明書中引用的所有出版物和專利申請在此引入以供參考，如同各單獨出版物或?qū)＠暾埦唧w和單獨指明引入以供參考的那樣。
雖然前面的發(fā)明已用一些說明性的細節(jié)和便于理解的例子進行了描述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將根據(jù)本發(fā)明的精神容易的懂得，可對本發(fā)明作某些改變和修飾，而不違背權(quán)利要求的精神和范圍。
實施例提供下列實施例僅供說明，而不是為了限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易理解，可改變或修改各種非關(guān)鍵性參數(shù)，而得到實質(zhì)上相似的結(jié)果。
實施例Ⅰ:GPCR-B3的克隆和表達由于味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)存在于舌的味蕾和上顎表皮中發(fā)現(xiàn)的味覺受體細胞中，從大鼠味覺乳頭了全長的cDNA文庫。用oligo-dT引導(dǎo)從幾百個大鼠周緣乳頭中分離polyA+RNA，并用定向IZAP載體(Stratagene Inc；Hoon & Ryba,J.Dent.Res.76:831-838(1997))根據(jù)標準分子生物學程序(見例如，Ausubel等，分子生物學現(xiàn)有方案(1995))制備了該文庫。還從大鼠和小鼠周緣、葉狀和蕈狀乳頭的單個分離的味覺受體細胞和味蕾，根據(jù)Dulac & Axel，細胞83:195-206(1995)制備了單細胞和單味蕾cDNA文庫集合。用酶消化和顯微切片來自成年大鼠和小鼠的舌上皮。為了使味蕾制備物中的裂解效率最大，將裂解液體積增加了10倍(Dulac& Axel，見上)。
從IZAP周緣cDNA文庫中，首先產(chǎn)生富含味覺組織中表達的序列的差減文庫，分離GPCR-B3。味覺受體細胞差減cDNA文庫的構(gòu)建和起始分析如Hoon & Ryba所述，見上。用非味覺cDNA探針斑點印跡法篩選cDNA克隆，實現(xiàn)了味覺特異性轉(zhuǎn)錄物的進一步富集。制備第一鏈cDNA并用如Ausubel等(見上所述)的隨機探測方法標記產(chǎn)生獨立的雜交探針。雜交條件和洗液是雜交65℃,2×SSC，洗滌65℃,0.1×SSC。
挑選所有在用味覺和非味覺組織差異篩選中顯示味覺組織富集的cDNA進行標準雙脫氧末端法，和自動ABI測序儀進行的DNA測序。用不同同源和結(jié)構(gòu)預(yù)測程序(如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的blast和http:∥dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/ struc-predict.html的Tmpred)對DNA進行數(shù)據(jù)分析。選出編碼新序列，與已知信號傳遞成分具有某些相似性的序列，具有多個預(yù)測的跨膜功能域的序列，或具有已知構(gòu)型，如SH2、SH3、PDZ等(見http://pfam.wustl.edu/的pfam)的序列的獨立cDNA，作為進一步分析的候選DNA。
通過與大鼠舌組織切片的原位雜交檢測候選DNA的味覺細胞表達。從成年大鼠獲得組織。將新鮮冰凍的切片(14毫米)與硅烷化玻片結(jié)合，如Ryba &Tirindelli，神經(jīng)元19:371-379(1997)所述制備用于原位雜交。在高嚴格度(5×SSC,50％甲酰胺，72℃)下進行所有原位雜交。對于單標記檢測，用堿性磷酸酶偶聯(lián)的異羥基洋地黃毒甙元抗體和標準顯色底物(Boehringer Mannheim)顯示信號，如Ryba & Tirindelli，見上所述。在～2000酶解和單細胞cDNA克隆上進行部分DNA測序反應(yīng)，和用～400不同候選cDNA進行原位雜交。該篩選鑒定了許多在味覺受體細胞中表達的基因，包括一個編碼GPCR-B3的3’片段的克隆。
從1ZAP大鼠周緣cDNA文庫中，根據(jù)標準噬斑雜交方案(Ausubel等，見上)，分離了全長大鼠GPCR-B3。將約2.5×106個克隆以高密度置于LB平板上(約100,000噬斑/板)，用放射性標記的GPCR-B3探針在高嚴格度(65℃,2×SSC)下影印雜交。收集陽性克隆，重新測試，純化并用DNA限制性作圖和測序分析確定特征。分離了數(shù)個全長GPCR-B3克隆，并確定特征(見SEQ ID NO:4-6及其編碼的氨基酸序列，SEQ ID NO:1-3)。
在低和中等嚴格度下(48℃,7×SSC和55℃,5×SSC)，篩選小鼠基因組Bac和1文庫(Genome Systems)，分離小鼠的大鼠GPCR-B3種間同系物。通過限制性作圖和DNA測序確定了克隆特征。進行RACE反應(yīng)(Marathon Kit,Clonetech)，用從小鼠周緣和葉狀乳頭分離的RNA制備的第一鏈cDNA分離了小鼠cDNA。從人睪丸文庫(Clonetech Inc.)分離了人GPCR-B3的同系物，并觀察到其它感覺受體，如嗅覺和視覺受體在睪丸中表達(Axel & Dulac，見上)。見圖1的GPCR-B3拓撲圖，顯示胞外功能域，7個跨膜功能域和一個胞內(nèi)或C-末端功能域。
實施例Ⅱ蛋白質(zhì)印跡和原位分析為了證明GPCR-B3蛋白質(zhì)在味覺細胞中的特異性表達，針對短肽和GPCR-B3融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生了抗體。該肽由從GPCR-B3推測蛋白質(zhì)(見例如SEQ ID NO:l和2)的N-或C-末端的18個氨基酸殘基構(gòu)成。融合蛋白由包含全部N-末端功能或最后3個預(yù)測跨膜區(qū)段加上C-末端區(qū)的GST-融合多肽構(gòu)成。用標準分子技術(shù)(Harlow & Lane，抗體(1988))產(chǎn)生了融合物。將肽與載體蛋白質(zhì)融合，接種入家兔，然后純化血清并如Cassill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11067-11070(1991)所述試驗。
