專利名稱：賦予植物抗病性的Pi－ta基因的制作方法
發(fā)明技域本發(fā)明涉及制備和應(yīng)用一種分離的核酸片段，所述核酸片段賦予植物抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)?；蛘邌为?dú)包含這種核酸片段以及合適調(diào)節(jié)序列的基因，或者包含這種核酸片段和AVR-Pita分離核酸片段或其功能等同亞片段以及合適調(diào)節(jié)序列的基因，可以用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生抗多種真菌病原體(特別是稻瘟病真菌)的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。
對(duì)于特定真菌或細(xì)菌病原體的一系列菌株(小種)對(duì)特定寄主物種的一系列栽培品種或者致病或者不致病的情況，已經(jīng)用遺傳分析來幫助闡述植物-病原體識(shí)別的遺傳基礎(chǔ)。在許多這種情況下，對(duì)寄主和病原體兩者的遺傳分析揭示出，許多無毒真菌和細(xì)菌菌株與致病菌株的不同之處是具有一個(gè)或多個(gè)無毒(“avr”或“AVR”)基因，所述基因在該寄主中具有相應(yīng)的“抗性”(R)基因。
這種無毒基因-抗性基因模型被稱為“基因?qū)颉蹦Ｐ?Crute等(1985)Mechanisms of Resistance of Plant Disease，第197-309頁，R.S.S.Fraser編輯；Ellingboe,(1981)Annu.Rev.Thvtopathol.19:125-143；Flor,(1971)Annu.Rev.Phythopathol.9:275-296)。按照該模型的簡單表述，植物抗性基因編碼avr基因產(chǎn)生的分子信號(hào)的特異性受體。然后，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將該信號(hào)帶到一組起動(dòng)寄主防衛(wèi)的靶基因。盡管有這種簡單的預(yù)測(cè)模型，但仍不了解avr-抗性基因互作的分子基礎(chǔ)。
第一個(gè)克隆的R-基因是玉米(Zea mays)的Hml基因，它賦予對(duì)真菌病原體Cochliobolus carbonum特定小種的抗性(Johal等，1992,Science 258:985-987)。Hml編碼將該病原體產(chǎn)生的毒素解毒的還原酶。第二個(gè)克隆的R-基因是番茄(Lycopersicon pimpinellifollium)的Pto基因(Martin等，1993,Science 262:1432-1436；美國專利第5,648,599)。Pto編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該激酶賦予番茄對(duì)細(xì)菌病原體丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv.tomato)表達(dá)avrPto無毒基因的菌株的抗性?，F(xiàn)在的研究重點(diǎn)是編碼富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)的蛋白的R-基因(Jones和Jones,1997,Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol.24:89-167)。已經(jīng)鑒定出兩類具有胞外LRR的膜錨蛋白。一個(gè)亞類包括缺乏胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的R-基因產(chǎn)物，例如編碼對(duì)黃枝孢(Cladosporium fulvum)的抗性的番茄Cf-9基因(Jones等，1994,Science 266:789-793,WO95/18230)，另一亞類包括具有胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的R-基因產(chǎn)物，水稻Xa-2l基因是編碼對(duì)細(xì)菌病原體水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)的抗性的基因(Song等,1995,Science 270:1804-1806；美國專利第5,859,339號(hào))。最大一類R-基因包括編碼具胞質(zhì)LRR的蛋白的那些基因，例如擬南芥屬(Arabidopsis)R-基因RPS2(Bent等，1994,Science 265:1856-1860；Mindrinos等，1994,Cell 78:1089-1099)和RPMl(Grant等，1995,Science 269:843-846)。這些R-蛋白也具有一個(gè)推定的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和或者一個(gè)亮氨酸拉鏈(LZ)基序或者一個(gè)與Toll/白介素-1受體(TIR)同源的序列。表1部分復(fù)制自Baker等(1997,Science 276:726-733)，作為迄今克隆的R-基因類別和每類中所克隆基因?qū)嵗暮喢鞲攀觥?br> 表1．分離的植物抗性基因1類別 R基因植物 病原體 結(jié)構(gòu)1 RPS2 擬南芥屬丁香假單胞菌番茄致病變種 LZ-NBS-LRRRPMI 擬南芥屬丁香假單胞菌斑生致病變種 LZ-NBS-LRR(Pseudomonas syringae pv.Maculicola)Prf番茄丁香假單胞菌番茄致病變種 LZ-NBS-LRRN 煙草煙草花葉病毒 TIR-NBS-LRRL6亞麻亞麻柳柵銹菌(Melampsora lini) TIR-NBS-LRRM 亞麻亞麻柳柵銹菌 TIR-NBS-LRRRPP5 擬南芥屬寄生霜霉(Peronospora parasitica) TIR-NBS-LRRI2番茄尖鐮孢(Fusarium oxysporum) NBS-LRR2 Pto番茄丁香假單胞菌番茄致病變種 蛋白激酶3 Cf-9 番茄黃枝孢 LRR-TMCf-2 番茄黃枝孢 LRR-TMHSlPro-1甜菜甜菜異皮線蟲(Heterodera schachtii) LRR-TM4 Xa21 水稻水稻黃單胞菌 LRK，蛋白激酶5 Hml玉米Cochliobolus carbonum，小種1 毒素還原酶1該表已經(jīng)部分復(fù)制自Baker等(1997,Science 276:726-733)。每個(gè)列出的R-基因的參考文獻(xiàn)均可以在該綜述文章中找到。
在對(duì)于基本真核細(xì)胞功能(例如細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞骨架組構(gòu)、小泡轉(zhuǎn)運(yùn)和防衛(wèi))重要的許多蛋白家族中發(fā)現(xiàn)了核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)。重要的實(shí)例包括RAS類、腺苷三磷酸酶、延伸因子和稱為G-蛋白的異三聚體GTP結(jié)合蛋白(Saraste等，1990,Trends in Biochem.Science 15:430)。這些蛋白共同具有結(jié)合ATP和GTP的能力(Traut,1994,Eur.J.Biochem.229:9-19)。
長期以來的假說是，稻瘟病系統(tǒng)代表一個(gè)由H.H.Flor定義的典型的基因?qū)蛳到y(tǒng)(Flor,1971,Annu.Rev.Phytopathol.19:125-143)。由于侵染水稻的Magnaporthe grisea田間分離菌的特征是育性低，因此這一點(diǎn)已經(jīng)阻礙了鑒定出稻瘟病病原體M.grisea中的AVR基因需要的遺傳分析。育性差的M.grisea水稻病原體和育性高的其它草本植物(例如彎葉畫眉草(Eragrostis curvula)和龍爪稷(Eleusine coracana))的M.grisea病原體之間的遺傳雜交，已經(jīng)提供了具有鑒定AVR基因所需的有性育性水平的所述真菌的實(shí)驗(yàn)室菌株(Valent等，1991,Genetics127:87-101)。自此，罕有育性的水稻病原體已經(jīng)提供了對(duì)于稻瘟病真菌AVR基因和特定的水稻R基因之間一對(duì)一遺傳對(duì)應(yīng)性或功能對(duì)應(yīng)性的證明(Silue等，1992,Phytopathology,82:577-580)。
人們對(duì)稻瘟病病理系統(tǒng)有強(qiáng)烈的興趣，因?yàn)樵谑澜绶秶鷥?nèi)由真菌病原體Magnaporthe grisea(Hebert)Barr(anamorph Pyricularia griseaSacc.)引起的稻瘟病繼續(xù)作為水稻作物最具爆炸性的和潛在損害性病害，盡管數(shù)十年來一直在研究對(duì)其的防治。在所有水稻育種程序中，稻瘟病抗性基因的操作仍是一個(gè)主要的目標(biāo)，因?yàn)檎婢后w進(jìn)化以擊敗所采用的抗性策略(參見The Rice Blast Disease,1994,Zeigler,Leong和Teng編輯，CAB International,Wallingford)。
在1915年左右，開始應(yīng)用市售的殺真菌劑來補(bǔ)充遺傳控制策略，當(dāng)時(shí)種植水稻的農(nóng)民使用基于無機(jī)銅的殺真菌劑(The Rice BlastDisease，第29章，1994,Zeigler,Leong和Teng編輯，CAB International,Wallingford)。隨著時(shí)間的流逝，用來防治稻瘟病的殺真菌劑已經(jīng)改變，其中某些化合物例如在二十世紀(jì)五十年代使用的有機(jī)汞制劑引起主要的環(huán)境損害。殺真菌劑防治稻瘟病對(duì)于農(nóng)民而言，目前意味著每年超過$500,000,000的成本。防治稻瘟病的費(fèi)用是世界水稻殺真菌劑市場(chǎng)中最大的一部分，于1998年總計(jì)為$752,000,000(Wood Mackerzie)。預(yù)期由于估計(jì)在1990年至2025年之間世界水稻的需求量每年增加1.7％，因此病害問題將日益加劇(參見The Rice Blast Disease，1994,Zeigler,Leong和Teng編輯，CAB International,Wallingford)。估計(jì)每年需要增加13,000,000噸稻谷來供養(yǎng)日益增長的人口，這種估計(jì)的需求必須來自日益減少的可用土地上產(chǎn)量的增強(qiáng)。由于目標(biāo)為高產(chǎn)的農(nóng)學(xué)生產(chǎn)實(shí)踐有利于稻瘟病，因此，這種病害將會(huì)繼續(xù)成為水稻作物產(chǎn)量的限制并很可能增加，除非可以將可持久的抗稻瘟病的遺傳抗性工程改造到水稻中。本發(fā)明是首先被克隆的稻瘟病抗性基因中的一個(gè)，對(duì)于工程改造對(duì)稻瘟病的可持久遺傳抗性的長期目標(biāo)而言，代表關(guān)鍵的第一步。
真菌M.grisea具有廣泛的寄生范圍，包括草本植物(Triticeae)(例如小麥)、(Oryzeae)(例如水稻)、(Clorideae)(例如龍爪稷)、(Paniceae)(例如珍珠粟)、(Andropogoneae)(例如高粱)和(Maydeae)(例如玉米)中的不同族的物種。現(xiàn)在分子分析已經(jīng)確定了8個(gè)M.grisea寄主物種?；詠喨?，每個(gè)亞群有針對(duì)有限的一組寄主物種的?；?Valent的綜述，1997,The Mycota V,Plant Relationships,Carroll/Tudzynski編輯，Springer-Verlag Berlin Heidelberg第37-54頁)。表2給出了目前根據(jù)線粒體DNA(mtDNA)類型的病原體亞群的觀念。根據(jù)獨(dú)立的核糖體DNA(rDNA)多態(tài)性(既包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，又包括內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列)和重復(fù)DNA和單拷貝序列中的多態(tài)性的分析，強(qiáng)有力地支持這一觀念。
看來水稻、小麥、龍爪稷、大麥和玉米的病原體(mtDNA Ⅰa-e型)密切相關(guān)，而馬唐(Digitaria spp.)和狼尾草(Pennisetum spp.)的病原體(mt DNA Ⅱ-Ⅳ型)與前述組別高度趨異的，它們相互之間也是如此。然而，m.grisea菌株在這種廣泛的寄主范圍中可以引起顯著的作物災(zāi)害。已經(jīng)表明，這種病原體在非洲是龍爪稷(Eleusine coracana)產(chǎn)量降低的一個(gè)主要原因，而在小麥(Triticum aestivum；Urashima等，1993,Plant Disease 77:l21l-l216)和珍珠粟(Pennisetum glaucum；Hanna等，1989,J.Heredity 80:145-147)中侵染盡管不大普遍，但在潮濕氣候條件下可能是嚴(yán)重的。在文獻(xiàn)中已經(jīng)記錄了在大麥和玉米中的這種病害(參見Urashima等，1993,Plant Disease 77:1211-1216)。
表2Magnaporthe grisea中的寄主專化性
1根據(jù)線粒體DNA單元型(haplotype)命名。2對(duì)“限定寄主物種”的致病力看來在該亞群中是保守的。某些寄主例如大麥被兩個(gè)或兩個(gè)以上亞群的成員侵染。
對(duì)植物致病真菌的致病性和寄主?；缘牧私獠蝗鐚?duì)細(xì)菌病原體和病毒病原體的了解，同樣，關(guān)于谷類作物抗性的分子基礎(chǔ)的了解比雙子葉作物或雙子葉模型系統(tǒng)例如擬南芥屬的了解要少(Baker等，1997，science 276726．733)。Sasaki報(bào)道了從1917年在日本開始的研究得到的關(guān)于稻瘟病抗性遺傳的第一個(gè)研究結(jié)果(Sasaki，1922，Japanese Genetics，Japan，1，81—85)。
從那時(shí)起，通過世界范圍的廣泛的遺傳分析，已經(jīng)確定了超過30個(gè)R基因，這些稻瘟病抗性基因中的許多基因已經(jīng)作圖至水稻染色體上(參見Takahashi，1965，The Rice Blast Disease，Johns Hopkins Press，Baltimore，303-329Causse等，1994，Genetics 1381251-1274)。這些R基因包括20種主效(major)抗性基因和11個(gè)推定的數(shù)量性狀基因座(OTL)。Kiyosawa已經(jīng)描述了13個(gè)主效抗性基因，發(fā)現(xiàn)其中9個(gè)基因?yàn)樵?個(gè)基因座的多等位基因；5個(gè)位于染色體11上的Pi-k基因座，2個(gè)位于染色體6上的Pi．z基因座，2個(gè)位于染色體12上的Pi-ta基因座(Kiyosawa，1984，Rice Genetics Newsletter 1:95-97)。最近在日本的研究(Ise，1992，Intemational mce Research Newsletter 178-9)和國際水稻研究所(IRRI)中的研究(Marcl(iU等，1 992，Phytopathology 82746—749)已經(jīng)產(chǎn)生了水稻近同源基因系(NIL),用作檢測(cè)哪些抗性基因有效防治各個(gè)真菌菌株的“差異”水稻品種。IRRI NIL提供在熱帶地區(qū)稻瘟病真菌群體的indica鑒定品種(indica differential)，已經(jīng)分析了它們的抗性基因及在Kiyosawa鑒定品種中存在的抗性基因之間的遺傳關(guān)系(Inukai等，1994,Phytopathology 84:1278-1283)。
與R基因緊密連鎖的分子標(biāo)記(或“標(biāo)志”)在育種程序中具有有效地基因滲入和操作那些R基因的實(shí)用性。通過比較近同源基因系的近同源基因模式及其供體和其回歸親本，Yu等(1987,Phytopathology77:323-326)能夠鑒定出5個(gè)與三個(gè)稻瘟病抗性基因連鎖的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記，并采用分離群體將其作圖至水稻染色體上。已經(jīng)報(bào)道了與R基因連鎖的RFLP標(biāo)記(Yu等，1991,Theor Appl Genet81:471-476)。對(duì)農(nóng)學(xué)上重要的R基因的分子克隆代表了研究人員將R基因與關(guān)鍵作物品種中的其它投入和產(chǎn)出性狀組合的能力的進(jìn)一步發(fā)展。
在對(duì)抗性遺傳的上述研究過程中，Sasaki通過觀察稻瘟病真菌的不同田間分離物在對(duì)不同水稻品種致病能力方面的變化，發(fā)現(xiàn)了稻瘟病病原體的生理小種(Sasaki,1922,Journal of Plant Protection 9:631-644；Sasaki,1923,Journal of Plant Protection 10:1-10)。對(duì)稻瘟病真菌的主效R基因抗性在田間條件下的不穩(wěn)定性或“破壞(breaking down)”已經(jīng)導(dǎo)致鑒別出根據(jù)對(duì)鑒別水稻品種致病力譜確定的許多小種或致病型(pathotype)(The Rice Blast Disease,1994，第13和16章，Zeigler,Leong和Teng,CAB International,Wallingford)。病原體群體在對(duì)應(yīng)用新抗性基因產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)是動(dòng)態(tài)的，有時(shí)在大田采用抗性基因后一年或兩年內(nèi)產(chǎn)生克服所述抗性基因的新的小種。
研究人員尚未深入地鑒定出稻瘟病病理系統(tǒng)中無毒基因/R基因?qū)Α?br> 于1997年7月15日授予Tanksley和Martin的美國專利第5,648,599號(hào)描述了一個(gè)從番茄中分離的基因片段，該片段編碼Pto絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過響應(yīng)植物細(xì)菌病原體的無毒基因而賦予植物抗病性。
公開于1995年10月26日的WO 95/28423描述了歸因于丁香假單胞菌RPS2基因家族的抗性、引物、探針和檢測(cè)方法。該公開的國際申請(qǐng)包括范圍廣的對(duì)編碼保護(hù)植物抵抗病原體的蛋白的基因的權(quán)利要求，所述蛋白具有特定NH2末端基序、NBS基序和富亮氨酸重復(fù)序列。Pi-ta蛋白有某些特有的特征。Pi-ta基因產(chǎn)物具有獨(dú)特的氨基末端，或者缺乏RPS2基因產(chǎn)物亞家族的潛在的亮氨酸拉鏈基序(Bent等，1994,Science 265:1856-1860；Mindrinos等，1994,Cell 78:1089-1099)，或者缺乏N基因亞家族編碼的Toll/白介素-1受體同源性(Whitman等，1994,Cell 78:1101-1115)。最重要的是，Pi-ta基因產(chǎn)物的羧基末端部分富亮氨酸，但它不符合所報(bào)道的R基因產(chǎn)物的富亮氨酸重復(fù)序列的共有序列(Jones和Jones,1997,Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol.24:89-167)。
于1996年11月5日授予Baker等的美國專利第5,571,706號(hào)包括由N基因賦予的植物病毒抗性。
于1999年1月12日授予Staskawicz等的美國專利第5,859,351號(hào)描述了PRF蛋白和核酸序列，該蛋白參與番茄的抗病性。
于1999年1月12日授予Ronald等的美國專利第5,859,339號(hào)描述了從水稻克隆的第一個(gè)抗性基因Xa-21，它編碼一種膜內(nèi)在蛋白，所述蛋白既具有LRR，又具有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，賦予水稻對(duì)細(xì)菌枯萎病的抗性。
于1991年10月17日公開的WO 91/15585和于1999年2月2日授予Wit等的美國專利第5,866,776號(hào)描述了采用病原體無毒基因和相應(yīng)的植物抗性基因保護(hù)植物抵抗病原體的方法。
于1997年10月7日授予Kawasaki等的美國專利第5,674,993(’993專利)描述了與稻瘟病抗性基因Pi-b、Pi-ta和Pi-ta2共分離的核酸標(biāo)記，并且建議通過采用這些核酸標(biāo)記可以分離和克隆稻瘟病抗性基因。然而，在’993專利中沒有提供任何稻瘟病抗性基因的核酸序列。應(yīng)該注意到，Pi-b稻瘟病抗性基因的推定的序列現(xiàn)在在Genbank中可得到(登錄號(hào)為AB013448)。
另外，Kawasaki等也發(fā)表了兩篇論文。第一篇論文Rybka等，MPMI,10(4):517-524(1997)，題目為“Indica衍生的稻瘟病抗性基因的高分辨率作圖。Ⅱ.Pi-ta2和Pi-ta及它們的起源的考慮”。在第519頁第2欄中提出的RAPD引物的序列與’993專利中SEQ ID NO:2中提出的RAPD引物的序列不同。該論文中所述引物的序列是TCCCCAGCCA。’993專利中所述引物的序列是TCGCCAGCCA。不清楚哪個(gè)序列正確。盡管如此，但顯然該論文沒有提出任何稻瘟病基因的任何核苷酸序列。第二篇論文是Nakamura等，Mol.Gen.Genet.254:611-62(1997)。該論文描述了采用水稻BAC文庫在稻瘟病抗性基因Pi-ta2的近著絲點(diǎn)區(qū)構(gòu)建800-kb的毗鄰群。同樣，沒有公開任何稻瘟病基因的核苷酸序列。
