專利名稱：生產(chǎn)唾液酸化寡糖的方法
本申請是1998年9月3日提出的美國申請系列No.09/146,285(它的全文并入本文作參考)的部分繼續(xù)申請。
本申請涉及酶促合成α-唾液酸化寡糖的方法。具體地說，在本發(fā)明的方法中，應(yīng)用α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸或其類似物(作為它的CMP-核苷酸應(yīng)用的)轉(zhuǎn)移到寡糖的非還原末端，所述寡糖在相對于該寡糖的非還原糖末端的次末端位置具有一個巖藻糖基。
在本申請中引用了下列文獻(在本申請相關(guān)部分以上標數(shù)字形式表示)，它們的全文并入本文作參考。1．Horowitz，糖綴合物(The Glycoconjugates),Vols.Ⅰ～Ⅴ,Pigman編輯，New York Academic Press(1977,1978,1982,1983)2．Hakomori，癌研究進展(Adv.Cancer Res.),52:257～331(1989)3．Venot等，美國專利No.5,352,6704．Schengrund等，生物化學雜志[美](J.Biol.Chem.),264:13233～13237(1989)5．Paulson,“動物病毒與細胞表面受體的相互作用”，受體(“Interaction of Animal Viruses with Cell SurfaceReceptors”in The Receptors),Conn編輯，N.Y.Acad.Press,pp.131～219(1985)6．Feizi,TIBS,16:84～86(1991)7．Brandley等，細胞(Cell),63:861～863(1990)8．Houghton等，關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂和癌的會議論文集(Symposium onGangliosides and Cancer),pp.233～237,VCH Publishers(1988)9． Irie等，關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂和癌的會議論文集，pp.247～257,VCHPublishers(1988)10．Howard，“關(guān)于更好的碳水化合物疫苗”；世界衛(wèi)生組織組織的會議會報(in“Towards Better Carbohydrate Vaccines”；Proceedings of a meeting organized by the World HealthOrganization),R.Bell,G.Torrigani編輯，pp.212～236,Wiley,Chichester,(1987)。11．Henningsson等，癌免疫學和免疫療法(Cancer Immunol.Immunother.),25:231～241(1987)12．Fung等，癌研究(Cancer Res.),50:4308～4314(1990)13．Livingston等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)),84:2911～2915(1987)14．Naor等，變態(tài)反應(yīng)進展(Prog.Allergy),22:107～146(1977)15．Orskov等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.),149:669～685(1979)16．Barsoum等，分子免疫學(Mol.Immunol.),18:495～550(1981)17．Jennings等，美國專利No.4,727,136(1985)18．Honda等，生物化學雜志[日](J.Biochem.)，(東京)95:1323～1329(1984)19．Nakamura等，生物化學雜志[日]，(東京)99:219～226(1986)20．Reuter等，糖綴合物雜志(Glycoconjugate J.),5:133～135(1988)21．Weinstein等，生物化學雜志[美]，257:13835～13844(1982)22．Paulsen等，生物化學雜志[美]，252:2356～2362(1977)23．Evans-Sadler等，生物化學雜志[美]，254:4434～4443(1979)24．Conradt等，日本-德國會議論文集(Japanese-GermanSymp.),pp.104～105，柏林(1988)25．Joziasse等，生物化學雜志[美]，260:4941～4951(1985)26．Evans-Sadler，生物化學雜志[美]，254:5934～5941(1979)27．Bergh等，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.),136:113～118(1983)28．Higa等，生物化學雜志[美]，260:8838～8849(1985)29．Paulsen等，歐洲生物化學雜志，140:523～530(1984)30．de Heij等，碳水化合物研究(Carbohydr.Res.),149:85～99(1986)31．“細胞生物學專論”中的唾液酸(Sialic Acids in“Cell BiologyMonographs”),Schauer編輯，Vol.10(1982)32．Okamoto等，四面體(Tetrahedron),46,No.17,pp.5835～5837(1990)。33．Ratcliffe等，美國專利No.5,079,353(1987)。34．Abbas等，日本-德國學術(shù)會議會報(Proc.Japanese-GermanSymp.)，柏林，pp.20～21(1988)。35．Paulsen，應(yīng)用化學[英](Angew.Chem.Int.Ed.Eng.),21:155～173(1982)。36．Schmidt，應(yīng)用化學[英]，25:212～235(1986)。37．Fugedi等，糖綴合物雜志(Glycoconj.J.),4:97～108(1987)。38．Kameyama等，碳水化合物研究，209:C.sub.1～C.sub.4(1991)。39．Brossmer等，生物化學與生物物理學學報(Biochem.Biophys,Acta.),96:1282～1289(1980)40．Gross等，歐洲生物化學雜志，168:595～602(1987)41．Zbiral等，化學和其它有關(guān)科學部門月刊[奧](Monatsh.Chem.),119:127～141(1988)42．Sharma等，碳水化合物研究，175:25～34(1989)43．Hasegawa等，碳水化合物化學雜志(J.Carbohydr.Chem.)，8:579～588(1989)44．Zbiral等，化學和其它有關(guān)科學部門月刊[奧]，116:87～98(1985)45．Salunkhe等，李必?；瘜W紀事(Liebigs Ann.Chem.),pp.187～189(1988)46．Hasegawa等，碳水化合物化學雜志，8:135～144(1989)47．Gross等，生物化學(Biochemistry),27:4279～4283(1989)48．Zbiral等，碳水化合物研究，194:C15～C18(1989)49．Gross等，F(xiàn)EBS通訊(FEBS Lett.),232:145～147(1988)50．Paulsen等，李必?；瘜W紀事，pp.277～279(1988)51．Nakajima等，農(nóng)業(yè)與生物化學[日](Agric.Biol.Chem.)，52:1209～1215(1988)52．Baumberger等，瑞士化學學報(Helv.Chem.Acta),69:1535～1541(1986)53．Beau等，歐洲生物化學雜志，160:531～540(1980)54．