專利名稱：植物根中基因表達(dá)所用的啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子導(dǎo)致編碼核苷酸序列的根-特異性表達(dá)，所述序列處于植物組織特異性基因表達(dá)所用啟動(dòng)子的控制之下，本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子的表達(dá)盒，重組載體和微生物，被它們轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法和分離根-特異性啟動(dòng)子的方法。
在下文中，公開(kāi)內(nèi)容中提及的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)都列入本文作為參考。
已證實(shí)通過(guò)基因工程方法修飾植物的基因型之后，該植物可有利地用于很多農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，這經(jīng)常是將某些特性傳遞給有用植物的唯一方法。這樣做的主要目的是植物保護(hù)以及增加可收獲產(chǎn)物的量。
已知多種方法可對(duì)雙子葉植物和單子葉植物進(jìn)行基因修飾(參見(jiàn)Gasser和Fraley，科學(xué)244(1989)，1293-1299；Potrykus，植物分子生物學(xué)和植物生理學(xué)年評(píng)，42(1991)，205-225)。所有方法都基于基因構(gòu)建體的傳遞，在大多數(shù)情況下，基因構(gòu)建體是結(jié)構(gòu)基因的特定編碼區(qū)與其它結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子區(qū)域以及轉(zhuǎn)錄終止子的新組合。
啟動(dòng)子的提供對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生作用很大，因?yàn)閱?dòng)子的特異性對(duì)利用基因工程方法傳遞的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)，組織類型和強(qiáng)度至關(guān)重要。
控制植物中外源基因表達(dá)的多種啟動(dòng)子是已知的。最常使用的啟動(dòng)子是35S CaMV啟動(dòng)子(Franck等，細(xì)胞1(1980)，285-294)，該啟動(dòng)子可導(dǎo)致導(dǎo)入基因的組成型表達(dá)。然而，也經(jīng)常使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如創(chuàng)傷誘導(dǎo)(DE-A-3843628)，化學(xué)誘導(dǎo)(Ward等，植物分子生物學(xué)，22(1993)，361-366)或光誘導(dǎo)(Fluhr等，科學(xué)，232(1986)，1106-1112)。
也描述了細(xì)胞-和組織-特異性啟動(dòng)子的用途保衛(wèi)細(xì)胞-特異性基因表達(dá)(DE-A-4207358)，種子-，塊莖-和果實(shí)-特異性基因表達(dá)(概述于Edwards和Coruzzi，遺傳學(xué)年評(píng)，24(1990)，275-303；DE-A-3843627)，韌皮部-特異性基因表達(dá)(Schmulling等，植物細(xì)胞，1(1989)，665-670)，根瘤-特異性基因表達(dá)(DE-A-3702497)或分生組織-特異性基因表達(dá)(Ito等，植物分子生物學(xué)，24(1994)，863-878)。
介導(dǎo)根中的基因表達(dá)的啟動(dòng)子包括例如II類patatin啟動(dòng)子(koster-Topfer等，Mol.Gen.Genet，219(1989)，390-396)，當(dāng)它與報(bào)道基因β-葡糖醛酸酶(GUS)基因融合之后，在馬鈴薯塊莖和根尖特定細(xì)胞層中表現(xiàn)出高表達(dá)。與農(nóng)桿氨酸合酶啟動(dòng)子(ags)的GUS融合實(shí)驗(yàn)(Inoguchi等，植物生理學(xué)，149(1996)，73-78)顯示出主要位于根中的高GUS活性。含有AKT1(＝鉀通道)-GUS-構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物(Lagarde等，植物雜志，9(1996)，195-203)特別地導(dǎo)致成熟根區(qū)段細(xì)胞外層中的表達(dá)。TobRB7(＝水通道)基因5’區(qū)域長(zhǎng)度為636bp的部分(Yamamoto等，植物細(xì)胞3(1991)，371-382)介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的根-特異性GUS表達(dá)。另外，還描述了與伸展蛋白基因啟動(dòng)子的GUS融合實(shí)驗(yàn)，其中可根據(jù)下胚軸，根和/或特定根區(qū)的發(fā)育階段來(lái)測(cè)定大豆幼苗中的GUS活性(Ahn等，植物細(xì)胞8(1996)，1477-1490)。
所述啟動(dòng)子的應(yīng)用經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。例如，可使用導(dǎo)致基因組成型表達(dá)的啟動(dòng)子來(lái)生產(chǎn)植物，其中所述基因受所述啟動(dòng)子的控制，所述植物對(duì)除草劑具有耐受性和對(duì)病原體具有抗性。然而，這些啟動(dòng)子的缺點(diǎn)是受該啟動(dòng)子控制的基因的產(chǎn)物存在于植物的所有部分，包括植物的被收獲部分，這在某些情況下是不合乎需要的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也存在問(wèn)題，因?yàn)橐话汶y以控制室外農(nóng)業(yè)所用的植物誘導(dǎo)條件。
如果想成功實(shí)施在植物中進(jìn)行基因修飾的多種方法，還必須使由不同方式調(diào)節(jié)的基因處于不同啟動(dòng)子的控制之下。因此，必須提供具有不同特異性的不同啟動(dòng)子系統(tǒng)。迄今為止，只有少數(shù)調(diào)節(jié)根中基因表達(dá)的啟動(dòng)子是已知的。如果想成功實(shí)施在植物中進(jìn)行基因修飾的特定方法，必須提供另一種能調(diào)節(jié)根中基因表達(dá)的啟動(dòng)子系統(tǒng)，相對(duì)于已知系統(tǒng)而言，該系統(tǒng)受調(diào)節(jié)的方式有所不同。
因此，本發(fā)明遇到的技術(shù)難題是提供在植物中進(jìn)行器官-特異性，優(yōu)選為根-特異性基因表達(dá)所用的工具。這些工具應(yīng)該適用于例如表達(dá)影響從土壤中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基因，和表達(dá)改良根的生長(zhǎng)的基因。
通過(guò)提供權(quán)利要求中表述的實(shí)施方案，已解決了這一技術(shù)問(wèn)題。
因此，本發(fā)明涉及選自下列的啟動(dòng)子a)啟動(dòng)子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的核酸序列；b)啟動(dòng)子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核酸序列的功能性部分，并可導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)；c)啟動(dòng)子，其具有能與SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列之一雜交的序列，并可導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)；d)編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQID No.8所示氨基酸序列具有至少60％同源性，其中這些啟動(dòng)子導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子是得自或衍生自植物基因的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的上下文中，“啟動(dòng)子”是含有基因(優(yōu)選為結(jié)構(gòu)基因)調(diào)節(jié)部分的DNA序列。基因的“調(diào)節(jié)部分”可被理解為決定基因表達(dá)的部分。調(diào)節(jié)部分具有序列基元，轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶在此裝配和誘導(dǎo)基因編碼部分的轉(zhuǎn)錄。另外，調(diào)節(jié)部分可含有一個(gè)或多個(gè)正調(diào)節(jié)元件，即所謂的增強(qiáng)子。此外或要不然，它也可含有負(fù)調(diào)節(jié)元件，即所謂的沉默子?！敖Y(jié)構(gòu)基因”是調(diào)節(jié)和編碼部分的遺傳單位，所述結(jié)構(gòu)基因的基因產(chǎn)物是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)一級(jí)氨基酸序列的信息包含在結(jié)構(gòu)基因的編碼部分，而調(diào)節(jié)部分決定合成基因產(chǎn)物所根據(jù)的編碼部分的轉(zhuǎn)錄物所形成的時(shí)間，在何種組織形成和形成的量。本發(fā)明的啟動(dòng)子可源自例如經(jīng)重組DNA技術(shù)修飾的和/或合成產(chǎn)生的植物基因。
在本發(fā)明的意義上，術(shù)語(yǔ)“根-特異性的”指的是受本發(fā)明啟動(dòng)子控制的外源基因在根中被表達(dá)。在本發(fā)明的意義上，根特異性特指相對(duì)于成熟的葉而言，本發(fā)明的啟動(dòng)子更有利于外源基因在根中表達(dá)，并導(dǎo)致顯著增加的表達(dá)，例如至少增加2至5倍，優(yōu)選增加5至10倍，特別優(yōu)選增加10至100倍。
在本發(fā)明的上下文中，可經(jīng)由報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)分析根特異性。為了檢測(cè)分離的啟動(dòng)子序列在根中的啟動(dòng)子活性，例如，可在植物轉(zhuǎn)化所用表達(dá)盒或載體中使啟動(dòng)子與報(bào)道基因，如大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶基因可操作相連。使用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物。隨后，通過(guò)例如Martin等(GUS報(bào)道基因系統(tǒng)可用作研究植物基因表達(dá)的工具，GUS法使用GUS基因作為基因表達(dá)的報(bào)道基因，Academic出版社(1992)，23-43)所述，與成熟的葉相比較，測(cè)定根中β-葡糖醛酸酶的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“根”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。另外，可參照Strasburger(Lehrbuch der Botanik fur HochschulenBegr，Eduard Strasburger u.a.，Peter Sitte的新版本，Hubert Ziegleru.a.，34，Aufl.，1998，F(xiàn)ischer(Gustav)-Verlag，Stuttgart)。
令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列的啟動(dòng)子能導(dǎo)致受其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。
