專利名稱：植物啟動(dòng)子和植物終止子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及植物啟動(dòng)子、植物終止子等。
2．相關(guān)技術(shù)描述多次嘗試通過(guò)將基因?qū)胫参锊⑹怪磉_(dá)，從而產(chǎn)生提供有用特性的各種轉(zhuǎn)基因植物，而且這些轉(zhuǎn)基因植物中的一些早已成為商業(yè)行為。為了產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因植物，重要的是使導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因有效表達(dá)。啟動(dòng)子是決定基因轉(zhuǎn)錄水平的主要因素，所以將感興趣的基因置于具有高轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子的控制下，一般可能增強(qiáng)該基因的表達(dá)。而且，由于終止子除了給出終止轉(zhuǎn)錄的指令之外，還對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA的加工和降解有重要作用，所在以緊隨感興趣基因翻譯區(qū)的3’末端之后插入終止子常?？梢杂行г黾釉摶虻谋磉_(dá)。
然而，通過(guò)導(dǎo)入感興趣基因可以在植物育種中使用的植物啟動(dòng)子和植物終止子至今仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，因此，強(qiáng)烈要求開發(fā)能夠在植物中有效表達(dá)感興趣基因的新的啟動(dòng)子和終止子。
發(fā)明概述在這樣的環(huán)境下，本發(fā)明人集中精力于研究能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子，并由此發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用具有特殊核苷酸序列的DNA，可以使感興趣基因在植物的葉、根、莖等組織中有效表達(dá)。本發(fā)明在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成。
由此，本發(fā)明提供下列各項(xiàng)1．包含下面的DNA(a)或(b)、特征為能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入，并且與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域同一性超過(guò)90％的核苷酸序列的DNA，該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。2．包含下面的DNA(a)或(b)、特征為能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的終止子(a)包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入，并且與SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域同一性超過(guò)90％的核苷酸序列的DNA，該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。3．特征為包含以能夠發(fā)揮功能的形式彼此連接的上述1的啟動(dòng)子和目的基因的嵌合基因。4．特征為包含以能夠發(fā)揮功能的形式彼此連接的上述1的啟動(dòng)子、目的基因、和上述2的終止子的嵌合基因。5．特征為包含上述1的啟動(dòng)子的載體。6．特征為包含上述1的啟動(dòng)子和目的基因的載體。7．特征為包含上述1的啟動(dòng)子、目的基因、和上述2的終止子的載體。8．產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法，其特征為包含將上述1的啟動(dòng)子、上述3或4的嵌合基因、和上述5、6、或7的載體中的任何一種導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟。9．特征為攜帶已導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的上述1的啟動(dòng)子、上述3或4的嵌合基因、和上述5、6、或7的載體中的任何一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化體。10．特征為宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞的上述9的轉(zhuǎn)化體。11．表達(dá)基因的方法，其特征為包含將上述1的啟動(dòng)子和位于該啟動(dòng)子下游的目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的步驟，和在宿主細(xì)胞中在所述啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該目的基因的步驟。12．表達(dá)基因的方法，其特征為包含將上述2的終止子和位于該終止子上游的目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的步驟，和在宿主細(xì)胞中在所述終止子的控制下表達(dá)該目的基因的步驟。
根據(jù)下文的詳述，本發(fā)明應(yīng)用性的其它方面將是顯而易見的。然而，應(yīng)當(dāng)這樣理解，詳述和特殊實(shí)施例只是以例示性方式說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，因?yàn)楦鶕?jù)此詳述，本發(fā)明范圍內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
貫穿此說(shuō)明書及其后權(quán)利要求，除非有其它要求，“包含”一詞應(yīng)當(dāng)理解為意指包括所述整體或步驟、或者整體或步驟的集合，而非排除任何其它整體或步驟、或者整體或步驟的集合。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了包含本發(fā)明啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCR16G6P的限制酶圖譜。“啟動(dòng)子”指本發(fā)明的啟動(dòng)子。同樣的，“Amp”表示氨芐青霉素抗性基因；“l(fā)acI”表示乳糖操縱子的阻遏蛋白基因；“l(fā)acZ”表示β-半乳糖苷酶基因；而“ORI”表示復(fù)制起點(diǎn)。
圖2顯示了包含本發(fā)明終止子的質(zhì)粒pCR16G6T的限制酶圖譜?！敖K止子”指本發(fā)明的終止子。同樣的，“Amp”表示氨芐青霉素抗性基因；“l(fā)acI”表示乳糖操縱子的阻遏蛋白基因；“l(fā)acZ”表示β-半乳糖苷酶基因；而“ORI”表示復(fù)制起點(diǎn)。
圖3顯示了插入了本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體pBICR16G6P的限制酶圖譜和構(gòu)建過(guò)程?！癎6-p”指本發(fā)明的啟動(dòng)子?！皀os-p”指胭脂堿合酶基因的啟動(dòng)子；“nos-t”指胭脂堿合酶基因的終止子；而“35S-p”指花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。同樣的，“NPTⅡ”表示卡那霉素抗性基因；“GUS”表示β-葡糖醛酸糖苷酶基因；而“HPT”表示潮霉素抗性基因。
圖4顯示了插入了本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)載體pBICR16G6PTΔG的限制酶圖譜和構(gòu)建過(guò)程?！癎6-p”指本發(fā)明的啟動(dòng)子，而“G6-t”指本發(fā)明的終止子。“G6-t’”指由“G6-t”缺失HindⅢ切割位點(diǎn)后衍生得到的終止子?！癛B”和“LB”分別指位于二元載體上的右邊界序列和左邊界序列?！癎US”表示β-葡糖醛酸糖苷酶基因。
發(fā)明詳述本發(fā)明由下文更詳細(xì)的描述。
本發(fā)明中使用的基因工程技術(shù)可以根據(jù)常用步驟進(jìn)行，例如J.Sambrook、E.F.Frisch和T.Maniatis在《分子克隆(MolecularCloning)》第2版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)和D.M.Glover在《DNA克隆(DNA Cloning)》(IRL出版社，1985)中描述的。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指具有起始位于該DNA下游的感興趣基因轉(zhuǎn)錄的功能的DNA。
本發(fā)明的啟動(dòng)子包括下列DNA(a)或(b)(下文稱為本發(fā)明啟動(dòng)子DNA)(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入，并且與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域同一性超過(guò)90％的核苷酸序列的DNA，該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。
在本文中，“其中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列”的范例可以包括那些包含天然發(fā)生的變異(因生物體間的物種或個(gè)體差異或者制備DNA的組織間的差異引起)或人工導(dǎo)入DNA的變異的核苷酸序列?！吧飳W(xué)功能與上述DNA(a)等效”的DNA可以是，例如那些包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA(條件是它們保留了在植物細(xì)胞中的啟動(dòng)子功能)，和與SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域同一性超過(guò)90％的DNA。這些DNA可以是那些由天然來(lái)源克隆的DNA，或在由天然來(lái)源克隆的DNA中包含人工導(dǎo)入的缺失、取代、或加入堿基的DNA，或通過(guò)化學(xué)合成而人工產(chǎn)生的DNA。
而且通過(guò)將本發(fā)明啟動(dòng)子和目的基因(位于該啟動(dòng)子的下游)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟，和在宿主細(xì)胞中在該啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該目的基因的步驟，有可能增加目的基因的表達(dá)效率。
該啟動(dòng)子DNA可以由例如胡蘿卜(諸如Daucus carota)的基因組DNA通過(guò)PCR方法進(jìn)行分離。
具體而言，由胡蘿卜(諸如Daucus carota)葉片收集組織，將得到的組織在液氮中凍結(jié)，隨后用研缽等物理研磨成細(xì)粉狀組織碎片。由組織碎片通過(guò)常用方法提取基因組DNA，例如通過(guò)M.Shure等人(細(xì)胞(Cell)35:225,1983)描述的CTAB方法或S.O.Rogers和A.J.Bendich(植物分子細(xì)胞學(xué)(Plant Mol.BIol.)5:69,1985)描述的尿素-酚方法。例如，可以以得到的基因組DNA作為模板，以具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7中第1位至第20位堿基表示的核苷酸序列的寡核苷酸，和具有與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7中第2029位至第2052位堿基表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行一輪至多輪PCR(反應(yīng)條件例如一輪至多輪PCR的每一輪進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃2min；74℃3min)，以擴(kuò)增包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA。作為這種引物使用的寡核苷酸可以根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列正確設(shè)計(jì)，而且可以任選的在它們的5’末端包含額外的核苷酸序列(諸如限制酶識(shí)別核苷酸序列)。
可以根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)或《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols In Molecular Biology)》(1987,John,Wiley&Sons,Inc.,ISBNO-471-50338-X)中描述的常用方法,將如上所述擴(kuò)增的DNA克隆到載體中。具體而言，可以使用諸如TA克隆試劑盒(TA Cloning Kit,Invirogen公司)中的質(zhì)粒載體或pBluescriptⅡ(STRATAGENE)等質(zhì)粒載體進(jìn)行克隆?？梢酝ㄟ^(guò)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》(第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，13.42-13.74)中描述的染料雙脫氧終止方法，分析克隆的DNA的核苷酸序列。為了制備用于核苷酸序列分析的樣品，可以任選的使用諸如ABI PRISM染料終止物循環(huán)測(cè)序簡(jiǎn)便反應(yīng)試劑盒(ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit,PE Biosystems)等商品化的試劑。
將報(bào)導(dǎo)基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶基因)連接在如上所述得到DNA的下游，按需要克隆到載體中，然后使用諸如下文描述的基因槍法或土壤桿菌感染法等方法導(dǎo)入培養(yǎng)的植物細(xì)胞(諸如煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2)。為了得到該啟動(dòng)子DNA，由培養(yǎng)細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，并通過(guò)酶學(xué)技術(shù)測(cè)量提取物的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以該活性值作為指示劑，或者通過(guò)將培養(yǎng)細(xì)胞在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并觀察藍(lán)色染料的附著，以染料附著程度作為指示劑，從而確認(rèn)上述DNA的啟動(dòng)子功能的存在與否。或者，可以相似的將與報(bào)導(dǎo)基因連接的上述DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞(諸如來(lái)自煙草野生型株系的細(xì)胞)，并可以由此細(xì)胞再生植株。為了得到該啟動(dòng)子DNA，可以通過(guò)測(cè)量來(lái)自植株或其后代的組織中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，或者通過(guò)將來(lái)自植株或其后代的組織或其部分在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并觀察藍(lán)色染料的附著，以染料附著程度作為指示劑，從而確認(rèn)上述DNA的啟動(dòng)子功能的存在與否。除了β-葡糖醛酸糖苷酶，其它基因，諸如蟲螢光素酶基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、和綠色熒光蛋白基因，也可以作為報(bào)導(dǎo)基因使用。
而且，該啟動(dòng)子DNA還可以如下獲得標(biāo)記例如至少包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:7所示部分核苷酸序列的DNA，并以此作為探針與得自植物等的DNA進(jìn)行雜交，以檢測(cè)并克隆探針特異結(jié)合的DNA。
在此方法中，可以將例如得自諸如胡蘿卜等植物的基因組DNA文庫(kù)作為與上述探針進(jìn)行雜交的DNA。關(guān)于這種DNA文庫(kù)，可以使用商品化的基因組DNA文庫(kù)，或者可以根據(jù)如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)或《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols InMolecular Biology)》(1987,John Wiley and Sons,Inc.,ISBNO-471-50338-X)中描述的用于文庫(kù)制備的常用方法，例如使用λ載體(諸如λFIXⅡ、λEMBL3、λEMBL4、或λDASHⅡ(STRATAGENE)和用于體外包裝的Gigapack包裝提取物(Gigapack PackagingExtracts,STRATAGENE)，制備供使用的基因組DNA文庫(kù)。
使探針與這些DNA雜交的方法可以包括菌落雜交和噬菌斑雜交，而正確的方法可以根據(jù)文庫(kù)制備中使用的載體類型進(jìn)行選擇。在使用質(zhì)粒載體構(gòu)建文庫(kù)的情況中，進(jìn)行菌落雜交。具體而言，首先將文庫(kù)中的DNA導(dǎo)入宿主生物體以獲得轉(zhuǎn)化體，將得到的轉(zhuǎn)化體稀釋，在瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，并于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落。另一方面，在使用噬菌體載體構(gòu)建文庫(kù)的情況中，進(jìn)行噬菌斑雜交。具體而言，首先將宿主生物體和文庫(kù)中的噬菌體在感染條件下混勻，然后進(jìn)一步與軟瓊脂培養(yǎng)基混勻，并在瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)噬菌斑。更具體的說(shuō)，例如根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2.60-2.65)中描述的方法，將大約9.0×105pfu噬菌體文庫(kù)在NZY瓊脂培養(yǎng)基中以0.1-1.0pfu/mm2瓊脂培養(yǎng)基的密度鋪開，并于37℃培養(yǎng)6-10小時(shí)。