Mack等，四面體通訊(Tetrahedron Lett.),28:191～194(1987)55．Gross等，歐洲生物化學雜志，177:583～589(1988)56．Christian等，碳水化合物研究，194:49～61(1989)57．Conradt等，F(xiàn)EBS通訊，170:295～300(1984)58．Christian等，碳水化合物研究，162:1～11(1987)59．Haverkamp等，Hoppe-Seyler生理化學雜志(Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.),360:159～166(1979)60．Gross等，糖綴合物雜志，4:145～156(1987)61．Hagedorn等，第八次碳水化合物會議(ⅩⅢth Carbohydr.Symp.)，伊薩卡鎮(zhèn)(1986)A462．Toone等，四面體，No.17,45:5365～5422(1989)63．Palcic，酶學中的方法(Methods in Enzymology),230:300(1994)64．Beyer等，酶學進展(Adv.Enzymol.),52:24～158(1981)65．國際專利申請公開No.WO 97/1830266．Le等，色譜學雜志(J.Chromatography),781:515～522(1997)67．Kashem等，美國專利No.5,374,65568．Gokhale等，加拿大化學雜志(Can J.Chem.),68:1063(1990)69．Srivastava等，生物化學雜志[美]，267:22356～22361(1992)70．Stangier等，碳水化合物研究，305:511～515(1998)71．Baisch等，生物器官和醫(yī)療化學通訊(Bioorganic and MedicinalChemistry Letters),6:2953～2956(1996)
碳水化合物和/或寡糖存在于多種天然糖綴合物和病理糖綴合物中1。特別有意義的是尤其在非還原糖末端含有唾液酸殘基的碳水化合物和寡糖31。這類唾液酸封端的碳水化合物和寡糖存在于許多與廣泛的生物現(xiàn)象相關(guān)的產(chǎn)品中，所述生物現(xiàn)象部分地基于通過碳水化合物結(jié)構(gòu)和通過它們與特異性配體的結(jié)合而攜帶的識別信號這一概念。
具體地說，這類唾液酸封端的碳水化合物和寡糖被認為是毒素4、病原劑(例如病毒)5的結(jié)合的受體，而且被認為是各種凝集素(特別是細胞粘連中涉及的那些)5,6等的識別位點。
類似地，某些寡糖(包括唾液酸封端的寡糖)已被鑒定為能抑制細胞介導的對抗原的免疫應(yīng)答。Venot等3描述了這類寡糖抑制細胞介導的對抗原的免疫應(yīng)答的能力。
此外，現(xiàn)有技術(shù)中有文獻記錄了在腫瘤相關(guān)的抗原中存在某些唾液酸封端的寡糖1，通常，以某種與正常寡糖不同的方式修飾了這類抗原上存在的寡糖的結(jié)構(gòu)從而導致腫瘤相關(guān)的抗原的表達2。在黑素瘤患者中用針對某些唾液酸化腫瘤相關(guān)的抗原(例如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2、GD3和GM2)的單克隆抗體研究了被動免疫療法的前景8,9。
這類寡糖的合成經(jīng)常涉及復(fù)雜的化學反應(yīng)(相應(yīng)地產(chǎn)率低)。因此，人們對于應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶來合成這些分子的至少一部分很感興趣。
糖基轉(zhuǎn)移酶是一類高度多形性的、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的膜結(jié)合酶，它們在糖蛋白和糖脂的N-聚糖(Asn-GlcNAc N-糖苷鍵；GlcNAc,N-乙酰葡糖胺)和O-聚糖(Ser/Thr-GalNAc,O-糖苷鍵；GalNAc,N-乙酰半乳糖胺)部分的生物合成中催化單一的單糖單元從核苷酸供體至受體糖的羥基的轉(zhuǎn)移。
真核生物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括一族糖基轉(zhuǎn)移酶，它們催化N-乙酰神經(jīng)氨糖酸(NeuAc)即一種唾液酸(SA)從GMP-SA轉(zhuǎn)移到糖綴合物的寡糖鏈的非還原末端。唾液酸的添加通常終止寡糖鏈延長，但神經(jīng)細胞粘著分子和神經(jīng)節(jié)苷脂上見到的聚唾液酸鏈除外。
糖蛋白和糖脂的N-和O-聚糖衍生物的合成中涉及的已知真核生物唾液酸轉(zhuǎn)移酶被歸納于表1中，摘自Palcic63。表中，R表示受體糖蛋白、糖脂或寡糖鏈的殘余部分。
表1 α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶是如下方面有用的真核生物酶糖蛋白的N-連接的和O-連接的唾液酸衍生物的體外合成，受體的測定，以及糖蛋白的其它定性和定量研究。然而，以前報導了2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶不能合成糖蛋白或糖脂的N-連接的和O-連接的唾液酸衍生物(其中，受體糖蛋白或糖脂在相對于寡糖的非還原糖末端的次末端位置具有一個巖藻糖基衍生物)(美國專利No.5,374,65567)。這需要在某些巖藻糖基化寡糖和唾液酸化寡糖的合成中精心設(shè)計以及在某些情況下需要應(yīng)用化學合成法而不是酶促合成法來完成一些步驟。
鑒于上述情況，特別有利的是開發(fā)輕易從寡糖制備α-唾液酸化寡糖的方法，所述寡糖指在相對于寡糖的非還原糖末端的次末端位置具有一個巖藻糖基衍生物的寡糖。本發(fā)明通過如下方法實現(xiàn)了這個設(shè)想應(yīng)用α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶將作為它的CMP-核苷酸衍生物活化的唾液酸(供體糖)與在糖部分的非還原末端的倒數(shù)第二位具有一個巖藻糖基衍生物的糖或寡糖(受體寡糖)有效地偶聯(lián)。
本發(fā)明涉及通過N-乙酰神經(jīng)氨糖酸的類似物合成在非還原糖末端封端的寡糖、糖蛋白和糖脂的方法。具體地說，本發(fā)明的方法應(yīng)用α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸或其類似物(作為它們的CMP-核苷酸衍生物活化的)轉(zhuǎn)移到寡糖受體的非還原末端。
因此，在它的方法方面之一中，本發(fā)明涉及一種酶促合成含唾液酸或其類似物的α-唾液酸化和巖藻糖基化寡糖的方法，該方法包括如下步驟a)選擇與在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的巖藻糖基化寡糖相容的唾液酸轉(zhuǎn)移酶；b)選擇與步驟(a)中選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶相容的CMP-唾液酸或其類似物；c)在如上步驟(a)中選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶存在下，在使唾液酸或其類似物從CMP-唾液酸或其類似物轉(zhuǎn)移到巖藻糖基化寡糖的非還原糖末端的條件下，將所述CMP-唾液酸或其類似物與下式的巖藻糖基化寡糖接觸 其中，R1表示糖殘基，R2表示糖殘基，并且，R1和R2一起表示選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體；n是0～約10,Y選自O(shè)、NH和S,R3選自H、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或具有至少一個碳原子的苷元部分；從而形成含唾液酸或其類似物的α-唾液酸化巖藻糖基化寡糖。
