專利名稱：堿性磷酸酶的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過光學(xué)測(cè)定來確定樣品中堿性磷酸酶的方法，其特征在于，用450±10nm的主要測(cè)定波長與速率空白(rateblank)法結(jié)合起來消除血紅蛋白的干擾；一種消除游離血紅蛋白或血液代用品(所致)干擾的方法；以及主要測(cè)定波長與速率空白法結(jié)合在消除游離血紅蛋白或血液代用品干擾方面的應(yīng)用。
已知，溶血作用對(duì)某些旨在確定分析物的診斷方法具有相當(dāng)大的干擾。溶血作用是指由于例如機(jī)械、滲透、化學(xué)或酶作用于紅血球細(xì)胞膜導(dǎo)致的紅血球的任何破壞。溶血作用導(dǎo)致血液色素——血紅蛋白(Hb)的釋放，致使血紅蛋白無法再從樣品中去除。血紅蛋白的存在是個(gè)問題，因?yàn)?，一方面，血紅蛋白的吸收譜在某些情況下相當(dāng)程度地重疊在待測(cè)物和指示劑(色原體)的光譜上，從而造成光度測(cè)定中的誤差。另一方面，血紅蛋白還能與樣品成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成同樣會(huì)導(dǎo)致虛假測(cè)定值的物質(zhì)。
近來，以血紅蛋白為基礎(chǔ)制造的血液代用品正越來越頻繁地用于治療目的，例如在大量失血后。血液代用品中的血紅蛋白可以是天然的或者是合成的。通常也用Hb-類似化合物。與通常血紅蛋白含量最高500mg/dl的溶血作用不同，用血液代用品治療期間，血清或血漿中Hb含量可能超過2000mg/dl。因此，對(duì)含血液代用品樣品的干擾要比對(duì)溶血樣品明顯得多，因?yàn)槠溲t蛋白或其合成類似物從一開始便處于游離形式。
游離血紅蛋白造成的干擾在堿性磷酸酶的光度測(cè)定中尤為嚴(yán)重。堿性磷酸酶的測(cè)定是通過在405～415nm(吸收度的增加)測(cè)定4-硝基酚的生成來實(shí)現(xiàn)的。血紅蛋白在415nm也有吸收。血紅蛋白的存在對(duì)堿性磷酸酶測(cè)定的干擾表現(xiàn)在兩個(gè)方面一方面，Hb譜在堿性介質(zhì)中隨時(shí)間而改變(吸收度增加)；另一方面，超過一定Hb含量，測(cè)定儀器就達(dá)到其光度計(jì)極限。
先有技術(shù)中公開了各種各樣的方法，旨在消除血紅蛋白對(duì)血清或血漿樣品分析的光譜影響和化學(xué)影響。
Jay和Provasek在《臨床化學(xué)》39/9，1804～1810(1993)中描述道血紅蛋白對(duì)堿性磷酸酶測(cè)定的干擾系由Hb光譜隨時(shí)間改變所致。此種干擾可利用數(shù)學(xué)校正算法(測(cè)定樣品中Hb濃度并對(duì)堿性磷酸酶測(cè)定值做一個(gè)等價(jià)于Hb被測(cè)數(shù)量的數(shù)值的校正)予以消除。
雖然Jay和Provasek等人提出的數(shù)學(xué)校正方法能夠消除最多至少800mg/dl Hb的Hb影響，然而用起來不十分方便，因?yàn)橐箢~外測(cè)定Hb含量，之后又需要進(jìn)行附加的數(shù)學(xué)校正步驟。
Jay和Provasek(見上面)還描述了采用所謂速率-空白測(cè)定消除干擾的進(jìn)一步方法。用速率-空白測(cè)定校正溶血干擾，也描述在EP-A-0695805中。按該方法，樣品進(jìn)行預(yù)反應(yīng)以確定實(shí)際光度測(cè)定樣品中所含某種成分之前的樣品溶血程度。獲得的測(cè)定值隨后再用預(yù)先測(cè)定的數(shù)值——即，將溶血程度與干擾成分對(duì)測(cè)定誤差的貢獻(xiàn)大小進(jìn)行關(guān)聯(lián)所確定的數(shù)值——進(jìn)行校正。