在上述兩種雜交方法中，將膜鋪在上述培養(yǎng)物生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基表面，并將攜帶質(zhì)粒或噬菌體的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到膜上。用堿處理后，中和膜，并進(jìn)一步處理將DNA固定在膜上。更具體的說(shuō)，例如在噬菌斑雜交的情況中，根據(jù)，《克隆和測(cè)序植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Cloningand Sequencing:Plant Biotechnology Experimental Manual)》(Watanabe和Sugiura編，Noson-bunka-sha,1989)中描述的常用方法，將諸如硝酸纖維素或尼龍膜(如Hybond-N+,Amersham PharmaciaBiotech公司)等膜鋪在上述瓊脂培養(yǎng)基上，并放置大約1分鐘，使噬菌體顆粒吸附到膜上。然后，將膜在堿液(1.5M NaCl、0.5N NaOH)中浸泡大約3分鐘以裂解噬菌體顆粒并由此將噬菌體DNA釋放到膜上，然后將膜在中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl緩沖液，pH7.5)中浸泡大約5分鐘。用清洗液(300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉、200mMTris-HCl緩沖液)清洗大約5分鐘后，將膜于大約80℃烘烤大約90分鐘，以將噬菌體DNA固定在膜上。
將制備的膜與作為探針的上述DNA進(jìn)行雜交?？梢匀鏒.M.Glover編的《DNA克隆，一種實(shí)用的方法(DNA cloning,a practicalapproach)》(IRL出版社，1985,ISBN 0-947946-18-7)；《克隆和測(cè)序植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Watanabe和Sugiura編，Noson-bunka-sha,1989)；或《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版,J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)所述進(jìn)行雜交。
為了用放射性同位素標(biāo)記作為探針使用的DNA，可以使用例如隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(Random Labeling Kit,Boehringer Mannheim或TakaraShuzo有限公司)，或者也可能以用作探針的DNA作為模板，用[α-32P]dCTP取代dCTP，通過(guò)PCR標(biāo)記DNA?；蛘?，為了用熒光染料標(biāo)記作為探針使用的DNA，可以使用例如ECL直接核酸標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)(ECLDirect Nucleic Acid Labeling and Detection System,AmershamPharmacia Biotech公司)。
可以獲得多種用于進(jìn)行雜交的試劑和溫度條件。例如，可以每cm2如上制備的膜配制50-200μl體積的含450-900mM NaCl、45-90mM檸檬酸鈉、0.1-1.0％十二烷基磺酸鈉(SDS)、和0-200μg/ml變性的非特異的DNA(在某些情況中，可以任選的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的預(yù)雜交溶液，優(yōu)選含900mM NaCl、90mM檸檬酸鈉、1％SDS、和100μg/ml變性的小牛胸腺DNA的預(yù)雜交溶液，將上述膜浸泡在溶液中并于42-68℃溫育1-4小時(shí)，優(yōu)選于45℃2小時(shí)。然后，將例如含450-900mM NaCl、45-90mM檸檬酸鈉、0.1-1.0％SDS、和0-200μg/ml變性的非特異的DNA(在某些情況中，可以任選的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的雜交溶液等，優(yōu)選含900mM NaCl、90mM檸檬酸鈉、1％SDS、和100μg/ml變性的小牛胸腺DNA的雜交溶液，與通過(guò)上述方法得到的探針(相當(dāng)于1.0×104-2.0×106cpm/cm2膜的量)混和，以制備50-200μl/cm2膜的體積的混和液，將膜浸泡在混和液中并于42-68℃溫育4-20小時(shí)，優(yōu)選于45℃16小時(shí)，以實(shí)現(xiàn)雜交。雜交反應(yīng)后，回收膜，并用例如含15-300mM NaCl、1.5-30mM檸檬酸鈉、0.1-1.0％SDS的清洗液等于42-68℃，優(yōu)選用含300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉、1％SDS的清洗液于55℃，清洗1-4次(每次各10-60分鐘)，優(yōu)選2次(每次各15分鐘)。而且，將膜用2xSSC溶液(300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉)簡(jiǎn)單漂洗，然后干燥。通過(guò)例如放射自顯影，確定膜上探針的位置，以檢測(cè)膜上與所用探針雜交的DNA的位置。鑒定最初的瓊脂培養(yǎng)基上與膜上檢測(cè)到的DNA位置對(duì)應(yīng)的克隆，可以挑取用于分離攜帶那些DNA的克隆。具體而言，將膜暴露于成像板(Fuji Photo Film有限公司)4小時(shí)，并使用BAS 2000(Fuji Photo Film有限公司)分析此成像板以檢測(cè)信號(hào)。由用于制備膜的瓊脂培養(yǎng)基，切下檢測(cè)到信號(hào)的相應(yīng)位置的部分(大約5mm2的膠塊)，將這些膠塊在大約500μl SM緩沖液(50mM Tris-HCl緩沖液pH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4、0.01％明膠)中浸泡2-16小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)，以洗脫噬菌體顆粒。根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法，將得到的噬菌體顆粒洗脫液在瓊脂培養(yǎng)基上鋪開，并于37℃培養(yǎng)6-10小時(shí)。使用此瓊脂培養(yǎng)基，以上述相同方式將噬菌體DNA固定到膜上，并將此膜與上述探針進(jìn)行雜交。由檢測(cè)到的信號(hào)在用于制備膜的瓊脂培養(yǎng)基上相應(yīng)位置的膠塊，洗脫噬菌體顆粒，在瓊脂培養(yǎng)基上鋪開，并以上述相同方式制備膜，以進(jìn)行雜交。重復(fù)這些鑒定和純化步驟，以得到攜帶具有可與所有探針雜交的核苷酸序列的DNA的噬菌體克隆。
可以將通過(guò)上述雜交篩選得到的克隆所含DNA亞克隆到可以容易制備或分析DNA的質(zhì)粒載體中，諸如商品化的pUC18、pUC19、pBluescript KS+、或pBluescript KS-，以制備質(zhì)粒DNA，而且可以使用例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,13.42-13.74)中描述的染料雙脫氧終止法測(cè)定其核苷酸序列?？梢愿鶕?jù)例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,13.15)中描述的引物延伸法制備用于核苷酸序列分析的樣品?；蛘?，為了分析核苷酸序列，可以根據(jù)例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法在NZYM液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增噬菌體克隆，以制備噬菌體溶液。由此噬菌體溶液，可以使用例如Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit(Clontech Laboratories公司)提取噬菌體克隆DNA，并將得到的DNA在上述用于制備核苷酸序列分析樣品的引物延伸法中作為模板使用。
該啟動(dòng)子DNA可以通過(guò)如上所述測(cè)定由此得到的DNA的啟動(dòng)子功能而獲得。
該啟動(dòng)子DNA還可以通過(guò)在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA的核苷酸序列中導(dǎo)入突變而獲得。具體而言，可以根據(jù)例如A.Greener和M.Callahan描述的方法(Strategies 7:32-34,1994)在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA中隨機(jī)導(dǎo)入突變，或者可以根據(jù)例如W.Kramer等人(核酸研究(Nucleic Acid Research)12:9441,1984)或W.Kramer和H.J.Frits(酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)154:350,1987)描述的缺口二聯(lián)體法，或根據(jù)T.A.Kunkel(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.of Natl.Acad.Sci.USA)82:488,1985)或T.A.Kunkel等人(酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)154:367,1987)描述的Kunkel法在包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA中位點(diǎn)特異的導(dǎo)入突變?；蛘?，具有在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7所示部分核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的寡核苷酸引物可以作為引物進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA。此外，可以產(chǎn)生SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)片段的部分核苷酸序列被其它啟動(dòng)子的部分核苷酸序列取代的嵌合DNA，還可以根據(jù)例如S.Henikoff等人(基因(Gene)28:351,1984)或C.Yanisch-Perron等人(基因(Gene)33:103,1985)描述的方法，制備具有其中SEQID NO:1所示部分核苷酸序列被缺失的核苷酸序列的DNA。該啟動(dòng)子DNA可以通過(guò)如上所述測(cè)定由此得到的DNA的啟動(dòng)子功能而獲得。
在如上所述得到的啟動(dòng)子DNA中，本發(fā)明啟動(dòng)子可以包含上文定義的DNA(a)或(b)，或者二者兼之，還可以重復(fù)包含這些DNA。
另外，本發(fā)明啟動(dòng)子還可以包含具有增加基因在植物中的轉(zhuǎn)錄效率的效果的核苷酸序列。這些核苷酸序列可以是例如組成性展示其轉(zhuǎn)錄效率增加效果的核苷酸序列，或物種、組織、或階段特異的展示其轉(zhuǎn)錄效率增加效果的核苷酸序列，或其轉(zhuǎn)錄效率增加效果由例如致病微生物感染、或由諸如光、熱、干旱、鹽、或創(chuàng)傷等壓力誘導(dǎo)的核苷酸序列。具有增加基因在植物中的轉(zhuǎn)錄效率的效果的核苷酸序列的特定范例包括，例如其中位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第318位至第138位堿基的甘露堿合酶基因區(qū)連接在位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第333位至第116位堿基的土壤桿菌章魚堿合酶基因區(qū)的下游的轉(zhuǎn)錄激活核苷酸序列，和其中位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第333位至第116位堿基的章魚堿合酶基因區(qū)連接在位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第318位至第213位堿基的甘露堿合酶基因區(qū)的下游的轉(zhuǎn)錄激活核苷酸序列(植物雜志(The Plant Journal)7(4):661-676,1995)；包含花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子中位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第343位至第91位堿基的核苷酸序列(自然(Nature)313:810-812,1985)；包含番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因(rbc-3A)中位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第1099位至第205位堿基的核苷酸序列(植物細(xì)胞(Plant Cell)1:217-227,1990)；包含煙草PR1a基因中位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第902位至第287位堿基的核苷酸序列(植物細(xì)胞(PlantCell)2:357-366,1990)；和包含馬鈴薯蛋白酶抑制物基因(PⅠ-Ⅱ)中位于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)上游第1300位至第195位堿基的核苷酸序列(植物細(xì)胞(Plant Cell)2:61-70,1990)。
此外，本發(fā)明啟動(dòng)子還可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中具有轉(zhuǎn)錄效率增加效果的核苷酸序列。還可以鑒定這些核苷酸序列，并制備重復(fù)包含這些核苷酸序列的本發(fā)明啟動(dòng)子，或通過(guò)將這些核苷酸序列與在植物細(xì)胞中具有啟動(dòng)子功能的另一種DNA進(jìn)行連接制備新的植物啟動(dòng)子。為了鑒定這些核苷酸序列，例如，可以在植物細(xì)胞中在各種本發(fā)明啟動(dòng)子DNA的控制下表達(dá)報(bào)導(dǎo)基因，并比較表達(dá)量以分析有助于轉(zhuǎn)錄效率增加效果的核苷酸序列。更具體的說(shuō)，例如，制備包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的各種DNA，并將報(bào)導(dǎo)基因(如β-葡糖醛酸糖苷酶基因)連接在各種DNA的下游。然后使用諸如下文描述的基因槍法或土壤桿菌感染法等方法，將這些構(gòu)建物導(dǎo)入培養(yǎng)的植物細(xì)胞(諸如煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2)。為了確定有助于轉(zhuǎn)錄效率增加效果的核苷酸序列，通過(guò)由培養(yǎng)細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，并通過(guò)酶學(xué)技術(shù)測(cè)量提取物的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以該活性值作為指示劑，或者通過(guò)將培養(yǎng)細(xì)胞在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并觀察藍(lán)色染料的附著，以染料附著程度作為指示劑，從而比較各種細(xì)胞中報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)量，而且可以將結(jié)果與與報(bào)導(dǎo)基因連接的上述DNA的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比?；蛘撸€可以相似的將與報(bào)導(dǎo)基因連接的上述DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞(諸如煙草野生型株系)，并可以由此細(xì)胞再生植株。為了確定有助于轉(zhuǎn)錄效率增加效果的核苷酸序列，通過(guò)測(cè)量來(lái)自植株或其后代的組織中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，或通過(guò)將來(lái)自植株或其后代的組織或其部分在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并觀察藍(lán)色染料的附著，以染料附著程度作為指示劑，從而比較各種上述DNA控制下的報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)量。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“終止子”指具有給出終止位于該DNA上游感興趣基因轉(zhuǎn)錄的指令功能的DNA。本發(fā)明的終止子包括下列DNA(a)或(b)(下文稱為本發(fā)明終止子DNA)(a)包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入，并且與SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域同一性超過(guò)90％的核苷酸序列的DNA，該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。
在本文中，“具有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列”的范例可以包括那些包含天然發(fā)生的變異(因生物體間的物種或個(gè)體差異或者制備DNA的組織間的差異引起)或人工導(dǎo)入DNA中的變異的核苷酸序列?！吧飳W(xué)功能與上述DNA(a)等效”的DNA可以是，例如，那些包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入的核苷酸序列的DNA(條件是它們保留了在植物細(xì)胞中的終止子功能)。這些DNA可以是那些由天然來(lái)源克隆的DNA，或在由天然來(lái)源克隆的DNA中包含人工導(dǎo)入的缺失、取代、或加入堿基的DNA，或通過(guò)化學(xué)合成而人工產(chǎn)生的DNA。
而且通過(guò)將本發(fā)明終止子和目的基因(位于該終止子的上游)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟，和在宿主細(xì)胞中在該終止子的控制下表達(dá)該目的基因的步驟，有可能增加目的基因的表達(dá)效率。
本發(fā)明終止子DNA可以根據(jù)上述用于獲得本發(fā)明啟動(dòng)子DNA的方法根據(jù)SEQ ID NO:2所示核苷酸序列分離。具體的實(shí)施例可以是以得自諸如胡蘿卜等植物的基因組DNA作為模板，以具有SEQ ID NO:2中第1位至第20位堿基表示的核苷酸序列的寡核苷酸，和具有與SEQID NO:2中第827位至第851位堿基表示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，進(jìn)行一輪至多輪PCR(反應(yīng)條件例如一輪至多輪PCR的每一輪進(jìn)行30-40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)。