本發(fā)明還涉及一種酶促合成巖藻糖基化和α-唾液酸化寡糖的方法，該方法包括如下步驟a)選擇一種能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶；b)選擇一種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；c)選擇與步驟(a)中選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶相容的CMP-唾液酸或其類似物；
d)選擇與步驟(b)中選定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶相容的GDP-巖藻糖或其類似物；e)在如上步驟(a)和步驟(b)中選定的所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶和所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶存在下，在使唾液酸或其類似物以及巖藻糖或其類似物分別從CMP-唾液酸或其類似物以及GDP-巖藻糖或其類似物轉(zhuǎn)移到所述寡糖的非還原糖末端的條件下，將所述CMP-唾液酸或其類似物以及所述GDP-巖藻糖或其類似物與下式的寡糖接觸R1-R2-(糖)n-Y-R3其中，R1表示糖殘基，R2表示糖殘基，并且，R1和R2一起表示選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和選定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的受體；n是0～約10,Y選自O(shè)、NH和S,R3選自H、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或具有至少一個碳原子的苷元部分；從而形成α-唾液酸化巖藻糖基化寡糖。
本發(fā)明還涉及一種測定未知寡糖受體的非還原末端結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括如下步驟a)將所述寡糖受體與不能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖的非還原末端唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸，測定所述寡糖是否被唾液酸化了；b)將所述寡糖與能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖的非還原末端唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸，測定所述寡糖是否被唾液酸化了；以及c)比較所得結(jié)果，確定所述非還原末端是否被巖藻糖基化了。如果在步驟(a)中，未知受體的第一份等分樣未被唾液酸化，而在步驟(b)中，受體的第二份等分樣被唾液酸化了，那么，所述受體在非還原次末端糖位置被巖藻糖基化了。
本發(fā)明涉及這一發(fā)現(xiàn)某些α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸的相容性類似物轉(zhuǎn)移到某些在相對于糖的非還原末端的次末端位置具有一個巖藻糖基的寡糖、糖蛋白和糖脂。這一發(fā)現(xiàn)使得有可能從在相對于糖的非還原末端的次末端位置具有一個巖藻糖基的寡糖合成在非還原末端α-唾液酸化的寡糖。該方法還使得有可能將唾液酸的相容性類似物轉(zhuǎn)移到巖藻糖基化寡糖。本發(fā)明還使得有可能測定受體的結(jié)構(gòu)以及其它的定性和定量研究糖蛋白和糖脂。
不過，在更詳細討論本發(fā)明之前，先定義下列術(shù)語。A．定義本文應(yīng)用的下列術(shù)語具有如下給定的定義術(shù)語“唾液酸”表示所有的唾液酸天然結(jié)構(gòu)，包括5-乙酰氨基-3,5-二脫氧-D-甘油基-D-半乳糖-nonulopyranosylonicacid(5-acetoamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-nonulopyranosylonic acid)(“Neu5Ac”)和Neu5Ac的天然類似物，包括N-乙醇酰神經(jīng)氨糖酸(Neu5Gc)和9-O-乙酰神經(jīng)氨糖酸(Neu5,9Ac2)，它們與選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是相容的。Schauer31提供了迄今已知的天然唾液酸完整的一覽表。
據(jù)說，被特定的α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶識別以便結(jié)合該酶然后適合轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w寡糖結(jié)構(gòu)上的天然唾液酸與唾液酸轉(zhuǎn)移酶是相容的，在本文有時被稱為“相容的天然唾液酸”。
術(shù)語“唾液酸的類似物”表示唾液酸的天然結(jié)構(gòu)的類似物，包括其中唾液酸單元已被化學修飾以便從這樣的結(jié)構(gòu)引入、修飾和/或除去一個或多個官能度的那些。例如，這樣的修飾能導致OH官能度的除去、胺官能度的引入、鹵官能度的引入等。至于和唾液酸轉(zhuǎn)移酶相容的唾液酸類似物，它們在本文有時被稱為“相容性唾液酸類似物”。
唾液酸的某些類似物是本領(lǐng)域已知的，例如包括9-疊氮基-Neu5Ac、9-氨基-Neu5Ac、9-脫氧-Neu5Ac、9-氟-Neu5Ac、9-溴-Neu5Ac、8-脫氧-Neu5Ac、8-表-Neu5Ac、7-脫氧-Neu5Ac、7-表-Neu5Ac、7,8-雙表-Neu5Ac、4-O-甲基-Neu5Ac、4-N-乙酰-Neu5Ac、4,7-二脫氧-Neu5Ac、4-氧代-Neu5Ac、3-羥基-Neu5Ac、3-氟-Neu5Ac酸以及Neu5Ac的6-硫代類似物。本文用來描述唾液酸的類似物的命名是Reuter等20規(guī)定的。
既然唾液酸轉(zhuǎn)移酶被用來轉(zhuǎn)移或貢獻出相容性的天然唾液酸，所以Neu5Ac的類似物在本文有時被稱為“人工供體而相容性的天然唾液酸則在本文有時被稱為“天然供體”。
術(shù)語“唾液酸轉(zhuǎn)移酶”指那些酶它們將相容性的天然唾液酸[作為它的胞苷一磷酸(CMP)衍生物活化的]轉(zhuǎn)移到糖脂或糖蛋白(總稱為糖綴合物)的末端寡糖結(jié)構(gòu)上，包括從基因修飾的微生物生產(chǎn)的酶，所述基因修飾為的是摻入和表達從另一來源(包括哺乳動物來源)獲得的唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的全部或部分。文獻中已鑒定了很多唾液酸轉(zhuǎn)移酶，不同的唾液酸轉(zhuǎn)移酶一般是通過接受該轉(zhuǎn)移酶的糖綴合物上末端糖單元而彼此區(qū)別的64。例如，已表征了構(gòu)建下列糖綴合物上的末端寡糖結(jié)構(gòu)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶αNeu5Ac(2-3)βGal(1→3/4)βGlcNAc-21αNeu5Ac(2-6)βGal(1-4)βGlcNAc-21,22αNeu5Ac(2-3)βGal(1-3)αGalNAc-23～25αNeu5Ac(2-6)αGalNAc-26～28αNeu5Ac(2-6)βGlcNAc-29,30。從各種來源分離了具有種種特異性的其它唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