因此，認(rèn)為迄今人們尚未克隆在防治Magnaporthe grisea中具有所展示的實(shí)用性的得自水稻的Pi-ta抗性基因并對(duì)其測(cè)序，所述Pi-ta抗性基因也作為其它禾本科作物的作物保護(hù)工具將具有重大價(jià)值。因此，本文所述的發(fā)明代表了稻瘟病病理系統(tǒng)中Pi-ta無毒基因/R基因?qū)Φ牡谝淮畏肿予b定。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種分離的核酸片段，該片段賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段。
另一方面，本發(fā)明涉及包含這樣的分離核酸的基因所述分離的核酸賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中這些片段有效連接至合適的調(diào)節(jié)序列。
在再一方面，本發(fā)明涉及賦予植物抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括將一種基因引起所述植物中，其中所述基因包含的分離核酸賦予抗真菌病原體引入的病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中這些片段有效連接至合適的調(diào)節(jié)序列。
在又一方面，本發(fā)明涉及賦予植物在受真菌病原體侵染位點(diǎn)的抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括用一種重組表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)一種分離的核酸片段，其賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段；和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接至調(diào)節(jié)序列，并且其中所述構(gòu)成物賦予植物在侵染位點(diǎn)的抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。
本發(fā)明也涉及重組表達(dá)構(gòu)成物，所述重組表達(dá)構(gòu)成物賦予植物在侵染位點(diǎn)抗真菌病原體所致病害的抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)一種分離的核酸片段，其賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗性基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述基因片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段；和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中提出的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接至調(diào)節(jié)序列。
也考慮用這樣的基因或重組表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化的植物和由這類植物獲得的種子。
生物保藏真菌菌株O-137已經(jīng)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209，其命名、保藏號(hào)和保藏日如下。真菌菌株G-213是一種分離自日本的Digitariasmutsii的病原體，得自Jean Loup Notteghem保藏中心，Laboratoire dephytopathologie,Institut de Recherches Agronomiques Tropicales et desCultures Vivrieres,Centre de Cooperation Internationale en RechercheAgronomique pour le Developpement(CIRAD),BP 5035,34032Montpellier Cedex 1，法國，并可根據(jù)名稱JP34得到。該菌株也保藏于ATCC。生物保藏號(hào)保藏日M.grisea O-137 ATCC 744571998年8月3日M.grisea G-213 PTA-191 1999年6月8日序列表和附圖簡述根據(jù)以下詳述和構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的序列描述，可以更全面地理解本發(fā)明。序列描述含根據(jù)37 C.F.R.1.822(通過引用結(jié)合到本文中)中定義的三字母代碼。核苷酸序列從5’讀至3’。
SEQ ID NO:1是得自稻品種Yashiro-mochi的Pi-ta基因的基因組克隆的5757個(gè)核苷酸的序列。
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1中所述Pi-ta基因編碼的預(yù)測(cè)的蛋白序列。
SEQ ID NO:3是得自感病的稻品種Tsuyuake的Pi-ta基因的基因組克隆的5113個(gè)核苷酸的序列。
SEQ ID NO:4是由SEQ ID NO:3中所述Pi-ta基因編碼的預(yù)測(cè)的蛋白序列。
SEQ ID NO:5是得自M.grisea水稻病原體O-137的AVR-Pita(先前稱為AVR2-YAMO)的672個(gè)核苷酸的編碼序列。
SEQ ID NO:6是由SEQ ID NO:5中所述序列編碼的預(yù)測(cè)的蛋白序列。
SEQ ID NO:7是得自侵染馬唐的M.grisea病原體G-213的AVR-Pita cDNA的675個(gè)核苷酸的編碼序列。
SEQ ID NO:8是由SEQ ID NO:7中所述序列編碼的預(yù)測(cè)的蛋白序列。
SEQ ID NO:9-24敘述了用于Pi-ta區(qū)遺傳作圖和克隆的寡核苷酸(RAPD)引物的序列。
SEQ ID NO:25-31是用于PCR擴(kuò)增BAC插入片段末端的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:32和33是用來證實(shí)RAPD標(biāo)記SP4B9位置的PCR引物。
SEQ ID NO:34-36是得自BAC克隆RB14E8的部分序列，所述克隆含有一個(gè)單拷貝的Pi-ta候選基因PRG2。
SEQ ID NO:37-64是用于對(duì)SEQ ID NO:1中所述Pi-ta(PRG2)的基因組克隆全測(cè)序的測(cè)序引物。
SEQ ID NO:65是用來獲得Pi-ta核酸片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:66和67是用來擴(kuò)增一種AVR-Pita核酸片段AVR-Pita176的PCR引物，其中所述片段直接編碼所述推定的成熟蛋白酶。
SEQ ID NO:68是含有天然Pi-ta啟動(dòng)子的2425bp(核苷酸1-2425)和Pi-ta cDNA(核苷酸2426-5211)的EcoRⅠ-HindⅢ片段的5222個(gè)核苷酸的序列。
SEQ ID NO:69和70是在構(gòu)建pML135中用來產(chǎn)生接頭片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:71和72是用來從玉米基因組DNA中擴(kuò)增Adh 1-6內(nèi)含子的PCR引物。
SEQ ID NO:73和74是在構(gòu)建pAVR3的過程中用來擴(kuò)增AVR-Pita核酸片段(SEQ ID NO:5)的PCR引物。


圖1A-B．含所述R基因的染色體區(qū)的分子圖譜。
A．測(cè)試1440種RAPD引物中的每種，以鑒定與得自水稻品種Yashiro-mochi的所述R基因連鎖的多態(tài)性。該圖顯示用16種引物產(chǎn)生的連鎖圖譜，所述連鎖圖譜標(biāo)識(shí)出在雙單倍體(DH)群體的119個(gè)成員中與所述R基因一起分離的多態(tài)DNA片段。給出了最可能的標(biāo)記順序(按照計(jì)算機(jī)程序Mapmaker第2版確定的)，左側(cè)是以厘摩(cM)顯示的標(biāo)記之間的距離。請(qǐng)注意，該圖譜沒有按比例畫出。標(biāo)記SP7C3、SP7H8和SP8C6表明在該群體中與所述R基因沒有重組，而標(biāo)記SP8B8和SP3G6作圖至連鎖群的遠(yuǎn)端。
B．通過在另外151個(gè)DH系和720個(gè)F2子代測(cè)試所述16種標(biāo)記，提高了連鎖圖的分辨率。在990株單株的較大的總?cè)后w中，標(biāo)記SP7C3、SP7H8和SP8C6再次顯示不與所述R基因重組。然而，該分析分辨出先前成簇的側(cè)翼標(biāo)記。標(biāo)記SP4B9和SP9F3與所述R基因最緊密鄰接。
圖2．Pi-ta的定位克隆。以最初用RAPD標(biāo)記SP7C3鑒定的單拷貝多態(tài)序列開始染色體步查實(shí)驗(yàn)。左邊的一個(gè)步驟鑒定出一個(gè)重組邊界，其為含有標(biāo)記SP4B9的BAC克隆，該標(biāo)記在F2子代系K25中通過重組事件與所述R基因分離?？招姆娇蝻@示用來鑒定重疊BAC克隆的BAC探針的位置，而實(shí)心方框顯示用來證實(shí)所述重疊的探針。通過隨機(jī)基因組測(cè)序分析的BAC克隆用虛線顯示。所述pi-ta基因候選物(PRG2)以及從179G5R至77D8-12的DNA標(biāo)記(顯示于代表所述基因組區(qū)的線上方)不能與標(biāo)記SP7C3和水稻作圖群體成員中根據(jù)表型定義的R基因(通過侵染測(cè)定確定的)重組。確定右邊界的標(biāo)記SP9F3顯示出在一個(gè)DH系YT171中與R基因重組。
圖3．顯示通過BAC RB142E8的隨機(jī)基因組測(cè)序獲得的前3個(gè)亞克隆(虛線)位置的限制性酶切圖譜。有bac142e8.pk0001.fl2(fl2；SEQID NO:34)、bac142e8.pk0001.b7(b7；SEQ ID NO:35)和bac142e8.pk0001.f8(f8；SEQ ID NO:36)。隨后的測(cè)序從“無擊中群(nohits class)”中鑒定出重疊亞克隆bac142e8.pk0001.e10(e10)和bac142e8.pk0005.c10(c10)。如圖4A中所述，將BAC RB142E8(#7)的5.3kb片段亞克隆到質(zhì)粒bac142e8.pk0001.f8中，得到含有完整R基因的pCB1641。在最上面的一條線上，兩個(gè)粗實(shí)心條顯示Pi-ta編碼序列，間插的細(xì)實(shí)線代表該基因中的單一內(nèi)含子，箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄方向。限制位點(diǎn)包括BamHⅠ(B)和EcoRⅠ(E)。
圖4．質(zhì)粒pCB1641和pCB1645的構(gòu)建。限制位點(diǎn)包括BamHⅠ(B)、EcoRⅠ(E)、HindⅢ(H)、SstⅡ和SalⅠ。斜體表示的限制位點(diǎn)(E,SalⅠ)得自所述載體，而不是得自所述水稻基因組序列。
A．質(zhì)粒pCB1641，含有基因組全長PRG2編碼序列，具有1255bp的啟動(dòng)子序列、1463bp內(nèi)含子和2kb 3’非翻譯序列，通過將得自克隆#7的5.3kb EcoRⅠ水稻基因組片段取代得自2.2 kb水稻DNA插入片段的(201bp)EcoRⅠ片段，連接到bac142e8.pk0001.f8中，構(gòu)建出該質(zhì)粒。
B．質(zhì)粒pCB1645，含有PRG2編碼序列的3’1028bp(位置4477-5505)，通過用引物GB46(SEQ ID NO:63)和GB47(SEQ ID NO:64)經(jīng)PCR從質(zhì)粒pCB1641擴(kuò)增該區(qū)，構(gòu)建該質(zhì)粒。這些引物分別含有SalⅠ和EcoRⅠ的限制位點(diǎn)。用SalⅠ和EcoRⅠ消化所述PCR片段，并將其克隆到pGALA-AD(Stratagene)的相應(yīng)位點(diǎn)中。
圖5．在質(zhì)粒pCB1641中含有的PRG2核酸片段中的相對(duì)引物位置。這些引物用來從抗性和敏感性水稻品種中擴(kuò)增基因組DNA片段，并用于DNA測(cè)序。
圖6．推導(dǎo)的Pi-ta蛋白序列。在敏感品種中發(fā)現(xiàn)的5個(gè)氨基酸差異顯示于該R蛋白序列上方。在正文中討論的R蛋白的特征以下劃線表示氨基酸236至244之間的P-回折結(jié)構(gòu)域、氨基酸314至323之間的激酶2a結(jié)構(gòu)域、氨基酸342至353之間的激酶3a結(jié)構(gòu)域、氨基酸407至415之間的疏水結(jié)構(gòu)域。于位置339、556、654和838的4個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)以雙下劃線表示。
圖7．在質(zhì)粒pCB1947、pML63和pCB1926中構(gòu)成物的圖示。
A．pCB1947含有工程改造為直接編碼所述推定成熟蛋白酶的AVR-Pita分離核酸片段(先前稱為AVR2-YAMO)的構(gòu)成物，用于瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。所述分離核酸片段的這種加工形式命名為AVR-Pita176，編碼由SEQ ID NO:6中所述氨基酸48-223組成的多肽。通過用于該克隆方法中的NcoⅠ位點(diǎn)，將起始甲硫氨酸加入所述構(gòu)成物中。首先用含有一個(gè)符合讀框的NcoⅠ位點(diǎn)的引物YL30(SEQ ID NO:66)和含有一個(gè)KpnⅠ位點(diǎn)的引物YL37(SEQ ID NO:67)，經(jīng)PCR擴(kuò)增AVR-Pita編碼序列，將其克隆到pML142的NcoⅠ-KpnⅠ位點(diǎn)中，得到載體pCB1947。在35S啟動(dòng)子下游插入的玉米Adh1-6內(nèi)含子導(dǎo)致在單子葉植物中表達(dá)增強(qiáng)。該內(nèi)含子描述于Mascarenhas D.等(1990)Plant Mol.Biol.15:913-920。
B．pML63含有有效連接至CaMV35S啟動(dòng)子和3’NOS序列的uidA基因(其編碼GUS酶)。pML63由pMH40修飾，以產(chǎn)生最小3’NOS終止子片段。pMH40描述于1998年4月23日公開的WO98/16650，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用包含Depicker等公開的(1982,J.Appl.Genet.1:561-574)核苷酸1277-1556的新的3’NOS終止子序列取代包含于pMH40中的770堿基對(duì)終止子序列。
C．pCB1926含有Pi-ta cDNA構(gòu)成物，通過首先用引物F12-1(SEQ ID NO:44)和GB67(SEQ ID NO:65)，從第一鏈cDNA中擴(kuò)增2.1kb部分Pi-ta cDNA核酸片段，構(gòu)建出該構(gòu)成物。通過加入含pCB1641的基因組Pi-ta基因5’端的706bp NcoⅠ-BamHⅠ片段，產(chǎn)生合成的全長cDNA，產(chǎn)生質(zhì)粒pCB1906。然后將pCB1649中含有天然Pi-ta啟動(dòng)子序列(pPi-ta)的2425bp和5’Pi-ta編碼序列的736bp的3.1kb EcoRⅠ片段插入pCB1906的EcoRⅠ位點(diǎn)，以取代所述合成cDNA核酸片段5’端的736bp，產(chǎn)生pCB1926。
圖8．分析水稻植株中Pi-ta功能的粒子轟擊瞬時(shí)測(cè)定。這些水稻葉片顯示出采用圖7中的構(gòu)成物進(jìn)行的GUS和Pi-ta和AVR-Pita cDNA在水稻中生物彈道(biolistic)瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果。所有幼苗均用35S::GUS(pML63)和35S/adh::AVR-Pita(pCB1947)共轟擊(co-bombard)。從也用在天然2.425 kb Pita啟動(dòng)子控制下的Pi-ta cDNA(pCB1926)轟擊的幼苗取下第3片和第4片葉片。顯示出在水稻品種YT14和YT16中內(nèi)源Pi-ta基因的存在(Pi-ta)或不存在(-)。在該圖的葉片中存在黑色斑點(diǎn)顯示出GUS表達(dá)，這在最左邊的葉片中最顯著。藍(lán)色GUS染色的缺乏用作HR抗性反應(yīng)的指示。在該測(cè)定中，用克隆的PRG2候選核酸片段替代內(nèi)源Pi-ta基因。YT14和YT16表示水稻葉片來源；它們均為水稻DH系，但YT14含有一個(gè)內(nèi)源Pi-ta核酸片段，而YT16不合內(nèi)源Pi-ta核酸片段。
圖9．對(duì)原代轉(zhuǎn)化體的DNA凝膠印跡分析，以確定完整的Pi-ta核酸片段的存在。用EcoRⅠ(印跡左手一側(cè))或EcoRⅤ(印跡的右手一側(cè))消化基因組cDNA，并用在質(zhì)粒pCB1645(圖4B)中克隆的Pi-ta核酸片段的1028 bp EcoRⅠ-SalⅠ 3’端片段探測(cè)。顯示對(duì)應(yīng)于Nipponbare轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化的Nipponbare親本的內(nèi)源感病pi-ta等位基因的條帶。所有其它條帶均代表得自質(zhì)粒pCB1641的Pi-ta核酸片段的拷貝。原代轉(zhuǎn)化體22-6-1-1、22-6-3-1和22-6-11-4是抗性的，而22-2-7-2、22-3-1-1和22-4-1-1是中等(intermediate)抗性的。
圖10．得自中間抗病性原代轉(zhuǎn)化體22-6-10-1的11株潮霉素抗性R1單株的DNA凝膠印跡分析，以確定所述完整的Pi-ta核酸片段的存在。用EcoRⅤ消化基因組DNA，并用分離自質(zhì)粒pCB1926的Pi-ta核酸片段的860 bp EcoRⅤ-HindⅢ 3’端片段探測(cè)。顯示對(duì)應(yīng)于Nipponbare轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化的Nipponbare親本的內(nèi)源感病pi-ta等位基因的條帶。另一上部條帶代表得自質(zhì)粒pCB1641的Pi-ta核酸片段的一個(gè)拷貝。R0原代轉(zhuǎn)化體22-6-10-1(14道)具有與11個(gè)R1子代(A-K)相同的RFLP。得自該植株的DNA質(zhì)量差，導(dǎo)致DNA印跡上14道中條帶變形且不均一。所有11株R1子代均含有相同的RFLP，為中等抗病性，表明所述Pi-ta核酸片段和抗病性表型穩(wěn)定遺傳。
發(fā)明詳述在本說明書的正文中，將使用許多術(shù)語。
術(shù)語“抗病性基因”是指編碼能夠在植物細(xì)胞或植物組織中激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)的多肽的基因。術(shù)語“抗病性基因”、“抗病(R)基因”和“R”基因在本文可互換。由防衛(wèi)反應(yīng)產(chǎn)生的抗性可以有幾種形式。例如，在某些遺傳背景中，在接種的植物組織上抗性可能沒有可見的癥狀，在其它遺傳背景中，抗性可以包括小的褐斑，所述真菌沒有從所述褐斑中形成孢子并且沒有再起動(dòng)侵染。在這兩種情況下，所述真菌病原體均沒有完成其生活周期，病害的發(fā)展被阻止。在某些情況下，抗病性可以采用不產(chǎn)生最嚴(yán)重病害中常見量的真菌孢子的較小的侵蝕斑形式。
“防衛(wèi)反應(yīng)”是由寄主(例如植物)產(chǎn)生的特異性的、抵抗侵染因子或病原體存在的防衛(wèi)反應(yīng)。
“Pi-ta抗病基因”是其編碼的多肽能夠在植物細(xì)胞或植物組織中激發(fā)抗真菌病原體(例如Magnaporthe grisea)的防衛(wèi)反應(yīng)的基因。
術(shù)語“Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)”是指由于產(chǎn)生Pi-ta抗病基因編碼的多肽和由于真菌病原體的存在所引起的防衛(wèi)反應(yīng)。
“AVR-Pita分離核酸片段”是指分離自病原體的核酸片段，其中所述核酸片段編碼一種多肽，該多肽與Pi-ta抗病蛋白的直接或間接的互作導(dǎo)致引發(fā)Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。
“分離的核酸片段”是單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，可選地含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離核酸片段可以包含一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA或合成DNA區(qū)段。