Hb干擾雖可利用速率-空白測(cè)定加以消除，但是最高僅限于Hb含量約1200mg/dl，因?yàn)镠b含量再增高時(shí)，已達(dá)到了光度計(jì)的極限。該極限對(duì)于消除溶血作用的干擾可能足夠了，但是對(duì)于消除血液代用品引起的干擾則根本不夠。
已公開的另一種消除血紅蛋白干擾的方法是測(cè)定清蛋白(PCT申請(qǐng)WO97/45728)，其中血紅蛋白干擾的消除是通過主要與次要波長的特定組合實(shí)現(xiàn)的。然而，該文中提到的波長組合無法用于堿性磷酸酶的測(cè)定，因?yàn)槿粼谶@樣的波長范圍測(cè)定，將不再能獲得代表4-硝基酚的測(cè)定信號(hào)。
公開的出版物WO97/45733描述道，血紅蛋白的干擾可利用單獨(dú)紫外試驗(yàn)中546和570的次要波長予以消除。然而，該方法僅能用于主要測(cè)定波長等于340nm的酶催紫外測(cè)試。盡管單單靠次要波長546或570nm便可完全消除Hb的干擾，但是這對(duì)于像主要測(cè)定波長位于415nm區(qū)間的堿性磷酸酶測(cè)定這種酶催色原體檢驗(yàn)來說卻是不可能的。
美國專利5,766,872提到，577nm的次要波長可減少淀粉酶測(cè)定中溶血作用的干擾。但是，所援引的測(cè)定數(shù)據(jù)卻表明，當(dāng)達(dá)到500mg/dl的Hb含量時(shí)，就已經(jīng)出現(xiàn)最高達(dá)8％的測(cè)定值顯著偏差。這對(duì)于消除溶血干擾來說可能是足夠了，但是在更高的Hb濃度下(例如，采用血液代用品治療期間所出現(xiàn)的濃度)，該測(cè)定值偏差將由于約415nm主要測(cè)定波長的使用以及那時(shí)Hb干擾的消除將不再充分，而變得更大。
目前，先有技術(shù)中尚沒有一種堿性磷酸酶的測(cè)定方法，在諸如含血液代用品樣品中出現(xiàn)的那樣高Hb濃度存在下也能不受干擾地實(shí)施。
因此，本發(fā)明目的是研發(fā)一種基本克服了先有技術(shù)缺點(diǎn)的測(cè)定樣品中堿性磷酸酶的改良方法。具體地說，目的是提供一種簡單和使用方便的方法，來消除堿性磷酸酶測(cè)定期間由血紅蛋白和基于血紅蛋白的血液代用品造成的干擾。
該目的是通過權(quán)利要求書中更詳細(xì)描述的利用光學(xué)測(cè)定確定樣品中堿性磷酸酶的方法實(shí)現(xiàn)的。該方法的特征在于，以450±10nm作為主要測(cè)定波長并結(jié)合實(shí)施速率空白程序。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，Hb對(duì)堿性磷酸酶測(cè)定的干擾只需改變主要波長并采用速率空白程序便可有效地消除。要滿意地消除Hb的干擾，僅改變主要波長或者僅采用速率空白程序都是不夠的。
鑒于4-硝基酚的吸收譜(的位置)，不僅可以在415nm，也可以在450±10nm處測(cè)定堿性磷酸酶。盡管這樣一來主要測(cè)定波長將不再位于檢驗(yàn)反應(yīng)通常的吸收峰，而是位于其一側(cè)，但所獲得的測(cè)定信號(hào)仍然足夠滿足精確測(cè)定堿性磷酸酶的需要。
雖然，新的主要測(cè)定波長450±10nm的選擇已經(jīng)導(dǎo)致血紅蛋白干擾略有減少，但是令人驚奇的是，干擾的完全消除只有在將主波長450±10nm與速率空白程序結(jié)合使用時(shí)才能實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明方法首次實(shí)現(xiàn)了在最高Hb含量為至少3000mg/dl的范圍內(nèi)以簡單的方式消除血紅蛋白和血紅蛋白類似化合物對(duì)堿性磷酸酶測(cè)定的干擾。該Hb干擾消除的上限是光度計(jì)操作所決定的極限。因此，本發(fā)明方法預(yù)計(jì)在最高6500mg/dl血紅蛋白含量范圍內(nèi)可做到很好地消除干擾。