“與在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的巖藻糖基化寡糖相容的唾液酸轉(zhuǎn)移酶”指能將在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基或其類似物的寡糖唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。發(fā)現(xiàn)了國際專利申請公開No.WO97/1830265公開的粘液瘤病毒α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有此能力。
預(yù)計，還被脊椎動物痘病毒亞科、昆蟲痘病毒亞科的其它屬和痘病毒科未分類的病毒編碼的相關(guān)唾液酸轉(zhuǎn)移酶將與巖藻糖基化寡糖相容。
據(jù)說，作為它們的胞苷一磷酸衍生物活化的唾液酸的類似物(它們被特定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶識別以便與該酶結(jié)合，然后適合轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w寡糖結(jié)構(gòu))與唾液酸轉(zhuǎn)移酶是相容的，所以在本文有時被稱為“唾液酸的相容性類似物”。由于轉(zhuǎn)移反應(yīng)應(yīng)用了唾液酸轉(zhuǎn)移酶，所以不用說，在這種反應(yīng)中應(yīng)用的唾液酸的類似物必定是唾液酸的相容性類似物。
Neu5Ac的CMP-核苷酸衍生物表示如下化合物唾液酸的類似物的CMP-衍生物指具有與上述化合物類似結(jié)構(gòu)的那些化合物，不同的是，Neu5Ac殘基被唾液酸的類似物替代了。
術(shù)語“巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶”指那些酶它們將相容性的天然巖藻糖[作為它的鳥苷二磷酸(GDP)衍生物活化的]轉(zhuǎn)移到糖脂或糖蛋白(總稱為糖綴合物)的末端寡糖結(jié)構(gòu)上，包括從基因修飾的微生物生產(chǎn)的酶，所述基因修飾為的是摻入和表達從另一來源(包括哺乳動物來源)獲得的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的全部或部分。文獻中已鑒定了很多巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
術(shù)語“巖藻糖的類似物”表示巖藻糖的天然結(jié)構(gòu)類似物，包括那些物質(zhì)，即，其中，巖藻糖單元已被化學修飾以便從這樣的結(jié)構(gòu)引入、修飾和/或除去一個或多個官能度。例如，這樣的修飾能導致OH官能度的除去、胺官能度的引入、鹵官能度的引入、硫酸根或磷酸根部分的引入等。某些巖藻糖的類似物是本領(lǐng)域已知的，例如包括3-脫氧巖藻糖68、阿拉伯糖、C-6修飾的巖藻糖69(即，6-O-丙基巖藻糖)和3,6-二脫氧-L-半乳糖70。
還預(yù)計，巖藻糖或巖藻糖的類似物可從其它嘌呤二磷酸(包括腺苷-5′-二磷酸巖藻糖、黃苷-5′-二磷酸巖藻糖、肌苷-5′-二磷酸巖藻糖等)被轉(zhuǎn)移71。
據(jù)說，作為它們的二磷酸衍生物活化的巖藻糖的類似物(它們被特定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶識別以便與該酶結(jié)合，然后適合轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w寡糖結(jié)構(gòu))與巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是相容的。至于巖藻糖類似物與巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是相容的，它們在本文有時被稱為“相容性巖藻糖類似物術(shù)語“寡糖”指下式的化合物R1-R2-(糖)n-Y-R3其中，R1表示糖殘基，R2表示糖殘基，并且，R1和R2一起表示選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和選定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的受體；n是0～約10,Y選自O(shè)、NH和S,R3選自H、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或具有至少一個碳原子的苷元部分。
術(shù)語“巖藻糖基化寡糖”指下式的化合物 其中，R1表示糖殘基，R2表示糖殘基，并且，R1和R2一起表示選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和選定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的受體；n是0～約10,Y選自O(shè)、NH和S,R3選自H、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或具有至少一個碳原子的苷元部分。
由于天然寡糖和巖藻糖基化寡糖都是某些α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體，所以被認為是體內(nèi)某些唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體，這些寡糖和巖藻糖基化寡糖在本文有時被稱為“天然受體”。反之，由于應(yīng)用于本發(fā)明的寡糖和巖藻糖基化寡糖有時不同于這樣的“天然受體所以，時被稱為“人工受體”。也就是說，人工受體是那些寡糖和巖藻糖基化寡糖它們在還原糖的異頭碳原子上含有一個取代基，該取代基不是羥基、蛋白質(zhì)或者能形成微團或其它大分子量聚集體的脂質(zhì)。因此，通過它的苷元部分連接到寡糖或巖藻糖基化寡糖的還原糖異頭碳原子上的蛋白質(zhì)應(yīng)當是人工受體，因為該受體包含“人造的”單元(即，苷元連接基)。
本發(fā)明的巖藻糖基化寡糖可借助于對該寡糖的一個或多個糖單元的化學修飾而進一步與天然受體區(qū)別。這樣的化學修飾可包括一個或多個糖單元中一個或多個官能度的引入和/或除去。例如，這樣的修飾可導致OH官能度的除去、糖單元的除去、胺官能度的引入、鹵官能度的引入、一個或多個糖單元的引入等。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述苷元部分具有1～20個碳原子，更優(yōu)選選自-(A)-Z′，其中，A表示一個鍵，2～10個碳原子的亞烷基，以及式-(CH2CR4R5G)n(CH2CR4R5)-這樣的一個部分，其中，n是等于0～5的整數(shù)；R4和R5獨立地選自氫，苯基，被1～3個選自胺、羥基、鹵素、1～4個碳原子的烷基和1～4個碳原子的烷氧基的取代基取代的苯基，甲基或者乙基；G選自一個鍵，氧，硫，NH；Z′選自氫、甲基、-OH、-SH、-NH2、-NHR6、-N(R6)2、-C(O)OH、-C(O)OR6、-C(O)NHNH2、-C(O)NH2、-C(O)NHR6、-C(O)N(R6)2和-OR7，其中，每個R6獨立地是1～4個碳原子的烷基，R7是3～10個碳原子的烯基。優(yōu)選地，-(A)-Z′基定義一個能被連接到載體的基或者一個可被衍生成一個能被連接到載體的基的基。
優(yōu)選地，所述苷元基是至少2個碳原子、更優(yōu)選至少4個碳原子的疏水基。最優(yōu)選的所述苷元基是-(CH2)8COOMe。
當所述苷元基是一個能被連接到載體(例如抗原載體)的基時，本發(fā)明的方法適用于制備人工綴合物，例如具有一個或多個α-唾液酸化寡糖基(包含唾液酸的類似物)的人工抗原，所述寡糖基懸掛于抗原上。
所述載體是低分子量或高分子量的、非免疫原性的或抗原性的載體，包括熒光標記、放射性標記、生物素的接頭，或者不耐光的連接臂，或者靶向的一個部分。優(yōu)選地，所述載體是抗原載體，所以，所述人工綴合物是人工抗原。在某些情況下，可能有利的是應(yīng)用非免疫原性載體。
另一方面，所述載體可以是低分子量載體，例如乙二胺、六亞甲基二胺、三(2-氨乙基)胺、L賴氨酰賴氨酸(L-lysilysine)、聚(L-賴氨酸)以及各種分子量的聚合物。