為了確認(rèn)該終止子DNA在植物細(xì)胞中的終止子功能，可以例如將能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子、諸如β-葡糖醛酸糖苷酶基因等報(bào)導(dǎo)基因、和該終止子DNA以能夠表達(dá)的方式連接在一起，同時(shí)，作為對(duì)照，以相同方式連接啟動(dòng)子和β-葡糖醛酸糖苷酶基因。使用諸如下文描述的基因槍法或土壤桿菌感染法等方法，將各種構(gòu)建物導(dǎo)入培養(yǎng)的植物細(xì)胞(例如煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2)。然后，通過(guò)由各種細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，并測(cè)量提取物的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，以該活性值作為指示劑，或者通過(guò)將所述細(xì)胞在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并觀察藍(lán)色染料的附著，以染料附著程度作為指示劑，確認(rèn)了β-葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)量在導(dǎo)入了連接在一起的啟動(dòng)子、β-葡糖醛酸糖苷酶基因和該終止子DNA的植物細(xì)胞中比對(duì)照高?；蛘呦嗨频模瑢⒛軌蛟谥参锛?xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、和該終止子DNA連接在一起，同時(shí)，作為對(duì)照，以相同方式連接啟動(dòng)子和β-葡糖醛酸糖苷酶基因，然后將各種構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞(諸如來(lái)自煙草野生型株系的細(xì)胞)，并可以由此細(xì)胞再生植株。可以通過(guò)測(cè)量來(lái)自再生植株或其后代的組織中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，或者通過(guò)將來(lái)自植株或其后代的組織或其部分在含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的染色液中浸泡并觀察藍(lán)色染料的附著，以染料附著程度作為指示劑，從而確認(rèn)該終止子DNA的終止子功能的存在與否。
而且，該終止子DNA還可以如下獲得標(biāo)記例如至少包含SEQ IDNO:2所示部分核苷酸序列的DNA，并以此作為探針與得自植物等的DNA雜交，以檢測(cè)并克隆探針特異結(jié)合的DNA。
在此方法中，可以將例如得自諸如胡蘿卜等植物的基因組DNA文庫(kù)作為與上述探針進(jìn)行雜交的DNA。關(guān)于這種DNA文庫(kù)，可以使用商品化的基因組DNA文庫(kù)，或者可以根據(jù)如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)或《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案》(1987,John Wiley and Sons,Inc.,ISBNO-471-50338-X)中描述的用于文庫(kù)制備的常用方法，例如使用λ載體(諸如λFIXⅡ、λEMBL3、λEMBL4、或λDASHⅡ(STRATAGENE)和用于體外包裝的Gigapack包裝提取物(Gigapack Packaging Extracts,STRATAGENE)，制備供使用的基因組DNA文庫(kù)。
使探針與這些DNA雜交的方法可以包括菌落雜交和噬菌斑雜交，而正確的方法可以根據(jù)文庫(kù)制備中使用的載體類型進(jìn)行選擇。在使用質(zhì)粒載體構(gòu)建文庫(kù)的情況中，進(jìn)行菌落雜交。具體而言，首先將文庫(kù)中的DNA導(dǎo)入宿主生物體以獲得轉(zhuǎn)化體，將得到的轉(zhuǎn)化體稀釋，在瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，并于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落。另一方面，在使用噬菌體載體構(gòu)建文庫(kù)的情況中，進(jìn)行噬菌斑雜交。具體而言，首先將宿主生物體和文庫(kù)中的噬菌體在感染條件下混勻，然后進(jìn)一步與軟瓊脂培養(yǎng)基混勻，并在瓊脂培養(yǎng)基上鋪板，于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)噬菌斑。更具體的說(shuō)，例如根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2.60-2.65)中描述的方法，將大約9.0×105pfu噬菌體文庫(kù)在NZY瓊脂培養(yǎng)基中以0.1-1.0pfu/mm2瓊脂培養(yǎng)基的密度鋪開，并于37℃培養(yǎng)6-10小時(shí)。
在上述兩種雜交方法中，將膜鋪在上述培養(yǎng)物生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基表面，并將攜帶質(zhì)?；蚴删w的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到膜上。用堿處理后，中和膜，并進(jìn)一步處理將DNA固定在膜上。更具體的說(shuō)，例如在噬菌斑雜交的情況中，根據(jù)，《克隆和測(cè)序植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Watanabe和Sugiura編，Noson-bunka-sha,1989)中描述的常用方法，將諸如硝酸纖維素或尼龍膜(如Hybond-N+,Amersham Pharmacia Biotech公司)等濾膜鋪在上述瓊脂培養(yǎng)基上，并放置大約1分鐘，使噬菌體顆粒吸附到膜上。然后，將膜在堿液(1.5M NaCl、0.5N NaOH)中浸泡大約3分鐘以裂解噬菌體顆粒并由此將噬菌體DNA釋放到膜上，然后將膜在中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl緩沖液，pH7.5)中浸泡大約5分鐘。用清洗液(300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉、200mM Tris-HCl緩沖液)清洗大約5分鐘后，將膜于大約80℃烘烤大約90分鐘，以將噬菌體DNA固定在膜上。
將制備的膜與作為探針的上述DNA進(jìn)行雜交?？梢匀鏒.M.Glover編的《DNA克隆，一種實(shí)用的方法(DNA cloning,a practicalapproach)》(IRL出版社，1985,ISBN 0-947946-18-7)；《克隆和測(cè)序植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Watanabe和Sugiura編，Noson-bunka-sha,1989)；或《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)所述進(jìn)行雜交。
為了用放射性同位素標(biāo)記作為探針使用的DNA，可以使用例如隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(Random Labeling Kit,Boehringer Mannheim或TakaraShuzo有限公司)，或者也可能以用作探針的DNA作為模板，用[α-32P]dCTP取代dCTP，通過(guò)PCR標(biāo)記DNA。或者，為了用熒光染料標(biāo)記作為探針使用的DNA，可以使用例如ECL直接核酸標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)(ECLDirect Nucleic Acid Labeling and Detection System,AmershamPharmacia Biotech公司)。
可以獲得多種用于進(jìn)行雜交的試劑和溫度條件。例如，可以每cm2如上制備的膜配制50-200μl體積的含450-900mM NaCl、45-90mM檸檬酸鈉、0.1-1.0％十二烷基磺酸鈉(SDS)、和0-200μg/ml變性的非特異的DNA(在某些情況中，可以任選的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的預(yù)雜交溶液，優(yōu)選含900mM NaCl、90mM檸檬酸鈉、1％SDS、和100μg/ml變性的小牛胸腺DNA的預(yù)雜交溶液，將上述膜浸泡在溶液中并于42-68℃溫育1-4小時(shí)，優(yōu)選于45℃2小時(shí)。然后，將例如含450-900mM NaCl、45-90mM檸檬酸鈉、0.1-1.0％SDS、和0-200μg/ml變性的非特異的DNA(在某些情況中，可以任選的含0-0.2％清蛋白、Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮等)的雜交溶液等，優(yōu)選含900mM NaCl、90mM檸檬酸鈉、1％SDS、和100μg/ml變性的小牛胸腺DNA的雜交溶液，與通過(guò)上述方法得到的探針(相當(dāng)于1.0×104-2.0×106cpm/cm2膜的量)混和，以制備50-200μl/cm2膜的體積的混和液，將膜浸泡在混和液中并于42-68℃溫育4-20小時(shí)，優(yōu)選于45℃16小時(shí)，以實(shí)現(xiàn)雜交。雜交反應(yīng)后，回收膜，并用例如含15-300mM NaCl、1.5-30mM檸檬酸鈉、0.1-1.0％SDS的清洗液等于42-68℃，優(yōu)選用含300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉、1％SDS的清洗液于55℃，清洗1-4次(每次各10-60分鐘)，優(yōu)選2次(每次各15分鐘)。而且，將膜用2×SSC溶液(300mM NaCl、30mM檸檬酸鈉)簡(jiǎn)單漂洗，然后干燥。通過(guò)例如放射自顯影，確定膜上探針的位置，以檢測(cè)膜上與所用探針雜交的DNA的位置。鑒定最初的瓊脂培養(yǎng)基上與膜上檢測(cè)到的DNA位置對(duì)應(yīng)的克隆，可以挑取用于分離攜帶那些DNA的克隆。具體而言，將膜暴露于成像板(Fuji Photo Film有限公司)4小時(shí)，并使用BAS 2000(Fuji Photo Film有限公司)分析此成像板以檢測(cè)信號(hào)。由用于制備膜的瓊脂培養(yǎng)基，切下檢測(cè)到信號(hào)的相應(yīng)位置的部分(大約5mm2的膠塊)，將這些膠塊在大約500μl SM緩沖液(50mM Tris-HCl緩沖液pH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4、0.01％明膠)中浸泡2-16小時(shí)，優(yōu)選3小時(shí)，以洗脫噬菌體顆粒。根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法，將得到的噬菌體顆粒洗脫液在瓊脂培養(yǎng)基上鋪開，并于37℃培養(yǎng)6-10小時(shí)。使用此瓊脂培養(yǎng)基，以上述相同方式將噬菌體DNA固定到膜上，并將此膜與上述探針進(jìn)行雜交。由檢測(cè)到的信號(hào)在用于制備膜的瓊脂培養(yǎng)基上相應(yīng)位置的膠塊，洗脫噬菌體顆粒，在瓊脂培養(yǎng)基上鋪開，并以上述相同方式制備膜，以進(jìn)行雜交。重復(fù)這些鑒定和純化步驟，以得到攜帶具有可與所用探針雜交的核苷酸序列的DNA的噬菌體克隆。
可以將通過(guò)上述雜交篩選得到的克隆所含DNA亞克隆到可以容易制備或分析DNA的質(zhì)粒載體中，諸如商品化的pUC18、pUC19、pBluescript KS+、或pBluescript KS-，以制備質(zhì)粒DNA，而且可以使用例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,13.42-13.74)中描述的染料雙脫氧終止法測(cè)定其核苷酸序列?？梢愿鶕?jù)例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,13.15)中描述的引物延伸法制備用于核苷酸序列分析的樣品?；蛘?，為了分析核苷酸序列，可以根據(jù)例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989,2.60-2.65)中描述的方法在NZYM液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增噬菌體克隆，以制備噬菌體溶液。由此噬菌體溶液，可以使用例如Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit(Clontech Laboratories公司)提取噬菌體克隆DNA，并將得到的DNA在上述用于制備核苷酸序列分析樣品的引物延伸法中作為模板使用。
該終止子DNA可以通過(guò)如上所述測(cè)定由此得到的DNA的終止子功能而獲得。
為了在諸如植物等宿主細(xì)胞中使用本發(fā)明啟動(dòng)子表達(dá)目的基因，可以使用其中本發(fā)明啟動(dòng)子和目的基因還有根據(jù)需要的終止子以能夠發(fā)揮功能的方式連接在一起的基因(下文稱為本發(fā)明嵌合基因)。在本文中，目的基因是那些要在諸如植物等宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因，包括例如編碼諸如酶、存儲(chǔ)蛋白、受體、轉(zhuǎn)錄因子、或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等蛋白質(zhì)的基因，這些基因可以以有義或反義方向(取決于它們的目的)適當(dāng)?shù)倪B接在本發(fā)明啟動(dòng)子的下游。所用終止子不受特別限制，只要它們?cè)趯?dǎo)入的宿主細(xì)胞中具有給出終止轉(zhuǎn)錄的指示功能，而且可以包括，例如得自土壤桿菌Ti質(zhì)粒的胭脂堿合酶基因的終止子(nos-t)和得自諸如GV1和GV2病毒等植物病毒的終止子，以及本發(fā)明終止子。此外，本發(fā)明嵌合基因可以重復(fù)包含本發(fā)明啟動(dòng)子或其部分的核苷酸序列。在本文中，術(shù)語(yǔ)“以能夠發(fā)揮功能的方式”指本發(fā)明嵌合基因所含的目的基因與本發(fā)明啟動(dòng)子和/或終止子的連接方式使得，當(dāng)用該嵌合基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，基因在宿主細(xì)胞中在啟動(dòng)子和/或終止子的控制下表達(dá)。
有關(guān)包含本發(fā)明啟動(dòng)子的載體，術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠在宿主細(xì)胞中繁殖的DNA，包括例如能夠在諸如大腸桿菌、酵母、植物細(xì)胞、或動(dòng)物細(xì)胞等細(xì)胞中繁殖的質(zhì)粒、噬菌體、和噬菌粒，而且根據(jù)宿主細(xì)胞和它們的目的選擇適當(dāng)?shù)妮d體。特定的范例可以是基于pUC的質(zhì)粒(諸如pUC118、pUC119,Takara Shuzo有限公司)、基于pSC101的質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒(諸如pBI101、pBI121,Clontech Laboratories公司)、Bluescript噬菌粒(諸如pBluescript SK(+/-),STRATAGENE)、基于M13的噬菌體(諸如mp10、mp11,Amersham Pharmacia Biotech公司)、基于λ的噬菌體(諸如λgt10、λgt11,STRATAGENE)或粘粒(諸如SuperCosⅠ,STRATAGENE)，而且通過(guò)常用基因工程技術(shù)將本發(fā)明啟動(dòng)子摻入這些載體，可以構(gòu)建包含本發(fā)明啟動(dòng)子的載體。
如果在包含本發(fā)明啟動(dòng)子的這些載體中，啟動(dòng)子下游還存在基因插入位點(diǎn)和終止子，則此載體可以優(yōu)選用于構(gòu)建在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“基因插入位點(diǎn)”指例如能夠被基因工程技術(shù)中常用的限制酶特異識(shí)別并切割的核苷酸序列，優(yōu)選的，指在包含本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的載體上唯一存在的這類限制酶識(shí)別核苷酸序列。這種基因插入位點(diǎn)、本發(fā)明啟動(dòng)子、和終止子的定位優(yōu)選是，當(dāng)目的基因插入該基因插入位點(diǎn)后，本發(fā)明啟動(dòng)子、目的基因、和終止子在載體上以能夠發(fā)揮功能的方式連接在一起。這種載體可以通過(guò)例如將本發(fā)明啟動(dòng)子DNA插入包含基因插入位點(diǎn)和終止子的質(zhì)粒而構(gòu)建，具體而言，插入pBI101.3(Clontech Laboratories公司)等等的多克隆位點(diǎn)(基因插入位點(diǎn))?；蛘?，還可以通過(guò)將本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子插入包含基因插入位點(diǎn)的載體而構(gòu)建，具體而言，插入pBIN19(核酸研究(Nucl.Acid Res.)12:8711-8721,1984)等等的多克隆位點(diǎn)(基因插入位點(diǎn))。
包含本發(fā)明嵌合基因的載體可以優(yōu)選用于將嵌合基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并且可以通過(guò)將嵌合基因克隆到上述載體中，或通過(guò)將目的基因克隆到包含本發(fā)明啟動(dòng)子、基因插入位點(diǎn)、和終止子的上述載體的基因插入位點(diǎn)而制備。例如，使用pBI101.3(Clontech Laboratories公司)制備的上述載體可以用限制酶進(jìn)行切割，以除去該載體上存在的報(bào)導(dǎo)基因(β-葡糖醛酸糖苷酶)，然后可以插入目的基因取代報(bào)導(dǎo)基因，以制備包含本發(fā)明嵌合基因的載體。
上述本發(fā)明載體可以包含目的基因和/或本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子，而且它還可以包含用于選擇導(dǎo)入了載體的宿主細(xì)胞的標(biāo)記基因(例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、能夠賦予植物對(duì)除草劑的抗性的基因等等)。此外，載體還可以以重復(fù)方式包含本發(fā)明啟動(dòng)子的核苷酸序列。