術(shù)語“功能等同的亞片段”和“功能等同亞片段”在本文中可互換使用。這些術(shù)語是指分離核酸片段的一部分或亞序列，其中無論所述片段或亞序列是否編碼活性酶，都保留改變基因表達(dá)或產(chǎn)生一定表型的能力。例如，所述片段或亞序列可以用于嵌合基因設(shè)計(jì)中，以在轉(zhuǎn)化植物中產(chǎn)生所需表型。可以通過以相對(duì)于植物啟動(dòng)子序列的合適方向連接核酸片段或其亞片段(無論其是否編碼活性酶)，設(shè)計(jì)用于共抑制或用于反義的嵌合基因。
本文所用的術(shù)語“基本上相似”和“基本上相應(yīng)”是指其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的改變不影響所述核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生特定表型的能力的核酸片段。這些術(shù)語也指本發(fā)明的核酸片段的修飾，例如相對(duì)于原始未修飾的片段而言基本上不改變所得核酸片段功能特性的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失或插入。因此，要理解的是，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到的，本發(fā)明不僅包括具體的例舉的序列。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)識(shí)別到，本發(fā)明包括的基本上相似的核酸序列也由其在中等嚴(yán)格條件(例如0.5×SSC、0.1％ SDS、60℃)下與本文例舉的序列雜交的能力來限定，或由其在中等嚴(yán)格條件下與本文報(bào)道的核苷酸序列的任何部分雜交的能力來限定，它們?cè)诠δ苌吓c本發(fā)明的啟動(dòng)子等同。優(yōu)選的本發(fā)明包括的基本上相似的核酸序列是與本文報(bào)道的核酸片段有80％相同的那些序列，或者它們與本文報(bào)道的核苷酸序列的任何部分有80％相同。更優(yōu)選與本文報(bào)道的核酸序列有90％相同或與本文報(bào)道的核苷酸序列的任何部分有90％相同的核酸片段。最優(yōu)選與本文報(bào)道的核酸序列有95％相同或與本文報(bào)道的核苷酸序列的任何部分有95％相同的核酸片段?？梢圆捎肔ASARGENE生物信息計(jì)算程序組(suite)(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的Megalign程序來確定序列對(duì)比和計(jì)算相似性百分比。采用Clustal序列對(duì)比法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)和默認(rèn)參數(shù)(缺口補(bǔ)償(GAPPENALTY=10，缺口長度補(bǔ)償=10)進(jìn)行多重對(duì)比。采用Clustal法，逐對(duì)序列對(duì)比和計(jì)算蛋白序列同一性百分比的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE=1,GAP PENALTY=3,WINDOW=5和DIAGONALS SAVED=5。對(duì)于核酸，這些參數(shù)是GAP PENALTY=10,GAP LENGTH PENALTY=10,KTUPLE=2,GAP PENALTY=5,WINDOW=4和DIAGONALSSAVED=4。氨基酸序列或核苷酸序列的“相當(dāng)大的部分”包括多肽中足夠的氨基酸序列或基因中足夠的核苷酸序列，所述足夠即足以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員人工評(píng)價(jià)所述序列，或通過采用例如BLAST(Altschul,S.F.等，(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)和Gapped Blast(Altschul,S.F.等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402)的算法，經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)序列對(duì)比和鑒定，提供對(duì)該多肽或該基因的推定的鑒定；也參見www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
“基因”是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括所述編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。“天然基因”是指如在自然界中發(fā)現(xiàn)的一樣，具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因?！扒逗匣颉笔侵阜翘烊换虻娜魏位?，包括在自然界中未發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括得自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或得自同一來源、但排列方式不同于天然形式的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。“內(nèi)源基因”是指在生物體的基因組中于天然位置的天然基因。“外源”基因是指不是在在所述寄主生物體中發(fā)現(xiàn)的、而是通過基因轉(zhuǎn)移被引入所述寄主生物體中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物體中的天然基因，或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化程序被引入基因組中的基因。
“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“調(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、之中或下游(3’非編碼序列)、且影響所連接的編碼序列轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。這種序列可以是天然的或是非天然的。調(diào)節(jié)序列可以包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識(shí)別序列。
“病原體”是指其侵染到活植物組織的細(xì)胞周圍或細(xì)胞中激發(fā)病害反應(yīng)的生物或侵染性因子。
“啟動(dòng)子”是指能夠控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的DNA序列。啟動(dòng)子序列包括鄰近的上游元件和更遠(yuǎn)的上游元件，后者通常稱作增強(qiáng)子。因此，“增強(qiáng)子”是刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，可以是所述啟動(dòng)子的固有元件，或是插入的以提高啟動(dòng)子水平或組織特異性的異源元件。啟動(dòng)子可以全部衍生自天然基因，或可以由衍生自自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或甚至包括合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，不同的啟動(dòng)子可能指導(dǎo)基因在不同組織或不同細(xì)胞類型中表達(dá)，或指導(dǎo)基因在不同發(fā)育階段表達(dá)，或?qū)Σ煌h(huán)境條件應(yīng)答而指導(dǎo)基因表達(dá)。引起基因在大多數(shù)時(shí)間在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”?？偸前l(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞的不同類類型的新啟動(dòng)子；在Okamuro和Goldberg(1989)Biochemistry of Plants 15:1-82的匯編中可以找到許多實(shí)例。人們還識(shí)別到，由于在大多數(shù)情況下尚未完全確定調(diào)節(jié)序列的實(shí)際邊界，因此某些變異的DNA片段可以具有相同的啟動(dòng)子活性。
“內(nèi)含子”是基因中不編碼蛋白序列的部分的間插序列。因此，這種序列被轉(zhuǎn)錄為RNA，但隨后被切下，不被翻譯。該術(shù)語也用于被切下的RNA序列?！巴怙@子”是基因中被轉(zhuǎn)錄且在得自該基因的成熟的信使RNA中發(fā)現(xiàn)的序列，但不必是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的一部分。
“翻譯前導(dǎo)序列”是指位于基因的啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可能影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物到mRNA的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。已經(jīng)描述了翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例(Turner,R.和Foster,G.D.(1995)Molecular Biotechnology 3:225)。
“3’非編碼序列”是指位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化識(shí)別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的其它序列。通常，聚腺苷酸化信號(hào)的特征在于影響聚腺苷酸序列段添加至mRNA前體3’端。Ingelbrech等，(1989)Plant Cell 1:671-680例舉了不同3’非編碼序列的應(yīng)用。
“RNA轉(zhuǎn)錄物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。如果所述RNA轉(zhuǎn)錄物是所述DNA序列完全互補(bǔ)的拷貝，則稱其為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或它可以是衍生自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，稱其為成熟RNA?！靶攀筊NA (mRNA)”是指無內(nèi)含子、且可以被細(xì)胞翻譯為蛋白質(zhì)的RNA。“cDNA”是指與mRNA模板互補(bǔ)且用反轉(zhuǎn)錄酶由所述mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的，或可以用DNA聚合酶Ⅰ的k1enow片段將其轉(zhuǎn)化為雙鏈形式。“有義”RNA是指包括mRNA在內(nèi)并因此可以在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯為蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”是指與靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或一部分互補(bǔ)、并且阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利第5,107,065號(hào))。反義RNA可以與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分互補(bǔ)，所述任何部分即5’非編碼序列、3’非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。“功能RNA”是指反義RNA、核酶RNA或不能被翻譯、但仍對(duì)細(xì)胞過程有影響的其它RNA。
術(shù)語“有效連接”是指單一核酸片段上的核酸序列的連接，使得一個(gè)核酸序列功能受另一核酸序列的影響。例如，如果啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即所述編碼序列在所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，則所述啟動(dòng)子與所述編碼序列有效連接?？梢詫⒕幋a序列以有義或反義方向有效連接于調(diào)節(jié)序列。
本文所用的術(shù)語“表達(dá)”是指功能性終產(chǎn)物的產(chǎn)生?；虻谋磉_(dá)或過量表達(dá)涉及該基因的轉(zhuǎn)錄和所述mRNA翻譯為前體蛋白或成熟蛋白。“反義抑制”是指能夠抑制靶蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生?！斑^量表達(dá)”是指在轉(zhuǎn)基因生物體中基因產(chǎn)物的產(chǎn)生超過了正常生物體或非轉(zhuǎn)化生物體中產(chǎn)生的水平。“共抑制”是指能夠抑制相同或基本上相似的外源或內(nèi)源基因表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(美國專利第5,231,020號(hào))。
“改變的表達(dá)”是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物體中的產(chǎn)生量或比例顯著不同于得自野生型生物體的相當(dāng)?shù)慕M織(器官和發(fā)育類型)中的活性。
“成熟”蛋白指經(jīng)過翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了初級(jí)翻譯產(chǎn)物中存在的前肽(pre-或propeptides)的多肽?！扒绑w”蛋白是指mRNA翻譯的初級(jí)產(chǎn)物；即仍存在前肽的初級(jí)產(chǎn)物。前肽可以是但不限于胞內(nèi)定位信號(hào)。
“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”是與蛋白一起翻譯、且將該蛋白引導(dǎo)至葉綠體或制造該蛋白的細(xì)胞中存在的其它質(zhì)體類型的氨基酸序列。“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列”是指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列?！靶盘?hào)肽”是與蛋白一起翻譯、且將該蛋白引導(dǎo)至分泌系統(tǒng)的氨基酸序列(Chrispeels,J.J.,(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42:21-53)。如果要將該蛋白引至液泡，則可以再加入液泡導(dǎo)向信號(hào)(見上文)，或如果要將該蛋白引至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，則可以加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)(見上文)。如果要將該蛋白引至細(xì)胞核，則應(yīng)該除去存在的任何信號(hào)肽，而包括一個(gè)核定位信號(hào)(Raikhel(1992)Plant Phys.100:1627-1632)。
“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到寄主生物體的基因組中，導(dǎo)致遺傳穩(wěn)定的遺傳。帶有所述轉(zhuǎn)化核酸片段的寄主生物體被稱為“轉(zhuǎn)基因”生物。水稻、玉米和其它單子葉植物的優(yōu)選細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法是應(yīng)用加速粒子或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等，(1987)Nature(London)327:70-73；美國專利第4,945,050號(hào))，或采用合適的含所述轉(zhuǎn)基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法(Ishida Y.等，1996,Nature Biotech.14:745-750)。
本文所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且更全面地描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(下文稱為“Sambrook”)。
“PCR”或“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是用于合成大量特定DNA區(qū)段的技術(shù)，由一系列重復(fù)的循環(huán)組成(Perkin Elmer Cetus Instruments,Norwalk,CT)。通常，將雙鏈DNA熱變性，將兩種與靶區(qū)段的3’邊界互補(bǔ)的引物于低溫下退火，然后于中等溫度下延伸。一組這些連續(xù)的三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán)。
本文所用的“表達(dá)構(gòu)成物”包括單獨(dú)使用或如本文所述相互結(jié)合使用的本發(fā)明的任何分離核酸片段，還可以與載體或其亞片段結(jié)合使用。如果使用載體，則載體的選擇決定于將用來轉(zhuǎn)化寄主植物的方法，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員熟知在載體上必須存在的遺傳元件，以便成功地轉(zhuǎn)化、選擇或繁殖寄主細(xì)胞，所述遺傳元件包括任何本發(fā)明的分離核酸片段。技術(shù)人員也會(huì)識(shí)別到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和模式的表達(dá)(Jones等，(1985)EMBO J.4:2411-2418；De Almeida等，(1989)Mol.Gen. Genetics218:78-86)，并且因此必須篩選多個(gè)事件，以便獲得表現(xiàn)出所需表達(dá)水平和模式的系。這種篩選可以通過DNA的DNA印跡分析、mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析或表型分析來完成。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)成物”和“重組表達(dá)構(gòu)成物”在本文中可互換使用。
本發(fā)明涉及賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的分離核酸片段，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ IDNO:1或68中所述的核苷酸序列或其功能等同亞片段。
也考慮包含有效連接至合適的調(diào)節(jié)序列的這些分離核酸片段的基因、在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。例如，這種基因可以是天然的或是嵌合的。
另一方面，本發(fā)明也涉及賦予植物抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括將任何上述基因引入所述植物的基因組中。
再一方面，本發(fā)明涉及賦予植物抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括用重組表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化植物，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)分離的核酸片段，其賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接于調(diào)節(jié)序列以在侵染位點(diǎn)表達(dá)，并且其中所述構(gòu)成物賦予植物在侵染位點(diǎn)的抗真菌病原體所致病害的抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。
在又一方面，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，所述載體賦予植物在侵染位點(diǎn)的抗真菌病原體所致病害的抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)分離的核酸片段，其賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接于調(diào)節(jié)序列。也考慮用這種表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化的植物和由這種轉(zhuǎn)化植物獲得的種子。
可以用克隆的R基因有助于構(gòu)建抗病原體的作物。特別是，可以用轉(zhuǎn)化技術(shù)，在農(nóng)藝種質(zhì)中疊加多個(gè)單基因，而沒有伴隨通過傳統(tǒng)育種技術(shù)所轉(zhuǎn)移基因的連鎖基因組序列?？寺〉腞基因也可以用來克服傳統(tǒng)育種不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病基因的問題。
本發(fā)明提供在防治水稻中真菌Magnaporthe grisea引起的稻瘟病方面具有實(shí)用性的分離核酸片段。當(dāng)所述病原體包含基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段的AVR-Pita分離核酸片段時(shí)，本發(fā)明的分離核酸片段是有效的。另一方面，當(dāng)將基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段的AVR-Pita無毒核酸片段作為有效連接于在侵染位點(diǎn)表達(dá)所述AVR-Pita分離核酸片段的啟動(dòng)子的外源核酸片段，引入寄主植物基因組中時(shí)，賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的本發(fā)明的分離核酸片段是有效的。
如下所述，其它M.grisea亞群具有與在水稻中激發(fā)Pi-ta特異性防衛(wèi)反應(yīng)的菌株中含有的AVR基因同源的AVR基因。證明觸發(fā)Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的AVR基因可能存在于亞群Ⅰ的M.grisea水稻病原體中、存在于亞群Ⅱ中的馬唐病原體中以及存在于亞群Ⅲ中的狼尾草病原體中，這支持該基因在該真菌侵染的多種禾本科寄主中防治M.grisea的廣泛用途。
因此，我們認(rèn)為，本發(fā)明的分離核酸片段在防治其它谷類作物(包括但不限于小麥、大麥、玉米、龍爪稷和珍珠粟)的M.grisea所致病害方面具有實(shí)用性。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的基于作圖的克隆策略，克隆了水稻Pi-ta抗病核酸片段，如下所述。已經(jīng)表明，將所克隆的Pi-ta核酸片段引入感病水稻中，賦予對(duì)病原體菌株的抗性，其方式與預(yù)期的Pi-ta抗病核酸片段的方式一致。
與所有已知類別的抗病基因產(chǎn)物相比，所述Pi-ta抗病基因產(chǎn)物具有新的結(jié)構(gòu)。Pi-ta蛋白與具有胞外LRR的膜錨蛋白類無相似之處。盡管Pi-ta基因產(chǎn)物與具有胞質(zhì)LRR的R基因產(chǎn)物例如擬南芥R基因RPS2(Bent等，1994,Science 265:1856-1860；Mindrinos等，1994,Cell78:1089-1099)和RPMl(Grant等，1995,Science 269:843-846)具有某些共同的特征，但它缺乏該類R基因產(chǎn)物特征性的LRR結(jié)構(gòu)。此外Pi-ta蛋白或者缺乏亮氨酸拉鏈基序，或者缺乏Toll/白介素-1受體基序，這二者進(jìn)一步細(xì)分胞質(zhì)LRR類的R基因產(chǎn)物(Jones和Jones,1997,Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol.24:89-167)。因此，Pi-ta抗病基因產(chǎn)物與目前鑒別的任何其它R基因產(chǎn)物屬于不同的類別中。
Japonica水稻品種Yashiro-mochi(Yamada等，1976,Ann.Phytopath.Sco.Japan 42:216)和K1(Kiyosawa,1984,Rice Genetics Newsletter 1:95)已經(jīng)被定為稻瘟病抗病基因Pi-ta的鑒別水稻品種。當(dāng)將品種K1中的Pi-ta基因基因滲入到來自indica水稻品種Tadukan的Japonica背景中時(shí)，Yashiro-mochi中Pi-ta的起源看來是稱為Okaine的高地水稻品種(Rybka等，1997,Mol.Plant Microbe Interact.10:517-524和其中的參考文獻(xiàn))。得自品種Tadukan的一個(gè)其它抗病基因Pi-ta2基因看來與Pi-ta是等位基因或與其緊密連鎖，盡管Pi-ta和Pi-ta2之間的關(guān)系看來比預(yù)期的一對(duì)獨(dú)立等位R基因更為復(fù)雜(Kiyosawa,1967,Japan.J.Breeding17:165-172；Kiyosawa,1971,JARQ 6:73-80)。IRRI NIL鑒別水稻品種中名為Pi-4(t)的R基因與Pi-ta基因緊密連鎖，可能實(shí)際上就是Pi-ta基因(Inukai等，1994,Phytopathology 84:1278-1283)。另外，具有Pi-ta的染色體12的著絲點(diǎn)區(qū)看來含有其它抗病基因-主效R基因Pi-6(t)(Abadassi等，l990,Rice GeneticsⅡ,IRRI,Los Banos,the Philippones,746-748)、稻瘟病QTL(Wang等，1994,Genetics 136:1421-1434)和病毒和昆蟲R基因。
PWL2基因是彎葉畫眉草上一種控制寄主物種?；缘腁VR基因(Sweigard等，1995,The Plant Cell 7:1221)，鑒定PWL2基因的遺傳雜交(雜交4360)中PWL2與決定水稻病原體侵染水稻品種Yashiro-mochi能力的另一真菌基因也是分離的。這第二種AVR基因-AVR-Pita(先前因?yàn)閅ashiro-mochi而稱為AVR2-YAMO)從親代菌株4224-7-8遺傳，并且衍生自中國田間分離物O-137(于1985年收集于杭州中國國家水稻研究所)。在得自雜交4360的5個(gè)完全的四分孢子中的每個(gè)四個(gè)孢子中，8個(gè)子囊孢子子代中的4個(gè)子囊孢子能夠侵染Yashiro-mochi，而其它子囊孢子不能侵染。對(duì)雜交4360和隨后的雜交的隨機(jī)孢子分析證實(shí)AVR-Pita的分離。雜交4360的無毒子代在Yashiro-mochi上常常產(chǎn)生少量完全致病的侵蝕斑。據(jù)推測(cè)，這些罕見的侵蝕斑可能是由于AVR-Pita基因座上發(fā)生的自發(fā)突變所致。如Sweigard等(1995,The PlantCell 7:1221)中所述，分離出喪失AVR-Pita功能的突變體。對(duì)Yashiro-mochi具完全毒性的這些突變體保留推定的親代的形態(tài)和育性特性以及MGR586 DNA指紋模式(profile)。所述突變體對(duì)具有其它R基因的水稻品種的寄主?；晕锤淖?。
雖然對(duì)于主要是單倍體真菌(如M.grisea)中的基因不易評(píng)價(jià)顯性，但正如根據(jù)基因?qū)蚣僬f預(yù)測(cè)的，毒性突變體的存在提示所述表達(dá)形式的這種AVR基因功能在于阻止對(duì)Yashiro-mochi的侵染。AVR-Pita基因的遺傳不穩(wěn)定性有助于其克隆。發(fā)現(xiàn)AVR基因與由雜交4360產(chǎn)生的M.grisea RFLP圖譜中一個(gè)連鎖群末端的一個(gè)物理標(biāo)記簇(包括端粒重復(fù)序列)一起共分離(Sweigard等，1993,Genetic Maps,S.J.O’Brien,Cold Spring Harbor Laboratory，第3.112-3.117頁)。已經(jīng)變?yōu)閷?duì)Yashiro-mochi水稻有致病力的自發(fā)突變體表現(xiàn)出在與所述無毒基因一起作圖的端粒限制片段中的結(jié)構(gòu)變化，提示該基因位于該染色體端部1-2kb中(Valent和Chumley,1994,The Rice Blast Disease,Zeigler,Leong和Teng編輯，CAB International,Wallingford)。對(duì)野生型無毒菌株和已經(jīng)在所述染色體末端獲得缺失的自發(fā)突變體的基因組DNA的DNA分析，鑒定出通過用各種限制酶消化基因組DNA產(chǎn)生的末端染色體片段的大小。該分析表明，所述AVR基因位于對(duì)應(yīng)于所述染色體末端的端粒6.5kb BglⅡ片段中。將所述對(duì)應(yīng)的端粒片段克隆，使得可以證明它實(shí)際上含有AVR-Pita基因，后者的功能是將水稻栽培品種Yashiro-mochi的毒性病原體轉(zhuǎn)化為對(duì)Yashiro-mochi無毒的菌株。
本發(fā)明的AVR-Pita核酸片段分離自中國水稻病原體O-137，編碼具有223個(gè)氨基酸的蛋白(SEQ ID NO:5)。氨基酸173-182形成中性鋅金屬蛋白酶的特征性基序，并且所述基序殘基的天然突變或體外突變破壞AVR基因活性，亦即它不再將所述病原體的毒性菌株轉(zhuǎn)化為對(duì)水稻品種Yashiro-mochi無毒的病原體。預(yù)測(cè)的氨基酸序列與從真菌中鑒定的其它金屬蛋白酶的同源性水平低(Genbank登錄號(hào)L37524和S16547)。表征最好的分泌性真菌金屬蛋白酶-得自米曲霉(Aspergillusoryzae)的NpⅡ在177個(gè)氨基酸的成熟區(qū)之前含有一個(gè)175個(gè)氨基酸的前原區(qū)(prepro-region)(Tatsumi等，1991,Mol.Gen.Genet.228:97-103)。預(yù)測(cè)的AVR-Pita氨基酸序列表現(xiàn)出與NpⅡ的同源性為35％，同一性為29％，最顯著的同源性限于成熟的177個(gè)氨基酸形式的NpⅡ。另外，AVR-Pita和NpⅡ的氨基酸序列的序列對(duì)比顯示參與成熟NpⅡ蛋白中的二硫鍵的半胱氨酸保守。預(yù)期AVR-Pita分離核酸片段編碼加工成為含176個(gè)氨基酸的成熟金屬蛋白酶的前原蛋白。根據(jù)該預(yù)測(cè)，將AVR-Pita176表達(dá)構(gòu)成物工程改造為直接產(chǎn)生推定的成熟蛋白酶，用于功能分析。
對(duì)于M.grisea水稻病原體在實(shí)驗(yàn)室或田間條件下的適應(yīng)性，看來不需要AVR-Pita基因。例如，與源菌株O-137同時(shí)收集的充分表征的中國田間分離物O-135(Valent等，1991,Genetics 127:87-101)，缺乏與該AVR核酸片段的同源性。諸如O-135的水稻病原體目前未受Pi-ta介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的影響，因?yàn)樗鼈儾荒茉诤琍i-ta的水稻中激發(fā)該反應(yīng)。
已經(jīng)從侵染非水稻的寄主植物的M.grisea菌株中克隆了功能性AVR-Pita核酸片段，它們與亞群Ⅰa中的水稻病原體包括來自亞群Ⅲ的馬唐病原體(JP34，在日本分離出的)和來自亞群Ⅳ的狼尾草病原體(BF17，在Burkina Faso分離出的)遠(yuǎn)緣相關(guān)。當(dāng)通過University ofWisconsin Computer group軟件包9.1的最佳擬合算法(Devereux等，1984,Proc.Natl Acad Sci USA 12:387-395)比較時(shí)，從馬唐病原體中克隆的AVR-Pita核酸片段(SEQ ID NO:7,G-213 AVR序列)對(duì)應(yīng)于與O-137 AVR-Pita氨基酸序列的相似性為87.9％、同一性為84.7％的翻譯的氨基酸序列。G-213 AVR-Pita(無毒)核酸片段具有所鑒定的差異最大的序列，它保留了將毒性水稻病原體轉(zhuǎn)化為無毒菌株的能力，所述無毒菌株激發(fā)Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。在侵染不同草本物種的遠(yuǎn)緣M.grisea菌株之間AVR基因功能的保守，提示所克隆的Pi-ta抗病基因?qū)⒂行У卦诔就獾钠渌闹髦参锷戏乐蔚疚敛≌婢?br> 本發(fā)明也涉及一種基因，所述基因包含的分離核酸片段編碼賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中該核酸片段有效連接于合適的調(diào)節(jié)序列。這種基因可以是分離的天然基因或是嵌合基因?？梢圆捎帽绢I(lǐng)城技術(shù)人員熟知的技術(shù)構(gòu)建嵌合基因。例如，可以制備一種嵌合基因，其包含有效連接于SEQ ID NO:68中所述天然Pi-ta啟動(dòng)子片段(核苷酸1-2425)的SEQ ID NO:68的核苷酸序列的編碼序列。
可以制備能夠建立抗真菌病原體的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物。可以用本文所述的分離的天然基因或嵌合基因轉(zhuǎn)化的植物的實(shí)例包括但不限于單子葉植物。所述單子葉植物最好是谷類作物。所述單子葉植物最優(yōu)選是水稻、小麥、大麥、玉米、龍爪稷或珍珠粟。也考慮這種轉(zhuǎn)基因植物的種子。
因此，本發(fā)明也涉及賦予植物抗真菌病原體的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括將本文所述的任何本發(fā)明基因引入所述植物中。在所述作物中對(duì)AVR-Pita無毒基因表達(dá)應(yīng)答，產(chǎn)生Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述AVR-Pita無毒基因表達(dá)或者是所述真菌病原體表達(dá)的天然AVR基因，或者是由植物對(duì)所述病原體應(yīng)答所表達(dá)的嵌合AVR轉(zhuǎn)基因。
另一方面，本發(fā)明也涉及也賦予植物抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，包括用重組表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)分離的核酸片段，其賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:l或68中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接于調(diào)節(jié)序列，并且其中所述構(gòu)成物賦予植物在侵染位點(diǎn)的抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。
在又一方面，本發(fā)明涉及重組表達(dá)構(gòu)成物，所述構(gòu)成物在侵染位點(diǎn)賦予植物抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)分離的核酸片段，其賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，和(2)一種核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接于調(diào)節(jié)序列。
也考慮用這種表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化的植物和由這種轉(zhuǎn)化植物獲得的種子?？梢匀缟纤?，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備這種表達(dá)構(gòu)成物。將轉(zhuǎn)基因引入植物即轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。優(yōu)選的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是應(yīng)用加速粒子或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等(1978)Nature(London)327:70-73；美國專利第4,945,050號(hào))?？梢杂眠@種重組表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化的植物的實(shí)例包括但不限于單子葉植物。所述單子葉植物優(yōu)選為谷類作物。最優(yōu)選所述單子葉植物為水稻、小麥、大麥、玉米、龍爪稷或珍珠粟。
實(shí)施例在以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明。根據(jù)以上的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適應(yīng)各種用途和條件。
除非另有說明，否則所有份數(shù)和百分比均按重量計(jì)，溫度為攝氏度。分子生物學(xué)技術(shù)通常如Sambrook,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.1989.Molecular cloning-A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York中所述進(jìn)行。
實(shí)施例1開發(fā)病原體菌株用于鑒定相應(yīng)的R基因所述病原體的無毒分離物對(duì)于鑒定寄主抗病基因是必不可少的，應(yīng)用新的病原體菌株可以鑒定出迄今已經(jīng)逃避檢測(cè)的抗病基因。對(duì)具有特定R基因的水稻品種表現(xiàn)出毒性(即它們不能激發(fā)R基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng))的兩個(gè)真菌菌株被認(rèn)為缺乏相應(yīng)的功能性AVR基因。然而，雖然鑒定寄主抗病基因必需所述真菌具有相應(yīng)AVR基因的無毒菌株，但當(dāng)兩種菌株對(duì)特定的水稻品種無毒時(shí)，它們可能具有相同的AVR基因，或具有觸發(fā)不同的R基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的不同的AVR基因。應(yīng)用新的或未鑒定的真菌菌株可能鑒定出先前未鑒定出的R基因。當(dāng)用田間分離水稻病原體例如O-137(所述AVR-Pita基因的來源)工作時(shí)，尤其需要注意。另外，眾人皆知稻瘟病侵染測(cè)定對(duì)環(huán)境條件敏感，尤其是在水稻品種對(duì)稻瘟病具有某些水平的一般抗性的時(shí)候，或是在所用的病原體的致病力和形態(tài)特征不穩(wěn)定的時(shí)候。因此，使用已完全表征的病原體菌株是成功的關(guān)鍵。
多種病原體資源，包括所述AVR-Pita基因分離的遺傳群體，有助于克隆所述R基因。子代菌株例如4360-R-17、4360-R-27、4360-R-30和隨后的后代菌株4375-R-26(Sweigard等，1995,The Plant Cell 7:1221)具有用于這些研究的改進(jìn)的特征。因?yàn)樵谶@些實(shí)驗(yàn)中的水稻雜交體具有至少2個(gè)分離的R基因-Pi-ta和Pi-km，并且因?yàn)椴≡w雜交體4360對(duì)應(yīng)于兩個(gè)已知R基因的AVR基因分離，有需要獲得帶有單AVR基因的遺傳鑒定的病原體菌株。需要這種菌株了鑒定各個(gè)R基因/AVR基因互作對(duì)侵蝕斑產(chǎn)生的影響。也有需要將抗性互作和感病互作之間的表型差異最大化，以確保在作圖群體的水稻子代中記錄抗性表型的準(zhǔn)確性。由含有AVR-Pita、但不含有AVRl-TSUY的雜交體4360獲得28個(gè)子代菌株。據(jù)認(rèn)為AVRl-TSUY是在japonica品種Tsuyuake中對(duì)應(yīng)于稻瘟病抗病基因Pi-km的AVR基因。根據(jù)對(duì)一個(gè)親本水稻品種產(chǎn)生完全感病性病癥(4型-5型侵蝕斑)和對(duì)其它水稻品種產(chǎn)生典型的抗病反應(yīng)(0型-1型侵蝕斑)(Valent等，1991,Genetics 127:87)的穩(wěn)定能力，篩選這28個(gè)子代。選擇M.grisea分離物4360-R-62作為試驗(yàn)菌株，它僅含AVR-Pita。在篩選的另外9個(gè)菌株中，選擇4360-R-67作為出色的病原體，它僅含AVRl-TSUY。用這兩種真菌菌株進(jìn)行以下描述的大多數(shù)R基因作圖。
另外，AVR基因功能喪失的突變體可用于與衍生出所述突變體的親代菌株進(jìn)行比較。例如，通過分離自發(fā)毒性突變體，從菌株4360-R-17衍生出菌株CP987。CP987中的AVR-Pita基因因小的缺失而失活。如Sweigard等(1995)The Plant Cell 7:1221中所述，容易從無毒田間分離物或?qū)嶒?yàn)室菌株中獲得毒性突變體。在相反方向的病原體性狀改變方面，當(dāng)用克隆的AVR-Pita基因轉(zhuǎn)化對(duì)Yashiro-mochi有致病力的田間分離物Guyll時(shí)，該分離物變得對(duì)該寄主無毒，產(chǎn)生菌株CP3285。稻瘟病系統(tǒng)中的真菌轉(zhuǎn)化是常規(guī)技術(shù)，如Sweigard等(1995)The Plant Cell 7:1221中所述。
實(shí)施例2植物侵染和評(píng)估侵染測(cè)定如先前所述進(jìn)行(Valent等，1991 Genetics 127:87)。通過用無菌0.25％明膠溶液洗滌，從在燕麥片瓊脂平板上生長的培養(yǎng)物中收集分生孢子。在生長室中，將來自每個(gè)水稻品種的4-5個(gè)單株播種在塑料花盆中的Metro-Mix盆栽培養(yǎng)基中。以14小時(shí)照的白晝周期、28℃和70-85％的相對(duì)濕度，培育植物。夜間條件為22℃和85％的相對(duì)濕度。將具有2周齡植物的花盆置于塑料袋中，以保持病原體滲透所述的95-100％的相對(duì)濕度，用病原體菌株例如實(shí)施例1中所述的4360-R-62或4360-R-67接種。用藝術(shù)家的氣刷(air brush)(Pasha,size1)，將每ml含2.5×105分生孢子的4ml水性懸浮液噴灑到植物上。然后以twist-tie關(guān)閉含接種的植物的塑料袋，在低光條件、室溫下培育24小時(shí)。24小時(shí)后，去除植物的塑料袋，將其放回生長室中。接種后7天，記錄侵染類型即侵蝕斑癥狀。用0-5的等級(jí)將侵染表型分類(Valent等，1991 Genetics 127:87-101)。0型和1型侵蝕斑記錄為抗性，而3型至5型侵蝕斑記錄為感病。