適用于上述寡糖的糖單元(即，糖)例如包括下列物質(zhì)的所有天然的和合成的衍生物葡萄糖、半乳糖、N-乙酰-葡糖胺、N-乙酰-半乳糖胺、巖藻糖、唾液酸、3-脫氧-D,L-辛酮糖酸等。除了呈它們的吡喃糖形式之外，所述寡糖中的全部糖單元還呈它們的D型，但巖藻糖例外(它呈它的L型)。
如上所示，適用于本文公開的方法中的寡糖包含末端單元(它們與選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是相容的)。也就是說，這樣的相容性末端單元能使寡糖被特定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶識別(以致該唾液酸轉(zhuǎn)移酶與所述寡糖結(jié)合)而且進一步能使唾液酸的相容性類似物轉(zhuǎn)移到所述寡糖上。B．合成和操作法寡糖的制備唾液酸類似物將被酶促與之偶聯(lián)的寡糖容易這樣制備或者通過完全的化學合成，或者通過化學/酶促合成[其中，應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶(而不是唾液酸轉(zhuǎn)移酶)實現(xiàn)將一個或多個糖單元相繼添加到糖或寡糖上]。這類方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，化學合成是用于下列目的的簡便方法制備完全寡糖糖苷；用于化學修飾糖單元，接著就可將該糖單元化學偶聯(lián)或酶促偶聯(lián)到寡糖糖苷上；或者用于化學制備寡糖糖苷(可在其上酶促偶聯(lián)一個或多個糖單元)。
糖單元的化學修飾是本領(lǐng)域熟知的，通常采用這些方法并針對每個需要合成的單個結(jié)構(gòu)最優(yōu)化。一般說來，全部或部分寡糖的化學合成首先涉及還原糖的異頭碳原子上糖苷鍵的形成。具體地說，在還原單元的端基異構(gòu)中心選擇性地修飾天然的或化學修飾的糖結(jié)構(gòu)(糖基供體)的適當保護形式以便引入一個離去基(包括鹵化物、三氯乙酰亞胺酸酯(trichloroacetimidate)、硫糖苷等)。然后，在催化條件[例如可溶性銀鹽，例如三氟甲磺酸銀；路易斯酸，例如三氟化硼醚合物或三甲代甲硅烷基三氟甲磺酸酯；或者硫糖苷啟動子，例如三氟甲磺酸甲酯或二甲基(甲硫基)锍三氟甲磺酸酯]下將所述供體與苷元或碳水化合物受體的適當形式(它在要形成糖苷鍵的位置具有一個游離羥基)反應(yīng)。多種苷元部分是本領(lǐng)域已知的，并且可呈合適的構(gòu)型被連接到所述還原單元的端基異構(gòu)中心。適當應(yīng)用相容性的保護基團(碳水化合物合成的技術(shù)中熟知的)將允許選擇性修飾合成的結(jié)構(gòu)或者進一步將另外的糖單元或糖部分連接到受體結(jié)構(gòu)。
在形成糖苷鍵之后，所述寡糖可被用于偶聯(lián)另外的糖單元或在選定的位置進行化學修飾，或者，在常規(guī)去保護后用于酶促合成。通常，天然的或化學修飾的糖單元與糖苷的化學偶聯(lián)是通過應(yīng)用文獻中充分記載的既定的化學性質(zhì)進行的。例如，參見Okamoto等32、Ratcliffe等33、Abbas等34、Paulsen35、Schmidt36、Fugedi等37和Kameyama等38。這些文獻每篇的公開內(nèi)容都以它們的全文并入本文作參考。
另一方面，酶促偶聯(lián)是通過應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶進行的，糖基轉(zhuǎn)移酶將作為它們的適當核苷酸供體活化的糖單元轉(zhuǎn)移到特定的糖或寡糖受體(通常在所述糖或寡糖的非還原糖部分處)。例如，參見Toone等62和美國專利No.5,374,65567。此外，有可能對糖或寡糖受體、糖供體或酶促反應(yīng)產(chǎn)物進行選擇性化學修飾以便引入修飾或在結(jié)構(gòu)內(nèi)進一步修飾。唾液酸的類似物的制備唾液酸的某些類似物是本領(lǐng)域熟知的，是應(yīng)用本領(lǐng)域充分記載的方法通過唾液酸的化學修飾制備的。例如，文獻中報導了化學修飾的Neu5Ac衍生物，它們包括9-疊氮基-Neu5Ac39、各種9-氨基-Neu5Ac衍生物40、9-脫氧-Neu5Ac41、9-氟-Neu5Ac42、9-溴-Neu5Ac43、8-脫氧-Neu5Ac41、8-表-Neu5Ac44、7-脫氧-Neu5Ac47、-表-Neu5Ac45、7,8-二表-Neu5Ac45、4-O-甲基-Neu5Ac53、4-N-乙酰-Neu5Ac48、4-表-Neu5Ac47、4,7-二脫氧-Neu5Ac41、4-氧代-Neu5Ac49、4-脫氧-Neu5Ac52、3-羥基-Neu5Ac50、3-氟-Neu5Ac51酸、在C-8或C-7處側(cè)鏈的解離產(chǎn)物46以及Neu5Ac的6-硫代類似物54。其它唾液酸類似物被公開于美國專利No.5,352,6703中。導致其它唾液酸類似物的化學修飾應(yīng)當按這些既定的方法。唾液酸的類似物至它們的CMP-核苷酸衍生物的活化唾液酸的類似物的酶促轉(zhuǎn)移需要先合成(即，活化)它們的核苷酸(CMP)衍生物。唾液酸的類似物的活化通常是通過應(yīng)用酶CMP-唾液酸合酶(它容易獲得)進行的，文獻提供了各種唾液酸的類似物的活化實例，例如9-取代的Neu5Ac28,39,40,55-57、7-表Neu5Ac58、7,8-二表-Neu5Ac58、4-O-甲基-Neu5Ac59、4-脫氧-Neu5Ac60、4-乙酰氨基-Neu5Ac48、7-脫氧-Neu5Ac56、4,7-二脫氧-Neu5Ac56、Neu5Ac的6-硫代衍生物61和Neu5OH(KDN)。還有其它活化的唾液酸類似物的實例被公開于美國專利No.5,352,6703。唾液酸的類似物至寡糖受體的轉(zhuǎn)移在與巖藻糖基化寡糖相容的選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶存在下，在一定的條件(其中，唾液酸或其類似物被轉(zhuǎn)移到受體)下，唾液酸的相容性類似物的核苷酸衍生物和相容性受體[即，巖藻糖基化寡糖或在非還原末端具有末端糖單元的寡糖(它們被選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶識別)]彼此結(jié)合。顯然，應(yīng)用的糖或寡糖受體必須是這樣的物質(zhì)它起應(yīng)用的特定唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物的作用。
在這方面，技術(shù)上認識到人工受體在某些情況下為唾液酸轉(zhuǎn)移酶(尤其當在所述結(jié)構(gòu)的苷元部分中修飾時)所耐受。
同樣，當唾液酸的類似物(即，人工供體)被酶促轉(zhuǎn)移時，要求所述類似物的CMP衍生物也被唾液酸轉(zhuǎn)移酶識別。在這方面，技術(shù)上認識到某些唾液酸轉(zhuǎn)移酶能耐天然唾液酸的一些修飾，所以，仍將這些唾液酸的類似物轉(zhuǎn)移到具有合適的末端受體結(jié)構(gòu)的糖蛋白或糖脂上。
發(fā)現(xiàn)了，唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有足夠的識別靈活性以致將人工供體轉(zhuǎn)移到人工受體3。這樣的靈活性使得容易合成一批寡糖，該寡糖在其非還原糖末端含有不同的唾液酸類似物。
如上所示，在唾液酸轉(zhuǎn)移酶存在下，在一定的條件(其中，唾液酸或其類似物被轉(zhuǎn)移到受體)下，相容性唾液酸的核苷酸衍生物或其相容性類似物與相容性受體[即，一種糖或在非還原末端具有末端糖單元的寡糖(它們被選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶識別)]彼此結(jié)合。本領(lǐng)域已知的合適的條件包括在適當?shù)膒H和溫度條件(例如6.5～7.5的pH和25℃～45℃、優(yōu)選35℃～40℃的溫度)下，將適當?shù)耐僖核徂D(zhuǎn)移酶添加到相容性受體和相容性唾液酸類似物的CMP-衍生物在適當緩沖劑(例如0.1M卡可酸鈉)的混合物中達12小時～4天。生成的寡糖可應(yīng)用常規(guī)方法(包括HPLC、離子交換色譜法、凝膠色譜法、反相色譜法和吸附色譜法)分離和純化。