可以根據(jù)諸如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第2版，J.Sambrook、E.F.Frisch、和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中描述的CaCl2法或電穿孔法等方法，將本發(fā)明載體導(dǎo)入諸如大腸桿菌或土壤桿菌等宿主細(xì)胞。導(dǎo)入了本發(fā)明載體的上述微生物細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)可以用于制備本發(fā)明嵌合基因或用于將嵌合基因?qū)胫参锛?xì)胞。
或者，可以通過(guò)例如基因槍法(使用基因槍直接導(dǎo)入植物組織或培養(yǎng)細(xì)胞的方法)將編碼本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA或本發(fā)明嵌合基因的DNA導(dǎo)入作為宿主細(xì)胞的植物細(xì)胞。相似的，還可以通過(guò)諸如土壤桿菌感染法(用土壤桿菌感染植物組織的方法)、電轉(zhuǎn)染法(原生質(zhì)體的電穿孔法或電轉(zhuǎn)染法)、或基因槍法等任何眾所周知的方法將本發(fā)明載體導(dǎo)入作為宿主細(xì)胞的植物細(xì)胞。
在其中宿主細(xì)胞中導(dǎo)入了本發(fā)明啟動(dòng)子、本發(fā)明嵌合基因、或本發(fā)明載體任何一種的轉(zhuǎn)化體中，那些植物轉(zhuǎn)化體的范例可以包括諸如水稻、玉米、大麥、和小麥等單子葉植物和包括豆類(諸如大豆、豌豆、蠶豆、和苜蓿)、茄類植物(諸如煙草、番茄、和馬鈴薯)、蕓苔科植物(諸如甘藍(lán)、油菜、和芥菜)、葫蘆類植物(諸如甜瓜、南瓜、和黃瓜)、傘形類植物(諸如胡蘿卜和芹菜)、紫菀類植物(諸如萵苣)等雙子葉植物。
可以通過(guò)將本發(fā)明啟動(dòng)子、本發(fā)明嵌合基因、或本發(fā)明載體導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。例如，可以得到在基因組DNA上目的基因上游插入了本發(fā)明啟動(dòng)子、并在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該目的基因的宿主細(xì)胞，或在基因組DNA中插入了本發(fā)明嵌合基因、并在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該嵌合基因所含基因的宿主細(xì)胞，或包含內(nèi)含本發(fā)明嵌合基因的載體、并在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下表達(dá)嵌合基因所含基因的宿主細(xì)胞。
由此得到的轉(zhuǎn)化體植物細(xì)胞可以根據(jù)例如S.B.Gelvin、R.A.Schilperoot和D.P.S.Verma的《植物分子生物學(xué)手冊(cè)(PlantMolecular Biology Manual)》(Kluwer Academic Publishers,1988)、Ko Simamoto和Kiyotaka Okada編的《用于植物模型(水稻和擬南芥)的實(shí)驗(yàn)方案(Experimental protocols for model plants(rice andArabidopsis thaliana))(Shujun-sha,ISBN4-87962-157-9,C3345,1996，第78-143頁(yè))或Hirofumi Uchimiya的《植物基因工程手冊(cè)如何生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物》(Kodansha-Scientific,1990,ISBN4-06-153513-7 C3045，第28-33頁(yè))中描述的常用植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的任何方法進(jìn)行再生；并可以由此得到所述植物細(xì)胞衍生的經(jīng)轉(zhuǎn)化植株。此外，通過(guò)培養(yǎng)和繁殖由此得到的植株，可以得到它們的后代。在本發(fā)明中，所有這些都包括于轉(zhuǎn)化體中。
為了確認(rèn)目的基因的導(dǎo)入成功與否，可以根據(jù)常用基因工程技術(shù)由上述轉(zhuǎn)化體提取DNA，用限制酶切割，并用于進(jìn)行Southern雜交(以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所用DNA或其部分作為探針)。相似的，為了研究目的基因的表達(dá)狀態(tài)，可以根據(jù)常用基因工程技術(shù)由這些轉(zhuǎn)化體提取RNA，并用于進(jìn)行Northern雜交(以具有將在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的感興趣基因的有義或反義核苷酸序列的寡核苷酸或DNA作為探針)。
通過(guò)以有義方向?qū)⒕唧w基因連接在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下并使之在宿主生物體的細(xì)胞中表達(dá)，可以為諸如植物等宿主生物體提供有用性狀。例如，通過(guò)表達(dá)諸如苯丙氨酸脫氨酶基因(PAL)、查爾酮合酶基因(CHS)、幾丁質(zhì)酶基因(CHT)、溶菌酶基因或PR蛋白質(zhì)基因等防衛(wèi)基因；諸如Pto基因等抗病基因；病毒外殼蛋白基因；BT(蘇云金芽孢桿菌)殺蟲蛋白基因等等，可以在宿主生物體的組織中增強(qiáng)針對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、昆蟲等的抗性。相似的，通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)諸如大豆的大豆球蛋白或β-conglycinin基因等存儲(chǔ)蛋白基因，可以增加飼料農(nóng)作物中各種蛋白質(zhì)的含量或基本氨基酸的含量；通過(guò)表達(dá)例如巴西堅(jiān)果的2S清蛋白基因、玉米或水稻的10kDa或15kDa蛋白質(zhì)基因，可以增加飼料農(nóng)作物中的甲硫氨酸含量或賴氨酸含量；通過(guò)表達(dá)諸如bioA、bioB、bioC、bioD、bioF、或bioH酶基因等生物素生物合成相關(guān)酶基因，可以增加飼料農(nóng)作物中的生物素含量；通過(guò)表達(dá)例如硬脂酰-ACP-去飽和酶基因、?；?ACP-硫酯酶基因、或3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因，可以使由磷脂含量降低和油酸含量及亞麻酸含量升高引起的脂類氧化穩(wěn)定性的增強(qiáng)和脂類的改進(jìn)成為可能；或者通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)?；D(zhuǎn)移酶基因，可以通過(guò)增加不飽和脂肪酸的比例增強(qiáng)對(duì)低溫的抵抗力。通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)諸如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、或新霉素抗性基因等涉及抗生素抗性的基因，還可以提供可用于轉(zhuǎn)化體選擇的抗生素抗性。此外，通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)諸如L-膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶或原卟啉原氧化酶(PPO)基因等涉及除草劑抗性的基因，還可能產(chǎn)生除草劑抗性農(nóng)作物植株。
另一方面，還可以將特定基因以反義方向連接在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下，并在諸如植物等宿主生物體的細(xì)胞中表達(dá)，以賦予宿主生物體以有用性狀。例如，通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)諸如水稻異構(gòu)酶等支鏈淀粉降解酶基因的反義基因，可以改進(jìn)水稻種子的淀粉成分；通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)諸如南瓜1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)合酶等乙烯合酶基因的反義基因，可以增強(qiáng)水果、花等的保存穩(wěn)定性；或者通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)針對(duì)番茄的多聚半乳糖醛酸酶基因的反義基因，也可以增強(qiáng)水果的保存穩(wěn)定性。
此外，通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)諸如S基因座特異性RNA酶基因等雄性不育相關(guān)基因，還可以控制植物的繁殖力。
實(shí)施例本發(fā)明由下列實(shí)施例舉例說(shuō)明，但是本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1本發(fā)明的啟動(dòng)子和終止子的分離本發(fā)明的啟動(dòng)子和終止子是使用由胡蘿卜葉制備的基因組DNA進(jìn)行反式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(反式PCR)得到的。步驟描述如下。(1)胡蘿卜基因組DNA的制備取10g6周齡幼苗的胡蘿卜葉，在液氮中磨碎，重懸于5ml 2xCTAB溶液(2％十六烷基三甲基溴化銨、100mMTris-HCl緩沖液pH8.0、20mMEDTA pH8.0、1.4M NaCl、1％聚乙烯吡咯烷酮)，然后于55℃溫育10分鐘。向此中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，于室溫輕輕混勻30分鐘，然后離心分別回收上層和下層。(1)向上層中加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),(2)向下層加入等體積的1xCTAB溶液(用無(wú)菌蒸餾水2倍稀釋2xCTAB得到的溶液)。將兩份混和物于室溫輕輕混勻10分鐘，再次離心，合并由(1)和(2)回收的上層。向此中，加入1/10體積的10％CTAB溶液(10％十六烷基三甲基溴化銨、0.7M NaCl)和等體積的沉淀緩沖液(2％十六烷基三甲基溴化銨、50mM Tris-HCl緩沖液pH8.0、10mM EDTA pH8.0)，輕輕混勻，然后離心?；厥粘恋恚貞矣?M NaCl-TE(1M NaCl、10mM Tris-HCl緩沖液pH8.0、1mM EDTApH8.0)，然后加入等體積的異丙醇并輕輕混勻，隨后離心。將得到的沉淀用70％乙醇漂洗，簡(jiǎn)單干燥，然后重懸于TE。向此懸浮液中，加入RNA酶至終濃度10μg/ml,于37℃溫育30分鐘，然后加入1/4體積的4M醋酸銨和2倍體積的100％乙醇，混勻，并靜置。通過(guò)將DNA沉淀纏繞在巴斯德吸管上回收，用70％乙醇漂洗，簡(jiǎn)單干燥，并重懸于TE(10mM Tris-HCl緩沖液pH8.0、1mM EDTA pH8.0)。將此DNA溶液適當(dāng)稀釋，并進(jìn)行吸光值測(cè)量和瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果確認(rèn)回收了大約350μg基因組DNA。(2)包含本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的DNA的PCR擴(kuò)增取10μg步驟(1)得到的基因組DNA，用100U PvuⅡ完全消化。然后加入1/10體積的3M醋酸鈉和2倍體積的100％乙醇，混勻，并于4℃以15000rpm離心10分鐘回收沉淀的DNA。將沉淀用70％乙醇漂洗，并重懸于TE至終濃度20ng/μl。使用此DNA溶液和連接試劑盒(Takara Shuzo有限公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系400μl，終濃度1ng/μl。然后將反應(yīng)混和物作為模板，使用具有下列核苷酸序列的寡核苷酸A和B進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸A:5’-GGGTT TCAAT GGATT CGATG-3’(20mer)寡核苷酸B:5’-GCAGA TGCTC AGAAC ACTGC-3’(20mer).而且，使用上述PCR混和物的一部分和具有下列核苷酸序列的寡核苷酸C和D進(jìn)行另一次PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃3min)寡核苷酸C:5’-GGCAG CTGGC ACCCA TGATA TTTAG AATG-3’(29mer)寡核苷酸D:5’-GGCAG CTGTT CATAA TTTAC AGAGT GAGTG ACAGTCAG-3’(38mer).通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠上分析反應(yīng)后溶液的一部分，確認(rèn)了大約3kb的DNA片段得到了擴(kuò)增。(3)本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的克隆和測(cè)序向步驟(2)得到的PCR混和物中加入TE，將體積調(diào)整至200μl。向此溶液中，加入等體積的中性酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，徹底混勻，然后于20℃以15000rpm離心5分鐘回收上層。向此中，加入1/10體積的3M醋酸鈉和2倍體積的100％乙醇，混勻，然后于4℃以15000rpm離心10分鐘回收沉淀的DNA。用70％的乙醇漂洗后，將DNA重懸于TE，并用30U PvuⅡ完全消化。反應(yīng)后，如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀。將回收的DNA重懸于50μlTE，并用旋轉(zhuǎn)層析柱S-400(Amersham Pharmacia Biotech公司)進(jìn)行純化。取1μl洗脫液在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析，揭示了存在大約2kb和大約1kb的DNA片段。取2μg pUC18載體，用10U SmaⅠ完全消化，并用堿性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)進(jìn)行去磷酸化。將反應(yīng)液如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，回收載體DNA，然后重懸于TE。取50ng此載體DNA和50ng上述片段，使用連接試劑盒(Takara Shuzo有限公司)進(jìn)行連接反應(yīng)，然后導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞。將完成導(dǎo)入步驟的細(xì)菌菌株在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并由生長(zhǎng)的克隆制備質(zhì)粒DNA。通過(guò)用限制酶切割DNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選擇出分別含有大約2kb和大約1kb的目的DNA片段的候選克隆。將具有存在于pUC18載體中的核苷酸序列的下列寡核苷酸E和F作為引物，使用Taq染料雙脫氧終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle SequencingKit,PE Biosystems)和熒光測(cè)序儀(PE Biosystems)分析候選克隆攜帶的DNA的核苷酸序列寡核苷酸E:5’-AACAA TTTCA CACAG GAAAC AGCTA TGACC-3’(30mer)寡核苷酸F:5’-CAGTC ACGAC GTTGT AAAAC GACGG CCAGT-3’(30mer)根據(jù)由此揭示的核苷酸序列，合成寡核苷酸，并作為引物以上述相同方式用于分析核苷酸序列。由此測(cè)定了SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。實(shí)施例2導(dǎo)入了本發(fā)明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生(1)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶識(shí)別核苷酸序列)的寡核苷酸G和H，并作為引物，以實(shí)施例1中得到的具有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃2min；74℃3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer),將擴(kuò)增的DNA片段用10U HindⅢ和10U XbaⅠ完全消化，然后將部分消化產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離。切下大約1.7kb的DNA條帶，使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA。相似的，將剩余溶液在4％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)上進(jìn)行分離，切下大約250bp的條帶，并純化膠塊所含DNA。取2μg由pBIN19(S.Ohta等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.)31(6):805-813,1990和Y.Hiei等人，植物雜志(Plant J.)6:271-282,1994)衍生的載體pIG121HM(見圖3)，用10U HindⅢ和10U XbaⅠ消化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA。將載體DNA和上述兩種DNA片段(大約1.7kb和大約250bp)使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的感受態(tài)細(xì)胞，并將完成導(dǎo)入步驟的細(xì)菌菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由生長(zhǎng)的克隆制備質(zhì)粒DNA，用限制酶HindⅢ和XbaⅠ切割，并在瓊脂糖凝膠電泳上分析，以選擇同時(shí)包含上述大約1.7kb DNA和大約250bp DNA片段的質(zhì)粒。然后，將選擇的質(zhì)粒作為模板，以上述寡核苷酸G和H作為引物，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer).由此確認(rèn)了大約2kb的DNA片段得到了擴(kuò)增，并由此得到了在β-葡糖醛酸糖苷酶基因上游包含本發(fā)明啟動(dòng)子的Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P(圖3)。(2)獲取轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort和D.P.S.Verma(《植物分子生物學(xué)/手冊(cè)(Plant Molecular Biology/Manual)》,1988,Kluwer Academic Publishers)和Valvekens等人(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5536-5540,1988)描述的方法得到轉(zhuǎn)基因植物。