實(shí)施例3對(duì)應(yīng)于稻瘟病AVR基因的R基因的鑒定和作圖產(chǎn)生水稻作圖群體。用兩個(gè)植物群體鑒定與所述R基因連鎖的物理標(biāo)記。首先，于CIAT(Centro Internacional de Agricultura Tropical；Apdo aereo 6713,Cali,Colombia)產(chǎn)生我們所用的雙單倍體(DH)群體。為了將已知在japonica和indica品種之間雜交中發(fā)生的分離異常的問題(Wang等，1994,Genetics 136:1421-1434)減至最小，決定以兩個(gè)japonica品種即Yashiro-mochi(具有R基因Pi-ta)和Tsuyuake(具有R基因Pi-km)之間的雜交進(jìn)行工作。盡管對(duì)于為整個(gè)水稻基因組作圖的目的而言，在兩個(gè)japonica品種之間多態(tài)性水平太低，但考慮到因?yàn)镻i-ta基因起源于indica水稻，所以在該R基因區(qū)應(yīng)該有足夠的多態(tài)性使得能夠?qū)共⌒孕誀钭鲌D。以下描述的對(duì)這種雜交結(jié)果的大量的分離分析，將作圖工作集中在基因組的特定區(qū)上。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生水稻DH系。首先，由得自水稻品種Yashiro-mochi和Tsuyuake之間正反交的F1植株的花粉，獲得單倍體愈傷組織。然后從該愈傷組織再生水稻植株。由該程序得到可育性植株已經(jīng)經(jīng)歷了單倍體基因組的自發(fā)二倍化。得自正反交的單株經(jīng)過7個(gè)自交世代，產(chǎn)生總共429個(gè)獨(dú)立的DH系。其中，119個(gè)系在該研究中用作起始作圖群體。
關(guān)于精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖，通過將兩個(gè)DH系YT4(含有得自品種Yashiro-mochi的活性Pi-ta R基因)和YT10(不含Pi-ta R基因)雜交，在DuPont產(chǎn)生F2群體。用于F2分析的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
分離分析鑒定出對(duì)應(yīng)于AVR-Pita的R基因。119個(gè)DH系對(duì)兩種真菌菌株4360-R-62和4360-R-67的反應(yīng)如下35個(gè)系抗這兩種菌株，24個(gè)系抗436-R-62,29個(gè)系抗4360-R-67，而31個(gè)系對(duì)這兩種菌株感病。在這4個(gè)表型類別中的子代符合預(yù)期的1∶1∶1∶1的比率(X2=2.20；P＞0.50)，表明如預(yù)期的，Pi-ta和Pi-km是獨(dú)立分離的R基因。也用菌株4360-R-62單獨(dú)接種另外115個(gè)DH系，其中62個(gè)系表現(xiàn)出抗病表型，而53個(gè)系表現(xiàn)出感病表型。因此，對(duì)菌株4360-R-62的抗病系與感病系的總比例是126比108，根據(jù)卡方檢驗(yàn)(X2=1.38,P＞0.20)，這沒有偏離預(yù)期的1∶1的比率。
根據(jù)水稻系YT10和YT4之間精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖雜交的F1和F2子代分析，進(jìn)一步支持對(duì)應(yīng)于病原體中AVR-Pita無毒基因的顯性R基因的分離。用4360-R-62侵染4株F1雜種，以確定是否如預(yù)期的所述R基因表型是顯性或半顯性。所有F1雜種均表現(xiàn)出0型或1型反應(yīng)，與抗病親本類似，表明在水稻中稻瘟病抗性的等位基因?qū)τ诟胁〉任换蚴秋@性的。也用4360-R-62侵染了720株F2子代。F2群體的侵染測(cè)定基本上與實(shí)施例2中所述相同，只是將植株播種在塑料盤中，每盤60株，將接種物減至每ml 1×105分生孢子。每盤施用約30ml分生孢子懸浮液。F2植株分離為541株抗病和179株感病，這近乎完美地符合3∶1比率(0.007；P＞0.90)，表明是單顯性基因。小心地修剪得自該分析的感病植株，以去除發(fā)病組織，并移植到新鮮盆栽培養(yǎng)基中，以用于精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖研究。
RAPD篩選以鑒定與所述R基因連鎖的DNA標(biāo)記。為了鑒定與所述R基因連鎖的物理標(biāo)記，在作圖早期使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)標(biāo)記(Williams等，1990,Nucleic Acids Research 18:6531-6535)。根據(jù)使用任意核苷酸作為單一引物對(duì)隨機(jī)DNA區(qū)段的擴(kuò)增，檢測(cè)多態(tài)性，即從一個(gè)親本擴(kuò)增但不從另一親本擴(kuò)增的DNA區(qū)段。為集中考慮與所述R基因連鎖的標(biāo)記，使用混合分離子分析(bulkerd segregantanalysis)。這是一種分分兩組單株之間多態(tài)性的方法，在一個(gè)組中單株均具有目的基因，而另一組中的單株均沒有目的基因。(Michelmore等，1991,Proc.Natl Acad Sci USA 88:9828-9832)。不連鎖的DNA區(qū)段同樣出現(xiàn)在兩個(gè)組中，而連鎖的DNA區(qū)段將在一組中出現(xiàn)，而在另一組中不出現(xiàn)。采用先前描述的方法(Dellaporta等，1983,Plant Mol.Biol.Reporter 1；19-21)，從各個(gè)DH系分離水稻總基因組DNA。通過凝膠電泳對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)量估計(jì)DNA濃度后，將得自10個(gè)抗4360-R-62的DH系的等份DNA和得自10個(gè)對(duì)4360-R-62感病的DH系的等份DNA混合，形成兩組“混合(bulked)”DNA。用混合DNA作為模板，評(píng)估RAPD標(biāo)記的擴(kuò)增。以20μl的體積進(jìn)行RAPD反應(yīng)，反應(yīng)物含有80mMTirs-HCl(pH9.0)；20mM(NH4)2SO4；3.5mM MgCl2；dGTP、dATP、dCTP和dTTP各100μM；0.2μM引物；10ng DNA；和1單位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)。用該程序擴(kuò)增的DNA片段在2％瓊脂糖(New England BioLabs)凝膠上電泳5小時(shí)，用1×TAE緩沖液。采用得自兩個(gè)親本即抗病組和感病組以及形成兩個(gè)組的每個(gè)單株的DNA模板，進(jìn)一步證實(shí)在抗病組和感病組中或者存在或者缺乏的多態(tài)片段。
將或者得自抗病系或者得自感病系的合并的DNA用作模板篩選1440種RAPD引物。95％以上的所述引物產(chǎn)生一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物。每種引物分離帶的平均數(shù)約為8。根據(jù)這些擴(kuò)增，RAPD引物SP1B8、SP2C12、SP3F4、SP3G6、SP4A5、SP4B9、SP6C2、SP6G10、SP7C3、SP7H8、SP8B8、SP8C6、SP8E2、SP8F1、SP9F3和SP15B12(SEQ ID NO:9-24)鑒別出與對(duì)應(yīng)于AVR-Pita的R基因的多態(tài)性。
SP1B8:5′-TCAGCGCCT-3′ (SEQ ID NO:9)SP2C12: 5′-CCAATCGGAC-3′(SEQ ID NO:10)SP3F4:5′-TAATGGGCGG-3′(SEQ ID NO:11)SP3G6:5′-GTCGCTACTG-3′(SEQ ID NO:12)SP4A5:5′-ACAGCGCCTT-3′(SEQ ID NO:13)SP4B9:5′-AGGCGTCTTC-3′(SEQ ID NO:14)SP6C2:5′-TAGCCAGACC-3′(SEQ ID NO:15)SP6G10: 5′-TCTATGCCCC-3′(SEQ ID NO:16)SP7C3:5′-ATGGCAGATG-3′(SEQ ID NO:17)SP7H8:5′-CGAGTCAACT-3′(SEQ ID NO:18)
SP8B8:5′-GTAGAAGCCT-3′(SEQ ID NO:19)SP8C6:5′-TCATGCGGAG-3′(SEQ ID NO:20)SP8E2:5′-CCATTTCCGT-3′(SEQ ID NO:21)SP8F1:5′-GGGAGGACTT-3′(SEQ ID NO:22)SP9F3:5′-AAAGGCAGTG-3′(SEQ ID NO:23)SP15B12: 5′-TGTGCAACGG-3′(SEQ ID NO:24)與所述R基因連鎖的標(biāo)記的起始作圖。記錄119個(gè)單個(gè)水稻DH系中每個(gè)系的連鎖RAPD分子標(biāo)記的分離。這些RAPD標(biāo)記與所述R基因之間的連鎖分析用計(jì)算機(jī)程序MAPMAKER(2.0版本)(Konieczny和Ausubel,1993,The Plant Journal 4:403)進(jìn)行。＞3的LOD計(jì)分用作建立RAPD標(biāo)記和所述R基因之間的連鎖。
兩點(diǎn)分析揭示了在所述DH群體中所鑒定的RAPD標(biāo)記中的強(qiáng)連鎖、以及在這些標(biāo)記和所述R基因之間的強(qiáng)連鎖。這些標(biāo)記相對(duì)于所述R基因的順序通過多點(diǎn)分析確定。SP7C3、SP7H8和SP8C6在圖譜上與所述R基因最近，在所述119個(gè)子代中沒有觀察到重組，而SP8B8和SP3G6作圖至所述作圖區(qū)的遠(yuǎn)端，距所述R基因的遺傳距離分別為8.6和7.3cM。這些標(biāo)記最可能的順序示于圖1A中。然而，許多標(biāo)記的次序不可能明確地確定，因?yàn)楦鶕?jù)這種群體的大小，任何特定次序相對(duì)于其它可選擇次序的概率不大于100∶1。
所述R基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)作圖。通過記錄較大的作圖群體中所述R基因和所述連鎖標(biāo)記的分離，達(dá)到提高作圖分辨率。包括另外的水稻DH系，以使作圖群體總共達(dá)270個(gè)系。另外，在該分析中包括得自DH系YT4和YT10之間遺傳雜交的720個(gè)F2子代。如上所述，用真菌菌株4360-R-62(僅含AVR-Pita)接種720株F2植株，以確定哪株含有相應(yīng)的R基因。通過去除發(fā)病組織并移植到新鮮的盆栽培養(yǎng)基中，讓得自該分析的感病植株恢復(fù)。正如人們充分理解的，RAPD標(biāo)記的F2分離分析是復(fù)雜的，因?yàn)檫@些標(biāo)記的顯性阻礙了對(duì)雜合子代和純合子代的分辨。在某些情況下，通過將共顯性標(biāo)記與RAPD標(biāo)記分離，可以克服這一困難。例如，在實(shí)施例4中描述了RFLP標(biāo)記與RAPD標(biāo)記的分離。通過檢查F3代中抗病表型的分離，完成雜合F2水稻系與純合F2水稻系的額外鑒別。在該研究中產(chǎn)生的精細(xì)結(jié)構(gòu)圖譜示于圖1B。
實(shí)施例4識(shí)別AVR-Pita的R基因是Pi-ta的證據(jù)獲得3條證據(jù)證明對(duì)應(yīng)于克隆的無毒基因的R基因是先前鑒定為Pi-ta的稻瘟病抗病基因。
稻瘟病抗病基因作圖至水稻染色體12。用192株單株的重組近交(RI)群體(通過使系LH422和9024雜交制備；Xiao等，1995,Genetics140:745)將所述R基因區(qū)作圖至其水稻染色體位置。采用得自多態(tài)RAPD標(biāo)記的側(cè)翼RFLP標(biāo)記，將所述R基因間接作圖。從凝膠上洗脫出RAPD片段，用GenecleanⅡ(Bio 101,San Diego,CA)純化(clean)，并亞克隆到TA克隆載體(Invitrogen,San Diego,CA)。用T7(SEQ ID NO:27)和SP6(SEQ ID NO:28)啟動(dòng)子引物擴(kuò)增亞克隆的DNA插入片段，將其用作探針，以檢查作圖群體的兩個(gè)親本。探針P4A5、P1B8、P7C3和P8C6分別用限制酶XbaⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ和DraⅠ顯示出多態(tài)性。記錄RI群體成員的4種RAPD標(biāo)記的等位基因模式(allelic pattern)并用MAPMAKER(2.0版本)程序作圖。以大于3的LOD計(jì)分評(píng)定所有的標(biāo)記。兩點(diǎn)分析確立所有這些標(biāo)記與染色體12上的許多RFLP標(biāo)記連鎖。多點(diǎn)分析將P7C3和P8G6置于RF341和RZ670之間的間隔中，遺傳距離分別為1.3cM和3.2cM(Causse等，1994,Genetics138:1251-1274)。標(biāo)記P1B8和P4A5作圖至RG9和RG869之間。因此，對(duì)應(yīng)于AVR-Pita的R基因作圖至與Pi-ta基因相同的染色體區(qū)。
AVR-Pita突變體和分離子代對(duì)報(bào)道含Pi-ta的其它水稻品種表現(xiàn)出相同的專化性。盡管所述R基因作圖至含Pi-ta抗病基因的染色體區(qū)，但它仍可能是一個(gè)未知的基因或是作圖至該同一區(qū)的其它R基因之一。鑒定出一系列的病原體菌株，包括O-137,AVR-Pita基因來源的中國田間分離物；4360-R-17和4360-R-27，含有所述AVR基因的雜交體4360的子代；4360-R-30，不含所述AVR基因的雜交體4360的子代；和CP987和CP983，喪失AVR基因功能的突變體。在對(duì)含有Pi-ta基因的其它水稻品種尤其是Tadukan和K1的侵染測(cè)定中使用這些病原體的分離物。這些病原體菌株對(duì)Yashiro-mochi、K1和Tadukan表現(xiàn)出的相同的無毒譜(表3)，提示對(duì)應(yīng)于AVR-Pita的R基因是先前鑒定的基因Pi-ta。缺乏Pi-ta的水稻品種Sariceltik對(duì)所有這些病原體菌株感病。
表3．在水稻栽培品種上的侵蝕斑類型
S感病型，3-5型侵蝕斑R抗病性，0-1型侵蝕斑日本鑒別病原體菌株侵染證實(shí)所述專化性。最后，用日本病原體菌株Ken60-19、Ken54-20、Ina72、Ina168、Ken54-04(Kiyosawa,1976,SABRAO Journal 8:53-67；Yamada等，1976,Ann.Phytopath.Soc.Japan 42:216)進(jìn)行接種；這些菌株用于各種水稻稻瘟病抗病基因(包括Pi-ta)的鑒定。將這些菌株與從本研究獲得的4360-R-62和4360-R-67一起接種到水稻DH子代系和鑒別水稻品種上。除Ina168外的所有這些田間分離物均對(duì)已知含Pi-ta R基因的鑒別水稻品種和含對(duì)應(yīng)于AVR-Pita的R基因的水稻DH子代系無毒，因此證明與Pi-ta的R基因一致的侵染和與病害的?；?。
實(shí)施例6染色體步查和Pi-ta R基因候選物PRG2的鑒定用Biomek自動(dòng)機(jī)(Beckman Instruments)將包含于210個(gè)微量滴定板中的BAC文庫點(diǎn)樣到高密度濾膜上。將整個(gè)文庫布置到14個(gè)濾膜上，密度為每個(gè)濾膜點(diǎn)樣16塊平板。用得自實(shí)施例3所述的RAPD標(biāo)記SP7C3的單拷貝RFLP探針p7C3探測(cè)該組濾膜。在整個(gè)DH和F2作圖群體中該標(biāo)記與Pi-ta基因共分離。在該雜交中鑒定出4個(gè)重疊BAC克隆5Cl、22H9、136F8和179G5(參見圖2)。用這些材料和信息作為起始點(diǎn)，用兩種方法從BAC水稻插入片段末端分離探針，用這些探針再次篩選所述文庫濾膜。用基于標(biāo)準(zhǔn)堿裂解質(zhì)粒純化法的小量制備(midi-prep)法(Sambrook)分離BAC DNA。分離載體一側(cè)插入片段邊界序列的方法涉及用或者BamHI或SphⅠ消化DNA，以去除大多數(shù)插入片段DNA。將剩余的載體再連接，并用或者M(jìn)13-20引物(SEQID NO:25)和反向引物(SEQ ID NO:26)或者T7引物(SEQ ID NO:27)和SP6引物(SEQ ID NO:28)，通過PCR分離所述插入片段序列。
M13-20: 5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′ (SEQ ID NO:25)M13-REV:5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′ (SEQ ID NO:26)T7: 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′ (SEQ ID NO:27)SP6:5′-ATTTAGGTGACACTATAG-3′ (SEQ ID NO:28)用兩種方法之一分離對(duì)側(cè)邊界片段。在第一個(gè)方法中，用ScaⅠ消化BAC克隆，使大多數(shù)基因組插入片段DNA缺失。將剩余的BAC克隆再連接，用T7引物(SEQ ID NO:27)和Belo840引物(SEQ ID NO:29)通過PCR擴(kuò)增插入片段的剩余部分。第二種方法涉及在用BamHⅠ消化BAC克隆并重新連接后使用反向PCR技術(shù)(Sambrook；Ochman H.等(1988)Genetics 120:621-623)，其中用引物IBAC1(SEQ ID NO:30)和IBAC2(SEQ ID NO:31)通過PCR擴(kuò)增對(duì)側(cè)邊界片段。從瓊脂糖凝膠亞克隆經(jīng)PCR獲得的邊界片段，并用作探針分離重疊BAC克隆。
Belo840:5′-TTTGTGATGGCTTCCATGTC-3′(SEQ ID NO:29)IBAC1: 5′-GTCGACTCTAGAGGATCC-3′ (SEQ ID NO:30)IBAC2: 5′-CTGCAGGCATGCAAGCTT-3′ (SEQ ID NO:31)向左側(cè)步查確定左側(cè)重組邊界。名為179G5R的BAC克隆179G5的一個(gè)插入邊界片段，采用DNA凝膠印跡分析時(shí)看來是單拷貝序列，用來探測(cè)BAC文庫濾膜。該片段鑒定出先前鑒定的BAC克隆中的4個(gè)克隆5C1、22H9、136F8和179G5以及3個(gè)新克隆31H3、107F10和157A9(圖2)。一個(gè)名為31H3R的插入片段末端片段與新BAC克隆70F1和147G7雜交。隨后顯示重疊水稻BAC克隆31H3、107F10、157A9、70F1和147G7含有對(duì)應(yīng)于確定所述R基因區(qū)一個(gè)邊界的RAPD標(biāo)記SP4B9的DNA序列(在測(cè)試的整個(gè)作圖群體中的一個(gè)子代水稻系中，在SP4B9和Pi-ta基因之間已經(jīng)發(fā)生重組)。用通過從瓊脂糖凝膠中亞克隆連鎖的SP4B9 PCR片段并對(duì)其測(cè)序而產(chǎn)生的特異性PCR引物GB24和GB25(SEQ ID NO:32和33)，表明SP4B9序列位于BAC毗鄰群中的該位置。該結(jié)構(gòu)確定圖2的BAC毗鄰群中的左側(cè)邊界，表明所述R基因位于該圖的右側(cè)。
GB245′-AGGCGTCTTCAGTTTTGTAATA-3′(SEQ ID NO:32)GB255′-AGGCGTCTTCCGGAAAGCAGCG-3′(SEQ ID NO:33)向右側(cè)步查將得自BAC克隆179G5相反端的、稱為G179G5L的邊界片段與BAC文庫濾膜上的其自身克隆雜交，以及與新BAC克隆34H9、50E12、108E4和158C2雜交。BAC末端片段158C2L與158C2以及新BAC克隆35B3、41F2和77D8雜交。因?yàn)?7D8的左側(cè)片段和右側(cè)片段均含有重復(fù)DNA序列，所以從瓊脂糖凝膠中克隆所述BAC插入片段內(nèi)部的單拷貝片段，稱為77D8-12，用其探測(cè)BAC文庫。該片段鑒定出77D8和41F2以及新BAC克隆18D1、6D5和142E8。