通過蛋白質(zhì)印跡分析來自周緣或蕈狀乳頭的蛋白勻漿測試了抗體特異性。該印跡還含有肝和腦蛋白抽提物作為陰性對照。對于免疫組織化學，如Ryba &tirindelli，見上所述制備了冰凍切片，用于原位雜交，除了封閉反應(yīng)使用10％驢免疫球蛋白、1％牛血清清蛋白、0.3％Triton X-100。在合適稀釋度的抗-TR1(1∶100)中培育切片12-18小時，用熒光蛋白偶聯(lián)的驢抗-兔第二抗體(Jackson Immunolaboratory)檢測。用F-肌動素標記BODIPYRTR-X類鬼筆環(huán)肽(Molecular Probes)對染味蕾。作為這些研究的對照，還使用了抗-NCAM抗體。用帶有氬-氪激光的Leica TSC共焦顯微鏡獲得熒光顯影。用肽免疫原預(yù)處理抗體終止了染色。對于蛋白質(zhì)印跡和原位分析，分別見圖2和3。
序列表大鼠GPCR-B3氨基酸序列--SEQ ID NO:1MLFWAAHLLLSLQLVYCWAFSCQRTESSPGFSLPGDFLLAGLFSLHGDCLQVRHRPLVTSCDRPDSFNGHGYHLFQAMRFTVEEINNSSALLPNITLGYELYDVCSESANVYATLRVLALQGPRHIEIQKDLPNHSSKVVAFIGPDNTDHAVTTAALLGPFLMPLVSYEASSVVLSAKRKFPSFLRTVPSDRHQVEVMVQLLQSFGWVWISLIGSYGDYGQLGVQALEELAVPRGICVAFKDIVPFSARVGDPRMQSMMQHLAQARTTVVVVFSNRHLARVFFRSVVLANLTGKVWVASEDWAISTYITSVTGIQGIGTVLGVAVQQRQVPGLKEFEESYVRAVTAAPSACPEGSWCSTNQLCRECHTFTTRNMPTLGAFSMSAAYRVYEAVYAVAHGLHQLLGCTSEICSRGPVYPWQLLQQIYKVNFLLHENTVAFDDNGDTLGYYDIIAWDWNGPEWTFEIIGSASLSPVHLDINKTKIQWHGKNNQVPVSVCTTDCLAGHHRVVVGSHHCCFECVPCEAGTFLNMSELHICQPCGTEEWAPKESTTCFPRTVEFLAWHEPISLVLIAANTLLLLLLVGTAGLFAWHFHTPVVRSAGGRLCFLMLGSLVAGSCSFYSFFGEPTVPACLLRQPLFSLGFAIFLSCLTIRSFQLVIIFKFSTKVPTFYRTWAQNHGAGLFVIVSSTVHLLICLTWLVMWTPRPTREYQRFPHLVILECTEVNSVGFLLAFTHNILLSISTFVCSYLGKELPENYNEAKCVTFSLLLNFVSWIAFFTMASIYQGSYLPAVNVLAGLTTLSGGFSGYFLPKCYVILCRPELNNTEHFQASIQDYTRRCGTT
小鼠GPCR-B3氨基酸序列--SEQ ID NO:2MLFWAAHLLLSLQLAVAYCWAFSCQRTESSPGFSLPGDFLLAGLFSLHADCLQVRHRPLVTSCDRSDSFNGHGYHLFQAMRFTVEEINNSTALLPNITLGYELYDVCSESSNVYATLRVPAQQGTGHLEMQRDLRNHSSKVVALIGPDNTDHAVTTAALLSPFLMPLVSYEASSVILSGKRKFPSFLRTIPSDKYQVEVIVRLLQSFGWVWISLVGSYGDYGQLGVQALEELATPRGICVAFKDVVPLSAQAGDPRMQRMMLRLARARTTVVVVFSNRHLAGVFFRSVVLANLTGKVWIASEDWAISTYITNVPGIQGIGTVLGVAIQQRQVPGLKEFEESYVQAVMGAPRTCPEGSWCGTNQLCRECHAFTTWNMPELGAFSMSAAYNVYEAVYAVAHGLHQLLGCTSGTCARGPVYPWQLLQQIYKVNFLLHKKTVAFDDKGDPLGYYDIIAWDWNGPEWTFEVIGSASLSPVHLDINKTKIQWHGKNNQVPVSVCTRDCLEGHHRLVMGSHHCCFECMPCEAGTFLNTSELHTCQPCGTEEWAPEGSSACFSRTVEFLGWHEPISLVLLAANTLLLLLLIGTAGLFAWRLHTPVVRSAGGRLCFLMLGSLVAGSCSLYSFFGKPTVPACLLRQPLFSLGFAIFLSCLTIRSFQLVIIFKFSTKVPTFYHTWAQNHGAGIFVIVSSTVHLFLCLTWLAMWTPRPTREYQRFPHLVILECTEVNSVGFLVAFAHNILLSISTFVCSYLGKELPENYNEAKCVTFSLLLHFVSWIAFFTMSSIYQGSYLPAVNVLAGLATLSGGFSGYFLPKCYVILCRPELNNTEHFQASIQDYTRRCGTT人GPCR-B3氨基酸序列--SEQ ID NO:3RSCSFNEHGYHLFQAMRLGVEEINNSTALLPNITLGYQLYDVCSDSANVYATLRVLSLPGQHHIELQGDLLHYSPTVLAVIGPDSTNRAATTAALLSPFLVHISYAASSETLSVKRQYPSFLRTIPNDKYQVETMVLLLQKFGWTWISLVGSSDDYGQLGVQALENQALVRGICIAFKDIMPFSAQVGDERMQCLMRHLAQAGATVVVVFSSRQLARVFFESVVLTNLTGKVWVASEAWALSRHITGVPGIQRIGMVLGVAIQKRAVPGLKAFEEAYARADKEAPRPCHKGSWCSSNQLCRECQAFMAHTMPKLKAFSMSSAYNAYRAVYAVAHGLHQLLGCASELCSRGRVYPWQLLEQIHKVHFLLHKDTVAFNDNRDPLSSYNIIAWDWNGPKWTFTVLGSSTWSPVQLNINETKIQWHGKNHQVPKSVCSSDCLEGHQRVVTGFHHCCFECVPCGAGTFLNKSELYRCQPCGTEEWAPEGSQTCFPRTVVFLALREHTSWVLLAANTLLLLLLLGTAGLFAWHLDTPVVRSAGGRLCFLMLGSLAAGSGSLYGFFGEPTRPACLLRQALFALGFTIFLSCLTVRSFQLIIIFKFSTKVPTFYHAWVQNHGAGLFVMISSAAQLLICLTWLVVWTPLPAREYQRFPHLVMLECTETNSLGFILAFLYNGLLSISAFACSYLGKDLPENYNEAKCVTFSLLFNFVSWIAFFTTASVYDGKYLPAANMMAGLSSLSSGFGGYFLPKCYVILCRPDLNSTEHFQASIQDYTRRCGST