將可以由購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株根據(jù)R.Deblaere等人(核酸研究(Nucleic Acid Res.)13:4777-4788,1985)描述的方法制備的土壤桿菌C58C1菌株，在YEB培養(yǎng)基中于30℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，然后接種新鮮的YEB培養(yǎng)基，并進(jìn)一步培養(yǎng)至培養(yǎng)液混濁度達(dá)到OD600=0.6。以下操作在低溫室中進(jìn)行。由培養(yǎng)液離心收集細(xì)菌細(xì)胞，重懸于預(yù)冷的無(wú)菌蒸餾水，并再次離心回收。此細(xì)菌細(xì)胞的清洗步驟重復(fù)2次，并使用10％甘油溶液而非無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行相似步驟。將由此得到的細(xì)菌細(xì)胞重懸于10％甘油，從而得到了比培養(yǎng)液濃縮400倍的懸浮液。向由此制備的細(xì)菌細(xì)胞懸浮液中，通過(guò)電穿孔法導(dǎo)入如上所述構(gòu)建的包含本發(fā)明啟動(dòng)子的Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P(見圖1)或作為對(duì)照的pIG121HM載體，并將完成導(dǎo)入處理的細(xì)菌菌株在含50μg/ml卡那霉素的YEB平板上進(jìn)行培養(yǎng)。由生長(zhǎng)的卡那霉素抗性克隆通過(guò)堿-SDS法制備質(zhì)粒DNA，并通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。通過(guò)溴乙錠染色檢測(cè)DNA條帶，確認(rèn)了已經(jīng)導(dǎo)入了Ti質(zhì)粒表達(dá)載體。然后，將此質(zhì)粒DNA作為模板，以上述寡核苷酸G和H作為引物，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer).由此確認(rèn)了大約2kb的DNA片段得到了擴(kuò)增，證實(shí)已經(jīng)導(dǎo)入了需要的表達(dá)載體。
將一片無(wú)菌培養(yǎng)的煙草葉片(0.7cm2)在土壤桿菌液體培養(yǎng)物(在含50μg/ml卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過(guò)夜)中浸泡2分鐘，用無(wú)菌濾紙吸去多余液體后，放置在MS-NB培養(yǎng)基上。于25℃共培養(yǎng)5天(光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí))后，將葉片用MS液體培養(yǎng)基清洗，并放置于MS-NBC培養(yǎng)基上。再培養(yǎng)5天后，將葉片轉(zhuǎn)移到含100μg/ml卡那霉素的MS-NBCK培養(yǎng)基上，并靜止培養(yǎng)大約1個(gè)月。從葉片上切下再生芽，并在MS-CK培養(yǎng)基上進(jìn)行次培養(yǎng)。大約1個(gè)月后，將生根的再生植株種植于土壤中以獲得自花授粉的種子。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的確認(rèn)將轉(zhuǎn)基因煙草種子在2.5％次氯酸鈉/0.002％Triton X-100中浸泡5分鐘，隨后用無(wú)菌水清洗4-5次，并通過(guò)在含100μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)從而無(wú)菌發(fā)芽。由展示卡那霉素抗性的植株，通過(guò)CTAB方法制備基因組DNA。取50ng此DNA作為模板，以包含GUS基因(一種報(bào)導(dǎo)基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸Ⅰ和包含本發(fā)明啟動(dòng)子(包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA)的部分核苷酸序列的寡核苷酸J的組合作為引物寡核苷酸I:5’-ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC-3’(30mer)寡核苷酸J:5’-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3’(20mer)或以包含GUS基因(一種報(bào)導(dǎo)基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸K和包含NOS終止子的部分核苷酸序列的寡核苷酸L的組合作為引物寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3’(21mer)寡核苷酸L:5’-GATAA TCATC GCAAG ACCGG-3’(20mer),進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；72℃ 3min)，并將部分PCR產(chǎn)物通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。結(jié)果是，確認(rèn)了大約310bp和大約400bp的需要的DNA片段分別得到了擴(kuò)增。實(shí)施例4A轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)根據(jù)Jefferson(植物分子生物學(xué)報(bào)告(Plant Mol.Biol.Rep.)5:387-405,1987)描述的方法，測(cè)量實(shí)施例2中得到的轉(zhuǎn)基因植株的幼苗的葉部和根部中的GUS活性和GUS染色。GUS活性使用4-甲基傘形酰葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl glucuronide)作為底物通過(guò)熒光法測(cè)量，而活性染色使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作為底物進(jìn)行，測(cè)量附著的藍(lán)色染料(靛藍(lán))的量。(1)GUS染色將上述轉(zhuǎn)基因煙草種子在含100μg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)從而無(wú)菌發(fā)芽。1周后、3周后、或1個(gè)月后，拔出卡那霉素抗性植株，并在GUS染色液(1mM X-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.3％Triton X-100)中于37℃浸泡過(guò)夜，使反應(yīng)能夠進(jìn)行。反應(yīng)后，用100％乙醇脫色，并觀察染色圖案。結(jié)果是，在導(dǎo)入了包含本發(fā)明啟動(dòng)子的Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P(見圖1)的轉(zhuǎn)基因煙草中，在表達(dá)載體上連接在本發(fā)明啟動(dòng)子下游的β-葡糖醛酸糖苷酶基因在葉、根、和莖中高度表達(dá)。(2)GUS活性測(cè)量將上述轉(zhuǎn)基因煙草種子在含100μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基上無(wú)菌發(fā)芽，并于25℃進(jìn)一步培養(yǎng)。發(fā)芽1周后、3周后、或1個(gè)月后，將取自卡那霉素抗性植株的0.8g根和0.5g葉置于研缽中，分別補(bǔ)加1ml和0.5ml提取緩沖液(50mM磷酸緩沖液pH7.0、10mM EDTA、0.1％TritonX-100、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、10mM巰基乙醇)，并加入適當(dāng)量的海沙一起研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，離心，并回收上清液。取10-70μl此液體，加入500μl反應(yīng)底物溶液(50mM磷酸緩沖液pH7.0、10mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、10mM巰基乙醇、1mM 4-甲基傘形酰-β-D-葡糖苷酸)，并于37℃溫育。于規(guī)則時(shí)間間隔由反應(yīng)液取樣100μl，立即加入900μl終止液(0.2M碳酸鈉)并混勻。在熒光分光光度計(jì)(HITACHI有限公司，F(xiàn)-2000)中測(cè)量由此制備的樣品的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm)。由測(cè)量值和葉或根提取物的蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算GUS活性。結(jié)果顯示于表1。通過(guò)使用Bio-Rad Laboratories的蛋白質(zhì)分析試劑的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的定量。在取自導(dǎo)入了Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P(其包含與β-葡糖醛酸糖苷酶基因連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA)的轉(zhuǎn)基因煙草的葉和根樣品中檢測(cè)到GUS活性。具有最高GUS活性的一株轉(zhuǎn)化體展示的GUS活性比用pIG121HM載體(其包含與β-葡糖醛酸糖苷酶基因連接的35S啟動(dòng)子的DNA)轉(zhuǎn)化的對(duì)照轉(zhuǎn)化體高8倍。
表1轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性測(cè)量結(jié)果。。播種后1周
播種后3周
播種后1個(gè)月
實(shí)施例4B轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)(1)獲取轉(zhuǎn)基因植物根據(jù)與上述實(shí)施例基本相同的方法，其中使用攜帶Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P的土壤桿菌C58C1菌株將載體導(dǎo)入靶植株，從而制備另一種轉(zhuǎn)基因植物擬南芥。
無(wú)菌發(fā)芽后，將一段(大約1cm)擬南芥根(在MS培養(yǎng)基上于23℃培養(yǎng)2-3周)在CIM瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，然后在土壤桿菌液體培養(yǎng)物(在含50μg/ml卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過(guò)夜)中浸泡2分鐘，用無(wú)菌濾紙吸去多余液體后，放置在CIM瓊脂培養(yǎng)基上。培養(yǎng)2天后，將根段轉(zhuǎn)移到SIMC瓊脂培養(yǎng)基上。再培養(yǎng)2天后，將根段轉(zhuǎn)移到SIMCH瓊脂培養(yǎng)基上。從根段上切下再生芽，并在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行次培養(yǎng)。大約1個(gè)月后，將生根的個(gè)體種植于土壤或褐塊石棉(rock wool)中并在培養(yǎng)室中培養(yǎng)以獲得近交種子。(2)轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的確認(rèn)將轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子在1.0％次氯酸鈉中浸泡5分鐘，隨后用無(wú)菌水清洗3-5次，然后在含20μg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基上無(wú)菌發(fā)芽。由取自展示潮霉素抗性的植株的4或5片蓮座葉，通過(guò)CTAB方法制備基因組DNA。取50ng此DNA作為模板，以包含GUS基因(一種報(bào)導(dǎo)基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸Ⅰ和包含本發(fā)明啟動(dòng)子(包含SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA)的部分核苷酸序列的寡核苷酸J的組合作為引物寡核苷酸I:5’-ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC-3’(30mer)寡核苷酸J:5’-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3’(20mer)或以包含GUS基因(一種報(bào)導(dǎo)基因)的部分核苷酸序列的寡核苷酸K和包含NOS終止子的部分核苷酸序列的寡核苷酸L的組合作為引物寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3’(21mer)寡核苷酸L:5’-GATAA TCATC GCAAG ACCGG-3’(20mer),進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；72℃ 3min)，并將部分PCR產(chǎn)物通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。結(jié)果證實(shí)大約310bp和大約400bp的需要的DNA片段分別得到了擴(kuò)增。(3)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)根據(jù)Jefferson(植物分子生物學(xué)報(bào)告(Plant Mol.Biol.Rep.)5:387-405,1987)描述的方法，測(cè)量實(shí)施例4B(1)和(2)中得到的轉(zhuǎn)基因植株幼苗的葉部和根部中的GUS活性和GUS染色。GUS活性使用4-甲基傘形酰葡糖苷酸作為底物通過(guò)熒光法測(cè)量，而活性染色使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作為底物進(jìn)行，測(cè)量附著的藍(lán)色染料(靛藍(lán))的量。(3-1)GUS染色將上述轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在含20μg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)從而無(wú)菌發(fā)芽。3周后，拔出潮霉素抗性植株，并在GUS染色液(1mMX-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.3％Triton X-100)中于37℃浸泡過(guò)夜，使反應(yīng)能夠進(jìn)行。反應(yīng)后，用100％乙醇脫色，并觀察染色圖案。結(jié)果是，在導(dǎo)入了包含本發(fā)明啟動(dòng)子的Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P(見圖1)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，在表達(dá)載體上連接在本發(fā)明啟動(dòng)子下游的β-葡糖醛酸糖苷酶基因在葉、根、和莖中高度表達(dá)。(3-2)GUS活性測(cè)量將上述轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在含20μg/ml潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)從而無(wú)菌發(fā)芽，并于23℃進(jìn)一步培養(yǎng)。播種3周后，將取自展示潮霉素抗性的3株個(gè)體的根和葉置于研缽中，分別補(bǔ)加1ml和1ml提取緩沖液(50mM磷酸緩沖液pH7.0、10mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、10mM巰基乙醇)，并加入適當(dāng)量的海沙一起研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，離心，并回收上清液。取10-70μl此液體，加入500μl反應(yīng)底物溶液(50mM磷酸緩沖液pH7.0、10mM EDTA、0.1％Triton X-100、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、10mM巰基乙醇、1mM 4-甲基傘形酰-β-D-葡糖苷酸)，并于37℃溫育。于規(guī)則時(shí)間間隔由反應(yīng)液取樣100μl，立即加入900μl終止液(0.2M碳酸鈉)并混勻。在熒光分光光度計(jì)(HITACHI有限公司，F(xiàn)-2000)中測(cè)量由此制備的樣品的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm)。由測(cè)量值和葉或根提取物的蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算GUS活性。通過(guò)使用Bio-Rad Laboratories的蛋白質(zhì)分析試劑的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的定量。結(jié)果在取自導(dǎo)入了Ti質(zhì)粒表達(dá)載體pBICR16G6P(其中包含與β-葡糖醛酸糖苷酶基因連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉和根樣品中檢測(cè)到了GUS活性。一些轉(zhuǎn)化體展示的GUS活性比用pIG121HM載體(其包含與β-葡糖醛酸糖苷酶基因連接的35S啟動(dòng)子的DNA)轉(zhuǎn)化的對(duì)照轉(zhuǎn)化體高幾倍。實(shí)施例5導(dǎo)入了本發(fā)明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)如實(shí)施例2(1)所示，將包含pBICR16G6P載體的細(xì)菌克隆在2ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將預(yù)培養(yǎng)物接種500ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基并于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以8000rpm離心10分鐘收集細(xì)菌細(xì)胞，并使用QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化載體DNA。