對(duì)BAC插入片段隨機(jī)基因組測(cè)序以鑒定R基因候選物。通過在反應(yīng)室(Nebulization tube,order #4207,IPI Medical Products,Chicago)中用氮?dú)?20psi)進(jìn)行高壓處理90秒，將重疊BAC克隆31H3、179G5、34H9、77D8和142E8霧化。剪切并再沉淀的DNA片段的末端通過高保真度DNA聚合酶(PFU,Stratagene)介導(dǎo)的補(bǔ)平反應(yīng)制成平端。用QIAEXⅡ凝膠提取試劑盒(Qiagen,Chatsworth,CA)，從瓊脂糖凝膠中分離大小范圍為1000-2000bp的DNA片段，將其亞克隆到pUC18的SmaⅠ位點(diǎn)中，并經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化到DH10B中。用通用反向引物，在一個(gè)方向?qū)珺AC DNA插入片段的克隆測(cè)序。對(duì)每個(gè)BAC的約300-400個(gè)克隆測(cè)序，以便由適當(dāng)?shù)臋C(jī)會(huì)從該組克隆中獲得序列，并鑒定出該組克隆中含有的所有基因。用BlastX程序(Gish,W.和States,D.J.(1993)Nature Genetics 3:266-272)進(jìn)行相似性檢索。為了方便起見，用BLAST計(jì)算的觀察到一種序列與所檢索的數(shù)據(jù)庫中含有的一種序列僅偶然匹配的P值(概率)在本文中以“pLog”值報(bào)道，它代表所報(bào)道的P值的對(duì)數(shù)負(fù)值。因此，pLog值越大，該序列和BLAST “擊中物”代表相似蛋白的可能性則越大。將所述克隆分為3組一組具有高度顯著性擊中物(pLog＞3)；一組具有弱顯著性擊中物(1＜=[最高pLog]＜=10)；一組無擊中物(pLog＜1)。例如，從RB142E8中獲得370個(gè)序列，60個(gè)序列(16.2％)屬于高顯著性類，71個(gè)(19.2％)屬于弱顯著性類，而239個(gè)(64.6％)屬于無擊中物類。進(jìn)一步研究與先前克隆的抗病基因、植物受體基因或植物防衛(wèi)基因具有同源性的序列。在詳細(xì)研究的5個(gè)候選物中，稱為PRG2的候選物表現(xiàn)出最可能是Pi-ta基因。
用屬于弱顯著性擊中物類別的3個(gè)序列鑒定出PRG2。例如，在bac142e8.pk0001.f12中測(cè)序的586bp DNA片段(SEQ ID NO:34；圖3中的“f12”)編碼的氨基酸序列與番茄中R基因功能所需的蛋白PRF(GenBank登錄號(hào)U653391)(Salmeron等，1996,Cell 86:123-133)具有中等相似性(pLog=5.80)。它還與擬南芥屬R基因RPM1編碼的氨基酸序列(X87851；Grant等，1995,Science 269:843-846)相關(guān)(pLog=5.43)。由bac142e8.pk0001.b7測(cè)序的598bp(SEQ ID NO:35；圖3中的“b7”，)鑒定出PRF基因和擬南芥肌球蛋白重鏈同源物(U19619)和bac142e8.pk0001.f8(SEQ ID NO:36；圖3中的“f8”)顯示出與RPM1和PRF的含P回折區(qū)同源的44個(gè)氨基酸的區(qū)。制備得自這些基因組克隆的引物用于如下所述在得自抗病水稻品種Yashiro-mochi的該區(qū)中進(jìn)一步進(jìn)行基因組測(cè)序。隨著測(cè)序的進(jìn)行，從顯示無顯著性擊中物的原始組239 BAC片段鑒定出另外的重疊亞克隆(圖3)。
實(shí)施例7分離Pi-ta候選基因的基因組克隆和cDNA克隆在實(shí)施例6中描述的從BAC 142E8亞克隆的核酸片段由于包含推定的Pi-ta基因座，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)序，以便設(shè)計(jì)克隆全長基因的策略。具體地說，bac142e8.pk0001.f8中的水稻基因組片段大小為2kb,在起始密碼子之前含有1255bp啟動(dòng)子序列(圖3)。用瓊脂糖凝膠純化的、得自克隆bac142e8.pk0001.b7和bac142e8.pk0001.f12的水稻插入片段對(duì)Yashiro-mochi基因組DNA和BAC 142E8進(jìn)行DNA印跡分析表明，BAC RB142E8含有一個(gè)單拷貝的PRG2。該分析也鑒定出一個(gè)得自142E8的5.3kb BamHⅠ片段，它含有該基因的剩余部分以及約2kb3’非翻譯區(qū)。將該5.3kb BamHⅠ片段從BAC DNA亞克隆到載體pBluescriptⅡSK+(Stratagene)中，并命名為克隆#7(圖3)。通過用EcoRⅠ消化bac142e8.pk0001.f8和克隆#7，將得自克隆#7的5.3kb EcoRⅠ片段連接到bac142e8.pk0001.f8中取代小的EcoRⅠ片段，裝配完整的基因(圖4)。所得的載體pCB1641在2.7kb載體中含有7.5kb水稻DNA插入片段。該水稻克隆包括全長的PRG2編碼序列與1255bp啟動(dòng)子序列和約2kb 3’非翻譯序列。使用DyeDeoxy終止子循環(huán)測(cè)序和377A型DNA測(cè)序系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA)，通過引物步查法測(cè)定在pCB1641中的5757bp該基因組克隆的兩條鏈的DNA序列(SEQ ID NO:1，包括完整的5’序列、編碼序列和內(nèi)含子以及終止密碼子后的246bp)。所用某些引物的相對(duì)位置示于圖5中(SEQ ID NO:37-64)。
F8-2: 5′-CCATCGGTGACCATGGG-3′ (SEQ ID NO:37)1641-1:5′-CCCTCTCCGTTGTTCCCATGG-3′ (SEQ ID NO:38)F8-4: 5′-GGGTTGGAGAATGCATGG-3′(SEQ ID NO:39)1641-2:5′-CCATGCATTCTCCAACCC-3′(SEQ ID NO:40)F8-3: 5′-CATGGATGGAGACCTCTGC-3′ (SEQ ID NO:41)F8-5: 5′-TCCTCAGAGGCGATCTCC-3′(SEQ ID NO:42)F8-1: 5′-GAACAGGGTGACCTCGTCG-3′ (SEQ ID NO:43)F12-1: 5′-GTGGCTTCCATTGTTGGATC-3′ (SEQ ID NO:44)F12-5: 5′-CGAACGGCGCATCCAACC-3′(SEQ ID NO:45)F12-6: 5′-GTGTCCTCTATTAGTAAATAC-3′ (SEQ ID NO:46)F12-7: 5′-GTATTTACTAATAGAGGACAC-3′ (SEQ ID NO:47)
1641-3: 5′-GGGCCTCCCTTGTTCGG-3′ (SEQ ID NO:48)1641-4: 5′-CCGAACAAGGGAGGCCC-3′ (SEQ ID NO:49)F12-4: 5′-CCTACAGATCTGTAGCCAGC-3′ (SEQ ID NO:50)F12-3: 5′-GCTGGCTACAGATCTGTAGG-3′ (SEQ ID NO:51)F12-2: 5′- GCTGGCTACAGATCTGTAGG-3′ (SEQ ID NO:52)B7-1:5′- GCTGGCTACAGATCTGTAGG -3′ (SEQ ID NO:53)B7-3:5′-GTGATTCCATTGCTGCATTCC-3′ (SEQ ID NO:54)B7-4:5′-CATGTGTAGTGCACCACATGG-3′ (SEQ ID NO:55)B7-2:5′-CTGTCGTCTGAGAATGATCC-3′ (SEQ ID NO:56)C10-1: 5′-CCAAGGACTACAACACTTGC-3′ (SEQ ID NO:57)173C12-5:5′-GCATCCCCAAATGGACTGG-3′(SEQ ID NO:58)1641-5: 5′-CCAGTCCATTTGGGGATGC-3′(SEQ ID NO:59)173-6: 5′-CAAGCATCCGACGCCGAGC-3′(SEQ ID NO:60)173-7: 5′-TTGTATATCAACCATAAGAGTGC-3′(SEQ ID NO:61)1641-6: 5′-GTTCTTTGATCCAAGTGTTAGG-3′ (SEQ ID NO:62)GB46:5′-CATTAAAGTCGACCTCAAACAATCATCAAGTCAGGT-3′(SEQ ID NO:63)GB47:5′-AATGCAGAATTCACAACACCACTAGCAGGTTTG-3′(SEQ ID NO:64)在pCB1641中亞克隆的所述水稻基因組片段(SEQ ID NO:1；5757個(gè)核苷酸)的DNA序列分析，鑒定出一個(gè)2784個(gè)核苷酸的可讀框，始于核苷酸1256，在核苷酸2199和3663之間被一個(gè)1463bp內(nèi)含子中斷。該編碼序列對(duì)應(yīng)于推定的具有928個(gè)氨基酸的多肽(圖6)。推定的蛋白的相對(duì)分子量為105kDa,pI為7.05。匹配N-糖基化共有序列[NX(S/T),X不是P](Kornfeld等，1985,Ann.Rev.Biochem.54:631)的4個(gè)氨基酸序列存在于PRG2蛋白中。
為了確定PRG2在水稻基因組中是以單拷貝存在還是以多拷貝存在，用或者編碼該基因氨基末端部分的核酸片段(用引物F8-5和F12-5擴(kuò)增的639bp片段)或者編碼羧基末端部分的核酸片段(核苷酸4477-5503，用引物GB47和GB46擴(kuò)增的)探測(cè)水稻總基因組DNA印跡。對(duì)于低嚴(yán)格性雜交，于50℃-55℃在含有0.1％SDS的2×SSPE中洗滌印跡，對(duì)于高嚴(yán)格性雜交，于65℃、含0.1％SDS的0.1×SSPE中洗滌印跡。甚至在高嚴(yán)格性條件下，N末端探針(包含堿基1401-2040的核酸片段)也在背景雜交的一般成片條帶中鑒定出一個(gè)單拷貝。用C末端核酸片段(作為pCB1645亞克隆，如下描述)探測(cè)完全相同的印跡，鑒定出一個(gè)拷貝，無背景成片條帶。結(jié)論是，PRG2是一個(gè)單拷貝基因，但在水稻基因組中可能有相關(guān)基因。
亞克隆所述單拷貝C末端探針，用作雜交探針。根據(jù)該區(qū)核苷酸4465-4497的序列合成引物GB47，只是修飾4471和4476之間的殘基，以加入一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)。同樣，引物GB46是核苷酸5519-5484的反向互補(bǔ)體，只是修飾對(duì)應(yīng)于核苷酸5512和5506的殘基以加入一個(gè)SalⅠ限制位點(diǎn)。引物GB46和GB47用來擴(kuò)增所述基因片段。如實(shí)施例6中所述從瓊脂糖凝膠純化，并用指定的酶消化后，將所述核酸片段亞克隆到載體pBD-GAL4 Cam(Stratagene)的EcoRⅠ/SalⅠ位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pCB1645(圖4B)。對(duì)亞克隆的片段測(cè)序以確證其結(jié)構(gòu)。
用反轉(zhuǎn)錄酶(RT)PCR并亞克隆，克隆全長Pi-ta cDNA片段。該方法涉及從含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因Nipponbare系27-4-8-1中分離mRNA，所述轉(zhuǎn)基因包含有效連接于CaMV 35S啟動(dòng)子的基因組Pi-ta核酸片段(實(shí)施例10，表達(dá)構(gòu)成物3)，并且所述轉(zhuǎn)基因Nipponbare系27-4-8-1在蛋白質(zhì)印跡上顯示過量表達(dá)Pi-ta。用分離的mRNA部分作為模板并用寡核苷酸GB67(SEQ ID NO:65)作為引物合成第一條鏈。
GB67:5′-CCATTAAGCTTGGTTTCAAACAATC-3′ (SEQ ID NO:65)用引物F12-1(SQ ID NO:44)和GB67(SQ ID NO:65)從第一鏈cDNA擴(kuò)增部分Pi-ta cDNA(2.1kb)。然后用BamHⅠ(存在于Pi-ta核酸片段中的限制位點(diǎn))和HindⅢ(存在于GB67序列中的限制位點(diǎn))將其克隆到pSL1180(Pharmacia)中。為了獲得全長的合成cDNA，將含有Pi-ta編碼序列5’端的706 bp NcoⅠ-BamHⅠ片段從pCB1649中分離出來，并克隆到2090bp BamHⅠ-HindⅢ部分Pi-ta cDNA片段上游的NcoⅠ-BamHⅠ位點(diǎn)中，產(chǎn)生全長啟動(dòng)子-較小的Pi-ta cDNA。DNA序列分析確定，在密碼子796處存在2bp缺失(可能是PCR人工產(chǎn)物(artifact))，導(dǎo)致移碼突變，可能使預(yù)測(cè)的Pi-ta蛋白截短了119個(gè)氨基酸。通過用得自含有正確序列的pCB1649的相應(yīng)序列取代1400 bp SphⅠ-BglⅡ片段將其校正，產(chǎn)生pCB1906。DNA序列分析也確定了預(yù)測(cè)的內(nèi)含子在該合成cDNA中精確地剪接。通過將3173 bp EcoRⅠ片段從pCB1649克隆到pCB1906的EcoRⅠ位點(diǎn)中，加入天然Pi-ta啟動(dòng)子片段(2425bp),產(chǎn)生含有最終Pi-ta cDNA構(gòu)成物的質(zhì)粒pCB1926。
實(shí)施例8從感病水稻品種Tsuyuake中克隆Pi-ta候選基因和序列分析以比較抗病和感病等位基因用得自感病品種Tsuyuake的DNA在噬菌體λ中構(gòu)建水稻基因組文庫(Sambrook)。用Dellaporta等，(1983)Plant Mol.Biology Reporter1:19-27中描述的程序，制備基因組DNA。將基因組DNA用限制酶Tsp509I(于5’-AATT-3’切割)部分消化。從瓊脂糖凝膠中純化大小范圍為7-10kb的DNA片段，將其亞克隆到載體λZapⅡ(Stratagene)的EcoRⅠ位點(diǎn)中。通過與pCB1641的DNA插入片段雜交篩選Tsuyuake文庫，鑒定出具有與PRG2相關(guān)的序列的8個(gè)重疊克隆。用圖5中的引物，對(duì)重疊1kb且包括完整編碼序列的兩個(gè)克隆T2-9和T2-2測(cè)序。得自Tsuyuake的克隆基因組片段的序列與得自水稻感病DH系YT16的PCR擴(kuò)增的基因組DNA的序列相同。
得自多個(gè)水稻系的抗病和感病等位基因的比較。得自抗病Yashiro-mochi水稻的功能性Pi-ta編碼序列(包含于SEQ ID NO:1和68中)與得自感病Tsuyuake水稻的非功能性編碼序列的序列(包含于SEQID NO:3中)有7個(gè)核苷酸不同。該編碼區(qū)這的7個(gè)堿基對(duì)置換導(dǎo)致所述兩種蛋白之間5個(gè)氨基酸的差異(圖6)。內(nèi)含子序列中發(fā)生另外6個(gè)堿基對(duì)的改變。所述編碼區(qū)中的大多數(shù)核苷酸差異發(fā)生在P回折基序之前的區(qū)中。兩個(gè)基因均編碼具有相同NBS基序和于位置339、556、654和838處的4個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)的蛋白。
根據(jù)用polyA+-RNA的RNA凝膠印跡分析測(cè)定，得自Yashiro-mochi的Pi-ta基因和得自Tsuyuake的感病等位基因均被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄物大小為3.3kb。此外，RNA印跡分析證明這兩個(gè)等位基因均為組成型表達(dá)。通過用在pCBl645中克隆的C末端Pi-ta片段探測(cè)polyA+-RNA印跡，進(jìn)行該分析。按照Perry和Francki的方法(1992,J.Gen.Virol.73:2105-2114)，由抗病水稻品種YT14或感病水稻品種YT16的2周齡葉片制備polyA+-mRNA。按照Ausubel等的方法(1987 Protocols inMolecular Biology,New York,John Wiley and Sons)進(jìn)行RNA凝膠印跡分析。
獲得來自其它水稻品種的Pi-ta核酸片段的基因組克隆序列，以便檢查核酸序列中的差異在抗病與感病形式的Pi-ta基因中是否保守。用圖5中所列的引物，對(duì)得自抗病品種Tadukan和K1的Pi-ta基因的PCR產(chǎn)物測(cè)序。據(jù)認(rèn)為這些品種已經(jīng)獲得了Pi-ta抗病基因，其方式與導(dǎo)致該基因在Yashiro-mochi中存在的方式不同。使用相同的PCR引物，對(duì)得自另一感病日本水稻品種Nipponbare和非相關(guān)感病品種Sariceltik的所述核酸片段測(cè)序。為了確定所述序列差異是否由japonica與indica等位基因之間的差異所致，對(duì)得自感病indica品種C101A51的所述核酸片段測(cè)序。結(jié)果表明，在核酸序列與對(duì)含AVR-Pita的稻瘟病病原體菌株的抗性之間有強(qiáng)相關(guān)；在測(cè)序的區(qū)上，Tadukan和K1與得自Yashiro-mochi的Pi-ta具有相同序列(表4)，得自Nipponbare和Sariceltik的基因與得自Tsuyuake的感病pi-ta基因具有相同序列。indicaC101A51等位基因的核苷酸序列提示有單個(gè)氨基酸的差異，于位置918的丙氨酸對(duì)絲氨酸，決定了Pi-ta功能的專化性。
表4抗病R蛋白和感病R蛋白之間的氨基酸差異
*具有得自Yashiro-mochi的R基因?qū)嵤├?通過在水稻中瞬時(shí)表達(dá)鑒定Pi-ta功能正如本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，用包被目的重組表達(dá)構(gòu)成物的粒子高速生物彈道轟擊植物組織，導(dǎo)致由所引入的質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)所述核酸片段。在瞬時(shí)葉片轟擊實(shí)驗(yàn)中，用報(bào)道基因表達(dá)證明抗病基因的功能，以分析過敏性細(xì)胞死亡抗病反應(yīng)的激發(fā)。這種分析已經(jīng)證明了用于鑒定細(xì)菌病原體R基因的實(shí)用性，因?yàn)橥ㄟ^用細(xì)菌病原體均一浸潤植物組織，可以供應(yīng)激發(fā)抗病反應(yīng)所需的對(duì)應(yīng)AVR基因(Mindrinos等，1994,Cell 78:1089-1099)。用直接穿透植物表皮并在穿透點(diǎn)產(chǎn)生局部侵蝕斑的真菌病原體(例如M.grisea)不可能進(jìn)行均一病原體浸潤。
為了克服真菌AVR基因在植物組織內(nèi)的均一摻入的障礙，通過與GUS報(bào)道基因一起共轟擊，測(cè)試AVR-Pita表達(dá)構(gòu)成物的引入。具體地說，工程化構(gòu)成物，使其在用于在植物細(xì)胞中組成型表達(dá)的35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)推定的成熟蛋白酶(AVR-Pita176)。首先，用NcoⅠ切割pML63(圖7B)，用S1核酸酶平端化。然后通過用Asp718進(jìn)一步消化去除GUS核酸片段。將用引物ML132(SEQ ID NO:69)和ML133(SEQ ID NO:70)產(chǎn)生的接頭片段克隆到平端化NcoⅠ和Asp718位點(diǎn)，產(chǎn)生pML135。
ML132:5′-CACGTGGAATTCCCCGGGG-3′ (SEQ ID NO:69)ML133:5′-GTACCCCCGGGGAATTCCACGTG-3′ (SEQ ID NO:70)用PmlⅠ和Asp718消化pML135，將用引物ML111(SEQ ID NO:71)和ML135(SEQ ID NO:72)經(jīng)PCR從玉米基因組DNA擴(kuò)增的Adh1-6內(nèi)含子克隆到pML135中，產(chǎn)生pML141。
ML111:5′-CCCGGGGAATTCCTGCAGAAGGTGCAAGGATTGCTGGAGCG-3′(SEQ ID NO:71)ML135:5′-TTTAAAGGTACCCCATGGCACGTGCCGGCTTGTTGTGGTCTTTTGGGTTCAC-3′ (SEQ ID NO:72)最后通過用BamHⅠ和NcoⅠ消化pML141產(chǎn)生pML142，并將含得自pML141的35S/Adh1-6序列的1.9kb片段克隆到pML63的BamHⅠ/NcoⅠ位點(diǎn)中。
質(zhì)粒pAVR3含有AVR-Pita核酸片段(SEQ ID NO:5)的核苷酸139-672，編碼預(yù)測(cè)的成熟蛋白酶以及一個(gè)額外的N末端氨基酸(AVR-Pita177，以前原蛋白的Ile-47開始)和一個(gè)起始密碼子，所述起始密碼子融合于載體pML142中的35S/Adhl-6啟動(dòng)子。用引物AV1(SEQID NO:73)和AV3(SEQ ID NO:74)，經(jīng)PCR從AVR-Pita cDNA擴(kuò)增AVR-Pita核酸片段(SEQ ID NO:5)，用PmlⅠ和KpnⅠ消化，用Klenow聚合酶平端化，并將其克隆到已經(jīng)用PmlⅠ和KpnⅠ消化并用Klenow聚合酶平端化的pML142中，產(chǎn)生pAVR3。
AV1: 5′-GCCGGCACGTGCCATGATTGAACGCTATTCCCAATG-3′(SEQ ID NO:73)AV3: 5′-GCCGGGATCCCCCTCTATTGTTAGATTGAC-3′(SEQ ID NO:74)用含有一個(gè)符合讀框的NcoⅠ位點(diǎn)的寡核苷酸YL30(SEQ ID NO:66)和YL37(SEQ ID NO:67)，經(jīng)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pAVR3中的AVR-Pita核酸片段(SEQ ID NO:5)，獲得所述預(yù)測(cè)的成熟蛋白酶(始于所述前原蛋白的Glu-48)的編碼序列。將PCR片段克隆到pML142的NcoⅠ/KpnⅠ中，產(chǎn)生載體pCB1947。進(jìn)行這一步以去除pAVR3中的Ile-47密碼子(att)，產(chǎn)生AVR-Pita176。在圖7A的圖例中描述了其它細(xì)節(jié)。