大鼠GPCR-B3核苷酸序列--SEQ ID NO:4ATTCACATCAGAGCTGTGCTCAGCCATGCTGGGCAGAGGGACGACGGCTGGCCAGCATGCTCTTCTGGGCTGCTCACCTGCTGCTCAGCCTGCAGTTGGTCTACTGCTGGGCTTTCAGCTGCCAAAGGACAGAGTCCTCTCCAGGCTTCAGCCTTCCTGGGGACTTCCTCCTTGCAGGTCTGTTCTCCCTCCATGGTGACTGTCTGCAGGTGAGACACAGACCTCTGGTGACAAGTTGTGACAGGCCCGACAGCTTCAACGGCCATGGCTACCACCTCTTCCAAGCCATGCGGTTCACTGTTGAGGAGATAAACAACTCCTCGGCCCTGCTTCCCAACATCACCCTGGGGTATGAGCTGTACGACGTGTGCTCAGAATCTGCCAATGTGTATGCCACCCTGAGGGTGCTTGCCCTGCAAGGGCCCCGCCACATAGAGATACAGAAAGACCTTCGCAACCACTCCTCCAAGGTGGTGGCCTTCATCGGGCCTGACAACACTGACCACGCTGTCACTACCGCTGCCTTGCTGGGTCCTTTCCTGATGCCCCTGGTCAGCTATGAGGCAAGCAGCGTGGTACTCAGTGCCAAGCGCAAGTTCCCGTCTTTCCTTCGTACCGTCCCCAGTGACCGGCACCAGGTGGAGGTCATGGTGCAGCTGCTGCAGAGTTTTGGGTGGGTGTGGATCTCGCTCATTGGCAGCTACGGTGATTACGGGCAGCTGGGTGTGCAGGCGCTGGAGGAGCTGGCCGTGCCCCGGGGCATCTGCGTCGCCTTCAAGGACATCGTGCCTTTCTCTGCCCGGGTGGGTGACCCGAGGATGCAGAGCATGATGCAGCATCTGGCTCAGGCCAGGACCACCGTGGTTGTGGTCTTCTCTAACCGGCACCTGGCTAGAGTGTTCTTCAGGTCCGTGGTGCTGGCCAACCTGACTGGCAAAGTGTGGGTCGCCTCAGAAGACTGGGCCATCTCCACGTACATCACCAGCGTGACTGGGATCCAAGGCATTGGGACGGTGCTCGGTGTGGCCGTCCAGCAGAGACAAGTCCCTGGGCTGAAGGAGTTTGAGGAGTCTTATGTCAGGGCTGTAACAGCTGCTCCCAGCGCTTGCCCGGAGGGGTCCTGGTGCAGCACTAACCAGCTGTGCCGGGAGTGCCACACGTTCACGACTCGTAACATGCCCACGCTTGGAGCCTTCTCCATGAGTGCCGCCTACAGAGTGTATGAGGCTGTGTACGCTGTGGCCCACGGCCTCCACCAGCTCCTGGGATGTACTTCTGAGATCTGTTCCAGAGGCCCAGTCTACCCCTGGCAGCTTCTTCAGCAGATCTACAAGGTGAATTTTCTTCTACATGAGAATACTGTGGCATTTGATGACAACGGGGACACTCTAGGTTACTACGACATCATCGCCTGGGACTGGAATGGACCTGAATGGACCTTTGAGATCATTGGCTCTGCCTCACTGTCTCCAGTTCATCTGGACATAAATAAGACAAAAATCCAGTGGCACGGGAAGAACAATCAGGTGCCTGTGTCAGTGTGTACCACGGACTGTCTGGCAGGGCACCACAGGGTGGTTGTGGGTTCCCACCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGCGAAGCTGGGACCTTTCTCAACATGAGTGAGCTTCACATCTGCCAGCCTTGTGGAACAGAAGAATGGGCACCCAAGGAGAGCACTACTTGCTTCCCACGCACGGTGGAGTTCTTGGCTTGGCATGAACCCATCTCTTTGGTGCTAATAGCAGCTAACACGCTATTGCTGCTGCTGCTGGTTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCATTTTCACACACCTGTAGTGAGGTCAGCTGGGGGTAGGCTGTGCTTCCTCATGCTGGGTTCCCTGGTGGCCGGAAGTTGCAGCTTCTATAGCTTCTTCGGGGAGCCCACGGTGCCCGCGTGCTTGCTGCGTCAGCCCCTCTTTTCTCTCGGGTTTGCCATCTTCCTCTCCTGCCTGACAATCCGCTCCTTCCAACTGGTCATCATCTTCAAGTTTTCTACCAAGGTGCCCACATTCTACCGTACCTGGGCCCAAAACCATGGTGCAGGTCTATTCGTCATTGTCAGCTCCACGGTCCATTTGCTCATCTGTCTCACATGGCTTGTAATGTGGACCCCACGACCCACCAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATTCTCGAGTGCACAGAGGTCAACTCTGTAGGCTTCCTGTTGGCTTTCACCCACAACATTCTCCTCTCCATCAGTACCTTCGTCTGCAGCTACCTGGGTAAGGAACTGCCAGAGAACTATAATGAAGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCCTCAACTTCGTATCCTGGATCGCCTTCTTCACCATGGCCAGCATTTACCAGGGCAGCTACCTGCCTGCGGTCAATGTGCTGGCAGGGCTGACCACACTGAGCGGCGGCTTCAGCGGTTACTTCCTCCCCAAGTGCTATGTGATTCTCTGCCGTCCAGAACTCAACAATACAGAACACTTTCAGGCCTCCATCCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCACTACCTGATCCACTGGAAAGGTGCAGACGGGAAGGAAGCCTCTCTTCTTGTGCTGAAGGTGGCGGGTCCAGTGGGGCCGAGAGCTTGAGGTGTCTGGGAGAGCTCCGGCACAGCTTACGATGTATAAGCACGCGGAAGAATCCAGTGCAATAAAGACGGGAAGTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA小鼠GPCR-B3核苷酸序列--SEQ ID NO:5TTTGGCCAGCATGCTTTTCTGGGCAGCTCACCTGCTGCTCAGCCTGCAGCTGGCCGTTGCTTACTGCTGGGCTTTCAGCTGCCAAAGGACAGAATCCTCTCCAGGTTTCAGCCTCCCTGGGGACTTCCTCCTGGCAGGCCTGTTCTCCCTCCATGCTGACTGTCTGCAGGTGAGACACAGACCTCTGGTGACAAGTTGTGACAGGTCTGACAGCTTCAACGGCCATGGCTATCACCTCTTCCAAGCCATGCGGTTCACCGTTGAGGAGATAAACAACTCCACAGCTCTGCTTCCCAACATCACCCTGGGGTATGAACTGTATGACGTGTGCTCAGAGTCTTCCAATGTCTATGCCACCCTGAGGGTGCCCGCCCAGCAAGGGACAGGCCACCTAGAGATGCAGAGAGATCTTCGCAACCACTCCTCCAAGGTGGTGGCACTCATTGGGCCTGATAACACTGACCACGCTGTCACCACTGCTGCCCTGCTGAGCCCTTTTCTGATGCCCCTGGTCAGCTATGAGGCGAGCAGCGTGATCCTCAGTGGGAAGCGCAAGTTCCCGTCCTTCTTGCGCACCATCCCCAGCGATAAGTACCAGGTGGAAGTCATAGTGCGGCTGCTGCAGAGCTTCGGCTGGGTCTGGATCTCGCTCGTTGGCAGCTATGGTGACTACGGGCAGCTGGGCGTACAGGCGCTGGAGGAGCTGGCCACTCCACGGGGCATCTGCGTCGCCTTCAAGGACGTGGTGCCTCTCTCCGCCCAGGCGGGTGACCCAAGGATGCAGCGCATGATGCTGCGTCTGGCTCGAGCCAGGACCACCGTGGTCGTGGTCTTCTCTAACCGGCACCTGGCTGGAGTGTTCTTCAGGTCTGTGGTGCTGGCCAACCTGACTGGCAAAGTGTGGATCGCCTCCGAAGACTGGGCCATCTCCACGTACATCACCAATGTGCCCGGGATCCAGGGCATTGGGACGGTGCTGGGGGTGGCCATCCAGCAGAGACAAGTCCCTGGCCTGAAGGAGTTTGAAGAGTCCTATGTCCAGGCAGTGATGGGTGCTCCCAGAACTTGCCCAGAGGGGTCCTGGTGCGGCACTAACCAGCTGTGCAGGGAGTGTCACGCTTTCACGACATGGAACATGCCCGAGCTTGGAGCCTTCTCCATGAGCGCTGCCTACAATGTGTATGAGGCTGTGTATGCTGTGGCCCACGGCCTCCACCAGCTCCTGGGATGTACCTCTGGGACCTGTGCCAGAGGCCCAGTCTACCCCTGGCAGCTTCTTCAGCAGATCTACAAGGTGAATTTCCTTCTACATAAGAAGACTGTAGCATTCGATGACAAGGGGGACCCTCTAGGTTATTATGACATCATCGCCTGGGACTGGAATGGACCTGAATGGACCTTTGAGGTCATTGGTTCTGCCTCACTGTCTCCAGTTCATCTAGACATAAATAAGACAAAAATCCAGTGGCACGGGAAGAACAATCAGGTGCCTGTGTCAGTGTGTACCAGGGACTGTCTCGAAGGGCACCACAGGTTGGTCATGGGTTCCCACCACTGCTGCTTCGAGTGCATGCCCTGTGAAGCTGGGACATTTCTCAACACGAGTGAGCTTCACACCTGCCAGCCTTGTGGAACAGAAGAATGGGCCCCTGAGGGGAGCTCAGCCTGCTTCTCACGCACCGTGGAGTTCTTGGGGTGGCATGAACCCATCTCTTTGGTGCTATTAGCAGCTAACACGCTATTGCTGCTGCTGCTGATTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCGTCTTCACACGCCTGTTGTGAGGTCAGCTGGGGGTAGGCTGTGCTTCCTCATGCTGGGTTCCTTGGTAGCTGGGAGTTGCAGCCTCTACAGCTTCTTCGGGAAGCCCACGGTGCCCGCGTGCTTGCTGCGTCAGCCCCTCTTTTCTCTCGGGTTTGCCATTTTCCTCTCCTGTCTGACAATCCGCTCCTTCCAACTGGTCATCATCTTCAAGTTTTCTACCAAGGTACCCACATTCTACCACACTTGGGCCCAAAACCATGGTGCCGGAATATTCGTCATTGTCAGCTCCACGGTCCATTTGTTCCTCTGTCTCACGTGGCTTGCAATGTGGACCCCACGGCCCACCAGGGAGTACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATTCTTGAGTGCACAGAGGTCAACTCTGTGGGCTTCCTGGTGGCTTTCGCACACAACATCCTCCTCTCCATCAGCACCTTTGTCTGCAGCTACCTGGGTAAGGAACTGCCGGAGAACTATAACGAAGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCCTCCACTTCGTATCCTGGATCGCTTTCTTCACCATGTCCAGCATTTACCAGGGCAGCTACCTACCCGCGGTCAATGTGCTGGCAGGGCTGGCCACTCTGAGTGGCGGCTTCAGCGGCTATTTCCTCCCTAAATGCTACGTGATTCTCTGCCGTCCAGAACTCAACAACACAGAACACTTTCAGGCCTCCATCCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCACTACCTGAGGCGCTGCGGCACTACCTGAGGCGCTGCGGCACTACCTGA人GPCR-B3核苷酸予列--SEQ ID NO:6AGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTGGTGCATATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCTTTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAGAAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGGGTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCCTGGTCAGGGGCATCTGCATTGCTTTCAAGGACATCATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCCCAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTTTTCGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGCCCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGTGGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGCAGACAAGGAGGCCCCTAGGCCTTGCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTGCAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATGAGTTCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTCCACCAGCTCCTGGGCTGTGCCTCTGAGCTCTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGCTTTTGGAGCAGATCCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATCCCCTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGGTCCTCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGTGGCACGGAAAGAACCACCAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGCACCAGCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTGGGACCTTCCTCAACAAGAGCGAGCTCTACAGATGCCAGCCTTGTGGAACAGAAGAGTGGGCACCTGAGGGAAGCCAGACCTGCTTCCCGCGCACTGTGGTGTTTTTGGCTTTGCGTGAGCACACCTCTTGGGTGCTGCTGGCAGCTAACACGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCACCTAGACACCCCTGTGGTGAGGTCAGCAGGGGGCCGCCTGTGCTTTCTTATGCTGGGCTCCCTGGCAGCAGGTAGTGGCAGCCTCTATGGCTTCTTTGGGGAACCCACAAGGCCTGCGTGCTTGCTACGCCAGGCCCTCTTTGCCCTTGGTTTCACCATCTTCCTGTCCTGCCTGACAGTTCGCTCATTCCAACTAATCATCATCTTCAAGTTTTCCACCAAGGTACCTACATTCTACCACGCCTGGGTCCAAAACCACGGTGCTGGCCTGTTTGTGATGATCAGCTCAGCGGCCCAGCTGCTTATCTGTCTAACTTGGCTGGTGGTGTGGACCCCACTGCCTGCTAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATGCTTGAGTGCACAGAGACCAACTCCCTGGGCTTCATACTGGCCTTCCTCTACAATGGCCTCCTCTCCATCAGTGCCTTTGCCTGCAGCTACCTGGGTAAGGACTTGCCAGAGAACTACAACGAGGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCTTCAACTTCGTGTCCTGGATCGCCTTCTTCACCACGGCCAGCGTCTACGACGGCAAGTACCTGCCTGCGGCCAACATGATGGCTGGGCTGAGCAGCCTGAGCAGCGGCTTCGGTGGGTATTTTCTGCCTAAGTGCTACGTGATCCTCTGCCGCCCAGACCTCAACAGCACAGAGCACTTCCAGGCCTCCATTCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCTCCACCTGA
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改活性。
40．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述胞外功能域與一固相連接。