使用基因轟擊方法(C.M.基因槍系統(tǒng)，Rehbock公司，東京，日本Yang N-S,Christou P，用于基因轉(zhuǎn)移的微粒轟擊技術(shù)(ParticleBombardment Technology for Gene Transfer),W.H.Freeman Co.Publishers，紐約，第52-59頁(yè))，將回收的載體導(dǎo)入大豆平展葉片(取自溫室生長(zhǎng)的植株)以及根據(jù)J.Finer和A.Nagasawa描述的方法(植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)(Plant Cell,Tissue and OrganCulture)15:125-136,1988)誘導(dǎo)和培養(yǎng)的大豆體細(xì)胞胚中。將0.5～1μm金顆粒(Tokuriki Honten有限公司，日本)用乙醇清洗幾次，并用無(wú)菌水配制60mg/ml的金顆粒懸浮液。取50μl金顆粒懸浮液、50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M亞精胺與20μl pBICR16G6P載體懸浮液(0.5μg/ml)混勻。于室溫靜置30分鐘后，以9000rpm離心10秒鐘回收金顆粒，并懸浮于65μl 75％乙醇。以9000rpm離心10秒鐘回收金顆粒，并重懸于300μl 100％乙醇。將此金顆粒懸浮液超聲波處理(TOMY SEIKO有限公司)，取20μl懸浮液轉(zhuǎn)移至發(fā)射器(Rehbock有限公司，日本)并干燥(分兩次轉(zhuǎn)移，每次10μl)。在110mmHg、335m/秒的條件下，用此金顆粒兩次轟擊MS瓊脂培養(yǎng)基上的大豆平展葉片或體細(xì)胞胚。
至于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用pBI121和pBI221(Clontech Laboratories公司)轟擊所述大豆平展葉片或體細(xì)胞胚?；蜣Z擊后，將大豆平展葉片或體細(xì)胞胚于25℃放置24小時(shí)，然后用GUS染色緩沖液(1mMX-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6、0.3％ Triton X-100)于37℃浸泡過(guò)夜。于室溫用100％乙醇脫色后，在體細(xì)胞胚以及平展葉片上觀察到GUS表達(dá)產(chǎn)生的藍(lán)點(diǎn)。因此，在大豆平展葉片和體細(xì)胞胚中都確認(rèn)有pBICR16G6P的強(qiáng)GUS活性。實(shí)施例6包含本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的載體的構(gòu)建(1)Ti質(zhì)粒衍生物(pBIΔ)的構(gòu)建為了構(gòu)建包含本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的植物表達(dá)載體，作為第一步，如圖4所示構(gòu)建了Ti質(zhì)粒衍生物(pBIΔ)。合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶識(shí)別核苷酸序列)的寡核苷酸P和Q并作為引物，取5ng pBI101載體(Clontech Laboratories公司)作為模板，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸P:5’-GGGAA TTCTC AGATT GTCGT TTCCC GCCTT CAG-3’(33mer)寡核苷酸Q:5’-CAGAT CTGGG GAACC CTGTG GTTG-3’(24mer)將擴(kuò)增的DNA片段用30U EcoRⅠ和30U SphⅠ完全消化，并將部分消化產(chǎn)物在4.0％ Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)上進(jìn)行分離。切下186bp的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA。取2μg載體pBI101(Clontech Laboratories),用10U EcoRⅠ和10U SphⅠ消化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA。將載體DNA和上述DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由生長(zhǎng)的克隆制備質(zhì)粒DNA，用限制酶EcoRⅠ和SphⅠ切割，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇包含上述186bp DNA片段的質(zhì)粒(pBIΔ)。EcoRⅠ位點(diǎn)是該質(zhì)粒T-DNA區(qū)中的唯一限制酶識(shí)別位點(diǎn)。(2)包含本發(fā)明啟動(dòng)子的pCR16G6P中HindⅢ和XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)的導(dǎo)入合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶識(shí)別核苷酸序列)的寡核苷酸R和S并作為引物，以具有實(shí)施例1中得到的SEQ IDNO:7所示核苷酸序列的質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸R:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)寡核苷酸S:5’-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3’(30mer)將擴(kuò)增的DNA片段用50U XbaⅠ完全消化，并將部分消化產(chǎn)物在4.0％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)上進(jìn)行分離。切下大約250bp的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA。取2μg具有實(shí)施例1中得到的SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的pCR16G6P載體，用10U XbaⅠ消化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA。將載體DNA和回收的250bp的DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由生長(zhǎng)的克隆制備質(zhì)粒DNA，用限制酶XbaⅠ切割，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇包含上述250bp的DNA片段的質(zhì)粒。然后，以選擇的質(zhì)粒作為模板，以上述寡核苷酸S作為引物寡核苷酸S:5’-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3’(30mer)使用Taq染料雙脫氧終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Taq Dye Deoxy TerminatorCycle Sequencing Kit,PE Biosystems)和熒光測(cè)序儀(PEBiosystems)分析選擇的質(zhì)粒中攜帶的核苷酸序列。結(jié)果證實(shí)該質(zhì)粒，即pBICR16G6P-2(圖4)，在β-葡糖醛酸糖苷酶基因的上游包含本發(fā)明的啟動(dòng)子。(3)包含本發(fā)明終止子的載體的構(gòu)建由包含SEQ ID NO:2中的DNA片段的pCR16G6T構(gòu)建包含本發(fā)明終止子核苷酸序列的pBICR16G6T-2，其中加入了用于基因克隆的SacⅠ和EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)。取50ng pC16質(zhì)粒DNA(植物細(xì)胞生理學(xué)(PlantCell Physiology)38(9):1080-1086,1997,JP 07-18828)用50UDraⅠ和50U SacⅠ完全消化，并將部分消化產(chǎn)物在4.0％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)上進(jìn)行分離。切下大約189bp的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA。
合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶識(shí)別核苷酸序列)的寡核苷酸T和U并作為引物，以5ng包含SEQ ID NO:2中的DNA片段的pCR16G6T作為模板，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸T:5’-TTCAT AATTT ACAGA GTGAG TGACA GTCAG-3’(30mer)寡核苷酸U:5’-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3’(34mer)將擴(kuò)增的DNA片段用20U EeoRⅠ和20U DraⅠ完全消化，并將部分消化產(chǎn)物在4.0％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)上進(jìn)行分離。切下800bp的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA。取2μg pUC18載體(Takara Shuzo有限公司)，用20U EcoRⅠ和20U DraⅠ消化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA。將載體DNA和上述兩種DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含100μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由白色菌落制備載體DNA，用限制酶EcoRⅠ和SacⅠ切割，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇包含989bp的DNA片段的載體(pCR16G6T-2)。(4)包含本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建取2μg此實(shí)施例6(2)中描述的pCR16G6P-2，用20U EeoRⅠ和20U SalⅠ完全消化，并將部分消化產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠(DojindoLaboratories)上進(jìn)行分離。切下大小為2kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA片段G。相似的，取2μg此實(shí)施例6(3)中描述的pCR16G6T-2，用20U EcoRⅠ和20U SalⅠ完全消化，并將部分消化產(chǎn)物在4％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上進(jìn)行分離。切下大小為1kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA片段H。同樣將pBluescript KS載體(Clontech Laboratories公司)用EcoRⅠ完全消化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA。將載體DNA和上述兩種DNA片段H和G使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含100μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由白色菌落制備載體DNA，用限制酶EeoRⅠ切割，并通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇包含3kb的DNA片段的載體。然后將該載體用20U EcoRⅠ完全消化。另一方面，將(1)中描述的pBIΔ用20U EcoRⅠ完全消化，并用堿性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)進(jìn)行去磷酸化。將載體DNA和3kb的DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由生長(zhǎng)的克隆制備載體DNA，用限制酶EcoRⅠ或EcoRⅠ和SalⅠ切割，并通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇分別包含3kb的DNA片段或大約2kb和1kb的DNA片段的載體(pBICR16G6PT)。(5)pBICR16G6PT中HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)的缺失取1μg pBICR16G6PT，用HindⅢ完全消化，并通過(guò)乙醇沉淀回收DNA。然后，將該DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)補(bǔ)平末端，并如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收DNA片段。將該DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由生長(zhǎng)的克隆制備載體DNA，用限制酶HindⅢ切割，并通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇缺失了HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)的載體(pBICR16G6PTΔ)。實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)(1)pBICR16G6PTΔ中GUS基因的導(dǎo)入取2μg pBI221質(zhì)粒DNA(Clontech Laboratories公司)，用20USmaⅠ和20U SacⅠ完全消化，并通過(guò)乙醇沉淀回收DNA。然后，將此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)補(bǔ)平末端，并如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收DNA片段。然后將DNA片段在1.0％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離。切下大小大約1.7kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含GUS基因。同樣取2μg pBluescript KS載體(ClontechLaboratories公司)，用20U SmaⅠ完全消化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA片段。將50μg載體DNA和100ng上述1.7kb GUS基因片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(TakaraShuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
合成具有下列核苷酸序列(包含基于pBluescript KS(寡核苷酸K)和GUS基因(寡核苷酸M)的核苷酸序列)的寡核苷酸M和K，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的白色菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在4.0％ Nusieve瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上進(jìn)行分離。選擇顯示有410bp的DNA片段擴(kuò)增的克隆用于進(jìn)一步的構(gòu)建。取2μg經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA，用20U SalⅠ和20UBamHⅠ完全消化，然后將DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(DojindoLaboratories)上進(jìn)行分離。切下大小大約1.7kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA片段。取2μgpBICR16G6PTΔ，用20U SalⅠ和20U BamHⅠ消化，并用堿性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)進(jìn)行去磷酸化。將50ng載體DNA和20ng上述1.7kb的DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