一旦形成，α-唾液酸化寡糖糖苷就可通過化學方法和/或酶促方法被進一步修飾而進一步衍生化該化合物。例如，可應(yīng)用其它糖基轉(zhuǎn)移酶來將糖基加到被所述轉(zhuǎn)移酶識別的α-唾液酸化寡糖上。后一方面是重要的，因為對寡糖進行的修飾必須與期望的酶促轉(zhuǎn)移一致。
另外，α唾液酸化寡糖可被化學修飾而將這些化合物進一步衍生化。這樣的化學修飾包括將唾液酸類似物上的9-疊氮基還原成氨基，它還可被進一步官能化成另一衍生物(例如9-乙酰氨基衍生物)。類似地，見于唾液酸類似物上的羧基可在α唾液酸化寡糖糖苷上通過內(nèi)酯化、還原或變換而被選擇性地轉(zhuǎn)化成酰胺。
在上文敘述的一步或多步酶促步驟中，可將酶與固體載體結(jié)合而便于試劑的反應(yīng)和從酶回收產(chǎn)品。C．應(yīng)用本發(fā)明的方法適用于制備含有唾液酸或其類似物的寡糖(所述唾液酸或其類似物通過α鍵被連接到寡糖的非還原糖末端)。這樣的寡糖在本領(lǐng)域中被公認適用作藥物，以及在這些結(jié)構(gòu)的抗體生成中被公認，所述抗體適用于診斷分析。
另外，本發(fā)明的方法適用于制備含有唾液酸的類似物的寡糖(所述唾液酸的類似物通過α鍵被連接到寡糖的非還原糖末端)，該寡糖可被偶聯(lián)到抗原性載體從而產(chǎn)生人工抗原。所以，這樣的寡糖在人工抗原的制備中起中間體的作用。
此外，本發(fā)明的方法適用于測定未知寡糖的非還原末端。具體地說，可將未知寡糖受體的第一份等分樣與一種唾液酸轉(zhuǎn)移酶(它不能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖的非還原末端唾液酸化)接觸，測定所述寡糖是否被唾液酸化了；還將所述未知寡糖的第二份等分樣與α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(它能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖的非還原末端唾液酸化)接觸，測定所述寡糖是否被唾液酸化了；將結(jié)果進行比較從而確定所述非還原末端是否被巖藻糖基化了。如果所述未知受體的第一份等分樣未被唾液酸化，而受體的第二份等分樣被唾液酸化了，那么，所述受體在非還原次末端糖位置被巖藻糖基化了。
實施例提供了如下實施例來闡述本發(fā)明，但不能認為以任何方式限制本在這些實施例中，除非下文另外定義，應(yīng)用的縮寫具有它們的通常被認可的含義PBS=磷酸鹽緩沖鹽水MES=嗎啉乙磺酸PMSF =α-甲苯磺酰氟Lex-gr=8-甲氧基羰基辛基α-L-巖藻糖基-(1→3)-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)]-β-D-2-乙酰胺-2-脫氧-吡喃葡萄糖苷Lea-gr =8-甲氧基羰基辛基β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)[α-L-巖藻糖基-(1→4)]-β-D-2-乙酰胺-2-脫氧-吡喃葡萄糖苷CMP-NANA=胞苷5′-一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨糖酸CMP-3H-NANA=胞苷5′-一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨糖酸[唾液酸-9-3H]BSA =牛血清白蛋白d =雙峰dd =一對雙峰s =單峰t =三峰GDP-Fuc =鳥苷-5′二磷酸-L-巖藻糖UDP-半乳糖 =尿苷-5′-二磷酸-半乳糖TMR =四甲基羅丹明可商購的組分是生產(chǎn)商列出的。一些敘述的生產(chǎn)商如下Millipore=Millipore Corp.,Bedford Mass。Waters=Waters Corp.,Milford,Mass。Boehringer Mannheim=Boehringer Mannheim,Laval,Quebec,Canada實施例1．病毒α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶細胞溶胞產(chǎn)物的制備粘液瘤病毒α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶細胞溶胞產(chǎn)物是通過與國際專利申請公開No.WO97/1830265(將它并入本文作參考)陳述的相似方法制備的。
用巴西粘液瘤病毒株Lausanne(Lu)(ATCC VR-115)(Campinas，巴西，1949分離的)和Uriarra(Ur)(澳大利亞首都地區(qū)，1953分離的)[Moses株(ATCC VR-116)的衍生物]感染十個T180瓶中的歐洲兔腎細胞(RK13)鋪滿層。將所述細胞保持在37℃達24小時。感染二十四小時后，通過刮除分離細胞，用PBS洗滌。通過在4℃下懸浮于20mL萃取緩沖液(50 mM MES,pH6．1,0.5％Triton-X100,100 mM NaCl,1.5 mM MgCl2,0.1 mM PMSF,10 mg/ml抑酶肽)中達45分鐘制備了細胞溶胞產(chǎn)物。通過在4℃下2,000g下離心15分鐘澄清溶胞產(chǎn)物。
回收上清液，溶于加樣緩沖液(50 mM MES,pH6．1,0.1％Triton-CF54,100 mM NaCl,25％甘油)而加到5 mL HiTrap Blue親和層析柱(Pharmacia,Piscataway NJ)上。用分步NaCl洗脫液(0.5M、1.0 M、1.5 M和2.0 M NaCl)從柱上洗脫α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。把洗脫液通過于柱緩沖液(50 mMES,pH6．1,0.1％Triton-CF54,25％甘油)中的PD-10柱(BioRad,Hercules,CA)而使α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶脫鹽。
應(yīng)用Bradford Bio-Rad按生產(chǎn)商的指示(用IgG作為蛋白質(zhì)標準物)測定了總蛋白質(zhì)濃度。實施例2．唾液酸至Lewisa和Lewisx寡糖受體的轉(zhuǎn)移將受體(54 nmol)、CMP-NANA(40 nmol)和CMP-3H-NANA(150,000～180,000 dpm)添加到0.5 mL微量離心管(microfuge tube)內(nèi)細胞溶胞產(chǎn)物(16μL)、水(3μL)和1μL分析緩沖液(250 mM MES,0.5％TrionCF54,pH7.0)的混合物中。將反應(yīng)混合物在37℃下保溫，用水稀釋到200μL，裝填到已用20 mL MeOH和20 mL水預(yù)平衡過的C18Sep-Pak反相柱體上。用50 mL水洗滌該柱體，用4 mL MeOH將產(chǎn)品洗脫入閃爍小管。通過在Beckman液體閃爍計數(shù)器(LS 1801)內(nèi)10 mL EcoLite(+)閃爍混合物(ICN,Montreal,Quebec,Canada)中的液體閃爍定量分析了MeOH洗脫液中的放射性活度。
重復(fù)試驗中轉(zhuǎn)移到不同受體的放射性結(jié)果如下
實施例3．唾液酸至各種寡糖受體的轉(zhuǎn)移測試了分離的病毒α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移唾液酸至各種受體的能力。