YL30:5′-ACAACAAGCCGGCACGTGCCATGGAACGCT-3′(SEQ ID NO:66)YL37:5′-TCCTTCTTTAGGTACCGCTCTCTC-3′ (SEQ ID NO:67)為了確定引入含Pi-ta的植物細(xì)胞中時(shí)AVR-Pita176構(gòu)成物的表達(dá)是否激發(fā)Pi-ta介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，用35S/Adhl-6::AVR-Pita176基因構(gòu)成物和35S::GUS報(bào)道基因共轟擊得自Pi-ta植物(Yashiro-mochi和YT14)和缺乏Pi-ta的植物(Nipponbare和YT16)的種子(圖7)。讓種子在葉片測(cè)定培養(yǎng)基1/2強(qiáng)度MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,1962,Physiol.Plant.15:473-497)上萌發(fā)一周，其中所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充100mg酪蛋白水解產(chǎn)物和0.5％瓊脂糖，在25℃培養(yǎng)箱中48小時(shí)，光周期為12小時(shí)，用100μEm-2s-1冷白光。用外科剃刀從瓊脂培養(yǎng)基切下二葉幼苗，置于含預(yù)先潤濕的濾紙的培養(yǎng)皿中。用永久性標(biāo)記在底部標(biāo)記小植株以用于鑒別。用Bio-Rad PDS-1000/He儀和1150psi爆破膜進(jìn)行幼苗的生物彈道轟擊。按照生產(chǎn)商提供的說明制備金粒子(0.6μm直徑)。對(duì)于每次共轟擊，用1.5μg35S/GUS和1μg其它質(zhì)粒包被1μg金粒子。轟擊后，將幼苗在含預(yù)先潤濕的濾紙的培養(yǎng)皿中保持于25℃48小時(shí)。葉片在70％乙醇中清洗并進(jìn)行組織學(xué)分析，用5-溴-4-氯-吲哚葡糖苷酸(X-gluc)作為底物，分析β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性(Jefferson,1987,Plant Mol.Bio.Rep.5:387-405)。
功能型AVR-Pita176表達(dá)構(gòu)成物與GUS構(gòu)成物共轟擊到含內(nèi)源Pi-ta基因的葉片中時(shí)，介導(dǎo)GUS表達(dá)的顯著降低(提示在表達(dá)之前細(xì)胞死亡)。正如所預(yù)期的，AVR-Pita176表達(dá)構(gòu)成物顯示出的活性顯著高于含全長AVR-Pita編碼序列的表達(dá)構(gòu)成物。早期實(shí)驗(yàn)根據(jù)觀察到典型Ⅰ型壞死斑和GUS表達(dá)降低，揭示出轟擊完整的Yashiro-mochi幼苗的葉片后的過敏樣反應(yīng)，但壞死斑形成的再現(xiàn)性不如GUS活性降低的再現(xiàn)性好。不能賦予無毒性的突變形式的AVR-Pita176也不能降低GUS表達(dá)。在缺乏內(nèi)源Pi-ta基因的水稻品種中也沒有觀察到該效應(yīng)。因此，當(dāng)直接引入含內(nèi)源Pi-ta基因的水稻葉片中時(shí)，AVR-Pita編碼序列的表達(dá)激發(fā)水稻防衛(wèi)反應(yīng)。
在瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定中PRG2代替內(nèi)源Pi-ta基因起作用。用AVR-Pita176(pCB1947；圖7A)、GUS(pML63；圖7B)和Pi-ta cDNA(pCB1926；圖7C)表達(dá)構(gòu)成物共轟擊抗病(YT14)和感病(YT16)水稻葉片，以觀察外源供應(yīng)的PRG2是否可以互補(bǔ)內(nèi)源Pi-ta功能。得自該測(cè)定的典型葉片示于圖8。無論P(yáng)i-ta表達(dá)構(gòu)成物是否與AVR-Pita176和GUS共轟擊，在抗病(YT14)葉片中均觀察到GUS表達(dá)水平降低。然而，在感病(YT16)水稻葉片中，只有在Pi-ta表達(dá)構(gòu)成物與AVR-Pita176和GUS一起共轟擊時(shí)，才注意到GUS表達(dá)的顯著降低。因此，PRG2代替內(nèi)源Pi-ta基因起作用，識(shí)別AVR-Pita176并誘導(dǎo)局部細(xì)胞死亡。僅用AVR-Pita176和GUS轟擊的感病YT16幼苗對(duì)照葉片具有高水平的GUS表達(dá)。得自品種C101A51的感病等位基因由于一個(gè)氨基酸而不同于Pi-ta，當(dāng)其與AVR-Pita176和GUS共轟擊時(shí)，不導(dǎo)致GUS表達(dá)的降低，表明在該測(cè)定中保持專化性。這些實(shí)驗(yàn)與PRG2事實(shí)上是Pi-ta基因的結(jié)論一致。
實(shí)施例10含所述推定R基因的轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)生如分子植物病理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)作法，R基因功能的鑒定涉及將轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地引入(即轉(zhuǎn)化)感病植物中，并且證明該轉(zhuǎn)基因賦予先前鑒定為感病的所述寄主植物抗病表型。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的將DNA轉(zhuǎn)化到高等植物的真核細(xì)胞中的一種方法是用目的核酸構(gòu)成物包被的金屬粒子高速彈道轟擊(參見Klein等Nature(1987)(London)327:70-73和參見美國專利第4,945,050號(hào))。Biolistic PDS-1000/He(RioRADLaboratories,Hercules,CA)用于這些實(shí)驗(yàn)。用粒子轟擊技術(shù)，以四種不同的含所述推定Pi-ta核酸片段的表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化感病水稻品種Nipponbare:
1)pCB1641-含有7kb Pi-ta核酸片段包括1255bp天然啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒(圖4A,SQ ID NO:1)。
2)pCB1649-含有8.4kb Pi-ta核酸片段包括3kb天然啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒。該載體與pCB1641相同，只是它含有較長的啟動(dòng)子區(qū)。為了制備pCB1649，用HindⅢ/SacⅡ切割pCB1641，以切下1.58kb片段。該片段用BAC142E8的4.98kb HindⅢ/SacⅡ亞克隆取代，產(chǎn)生pCB1649。該克隆步驟基本上用較長的4656bp啟動(dòng)子片段取代了pCB1641中的1255bp啟動(dòng)子。
3)35S/Pi-ta含有有效連接至1.9kb修飾的35S啟動(dòng)子片段的5.36kb Pi-ta核酸片段的質(zhì)粒。通過將5.36kb NcoⅠ/KpnⅠ片段從pCB1641克隆到含有35S啟動(dòng)子片段的質(zhì)粒pML63的NcoⅠ/KpnⅠ位點(diǎn)中，構(gòu)建該載體。
4)pCB1926-含有Pi-ta cDNA核酸片段和圖7C、SEQ ID NO:68中所述2425bp天然啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒。
將來自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的賦予潮霉素抗性的細(xì)菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HptⅡ)基因用作水稻轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。在所使用的載體pML18中，將HptⅡ基因與來自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子以及來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacieus)的章魚氨酸核酶的終止信號(hào)和聚腺苷酸化信號(hào)工程化在一起。pML18在1997年12月18日公開的WO97/47731中描述，所述轉(zhuǎn)錄的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
得自萌發(fā)的Nipponbare種子盾片的胚胎發(fā)生愈傷組織用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的源材料。通過將無菌水稻種子在愈傷組織起始培養(yǎng)基(MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1.0mg/l 2,4-D和10μM AgNO3)上于黑暗、27-28℃下萌發(fā)，產(chǎn)生該材料。將由胚的盾片增殖的胚胎發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移至CM培養(yǎng)基(N6鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1mg/l 2,4-D,Chu等，1985,Sci.Sinica 18:659-668)。將愈傷組織培養(yǎng)物通過以2周間隔進(jìn)行常規(guī)繼代培養(yǎng)保持在CM上，并在起始后10周內(nèi)用于轉(zhuǎn)化。
制備愈傷組織用于轉(zhuǎn)化，在置于CM培養(yǎng)基上的Whatman #541紙圓形的中心上，將0.5-1.0mm小塊以約1mm間隔布置在直徑約4cm的圓形區(qū)中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。具有愈傷組織的平板在黑暗中于27-28℃下培育3-5天。在轟擊之前，將帶有愈傷組織的濾紙轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM培養(yǎng)基，于黑暗中3小時(shí)。然后在無菌通風(fēng)櫥中將培養(yǎng)皿蓋半開20-45分鐘，以使組織上的水分消散。
將得自兩種不同質(zhì)粒的環(huán)狀質(zhì)粒DNA共沉淀在金粒子表面上，所述不同質(zhì)粒例如含有水稻轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記的pML18和含有所述推定R基因的pCB1641。為完成這一步，將2∶1比率的性狀選擇標(biāo)記DNA的總共10μg DNA加入50μl等份的已經(jīng)以60mg ml-1的濃度再懸浮的金粒子上。然后將氯化鈣(50μl 2.5M溶液)和亞精胺(20μl 0.1M溶液)加入金DNA懸浮液中，同時(shí)將試管渦旋混合3分鐘。金粒子在微量離心機(jī)中離心1秒，除去上清液。然后用1ml無水乙醇將金粒子洗滌2次，將其再懸浮于50μl無水乙醇中，超聲處理(bath sonicator)1秒，以分散金粒子。將金懸浮液于-70℃孵育5分鐘，如有需要進(jìn)行超聲處理(bath sonicator)以分散粒子。然后將6μl DNA包被的金粒子上樣至聚酯薄膜巨載體圓盤上，讓乙醇蒸發(fā)。
干燥期結(jié)束時(shí)，將含所述組織的培養(yǎng)皿置于PDS-1000/He室中。然后將室中的空氣排至28-29英寸Hg的真空。采用激波管中He壓力達(dá)到1080-1100psi時(shí)爆炸的爆破膜，用氦沖擊波加速所述巨載體。將組織置于距終止屏約8cm，對(duì)愈傷組織轟擊2次。以該方式用DNA包被的金粒子轟擊5-7個(gè)組織平板。轟擊后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至無補(bǔ)充山梨醇或甘露醇的CM培養(yǎng)基上。
在轟擊后3-5天內(nèi)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至SM培養(yǎng)基(含50mg/l潮霉素的CM培養(yǎng)基)。為此，將愈傷組織從平板轉(zhuǎn)移至無菌50ml錐形管中并稱重。加入40℃融化的頂層瓊脂，100mg愈傷組織使用2.5ml頂層瓊脂。通過使愈傷組織塊反復(fù)通過10ml移液管吸放，將愈傷組織塊破碎成小于2mm直徑的片段。將3ml等份的愈傷組織懸浮液平板接種到新鮮SM培養(yǎng)基上，將平板于黑暗中27-28℃下培養(yǎng)4周。4周后，鑒定轉(zhuǎn)基因愈傷組織事件，將其轉(zhuǎn)移至新鮮的SM培養(yǎng)基上，在黑暗中于27-28℃下再生長2周。
將生長中的愈傷組織轉(zhuǎn)移至RM1培養(yǎng)基(MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，2％蔗糖，3％山梨醇，0.4％gelrite+50ppm hyg B)上，于黑暗、25℃下培養(yǎng)2周。2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至RM2培養(yǎng)基(MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，3％蔗糖，0.4％gelrite+50ppm hyg B)并置于冷白光(～40μEm-2s-1)下，光周期為12小時(shí)，溫度為25℃，濕度為30-40％。在光照下2-4周后，愈傷組織開始組構(gòu)并形成苗。將苗從周圍愈傷組織/培養(yǎng)基取出，溫和地轉(zhuǎn)移至phytatrays(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中的RM3培養(yǎng)基(1/2×MS鹽，Nitsch和Nitsch維生素，1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，并采用與前一步驟相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)。
2-3周后，當(dāng)已經(jīng)發(fā)生足夠的根和苗生長時(shí)，將植株從RM3轉(zhuǎn)移至含有Metro mix 350的4”花盆中。用12hr/12hr光/黑暗周期，用～30/18℃晝/夜溫度方案，培育植株。
實(shí)施例11通過轉(zhuǎn)基因水稻中的功能互補(bǔ)鑒定Pi-ta轉(zhuǎn)化體的分子分析用等位基因特異性PCR以及DNA凝膠印跡分析，分析轉(zhuǎn)化體中R基因序列的存在。如實(shí)施例7中所述，采用得自pCB1645的PRG2 DNA插入片段作為雜交探針進(jìn)行高嚴(yán)格性DNA凝膠印跡分析。圖9顯示了用pCB1641中的PRG2分離核酸片段產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體的分析的典型結(jié)果。事件范圍從所述推定Pi-ta基因單拷貝的插入至復(fù)雜的多拷貝插入。
抗病表型獲得的分析。如實(shí)施例2中所述，用含AVR基因的病原體菌株4360-R-62或O-137測(cè)試獲得的抗病功能，進(jìn)行致病性測(cè)定。表5顯示了在通過用pCB1641和HygR質(zhì)粒(pML18)共轟擊產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化體上進(jìn)行分析的結(jié)果。
表5
對(duì)于構(gòu)成物pCB1641，分析的42個(gè)轉(zhuǎn)化體中有7個(gè)抗病，42個(gè)轉(zhuǎn)化體中有13個(gè)為中等抗病。中等抗病的特征為均一的較低數(shù)目的侵蝕斑，其侵蝕斑也比缺乏AVR-Pita的真菌菌株產(chǎn)生的侵蝕斑小。對(duì)于帶有有效連接到35S啟動(dòng)子的PRG2編碼序列的構(gòu)成物，41個(gè)中有4個(gè)顯示中等抗病。未令人意外的是，22/42含Pi-ta轉(zhuǎn)基因(pCB1641)的原代轉(zhuǎn)化體感病，這可能是影響生物彈道植物轉(zhuǎn)化的3個(gè)不同問題的結(jié)果。許多整合事件含多拷貝的Pi-ta轉(zhuǎn)基因(圖9)，包括可能已經(jīng)片段化的某些Pi-ta轉(zhuǎn)基因。這可能導(dǎo)致基因沉默事件。其次，在某些整合事件中，所述轉(zhuǎn)基因可能插入不適于基因表達(dá)的染色體區(qū)中。第三個(gè)可能的因素可以是因所述轉(zhuǎn)基因中小的缺失或移碼突變所致的基因失活，這種突變可能是DNA印跡上檢測(cè)不到的。
將得自單個(gè)R0轉(zhuǎn)化體的R1幼苗分為兩個(gè)組，用或者無毒菌株O-137或者衍生自O(shè)-137的毒性突變體(CP3337)接種，以確定所述抗病表型是否穩(wěn)定地通過減數(shù)分裂，并且是否所述抗性具有Pi-ta抗病基因特征性的?；?。例如，R1幼苗家族22-6-10-1的DNA凝膠印跡分析(圖10)顯示出與Pi-ta特異性抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳。該R1分析的結(jié)果證明，PRG2以Pi-ta基因特征性專化性賦予抗性，并且這種抗性穩(wěn)定遺傳。因此，得出的結(jié)論是，SEQ ID NO:1對(duì)應(yīng)于Pi-ta抗病基因。
實(shí)施例12Pi-ta抗病基因產(chǎn)物的特征鑒定現(xiàn)在可得自Genbank的候選Pi-b基因序列(登錄號(hào)AB013448)的編碼多肽，表現(xiàn)出與基本上相對(duì)于SEQ ID NO:2中所述Pi-ta多肽氨基酸殘基200-680的亞片段有30％同一性(49％相似性)。采用BESTFIT(Smith和Waterman,1981,Advances in Applied Mathematics 2:482-489)，發(fā)現(xiàn)翻譯的Pi-ta多肽序列氨基酸殘基208-527顯示出與RPM1蛋白的氨基酸序列(Grant等，1995,Science 269:843-846)的同一性為30.3％(44.3％相似性)。同一區(qū)顯示出與涉及抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的番茄PRF蛋白(Salmeron等，1996,Cell 86:123-133)的同一性為27.4％(38.8％相似性)，與擬南芥屬R基因RPS2(Bent等，1994,Science 265:1856-1860；Mindrinos等，1994,Cell 78:1089-1099)的產(chǎn)物有24.5％同一性(38％相似性)。沒有觀察到與任何些先前克隆的R基因產(chǎn)物的富亮氨酸區(qū)有顯著的相似性。
Pi-ta基因產(chǎn)物的顯著特征是許多ATP結(jié)合蛋白和GTP結(jié)合蛋白特征性的NBS基序(Traut,1994,Eur.J.Biochem.229:9-19)。氨基酸236-244匹配磷酸結(jié)合(P)回折的一般共有序列GXGXXG(R/k)V。可能的伴激酶結(jié)構(gòu)域(companion kinase domain)位于氨基酸314-323(激酶結(jié)構(gòu)域2a)和氨基酸342-353(激酶結(jié)構(gòu)域3a)周圍。在兩個(gè)亞類的胞質(zhì)R基因產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)保守的內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域(Jones和Jones,1997,Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol.24:89-167)部分存在于氨基酸407-415之間。然而，這兩個(gè)R基因亞類的關(guān)鍵特征在Pi-ta中沒有發(fā)現(xiàn)。首先，Pi-ta基因產(chǎn)物具有特有的氨基末端，或者缺乏RPS2基因產(chǎn)物亞家族的潛在的亮氨酸拉鏈基序(Bent等，1994,Science 265:1856-1860；Mindrinos等，1994,Cell 78:1089-1099)，或者缺乏N基因亞家族編碼的Toll/白介素-1受體同源性(Whitman等，1994,Cell 78:1101-1115)。也許最重要的是，Pi-ta基因產(chǎn)物的羧基末端部分富亮氨酸，但它不符合報(bào)道的R基因產(chǎn)物的富亮氨酸重復(fù)序列的任何共有序列(Jones和Jones,1997,Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol.24:89-167)。