合成具有下列核苷酸序列的寡核苷酸U和K，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的白色菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸U:5’-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3’(34mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離。選擇顯示大約1.1kb的DNA片段擴(kuò)增的克隆用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(pBICR16G6PTΔG)。將包含pBICR16G6PTΔG載體的細(xì)菌克隆用2ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將預(yù)培養(yǎng)物接種500ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基并于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以8000rpm離心10分鐘收集細(xì)菌細(xì)胞，并使用QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化載體DNA。(2)通過(guò)基因轟擊的GUS基因表達(dá)的確認(rèn)使用實(shí)施例5描述的Morikawa等人的方法(C.M.基因槍系統(tǒng)，Rehbock公司，東京，日本)，將pBICR16G6PTΔG導(dǎo)入大豆體細(xì)胞胚。至于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以相同方式導(dǎo)入pBI221(Clontech Laboratories公司)。將經(jīng)轟擊的大豆體細(xì)胞胚于25℃放置24小時(shí)，并用GUS染色緩沖液于37℃浸泡過(guò)夜。在經(jīng)pBICR16G6PTΔG轟擊的大豆體細(xì)胞胚中觀察到強(qiáng)GUS染色圖案。實(shí)施例8本發(fā)明啟動(dòng)子中突變位點(diǎn)的引入(1)啟動(dòng)子中突變位點(diǎn)的引入(1-1)本發(fā)明啟動(dòng)子中SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)的缺失取2μg pBICR16G6P，用20U SacⅠ完全消化。然后，將此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)補(bǔ)平末端，并如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收DNA片段。然后將此DNA片段在1.0％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離，切下大小大約(a)3.9kb和(b)880bp的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-RadLaboratories)純化各膠塊所含DNA片段(a)和(b)。將50ng DNA片段(a)和100ng DNA片段(b)使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。
合成具有下列核苷酸序列(即包含上述核苷酸序列)的寡核苷酸M和G，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離。選擇顯示大約2kb的DNA片段擴(kuò)增的克隆，并使用Qia制備旋轉(zhuǎn)試劑盒(Qia-prep spin kit,QIAGEN公司)純化質(zhì)粒DNA。將經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA用SacⅠ切割，并通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒。SEQ ID NO:3所示基因核苷酸序列是SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒的范例。(1-2)本發(fā)明啟動(dòng)子中SphⅠ識(shí)別位點(diǎn)的缺失如(1-1)所述，可以缺失SEQ ID NO:7所示DNA片段中的SphⅠ識(shí)別位點(diǎn)。取2μg pBICR16G6P，用20U SphⅠ完全消化。然后，將此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)補(bǔ)平末端，并如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收DNA片段。然后將此DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離，切下大小大約(c)3.0kb和(d)1.6kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-RadLaboratories)純化膠塊中所含的DNA片段(c)和(d)。將50ng DNA片段(c)和100ng DNA片段(d)使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。
合成具有下列核苷酸序列(即包含上述核苷酸序列)的寡核苷酸M和N，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸N:5’-AGGAC GACTT AGGTG AATAC-3’(20mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離。選擇顯示大約1.6kb的DNA片段擴(kuò)增的克隆，并使用Qia制備旋轉(zhuǎn)試劑盒(Qia-prep spin kit,QIAGEN公司)純化質(zhì)粒DNA。將經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA用SphⅠ切割，并通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇SphⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒。SEQ ID NO:4所示基因核苷酸序列是SphⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒核苷酸序列的范例。同樣，SphⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的啟動(dòng)子可以用于如(1-1)所述進(jìn)一步缺失SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)。(1-3)本發(fā)明啟動(dòng)子中XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)的缺失如(1-1)和(1-2)所述，可以缺失SEQ ID NO:7所示DNA片段中的XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)。取2μg pBICR16G6P，用20U XbaⅠ完全消化。然后，將此DNA片段用5U T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)補(bǔ)平末端，并如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收DNA片段。然后將此DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上分離大小大約(e)7.0kb的DNA片段，并在4.0％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)上分離大小大約(f)250bp的DNA條帶。使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA片段(e)和(f)。將50ng DNA片段(e)和20ng DNA片段(f)使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(TakaraShuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。
合成具有下列核苷酸序列(即包含上述核苷酸序列)的寡核苷酸M和N，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸O:5’-ATACA TCTTT TCAAA TTTCA-3’(20mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在4.0％ Nusieve瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上進(jìn)行分離。選擇顯示大約250bp的DNA片段擴(kuò)增的克隆，并使用Qia制備旋轉(zhuǎn)試劑盒(Qia-prep spin kit,QIAGEN公司)純化質(zhì)粒DNA。將經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA用XbaⅠ切割，并通過(guò)1.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，以選擇XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒。SEQ ID NO:5所示基因核苷酸序列是XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒核苷酸序列的范例。同樣，XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn)缺失的啟動(dòng)子可以用于分別如(1-1)或(1-2)所述進(jìn)一步缺失SacⅠ或SphⅠ識(shí)別位點(diǎn)。(2)包含本發(fā)明突變啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體的構(gòu)建可以通過(guò)實(shí)施例2中描述的方法構(gòu)建表達(dá)載體。合成具有下列核苷酸序列(包含用于克隆的限制酶識(shí)別核苷酸序列)的寡核苷酸G和H，并作為引物，以具有SEQ ID NO:3、4或5所示核苷酸序列的質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)，將擴(kuò)增的DNA片段用10U HindⅢ和10U XbaⅠ完全消化，然后將部分消化產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離。分別切下大約2.0kb的DNA條帶或大約1.7kb和250bp的DNA條帶，使用玻璃珠(Bio-RadLaboratories)純化膠塊所含DNA片段。取2μg由pBIN19(S.Ohta等人，植物細(xì)胞生理學(xué)(Plant Cell Physiol.)31(6):805-813,1990和Y.Hiei等人，植物雜志(Plant J.)6:271-282,1994)衍生的載體pIG121HM(見圖3)，用10U HindⅢ和10U XbaⅠ消化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA。將載體DNA和上述兩種DNA片段(大約2.0kb、1.7kb和大約250bp)使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將完成導(dǎo)入步驟的細(xì)菌菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。然后由生長(zhǎng)的克隆制備質(zhì)粒DNA，用限制酶HindⅢ和XbaⅠ切割，并在瓊脂糖凝膠電泳上分析，以選擇包含上述2.0kb或1.7kb和250bpDNA片段的載體。然后，將選擇的載體作為模板，以上述寡核苷酸G和H作為引物，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃3min)寡核苷酸G:5’-GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA-3’(28mer)寡核苷酸H:5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)結(jié)果證實(shí)大約2kb的DNA片段得到了擴(kuò)增，由此得到了在β-葡糖醛酸糖苷酶基因上游包含具有本發(fā)明SEQ ID NO:3、4或5所示核苷酸序列的啟動(dòng)子的Ti質(zhì)粒表達(dá)載體。而且，上述質(zhì)粒中包含的NOS終止子可以換為得自pBICR16G6PT或?qū)嵤├?中所述pBICR16G6PTΔ的終止子。實(shí)施例9包含本發(fā)明啟動(dòng)子和終止子的載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)(1)包含本發(fā)明終止子的表達(dá)載體中GUS基因的導(dǎo)入可以如實(shí)施例7(1)所述將GUS基因?qū)氡磉_(dá)載體。取2μg pBI221質(zhì)粒DNA(Clontech Laboratories公司)，用20U SmaⅠ和20U SacⅠ完全消化，并通過(guò)乙醇沉淀回收DNA。然后，將此DNA片段用5U T4DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)補(bǔ)平末端，并如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收DNA片段。然后將DNA片段在1.0％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離。切下大小大約1.7kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含GUS基因。同樣取2μg pBluescript KS載體(Clontech Laboratories公司)，用20U SmaⅠ完全消化，并用堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化。然后如上所述進(jìn)行酚處理和乙醇沉淀，從而回收載體DNA片段。將50μg載體DNA和100ng上述1.7kb GUS基因片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在含100μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
合成具有下列核苷酸序列(包含基于pBluescript KS(寡核苷酸K)和GUS基因(寡核苷酸M)的核苷酸序列)的寡核苷酸M和K，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的白色菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸M:5’-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3’(17mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在4.0％Nusieve瓊脂糖凝膠(FMCBioProducts)上進(jìn)行分離。選擇顯示410bp的DNA片段擴(kuò)增的克隆用于進(jìn)一步的構(gòu)建。取2μg經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA，用20U SalⅠ和20U BamHⅠ完全消化，然后將DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(DojindoLaboratories)上進(jìn)行分離。切下大小大約1.7kb的DNA條帶，并使用玻璃珠(Bio-Rad Laboratories)純化膠塊所含DNA片段。取2μgpBICR16G6PT，用20U SalⅠ和20U BamHⅠ消化，并用堿性磷酸酶(Takara Shuzo有限公司)進(jìn)行去磷酸化。將50ng載體DNA和20ng上述1.7kb的DNA片段使用連接試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌HB101菌株(Takara Shuzo有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞，并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
合成具有下列核苷酸序列的寡核苷酸U和K，并作為引物，與上述轉(zhuǎn)化體的白色菌落懸浮液一起，進(jìn)行PCR(40個(gè)循環(huán)94℃ 1min；55℃ 2min；74℃ 3min)寡核苷酸U:5’-GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC-3’(34mer)寡核苷酸K:5’-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT-3’(21mer)然后將擴(kuò)增的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Dojindo Laboratories)上進(jìn)行分離。選擇顯示大約1.1kb的DNA片段擴(kuò)增的克隆用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(pBICR16G6PTG)。將包含pBICR16G6PTG的細(xì)菌克隆用2ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將預(yù)培養(yǎng)物接種500ml含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基，并于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以8000rpm離心10分鐘收集細(xì)菌細(xì)胞，并使用QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化質(zhì)粒DNA。pBICR16G6PTG或pBICR16G6PTΔG中包含的SEQ ID NO:7中的本發(fā)明啟動(dòng)子可以換成實(shí)施例8中所述啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(自然(Nature)313:810-812)或NOS啟動(dòng)子(核酸研究(Nucleic Acid Res.)11(2):369-385,1983)交換。(2)使用轉(zhuǎn)基因煙草的GUS基因表達(dá)的確認(rèn)如實(shí)施例2(2)所述，將一片無(wú)菌培養(yǎng)的煙草葉片(0.7cm2)在包含實(shí)施例8和9的表達(dá)載體的土壤桿菌培養(yǎng)物(在含50μg/ml卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過(guò)夜)中浸泡2分鐘，用無(wú)菌濾紙吸去多余液體后，放置在MS-NB培養(yǎng)基上。于25℃共培養(yǎng)5天(光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí))后，將葉片用MS液體培養(yǎng)基清洗，并放置于MS-NBC培養(yǎng)基上。再培養(yǎng)5天后，將葉片轉(zhuǎn)移到含選擇藥物的MS-NBCK培養(yǎng)基上，并靜止培養(yǎng)大約1個(gè)月。從葉片上切下再生芽，并在MS-CK培養(yǎng)基上進(jìn)行次培養(yǎng)。大約1個(gè)月后，將生根的個(gè)體種植于土壤中以獲得自花授粉的種子。可以如實(shí)施例3所述在上述轉(zhuǎn)基因煙草中確認(rèn)GUS基因。同樣可以通過(guò)實(shí)施例4中所述方法確認(rèn)基于本發(fā)明終止子的GUS表達(dá)活性。(3)使用基因轟擊的GUS基因表達(dá)的確認(rèn)使用實(shí)施例5描述的Morikawa等人的方法(C.M.基因槍系統(tǒng)，Rehbock公司，東京，日本)，可以將載體DNA導(dǎo)入大豆體細(xì)胞胚。至于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，可以以相同方式導(dǎo)入pBI221(Clontech Laboratories公司)。將經(jīng)轟擊的大豆體細(xì)胞胚于25℃放置24小時(shí)，并用GUS染色緩沖液于37℃浸泡過(guò)夜。在經(jīng)上述載體轟擊的大豆體細(xì)胞胚中觀察到強(qiáng)GUS染色圖案。