這一觀察結(jié)果特別令人驚奇，因?yàn)橄鄬?duì)于SEQ ID No.1而言，具有約1000bp延伸的啟動(dòng)子區(qū)域基因組片斷(SEQ ID No.13)(參見(jiàn)實(shí)施例2)不能介導(dǎo)根-特異性GUS表達(dá)。僅有按實(shí)施例3C所述產(chǎn)生的，相對(duì)于大片斷(SEQ ID No.13)而言較短的啟動(dòng)子片斷(SEQ ID No.1至6)，才能導(dǎo)致由該啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列的根-特異性基因表達(dá)。
在分析cDNA序列(SEQ ID No.7)時(shí)，在實(shí)際存在的ATG(SEQ IDNo.7的第256-258位)的5’區(qū)域上游又發(fā)現(xiàn)3個(gè)另外的ATG翻譯起始密碼子(SEQ ID No.7的第42-44，65-67和142-144位)，它們導(dǎo)致出現(xiàn)幾個(gè)上游開(kāi)放閱讀框(uORF)。這種uORF的存在對(duì)特定mRNA的翻譯率具有負(fù)面影響。構(gòu)建多種啟動(dòng)子片斷時(shí)，優(yōu)選使它們不含這一5’上游區(qū)域(SEQ ID No.7的第1-255位)。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可以使由該啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列進(jìn)行根-特異性基因表達(dá)。它是其它根-特異性啟動(dòng)子的很有意思的替代品，因?yàn)樗材芙閷?dǎo)根毛中的基因表達(dá)。由于根毛的表面積比根大，因此，利用本發(fā)明的啟動(dòng)子能更有效地操縱這種基因的表達(dá)，其基因產(chǎn)物可介導(dǎo)經(jīng)由根毛細(xì)胞運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。
本發(fā)明啟動(dòng)子有多種可能的用途供人支配。例如，一種可能性是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所述植物因根毛代謝被修飾，對(duì)根周邊的環(huán)境(根際)產(chǎn)生積極影響而顯示出增加的產(chǎn)量。另外，本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于基因的根-特異性表達(dá)，所述基因能介導(dǎo)例如從被污染的土壤中吸收重金屬離子。因此，利用本發(fā)明的啟動(dòng)子可以產(chǎn)生能用于植物除污的植物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子能導(dǎo)致受所述啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列在特定的根細(xì)胞中表達(dá)，所述根細(xì)胞如初生根的根細(xì)胞，初生根的根毛，根尖的根細(xì)胞或下胚軸下方的初生根的根毛。
除了表現(xiàn)出SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示完整序列的啟動(dòng)子外，本發(fā)明還涉及表現(xiàn)出所述序列的功能性部分，并導(dǎo)致受這些啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的上下文中，“功能性片斷”被理解為盡管核苷酸序列有所不同，但仍具有所需功能，例如啟動(dòng)子活性和組織或器官特異性的序列。測(cè)定啟動(dòng)子活性的方法包括例如，測(cè)定特定標(biāo)記基因的表達(dá)率，所述標(biāo)記基因處于本發(fā)明啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制之下。適當(dāng)標(biāo)記基因是例如大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因或綠色熒光蛋白(GFP)基因(Baulcombe等，植物雜志，7(16)(1993)，1045-1053)。通過(guò)比較上述標(biāo)記基因在植物各個(gè)組織或器官中的表達(dá)率，易于確定器官和組織特異性。在本發(fā)明的意義上，啟動(dòng)子序列的功能性片斷含有本文所述序列的天然變體，以及通過(guò)例如化學(xué)合成得到的人工核苷酸序列。
特別是，功能性片斷也可以是原始分離的啟動(dòng)子序列的天然或人工突變體，該突變體也表現(xiàn)出所需的功能。突變包括取代，添加，缺失，交換和/或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基。因此，本發(fā)明也包括通過(guò)修飾SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQID No.5或SEQ ID No.6所示的核苷酸序列而得到的核苷酸序列。所述修飾的目的可以是例如進(jìn)一步界定其中所含的啟動(dòng)子序列，或者導(dǎo)入其它限制性位點(diǎn)。
啟動(dòng)子序列的功能性部分也包括啟動(dòng)子變體，其啟動(dòng)子活性相對(duì)于野生型而言有所降低或增加。
理論上，真核RNA聚合酶II啟動(dòng)子的活性是由多種反式作用因子(DNA結(jié)合蛋白)的協(xié)同相互作用導(dǎo)致的，所述因子與啟動(dòng)子上存在的多種順式調(diào)節(jié)的DNA元件結(jié)合。這些因子直接或間接地與基本轉(zhuǎn)錄機(jī)上的單個(gè)或幾個(gè)因子相互作用，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近形成前起始復(fù)合物(Drapkin等，最新細(xì)胞生物學(xué)觀點(diǎn)5(1993)，469-476)?？蓪⑵浞Q為真核RNA聚合酶II啟動(dòng)子的組件建立(modular set-up)，其中多種順式-元件(組件)作為部分組分各自決定著啟動(dòng)子的總活性(Tjian和Maniatis，細(xì)胞77(1994)，5-8)。通過(guò)例如用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子進(jìn)行啟動(dòng)子研究，闡明了組件建立(Benfey和Chua，科學(xué)250(1990)，959-966；Benfey等，EMBO J.9(1990)，1677-1684；Benfey等，EMBO J.9(1990)，1685-1696)。由于-343至+8(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)而言)啟動(dòng)子的不同限制性亞片斷在轉(zhuǎn)基因煙草植物中介導(dǎo)不同的組織特異性，可將啟動(dòng)子分為6個(gè)亞-結(jié)構(gòu)域。因此，完整啟動(dòng)子介導(dǎo)的強(qiáng)組成型表達(dá)可被分為組織-特異性的部分活性。