序列表<110>E.I.du Pont de Nemours and Company<120>賦予植物抗病性的Pi-ta基因<130>BB-1136-A<140><141><150>60/095,229<151>1998-08-04<160>74<170>Microsoft Office 97<210>1<211>5757<212>DNA<213>稻<400>1gatgccgtcg tatactcgta tgctgctgcc ttctatcgat cgatcaaact cccgagtccc 60gagtccgagt cgcgtacgcg tgccggcgtg cggcgccgtg tgcgtccgca gttcgcaggc 120cgcacgctcg gctgggctgg ctctagtcct actgggcttc tcgcaggtgg gggcccctgg 180aaattggggg ccccctgcga tcgcccagct cgctctccgc gatcgacggg cctgggtagt 240tagcaccttg atcctggtta ccactacctc tcgagtagat ggcatctact cgagaggtag 300tggcagccaa gaattaacaa cataggccgg tgatgacgag ggagacagca ccatcggtga 360ccatgggaac aagggagagg gcattaatgg aagtgttgct aacccaaagc tactactatg 420aagataagta ctgtaggatt agtactctca actcagtggc atgcttttat ccaaaaggct 480acaatcaaga gttgcttcca gggcaaatgc ccttagttat gctttttttt tttaatcccc 540aatgggctct cctctgtaga attttcttcc aactttatcc tctttggagt ttggcctaac 600ctaacatcta attatatagt taccatcgta caacgttact ctcaagcgag aaccaagtcg 660tcatagttcc aaagtaggaa aagttattcc attaattagc tactcggtcc atgcaaagat 720cgtaagcata tttattttat catcgagacc aagaaaaaaa attaactcat tcgatttgta 780ctcccatgta acaaactttt tcatatgcat gcaaaagggt tggagaatgc atggcagctc 840aagtttcggt caacaattta atcatacacg gtaaaacgaa aagagactct cttcatttaa 900ggctcggatg catggagact atatgaataa gctcatctca tttggaaaaa aataatcaaa 960acaatgaaat atgcttaata catttggatt tggatggagt atctccctat gacgaaagag 1020acgagggatt gcctacttct ttccacatca acctttgaag gctatggcag agctacattt 1080gcagcgcagc ctctctgcat gatttcttac tagataggat taagtttcaa gagttaattt 1140cttgtactct tgggcgatcc atgctgtcaa atcagcaact aacgaggcat aatctcgatc 1200actagctctg atctgatctt cagctagcgc cggcgagctg cagaggtctc catccatggc 1260gccggcggtc attgcatcgc agggtgtcat catgcggtcc ctgacgagca agctcgactc 1320gctgctgctg cagccgccgg agccgccgcc gcctgcgcaa ccgtcgtcgc tgcggaaggg 1380ggagaggaag aagatcctcc tcctcagagg cgatctccga cacctgctag atgactacta 1440cctcctcgtg gagccgccgt cagacaccgc gccaccgcca gactcgacgg cggcgtgctg 1500ggctaaggag gttcgcgagc tctcctacga cgtcgacgac ttcctcgacg agctaacgac 1560ccagctcctc 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caattattat acccacctca ttctactaac agcaattgag 2460ttgttaatat aaatagatat ggtctattgc atgaaaaaat aaaggtaaag tgtttacatt 2520atttctacta ctagtagcag aactacaaag ttgtttgtat ttttaattat taaatgtaaa 2580tgaaagtaca tgtttcatac ccttgttatt tttttaggcg actaaactac tagtacatta 2640tttctactac tagtagaaca actacaaagt tgtttgtatt tttaattact aaatgtaaat 2700gaaagtacat gcttcatacc cttgttataa tattttagac taaactacca caatggcatg 2760ttaacttata gcagtaagtt gtaatttatt ttcttttcat tttctcagtt gttacaagaa 2820ctttttttta cttaataaaa aatagtcgta agggcctccc ttgttcggtc aaaaaagaat 2880tagactaaac tcaatcgtat ttgtacataa acaaaattta aaatataact aaaacgaaac 2940agtgataaaa atggtgcaat ttaactgctg cctcttgttt taatgtctga caatgttgat 3000tttgtatata tgtttggcca tttattttat tcaaattttt tacaaatatg aaaaatataa 3060tatgtgctta aattactttt aatgataaaa taaatttaag aaaatgataa ttatattttt 3120aataagatgg atgatctaac atatatatgt ccaaaagttt gacatcaaac attaaaaaca 3180agagagagta tttgcttagg agtacgtgtc tttttccatg ccttagaaca ggtacaatag 3240caggttataa gctaggccaa acatatttta 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Leu Lys Val Ala Ser Ile Val Gly Ser Gly Gly Val225 230 235 240Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Glu Phe Tyr Arg Leu His Gly Arg Arg245 250 255Leu Asp Ala Pro Phe Asp Cys Arg Ala Phe Val Arg Thr Pro Arg Lys260 265 270Pro Asp Met Thr Lys Ile Leu Thr Asp Met Leu Ser Gln Leu Arg Pro275 280 285Gln His Gln His Gln Ser Ser Asp Val Trp Glu Val Asp Arg Leu Leu290 295 300Glu Thr Ile Arg Thr His Leu Gln Asp Lys Arg Tyr Phe Ile Ile Ile305 310 315 320Glu Asp Leu Trp Ala Ser Ser Met Trp Asp Ile Val Ser Arg Gly Leu325 330 335Pro Asp Asn Asn Ser Cys Ser Arg Ile Leu Ile Thr Thr Glu Ile Glu340 345 350Pro Val Ala Leu Ala Cys Cys Gly Tyr Asn Ser Glu His Ile Ile Lys355 360 365Ile Asp Pro Leu Gly Asp Asp Val Ser Ser Gln Leu Phe Phe Ser Gly370 375 380Val Val Gly Gln Gly Asn Glu Phe Pro Gly His Leu Thr Glu Val Ser385 390 395 400His Asp Met Ile Lys Lys Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Ile Thr Ile405 410 415Thr Ala Arg His Phe Lys Ser Gln Leu Leu Asp Gly Met Gln Gln Trp420 425 430Asn His Ile Gln Lys Ser Leu Thr Thr Ser Asn Leu Lys Lys Asn Pro435 440 445Thr Leu Gln Gly Met Arg Gln Val Leu Asn Leu Ile Tyr Asn Asn Leu450 455 460Pro His Cys Leu Lys Ala Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Ile Tyr Lys Glu465 470 475 480Asp Tyr Ile Ile Arg Lys Ala Asn Leu Val Arg Gln Trp Met Ala Glu485 490 495Gly Phe Ile Asn Ser Ile Glu Asn Lys Val Met Glu Glu Val Ala Gly500 505 510Asn Tyr Phe Asp Glu Leu Val Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Val Asp515 520 525Val Asn Cys Lys Asn Glu Val Leu Ser Cys Val Val His His Met Val530 535 540Leu Asn Phe Ile Arg Cys Lys Ser Ile Glu Glu Asn Phe Ser Ile Thr545 550 555 560Leu Asp His Ser Gln Thr Thr Val Arg His Ala Asp Lys Val Arg Arg565 570 575Leu Ser Leu His Phe Ser Asn Ala His Asp Thr Thr Pro Leu Ala Gly580 585 590Leu Arg Leu Ser Gln Val Arg Ser Met Ala Phe Phe Gly Gln Val Lys595 600 605Cys Met Pro Ser Ile Ala Asp Tyr Arg Leu Leu Arg Val Leu Ile Leu610 615 620Cys Phe Trp Ala Asp Gln Glu Lys Thr Ser Tyr Asp Leu Thr Ser Ile625 630 635 640Phe Glu Leu Leu Gln Leu Arg Tyr Leu Lys Ile Thr Gly Asn Ile Thr645 650 655Val Lys Leu Pro Glu Lys Ile Gln Gly Leu Gln His Leu Gln Thr Leu660 665 670Glu Ala Asp Ala Arg Ala Thr Ala Val Leu Leu Asp Ile Val His Thr675 680 685Gln Cys Leu Leu His Leu Arg Leu Val Leu Leu Asp Leu Leu Pro His690 695 700Cys His Arg Tyr Ile Phe Thr Ser Ile Pro Lys Trp Thr Gly Lys Leu705 710 715 720Asn Asn Leu Arg Ile Leu Asn Ile Ala Val Met Gln Ile Ser Gln Asp725 730 735Asp Leu Asp Thr Leu Lys Gly Leu Gly Ser Leu Thr Ala Leu Ser Leu740 745 750Leu Val Arg Thr Ala Pro Ala Gln Arg Ile Val Ala Ala Asn Glu Gly755 760 765Phe Gly Ser Leu Lys Tyr Phe Met Phe Val Cys Thr Ala Pro Cys Met770 775 780Thr Phe Val Glu Gly Ala Met Pro Ser Val Gln Arg Leu Asn Leu Arg785 790 795 800Phe Asn Ala Asn Glu Phe Lys Gln Tyr Asp Ser Lys Glu Thr Gly Leu805 810 815Glu His Leu Val Ala Leu Ala Glu Ile Ser Ala Arg Ile Gly Gly Thr820 825 830Asp Asp Asp Glu Ser Asn Lys Thr Glu Val Glu Ser Ala Leu Arg Thr835 840 845Ala Ile Arg Lys His Pro Thr Pro Ser Thr Leu Met Val Asp Ile Gln850 855 860Trp Val Asp Trp Ile Phe Gly Ala Glu Gly Arg Asp Leu Asp Glu Asp865 870 875 880Leu Ala Gln Gln Asp Asp His Gly Tyr Gly Phe Phe Ile Leu Phe Pro885 890 895Gly Tyr Asn Leu Gln Gly Leu Leu Ser Phe Phe Leu Ser Leu Pro Trp900 905 910Leu Leu Ser Leu Pro Ala Met His Leu Gln Pro Asp Leu Met Ile Val915 920 925<210> 3<211> 5113<212> DNA<213> 稻<400> 3aattatatag ttaccatcgt acaacgttac tctcaagcga gaaccaagtc gtcatagttc 60caaagtagga aaagttattc cattaattag ctactcggtc catgcaaaga tcgtaagcat 120atttatttta tcatcgagac caagaaaaaa aattaactca ttcgatttgt actcccatgt 180aacaaacttt ttcatatgca tgcaaaaggg ttggagaatg catggcagct caagtttcgg 240tcaacaattt aatcatacac ggtaaaacga aaagagactc tcttcattta aggctcggat 300gcatggagac tatatgaata agctcatctc atttggaaaa aaataatcaa aacaatgaaa 360tatgcttaat acatttggat ttggatggag tatctcccta tgacgaaaga gacgagggat 420tgcctacttc tttccacatc aacctttgaa ggctatggca gagctacatt tgcagcgcag 480cctctctgca tgatttctta ctagatagga ttaagtttca agagttaatt tcttgtactc 540ttgggcgatc catgctgtca aatcagcaac taacgaggca taatctcgat 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權(quán)利要求
1．賦予抗真菌病原體所致病害的Pi-ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的分離核酸片段，其中所述核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:1或68中所述的核苷酸序列或其功能等同亞片段。
2．包含有效連接于合適調(diào)節(jié)序列的權(quán)利要求1的核酸片段的基因。
3．權(quán)利要求2的基因，其中所述基因是嵌合的。
4．在基因組中包含連接于天然啟動(dòng)子的權(quán)利要求1的核酸片段的植物。
5．在基因組中包含權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的核酸片段的植物。
6．權(quán)利要求4的植物，其中所述植物是單子葉植物。
7．權(quán)利要求5的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
8．權(quán)利要求4的植物，其中所述植物是禾谷類。
9．權(quán)利要求5的植物，其中所述植物是禾谷類。
10．權(quán)利要求8的植物，其中所述禾谷類選自水稻、小麥、大麥、玉米、龍爪稷和珍珠粟。
11．權(quán)利要求4的植物，其中所述植物是Magnaporthe grisea的天然寄主。
12．權(quán)利要求5的植物，其中所述植物是Magnaporthe grisea的天然寄主。
13．權(quán)利要求4、6、8、10或11的植物的種子。
14．權(quán)利要求5的植物的種子。
15．權(quán)利要求7的植物的種子。
16．權(quán)利要求9的植物的種子。
17．權(quán)利要求12的植物的種子。
18．權(quán)利要求1的核酸片段，其中所述片段賦予對(duì)稻瘟病真菌的抗性。
19．權(quán)利要求1的核酸片段，其中所述片段賦予抗含AVR-Pita分離核酸片段的真菌病原體的抗性，所述AVR-Pita分離核酸片段基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同亞片段。
20．賦予植物抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括用表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，所述表達(dá)構(gòu)成物包含有效連接于合適調(diào)節(jié)序列的權(quán)利要求1的核酸片段。
21．賦予植物抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的方法，所述方法包括用重組表達(dá)構(gòu)成物轉(zhuǎn)化所述植物，所述重組表達(dá)構(gòu)成物包含(1)權(quán)利要求1的核酸片段，和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ IDNO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接于調(diào)節(jié)序列，并且其中所述構(gòu)成物賦予植物在侵染位點(diǎn)的抗真菌病原體所致病害的抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。
22．權(quán)利要求20或21的方法，其中賦予對(duì)稻瘟病真菌的抗性。
23．權(quán)利要求20或21的方法，其中所述植物是單子葉植物。
24．權(quán)利要求20或21的方法，其中所述植物是禾谷類。
25．權(quán)利要求20或21的方法，其中所述禾谷類選自水稻、小麥、大麥、玉米、龍爪稷和珍珠粟。
26．權(quán)利要求20或21的方法，其中所述植物是Magnaporthegrisea的天然寄主。
27．賦予植物在侵染位點(diǎn)的抗真菌病原體所致病害的抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的重組表達(dá)構(gòu)成物，其包含(1)權(quán)利要求1的核酸片段，和(2)AVR-Pita分離核酸片段，其基本上相當(dāng)于SEQ ID NO:5或7中所述的核苷酸序列或其功能等同的亞片段，其中所述核酸片段有效連接于調(diào)節(jié)序列。
28．權(quán)利要求27的重組表達(dá)構(gòu)成物，其中所述構(gòu)成物賦予對(duì)稻瘟病真菌的抗性。
29．在基因組中包含權(quán)利要求27或28的表達(dá)構(gòu)成物的植物。
30．權(quán)利要求29的植物，其中所述植物是單子葉植物。
31．權(quán)利要求30的植物，其中所述植物是禾谷類。
32．權(quán)利要求31的植物，其中所述禾谷類選自水稻、小麥、大麥、玉米、龍爪稷和珍珠粟。
33．權(quán)利要求29的植物，其中所述植物是Magnaporthe grisea的天然寄主。
34．權(quán)利要求29的植物的種子。
35．權(quán)利要求30、31、32或33中任一種植物的種子。
全文摘要
描述了賦予植株抗真菌病原體所致病害的Pi－ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的分離核酸片段的制備和應(yīng)用。單獨(dú)包含這種核酸片段以及合適調(diào)節(jié)序列的基因,或者包含這種核酸片段和AVR－Pita分離核酸片段或其同功亞片段以及合適的調(diào)節(jié)序列的基因,可以用來產(chǎn)生可產(chǎn)生抗多種真菌病原體(特別是稻瘟病真菌)的Pi－ta抗病基因介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1321191SQ99811644
公開日2001年11月7日 申請(qǐng)日期1999年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月4日
發(fā)明者B·S·瓦倫特, G·T·布賴安 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司