41．如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述胞外功能域與一固相共價連接。
42．如權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通過測量胞內(nèi)cAMP、IP3、或Ca2+的變化確定的。
43．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是化學作用。
44．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是物理作用。
45．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通過測量所述化合物與胞外功能域的結(jié)合確定的。
46．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽是重組的。
47．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽來自大鼠、小鼠或人。
48．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
49．如權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述多肽在細胞內(nèi)或細胞膜中表達。
50．如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述細胞是真核細胞。
51．一種鑒定調(diào)節(jié)感覺細胞中的感覺信號傳遞的化合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟如下(ⅰ)使該化合物與一種多肽接觸，所述多肽含有感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜功能域，該跨膜功能域含有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的跨膜功能域約70％以上相同的氨基酸序列；和(ⅱ)確定所述化合物對所述跨膜功能域的功能性作用。
52．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述多肽含有與異源多肽共價連接的跨膜功能域，形成嵌合多肽。
53．如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述嵌合多肽具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。
54．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通過測量胞內(nèi)cAMP、IP3、或Ca2+的變化確定的。
55．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是化學作用。
56．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是物理作用。
權(quán)利要求
1．一種分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼一種感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體，該受體含有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸。
2．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼一種與針對SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合的受體。
3．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼具有G-偶聯(lián)蛋白受體活性的受體。
4．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼一種受體，所述受體含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
5．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
6．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸是來自人、小鼠或大鼠。
7．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，在嚴格雜交條件下，通過與簡并引物組相同的序列選擇性雜交的引物，擴增所述核酸，所述簡并引物組編碼的氨基酸序列選自IAWDWNGPKW(SEQ ID NO:7)和LPENYEAKC(SEQ ID NO:8)。
8．如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼具有約92kDa-102kDa之間分子量的受體。
9．一種編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的分離的核酸，其特征在于，所述核酸在高度嚴格條件下能與具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6的序列的核酸特異性雜交。
10．一種編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的分離的核酸，該受體含有與具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列的多肽70％以上相同的氨基酸，其特征在于，所述核酸能在中等嚴格雜交條件下與SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6的核苷酸序列選擇性雜交。
11．一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域，所述胞外功能域與SEQ ID NO:1的胞外功能域具有70％以上相同的氨基酸序列。