按本發(fā)明的速率空白程序，在實(shí)際光度測(cè)定樣品所含某一成分之前，樣品先進(jìn)行預(yù)反應(yīng)以確定樣品的溶血程度。獲得的待測(cè)組分測(cè)定值隨后再用預(yù)先測(cè)定的數(shù)值——即，將溶血程度與干擾成分對(duì)測(cè)定誤差的貢獻(xiàn)大小進(jìn)行關(guān)聯(lián)所確定的數(shù)值——進(jìn)行校正。速率空白程序本身在校正溶血干擾方面的應(yīng)用，例如描述在EP-A-0695805以及Jay和Provasek在《臨床化學(xué)》卷39/9，1804～1810(1993)中。
速率空白程序所采用的次要測(cè)定波長對(duì)本發(fā)明來說并不重要。還有，預(yù)反應(yīng)和主反應(yīng)測(cè)定的時(shí)間范圍長度也不起決定作用。而測(cè)定預(yù)反應(yīng)和主反應(yīng)在1～4min期間的吸收度變化已證明是適宜的。
本發(fā)明方法適合測(cè)定任何含游離血紅蛋白的樣品。術(shù)語游離血紅蛋白，就本發(fā)明意義而言，旨在用來將它與完好的紅血球中存在的血紅蛋白區(qū)別開來。含游離血紅蛋白的樣品的例子是溶血的血清或血漿樣品或者含血液代用品的樣品。屬于術(shù)語游離血紅蛋白范疇的血液代用品的例子，就本發(fā)明意義而言是衍生的、聚合的、改性的或交聯(lián)的血紅蛋白衍生物，特別是人體血紅蛋白或牛血紅蛋白，例如DCL血紅蛋白(雙阿司匹林-交聯(lián)的血紅蛋白)或重組生成的血紅蛋白。
本發(fā)明還涉及在測(cè)定堿性磷酸酶的方法中消除游離血紅蛋白所致干擾的方法。該方法的特征在于，主要測(cè)定波長450±10nm與速率空白程序的結(jié)合運(yùn)用。
本發(fā)明另一個(gè)主題是，主要測(cè)定波長450±10nm與速率空白程序的結(jié)合，在消除堿性磷酸酶測(cè)定方法中游離血紅蛋白或用血紅蛋白制造的血液代用品所致干擾上的應(yīng)用。
本發(fā)明將通過下列實(shí)施例加以闡明。
實(shí)例a)含血紅蛋白樣品的制備將含Hb的溶液加入到一份取自某一血清源的血清中，達(dá)到至少3000 mg/dl的Hb含量。來自同一血清源的另一份相同體積血清與等當(dāng)量氯化鈉溶液(154mmol/l)彼此混合。隨后，這兩份彼此以不同比例混合，從而獲得11個(gè)樣品組成的Hb濃度系列，其中最低的樣品中不含Hb，而最高的樣品中有至少3000mg/dl Hb。
b)按SFBC法測(cè)定堿性磷酸酶根據(jù)Ann.Biol.Clin，卷35，271(1977)所載SociétéFrancaisede Biologie Clinique(法國臨床生物學(xué)學(xué)會(huì))建議的方法測(cè)定堿性磷酸酶的測(cè)定是在Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析儀上進(jìn)行的。
采用下列試劑試劑1930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液，pH10.5；
1.03mmol/l天冬氨酸鎂；試劑2930mmol/l 2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液，pH10.5；1.03mmol/l天冬氨酸鎂；98mmol/l磷酸4-硝基苯酯試驗(yàn)程序如下250μl試劑1加入到11μl樣品中，5min后，加入50μl試劑2。作為對(duì)比測(cè)定，又經(jīng)過50秒后測(cè)定分析物，期間測(cè)定隨后4min內(nèi)的吸收度變化。下面的主要測(cè)定波長(λ1)和次要測(cè)定波長(λ2)結(jié)合起來用于測(cè)定λ1/λ2＝415/660nm(以往的儀器設(shè)定值)、415/570nm和450/660nm(對(duì)比)。又按照J(rèn)ay和Provasek提出的速率空白測(cè)定法測(cè)定了另一些堿性磷酸酶作為進(jìn)一步的比較(稱作415/660nm RB)。