將受體(54 nmol)、CMP-NANA(40 hmol)和CMP-3H-NANA(150,000～180,000 dpm)添加到0.5 mL微量離心管內(nèi)細胞溶胞產(chǎn)物(16μL)、水(3μL)和分析緩沖液(250 mM MES,0.5％Triton CF54,pH6.1)的混合物中。將反應(yīng)混合物在37℃下保溫，用水稀釋，通過如上實施例2中給出的方法進行測定而獲得轉(zhuǎn)移的相對速度。用模擬法通過將受體濃度從約0.2×Km變到3×Km進行了動力學分析。
gr=(CH2)8COOMeCMP-NANA=胞苷5′-一磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨糖酸1這些化合物起病毒α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體的作用，但不是以前已知的哺乳動物α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體。
這表明了，病毒α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶能利用一些不同的寡糖結(jié)構(gòu)作為唾液酸的轉(zhuǎn)移的受體。實施例4．唾液酸與Lewisa和Lewisx寡糖受體的2,3-鍵的證實將Lea-TMR(35 nmol)和CMP-NANA(200 nmol)與病毒細胞溶胞產(chǎn)物(4.9μL)和堿性磷酸酶溶液(0.1μL)[5μL堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)1000U/ml和1μL BSA溶液(100 mg/mL)]保溫。在室溫(25℃)下緩慢旋轉(zhuǎn)42小時后，往該混合物中添加追加的堿性磷酸酶溶液(0.2μL)和CMP-NANA溶液(100 mM,0.2μL)，使之在室溫下又反應(yīng)2天。將反應(yīng)混合物升溫并保持在37℃達48小時，然后，將混合物裝填到已用10 mL MeOH和10 mL水預(yù)平衡的C18-Sep-Pak柱體(Waters)上。用5 mL水洗滌柱體，再用5 mL MeOH洗脫TMR-標記的化合物。真空干燥該溶液，流過一個濾器(Milliex-GV濾器，0.22μm,MilliporeCorp.)，凍干。往于物質(zhì)中添加水配成100μMTMR濃度。將該溶液(0.5μL)與毛細管電泳流動緩沖液(10 mM磷酸鹽、10 mM硼酸鈉、10 mM十二烷基硫酸鈉、10 mM苯基硼酸pH9.0,499.5μL)混合。將該溶液用于分離和分析，即，應(yīng)用Le等66提出的方法，采用激光誘導的熒光檢測通過毛細管電泳分離和分析。酶反應(yīng)中產(chǎn)生的新產(chǎn)物峰具有與真正的唾液酸化Lex-TMR相同的遷移時間，通過用神經(jīng)氨酸酶處理又將所述新產(chǎn)物峰轉(zhuǎn)回到Lex-TMR。實施例5．唾液酸Lex-gr的制備性合成將細胞溶胞產(chǎn)物(14 mL)與BSA溶液(5μL,100 mg/mL)混合。在Slide-A lyzer(Pierce Chemical Company,Rockford,Illilnois)中濃縮該溶液至1.8 mL。將Lex-gr(4.7 mg,6.7μmol)和CMP-NANA(6.8mg,10.3μmol)添加到200μL濃縮后的細胞溶胞產(chǎn)物中。添加堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim,1000U/mL,10μL)。在室溫下將反應(yīng)混合物旋轉(zhuǎn)24天。在該保溫過程中，添加CMP-NANA[6次，3天、7天、11天后(每次3.0 mg)；14天、18天、21天后(每次2.0 mg)]。將混合物裝填到已用10 mL MeOH和10 mL水預(yù)平衡的C18-Sep-Pak柱體(Waters)上。用40 mL水洗滌柱體，再用50 mL 10％MeOH洗脫產(chǎn)品。真空干燥洗脫液，再次裝填到已用10 mL MeOH和10 mL水預(yù)平衡的C18-Sep-Pak柱體上。先用水(10 mL)、1％MeOH(10 mL)洗滌，再用5％MeOH(10 mL)洗滌后，用10％MeOH(17 mL)洗脫所需的產(chǎn)品。真空干燥該溶液，流過一個濾器(Milliex-GV濾器，0.22μm，Millipore Corp.)，凍干而給出唾液酸化Lex-gr(2.19 mg,33％)。通過NMR光譜和質(zhì)譜證實了產(chǎn)品唾液酸Lex-gr的結(jié)構(gòu)。NMR(300Hz，只示出了特征峰，D2O)δ 5.10(d,H,=3.9Hz,H-1(Fuc)),4.51(d,2H,J=8.0Hz,H-1(Gal,GlcNAc)),3.69(s,3H,CO2Me),2.76(dd,H,J=4.7,12.6Hz,H-3,(NANA)),2.38(t,2H,J=11.4 Hz,CH2CO2Me),2.04(s,3H,Ac),2.02(s,3H,Ac),1.79(t,H,J=12.2,1.8Hz,H-3(NANA)),1.17(d,3H,J=6.6Hz,H-6(Fuc)).關(guān)于C41H69N2O25計算的質(zhì)量=989.4；實測989.0還按類似方法從Lea-gr合成了唾液酸化Lea-gr。通過NMR光譜和質(zhì)譜證實了它的結(jié)構(gòu)。NMR(300Hz,只示出了特征峰，D2O)δ5.00(d,H,J=3.9Hz,H-1(Fuc)),4.52(d,2H,J=7.7 Hz,H-1(Gal,GlcNAc)),3.69(s,3H,CO2Me),2.76(dd,H,J=4.7,12.5Hz,H-3,(NANA)),2.39(t,2H,J=7.3Hz,CH2CO2Me),2.02(s,6H,Ac),1.76(t,H,J=12.3,H-3(NANA)),1.16(d,3H,J=6.4Hz,H-6(Fuc)).關(guān)于C41H69N2O25計算的質(zhì)量=989.4；實測989.0實施例6．從GlcNAc-TMR合成唾液酸Lex-TMR將GlcNAc-TMR(35 nmol)、UDP-半乳糖(70 nmol)、0.5μL分離的牛乳β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(0.3 mU)、GDP-巖藻糖(70 nmol)、0.5μL分離的人乳α1,3,4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(0.03 mU)、CMP-NANA(100nmol)、0.1μL1 M MnCl2和0.1μL堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim,10 mU)與5.7μL濃縮的病毒細胞溶胞產(chǎn)物溶液保溫。在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)24小時后，取出0.2μL等分樣，在硅膠60F254薄層層析板(Merck,Darmstadt Germany)上涂成斑點。用異丙醇H2O∶NH4OH(7∶2∶1)展開層析板。Lex-TMR(Rf=0.18)和唾液酸Lex-TMR(Rf=0.30)都是可見的，這是由于存在粉紅色生色團TMR的緣故。這些Rfs相應(yīng)于真實物質(zhì)和酶反應(yīng)混合物中形成的唾液酸Lex-TMR的那些(與唾液酸Lex-TMR一起遷移的)。未檢測到原料GlcNAc-TMR(Rf=0.39)和反應(yīng)中間體LacNAc-TMR(Rf=0.25)。實施例7．從Lec-TMR合成唾液酸Lea-TMR將Lec-TMR(15 nmol)、GDP-巖藻糖(70 nmol)、0.5μL分離的人乳α1,3,4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(0.03 mU)、CMP-NANA(100 nmol)、0.1μL1M MnCl2和0.1μL堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim,10 mU)與5.1μL濃縮的病毒細胞溶胞產(chǎn)物溶液保溫。在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)72小時后，取出0.2μL等分樣，在硅膠60F254薄層層析板(Merck,DarmstadtGermany)上涂成斑點。用異丙醇H2O∶NH4OH(7∶2∶1)展開層析板。Lea-TMR(Rf=0.18)和唾液酸Lea-TMR(Rf=0.25)都是可見的，這是由于存在粉紅色生色團TMR的緣故。這些Rfs相應(yīng)于真實物質(zhì)和酶反應(yīng)混合物中形成的唾液酸Lea-TMR的那些(與唾液酸Lea-TMR一起遷移的)。未檢測到原料Lec-TMR(Rf=0.31)。