12．如權(quán)利要求11所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼與一核酸編碼的異源多肽連接的胞外功能域，形成嵌合多肽。
13．如權(quán)利要求11所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼SEQ ID NO:1的胞外功能域。
14．一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜功能域，所述跨膜功能域與SEQ ID NO:1的跨膜功能域具有70％以上相同的氨基酸序列。
15．如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼與一核酸編碼的異源多肽連接的跨膜功能域，形成嵌合多肽。
16．如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼SEQ ID NO:1的跨膜功能域。
17．如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸還編碼一胞質(zhì)功能域，所述胞質(zhì)功能域含有與SEQ ID NO:1的胞質(zhì)功能域70％以上相同的氨基酸。
18．如權(quán)利要求17所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸編碼SEQ ID NO:1的胞質(zhì)功能域。
19．一種分離的感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體，其特征在于，該受體含有與SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列70％以上相同的氨基酸序列。
20．如權(quán)利要求19所述的分離的受體，其特征在于，所述受體與針對SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合。
21．如權(quán)利要求19所述的分離的受體，其特征在于，所述受體具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。
22．如權(quán)利要求19所述的分離的受體，其特征在于，所述受體具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
23．如權(quán)利要求19所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸是來自人、小鼠或大鼠。
24．一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽含有感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域，所述胞外功能域含有與SEQ ID NO:1的胞外功能域70％以上相同的氨基酸序列。
25．如權(quán)利要求24所述的分離的多肽，其特征在于，所述多肽編碼SEQ ID NO:1的胞外功能域。
26．如權(quán)利要求24所述的分離的多肽，其特征在于，所述胞外功能域與一異源多肽共價連接，形成嵌合多肽。
27．一種分離的多肽，其特征在于，該多肽含有感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜功能域，所述跨膜功能域含有與SEQ ID NO:1的跨膜功能域70％以上相同的氨基酸序列。
28．如權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其特征在于，所述多肽編碼SEQ ID NO:1的跨膜功能域。
29．如權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其特征在于，所述多肽還含有胞質(zhì)功能域，所述胞質(zhì)功能域含有與SEQ ID NO:1的胞質(zhì)功能域70％以上相同的氨基酸。
30．如權(quán)利要求29所述的分離的多肽，其特征在于，所述多肽編碼SEQ ID NO:1的胞質(zhì)功能域。
31．如權(quán)利要求27所述的分離的多肽，其特征在于，所述跨膜功能域與異源多肽共價連接，形成嵌合多肽。
32．如權(quán)利要求31所述的分離的多肽，其特征在于，所述嵌合多肽具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。
33．一種抗體，其特征在于，該抗體與權(quán)利要求19所述受體選擇性結(jié)合。
34．一種表達載體，其特征在于該表達載體含有權(quán)利要求1所述的核酸。
35．一種宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞被權(quán)利要求34所述載體轉(zhuǎn)染。
36．一種鑒定調(diào)節(jié)感覺細胞中的感覺信號傳遞的化合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟如下(ⅰ)使所述化合物與一種多肽接觸，所述多肽含有感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域，該胞外功能域含有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的胞外功能域約70％以上相同的氨基酸序列；和(ⅱ)確定所述化合物對所述胞外功能域的功能性作用。
37．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽是一種感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體，所述受體含有與編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽約70％以上相同的氨基酸。
38．如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述多肽含有與一異源多肽共價連接的胞外功能域，形成嵌合多肽。