實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基的組成如下(1)植物培養(yǎng)基(ⅰ)MS瓊脂培養(yǎng)基(用于煙草)將4.4g MURASHIGE AND SKOOG基本培養(yǎng)基(Sigma Chemical公司)和30g蔗糖溶于1L蒸餾水，用1N KOH調(diào)至pH5.8，補(bǔ)加8g瓊脂(Wako Pure Chemical Industries公司)，然后高壓滅菌。(ⅱ)MS-NB瓊脂培養(yǎng)基MS瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)充0.1μg/ml 1-萘乙酸(NAA)和1.0μg/ml 6-芐氨基嘌呤(BA)。(ⅲ)MS-NBC瓊脂培養(yǎng)基MS-NB瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)加300μg/ml頭孢噻肟。(ⅳ)MS-NBCK瓊脂培養(yǎng)基MS-NB瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)加100μg/ml卡那霉素和300μg/ml頭孢噻肟。(ⅴ)MS-CK瓊脂培養(yǎng)基MS瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)加100μg/ml卡那霉素和300μg/ml頭孢噻肟。(ⅵ)MS瓊脂培養(yǎng)基(用于擬南芥)將4.4g MURASHIGE AND SKOOG(Sigma Chemical公司)和20g蔗糖溶于1L蒸餾水，用1N KOH調(diào)至pH6.3，補(bǔ)加2g Gellan gun(WakoPure Chemical Industries公司)，然后高壓滅菌。(ⅶ)CIM瓊脂培養(yǎng)基MS瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)加0.5μg/ml 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和0.05μg/ml激動(dòng)素。(ⅷ)SIMC瓊脂培養(yǎng)基MS瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)加5μg/ml N6-(2-異戊烯基)腺嘌呤(2-iP)、0.15μg/ml吲哚乙酸(IAA)、和300μg/ml頭孢噻肟。(ⅸ)SIMCH瓊脂培養(yǎng)基SIMC瓊脂培養(yǎng)基補(bǔ)加20μg/ml潮霉素。(2)細(xì)菌和噬菌體培養(yǎng)基(ⅰ)LB培養(yǎng)基將10g細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco Laboratories)、5g細(xì)菌用酵母提取物(Difco Laboratories)、和10g NaCl溶于1L蒸餾水，用5N NaOH調(diào)pH7.0，并高壓滅菌。當(dāng)用于平板時(shí)，在高壓滅菌前加入15g瓊脂。(ⅱ)YEB培養(yǎng)基將5g細(xì)菌用牛肉提取物(Difco Laboratories)、1g細(xì)菌用酵母提取物(Difco Laboratories)、5g多蛋白胨、5g蔗糖、0.2ml 10N NaOH溶于1L蒸餾水，高壓滅菌，然后在使用前加入0.2ml過(guò)濾除菌的1MMgSO4。當(dāng)制備瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，在高壓滅菌前加入15g瓊脂。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠在植物中有效表達(dá)感興趣基因的啟動(dòng)子和終止子。
序列表<110>Sumitomo Chemical Co.Ltd.<120>植物啟動(dòng)子和終止子<130>P149669<160>9<210>1<211>2052<212>DNA<213>Daucus carota L.<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)...(2052)<400>1catgtgtgcc ctacagcaca tagggcctgt ttggttgaga gaagcagaag ctgcttctga 60cttcttcttc ttttgacctg tttgtataaa gaagtagaaa tatttttaaa aagctgcgaa120tactaacttc tctctcacaa cttccgcttc ttttccaaac actttattaa cttttttact180tctcatttct actccacttc tttgctataa gcaagaaatc acttctttta agctaaccca240aacggcctca ataaaagatc attcataaat gtatctttca attttaggat aacaatacgt300gaacagggtt attttttaac gtgtcaacaa attctaataa ttttacctgg ccggtgaaca360ccgtcttcca agataatata ttttaatttt gtagcctccc ttttaaccaa attcgcatgc420aggacgactt aggtgaatac acattgtact gtgagtcttt aaacaaagaa caagtggttc480atgctcagcc atcaaaattg acaaaacccg acacaacact ctatccacgt actatacttt540tggccgaatg cttctcaaaa tgttttttat atgtaaaata atgcccatcc aaggataagt600aaaattcccg tttaaccagt ttgttaatat atatgtttac acttacaaga ggatattcgt660aatactttta gacgacaaga gacttaggtc aaaaatggac gctggtaaac agcctagact720tggtcactga taaatagata 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ggtcaaatgg gaagttcatg 1620tgtattcaat agttttaata taaaagtaaa ttttaaatta attgttattt ttgtttcaga 1680aatttaaaat aaattattga gcatgggaag ttcacgggca tcattgagca gcactagact 1740gtttgaacaa tgtatgtccg gtgtacatct atgacctttc aactcaaact agtgaataat 1800gcattctaga atacatcttt tcaaatttca acaaacacag ctttaacttt tctttcaacg 1860gattggaatc cttttctaaa ctttttaaaa taaaaaaaat gcattattgt aatatttatc 1920aacacctcaa cattgatgtt agcgtactat aaataggtgc tcttggtgct ctactatcat 1980cacatcaatc ttacaccaca aaccttgagc ttaatttttc tacttattct cagcaataac 2040attctaaata tc 2052<210>2<211>851<212>DNA<213>Daucus carota L.<220><221>終止子<222>(1)…(851)<400>2ctgaaaagga agttcatcga tctatcagca aaattagaga acttgtgagg tcacagaagt60ctgaaggact agcggaacct gaaactgggt ctcagaagag gatcacctac gagcaagtga 120agaaaatggc aactttattt gatgacttgt tgatatttat tgagaattac aactttgcag 180aaaagccaac tctgcggttt caggttctgg aattaattaa gcttttacat cactatggaa 240gtgatactat tcgaagcgga gtggaggaag aacttgagta cgtgaatgag aaaaattcag 300caacacagta caagaaagct ctggaagtaa tgttgagagt atgcaataag gagaatacgg 360ggatacgtca aagtattttt tacgacacaa tagaaaaggc agaaagggat aaagtgctct 420atgaatggtg aggaattggg acggtttagg ttagcttaaa aaaagtgact tcttacttga 480agtaatgaag tggagtagaa ctgataagta aagtaataat tataagttat taaagtgttt 540ggaaaagaaa tagaagttgt aaagaaaagt tagcattttc tacttccaac ttatttctca 600cgacttctta aaagtacttc ttactttttt acacaaacgg gtcaaggaaa gtggaagcaa 660aaagctggag ttacttctta taagaatgtt tatactaaat gagaaatgac aaacacagaa 720atgagaatga atatgattat tggtttaata atagtgtatt ttatttaaaa agatcgcata 780cattaccagc cagatgaagt tattcatcac aactcacaac aaagtacaaa gaaaaagttg 840caattctgtc a851<210>3<211>2048<212>DNA<213>Daucus carota L.<220><221>啟動(dòng)子<222>(1)…(2048)<400>3catgtgtgcc ctacagcaca tagggcctgt ttggttgaga gaagcagaag ctgcttctga60cttcttcttc ttttgacctg tttgtataaa gaagtagaaa tatttttaaa aagctgcgaa 120tactaacttc tctctcacaa cttccgcttc ttttccaaac actttattaa cttttttact 180tctcatttct actccacttc tttgctataa gcaagaaatc acttctttta agctaaccca 240aacggcctca ataaaagatc attcataaat gtatctttca 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1140atatggattg gacacggaga ctaagaaaaa tgtataaagt aatgtagagt aaaaagaaag 1200agaaagaaaa gtgggtaaag tagcgggacc caccaatata taattgatag atttagaaaa 1260gtagttgaaa gtagtgggtg ggtgggattt ttatattata aaaatttact attttgagaa 1320agttttgaaa tgtatagaat tgagtgggac atccataaaa ggaaagtgta tagaattaaa 1380tgggacagag ggagtaatac ctttatgata tataaatttt tgttattttg atttcataag 1440attataaatc tatgttataa tgataatata attttaaaaa taatactata ttaattctga 1500ttagtcgatt accgcctttt ataattttac aatactgagt aatatgaata aatcagttat 1560ctgaaaagca aataatatct ttgtaaaaca gcgttcggtc aaatgggaag ttcatgtgta 1620ttcaatagtt ttaatataaa agtaaatttt aaattaattg ttatttttgt ttcagaaatt 1680taaaataaat tattgagcat gggaagttca cgggcatcat tgagcagcac tagactgttt 1740gaacaatgta tgtccggtgt acatctatga cctttcaact caaactagtg aataatgcat 1800tctagaatac atcttttcaa atttcaacaa acacagcttt aacttttctt tcaacggatt 1860ggaatccttt tctaaacttt ttaaaataaa aaaaatgcat tattgtaata tttatcaaca 1920cctcaacatt gatgttagcg tactataaat aggtgctctt ggtgctctac tatcatcaca 1980tcaatcttac 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1．包含下面的DNA(a)或(b)、特征為能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入，并且與SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域核苷酸序列同一性超過(guò)90％的核苷酸序列的DNA，該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。
2．包含下面的DNA(a)或(b)、特征為能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的終止子(a)包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA，或(b)包含在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入，并且與SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域核苷酸序列同一性超過(guò)90％的核苷酸序列的DNA，該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。
3．特征為包含以能夠發(fā)揮功能的形式彼此連接的權(quán)利要求1的啟動(dòng)子和目的基因的嵌合基因。
4．特征為包含以能夠發(fā)揮功能的形式彼此連接的權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、目的基因、和權(quán)利要求2的終止子的嵌合基因。
5．特征為包含權(quán)利要求1的啟動(dòng)子的載體。
6．特征為包含權(quán)利要求1的啟動(dòng)子和目的基因的載體。
7．特征為包含權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、目的基因、和權(quán)利要求2的終止子的載體。
8．產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法，其特征為包含將權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求3或4的嵌合基因、和權(quán)利要求5、6、或7的載體中的任何一種導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟。
9．特征為攜帶已導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求3或4的嵌合基因、和權(quán)利要求5、6、或7的載體中的任何一種的轉(zhuǎn)化體。
10．權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其特征為宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
11．表達(dá)基因的方法，其特征為包含將權(quán)利要求1的啟動(dòng)子和位于該啟動(dòng)子下游的目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的步驟，和在宿主細(xì)胞中在所述啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該目的基因的步驟。
12．表達(dá)基因的方法，其特征為包含將權(quán)利要求2的終止子和位于該終止子上游的目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的步驟，和在宿主細(xì)胞中在所述終止子的控制下表達(dá)該目的基因的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及:(1)包含下面的DNA(a)或(b)、特征為能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子:(a)包含SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶7所示核苷酸序列的DNA,或(b)包含在SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶7所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入,并且與SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶7所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域核苷酸序列同一性超過(guò)90%的核苷酸序列的DNA,該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效;(2)包含下面的DNA(a)或(b)、特征為能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的終止子:(a)包含SEQ ID NO∶2所示核苷酸序列的DNA,或(b)包含在SEQ ID NO∶2所示核苷酸序列中有一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、取代、或加入,并且與SEQ ID NO∶2所示核苷酸序列中由250個(gè)或更多堿基組成的任何區(qū)域核苷酸序列同一性超過(guò)90%的核苷酸序列的DNA,該DNA的生物學(xué)功能與上述DNA(a)等效。根據(jù)本發(fā)明,提供了能夠在植物中有效表達(dá)基因的啟動(dòng)子和終止子。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1321198SQ99811630
公開日2001年11月7日 申請(qǐng)日期1999年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月2日
發(fā)明者西川聰美, 大江田憲治 申請(qǐng)人:住友化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社