采用測(cè)定波長組合λ1/λ2＝450/660nm測(cè)定本發(fā)明分析物。對(duì)于速率空白測(cè)定，試劑1加入到樣品中以后3.0～4.9min內(nèi)測(cè)定預(yù)反應(yīng)的吸收度變化；試劑1加入到樣品中以后7.9～9.8min內(nèi)測(cè)定主反應(yīng)的吸收度變化。這在Boehringer Mannheim/Hitachi 911分析儀上對(duì)應(yīng)于測(cè)定點(diǎn)[10]-[16]和[25]-[31]。結(jié)果載于標(biāo)記為“450/660nm RB”的一欄中。
按本發(fā)明的測(cè)定結(jié)果以及對(duì)比測(cè)定結(jié)果載于下表1中?？梢钥闯觯扇?50nm的新主要波長與速率空白程序這樣的創(chuàng)造性組合，與其他測(cè)定波長組合或者與在415nm的主要波長處的速率空白測(cè)定相比，可大大減少含Hb血液代用品的干擾。表137℃下測(cè)定的堿性磷酸酶含量，U/l
*此時(shí)采用交聯(lián)的血紅蛋白。
權(quán)利要求
1.一種通過光學(xué)測(cè)定來確定樣品中堿性磷酸酶的方法，其中采用450±10nm的主要測(cè)定波長與速率空白程序的組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)定是在血清或血漿樣品中進(jìn)行的。
3.以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所測(cè)定的樣品含有游離血紅蛋白或以血紅蛋白為基礎(chǔ)制造的血液代用品。
4.以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中血液代用品含有衍生的、改性的或交聯(lián)的人體血紅蛋白、牛血紅蛋白或重組生成的血紅蛋白。
5.以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中樣品的血紅蛋白含量最高6500mg/dl。
6.一種在測(cè)定堿性磷酸酶的方法中消除游離血紅蛋白或血液代用品引起的干擾的方法，其中采用450±10nm的主要測(cè)定波長與速率空白程序的組合。
7.一種450±10nm的主要測(cè)定波長與速率空白程序相結(jié)合在消除堿性磷酸酶測(cè)定方法中游離血紅蛋白或血液代用品干擾方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過光學(xué)測(cè)定確定樣品中堿性磷酸酶的方法,其特征在于,用450±10nm的主要測(cè)定波長與速率空白技術(shù)結(jié)合起來消除血紅蛋白的干擾。本發(fā)明還涉及一種消除游離血紅蛋白或血液代用品(所致)干擾的方法,以及主波長與速率空白技術(shù)結(jié)合在消除堿性磷酸酶測(cè)定期間游離血紅蛋白或血液代用品造成的干擾方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/42GK1322255SQ99811934
公開日2001年11月14日 申請(qǐng)日期1999年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月8日
發(fā)明者R·維謝特, W·特雷貝爾 申請(qǐng)人:羅赫診斷器材股份有限公司