39．如權(quán)利要求37或38的方法，其特征在于，所述多肽具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。
40．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述胞外功能域與一固相連接。
41．如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述胞外功能域與一重相共價連接。
42．如權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通過測量胞內(nèi)cAMP、IP3、或Ca2+的變化確定的。
43．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是化學作用。
44．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是物理作用。
45．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通過測量所述化合物與胞外功能域的結(jié)合確定的。
46．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽是重組的。
47．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽來自大鼠、小鼠或人。
48．如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
49．如權(quán)利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述多肽在細胞內(nèi)或細胞膜中表達。
50．如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述細胞是真核細胞。
51．一種鑒定調(diào)節(jié)感覺細胞中的感覺信號傳遞的化合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟如下(ⅰ)使該化合物與一種多肽接觸，所述多肽含有感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的胞外功能域，該跨膜功能域含有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的跨膜功能域約70％以上相同的氨基酸序列；和(ⅱ)確定所述化合物對所述跨膜功能域的功能性作用。
52．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述多肽含有與異源多肽共價連接的跨膜功能域，形成嵌合多肽。
53．如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述嵌合多肽具有G-蛋白偶聯(lián)受體活性。
54．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通過測量胞內(nèi)cAMP、IP3、或Ca2+的變化確定的。
55．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是化學作用。
56．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是物理作用。
57．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述多肽是重組的。
58．如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述多肽來自大鼠、小鼠或人。
59．如權(quán)利要求51或52所述的方法，其特征在于，所述多肽在細胞內(nèi)或細胞膜中表達。
60．如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述細胞是真核細胞。
61．一種制備感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的方法，其特征在于，該方法包括步驟用含有編碼該受體的核酸的重組表達載體表達該載體，所述受體的氨基酸序列含有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽70％以上相同的氨基酸。
62．一種制備含有感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的重組細胞的方法，其特征在于，該方法包括步驟用含有編碼該受體的核酸的重組表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，所述受體的氨基酸序列含有與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽70％以上相同的氨基酸。
63．一種制備含有編碼感覺轉(zhuǎn)導(dǎo)G-蛋白偶聯(lián)受體的核酸的重組表達載體的方法，其特征在于，該方法包含步驟將編碼所述受體的核酸與一表達載體連接，所述受體的氨基酸序列含有與具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的多肽70％以上相同的氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了感覺細胞特異性G－蛋白偶聯(lián)受體的分離的核酸和氨基酸序列，這些受體的抗體，檢測這些核酸和受體的方法，和篩選感覺細胞特異性G－蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)劑的方法。
文檔編號C12N5/02GK1317010SQ99810525
公開日2001年10月10日 申請日期1999年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月28日
發(fā)明者C·S·朱克, J·E·阿德萊爾, J·林德邁耶, N·里巴, M·胡恩 申請人:加利福尼亞大學董事會, 美國政府健康及人類服務(wù)部