權(quán)利要求
1．一種酶促合成含唾液酸或其類似物的α-2,3唾液酸化巖藻糖基化寡糖的方法，該方法包括如下步驟a)選擇與在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的巖藻糖基化寡糖相容的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶；b)選擇與步驟(a)中選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶相容的CMP-唾液酸或其類似物；c)在如上步驟(a)中選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶存在下，在使唾液酸或其類似物從CMP-唾液酸或其類似物轉(zhuǎn)移到巖藻糖基化寡糖的非還原糖末端的條件下，將所述CMP-唾液酸或其類似物與下式的巖藻糖基化寡糖接觸 其中，R1表示糖殘基，R2表示糖殘基，并且，R1和R2一起表示選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體；n是0～約10,Y選自O(shè)、NH和S,R3選自H、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或具有至少一個碳原子的苷元部分；從而形成含唾液酸或其類似物的α-2,3唾液酸化巖藻糖基化寡糖。
2．權(quán)利要求1的方法，其中，所述苷元部分選自-(A)-Z′，其中，A表示一個鍵，2～10個碳原子的亞烷基，以及式-(CH2CR4R5G)n(CH2CR4R5)-這樣的一個部分，其中，n是等于0～5的整數(shù)；R4和R5獨立地選自氫，苯基，被1～3個選自胺、羥基、鹵素、1～4個碳原子的烷基和1～4個碳原子的烷氧基的取代基取代的苯基，甲基或者乙基；G選自一個鍵，氧，硫，NH；Z′選自氫、甲基、-OH、-SH、-NH2、-NHR6、-N(R6)2、-C(O)OH、-C(O)OR6、-C(O)NHNH2、-C(O)NH2、-C(O)NHR6、-C(O)N(R6)2和-OR7，其中，每個R6獨立地是1～4個碳原子的烷基，R7是3～10個碳原子的烯基。
3．一種酶促合成巖藻糖基化和α-2,3唾液酸化寡糖的方法，該方法包括如下步驟a)選擇一種能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖唾液酸化的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶；b)選擇一種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；c)選擇與步驟(a)中選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶相容的CMP-唾液酸或其類似物；d)選擇與步驟(b)中選定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶相容的GDP-巖藻糖或其類似物；e)在如上步驟(a)和步驟(b)中選定的所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶和所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶存在下，在使唾液酸或其類似物以及巖藻糖或其類似物分別從CMP-唾液酸或其類似物以及GDP-巖藻糖或其類似物轉(zhuǎn)移到所述寡糖的非還原糖末端的條件下，將所述CMP-唾液酸或其類似物以及所述GDP-巖藻糖或其類似物與下式的寡糖接觸R1-R2-(糖)n-Y-R3其中，R1表示糖殘基，R2表示糖殘基，并且，R1和R2一起表示選定的唾液酸轉(zhuǎn)移酶和選定的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的受體；n是0～約10,Y選自O(shè)、NH和S,R3選自H、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或具有至少一個碳原子的苷元部分；從而形成α-2,3唾液酸化巖藻糖基化寡糖。
4．權(quán)利要求3的方法，其中，所述苷元部分選自-(A)-Z′，其中，A表示一個鍵，2～10個碳原子的亞烷基，以及式-(CH2CR4R5G)n(CH2CR4R5)-這樣的一個部分，其中，n是等于0～5的整數(shù)；R4和R5獨立地選自氫，苯基，被1～3個選自胺、羥基、鹵素、1～4個碳原子的烷基和1～4個碳原子的烷氧基的取代基取代的苯基，甲基或者乙基；G選自一個鍵，氧，硫，NH；Z′選自氫、甲基、-OH、-SH、-NH2、-NHR6、-N(R6)2、-C(O)OH、-C(O)OR6、-C(O)NHNH2、-C(O)NH2、-C(O)NHR6、-C(O)N(R6)2和-OR7，其中，每個R6獨立地是1～4個碳原子的烷基，R7是3～10個碳原子的烯基。
5．一種測定未知寡糖受體的非還原末端結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括如下步驟a)將所述寡糖受體與不能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖的非還原末端唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸，測定所述寡糖是否被唾液酸化了；b)將所述寡糖與能使在非還原次末端糖位置具有一個巖藻糖基的寡糖的非還原末端唾液酸化的α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸，測定所述寡糖是否被唾液酸化了；以及c)比較所得結(jié)果，確定所述非還原末端是否被巖藻糖基化了。
6．權(quán)利要求5的方法，其中，步驟(c)包括確定如果未知受體在權(quán)利要求5的步驟(a)中未被唾液酸化但在權(quán)利要求5的步驟(b)中被唾液酸化了，那么，未知受體在非還原次末端糖位置被巖藻糖基化了。
全文摘要
公開了酶促合成α－唾液酸化寡糖糖苷的方法。具體地說，在公開的方法中，應(yīng)用α2,3－唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸的類似物(作為它的CMP－核苷酸衍生物應(yīng)用的)轉(zhuǎn)移到寡糖的非還原糖末端，所述寡糖在非還原糖末端的次末端糖單元中具有一個巖藻糖基。在該方法中選擇應(yīng)用的唾液酸類似物和寡糖與應(yīng)用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶應(yīng)是相容的。
文檔編號C12P19/00GK1317053SQ99810599
公開日2001年10月10日 申請日期1999年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月3日
發(fā)明者M·M·帕爾西克, K·筋野 申請人:辛索爾布生物技術(shù)有限公司