通過(guò)例如與基本啟動(dòng)子報(bào)道基因盒融合，可鑒定本發(fā)明啟動(dòng)子的單個(gè)亞-結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)潛在的組織特異性?；締?dòng)子是含有TATA盒或起始子序列(Smale和Baltimore，細(xì)胞57(1989)，103-113；Zawel和Reinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.44(1993)。67-108；Conaway和Conaway，生物化學(xué)年評(píng)，62(1993)，161-190)的DNA序列，所述TATA盒位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約20至30個(gè)堿基對(duì)?；締?dòng)子是例如-63至+8Δ35S啟動(dòng)子(Frohberg，F(xiàn)U BerlinFB Biologie的論文(1994))，-332至+14基本patatin I類啟動(dòng)子以及-176至+4基本PetE啟動(dòng)子(Pwee等，植物雜志，3(1993)，437-449)。
另外，也可以通過(guò)缺失分析和/或誘變(Kawagoe等，植物雜志，5(6)(1994)，885-890)來(lái)鑒定本發(fā)明啟動(dòng)子的亞-結(jié)構(gòu)域或順式-元件。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的報(bào)道基因活性，可在植物中進(jìn)行亞-結(jié)構(gòu)域或順式-元件的功能性試驗(yàn)。在本發(fā)明的上下文中，啟動(dòng)子序列的功能性部分也包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列的亞-結(jié)構(gòu)域和/或順式-元件，它們能介導(dǎo)根特異性。
另外，利用多聚化可以顯著增加亞-區(qū)域或順式-元件的效力。對(duì)CaMV 35S啟動(dòng)子而言，長(zhǎng)度為250bp的片斷串聯(lián)二聚化可導(dǎo)致啟動(dòng)子活性增加10倍(Kay等，科學(xué)230(1987)，1299-1302)。對(duì)CaMV 35S啟動(dòng)子的亞-結(jié)構(gòu)域B5而言，當(dāng)該結(jié)構(gòu)域以四聚體而不是單聚體的形式存在時(shí)，啟動(dòng)子構(gòu)建體的活性顯著增加(Benfey等，EMBO J.9(1990)，1685-1696)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明特別地涉及SEQID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列的亞-結(jié)構(gòu)域和/或順式-元件的二-和多聚體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子活性相對(duì)于野生型而言的增加可通過(guò)聯(lián)合使用本發(fā)明的啟動(dòng)子和所謂的增強(qiáng)子而獲得。
在文獻(xiàn)中，已描述了多種增強(qiáng)子，它們通常導(dǎo)致組織-特異性的表達(dá)增加，其中組織特異性通常由所用的相關(guān)增強(qiáng)子來(lái)決定(Benfey等，科學(xué)250(1990)，959-966；Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202；Chen等，EMBO J.7，(1988)，297-302；Simpson等，自然323(1986)，551-554)。
另外，有一些增強(qiáng)子，例如PetE增強(qiáng)子(Sandhu等，植物分子生物學(xué)37(1998)，885-896)不具有組織-特異性效果，因此將其置于本發(fā)明啟動(dòng)子之前，作為純粹的定量增強(qiáng)子元件，以增加根中的表達(dá)而不改變本發(fā)明啟動(dòng)子的組織特異性。
基于特定盒(BoxII)多聚化的根-特異性增強(qiáng)子描述于例如“T-DNA基因5生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的DNA-蛋白質(zhì)相互作用”(作者SirpaNuotio，Acta Univeritatis Ouluensis，A Scientiae RerumNaturalium 299(1997)，Oulu大學(xué)出版社，pp.38)。另外，也可使用合成的增強(qiáng)子，它可衍生自例如天然增強(qiáng)子和/或可通過(guò)多種增強(qiáng)子的組合來(lái)獲得。
本發(fā)明還涉及啟動(dòng)子，其具有能與SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列，并可導(dǎo)致由所述啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。優(yōu)選所述序列在嚴(yán)緊條件下與SEQID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列雜交。
術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”優(yōu)選指如Sambrook等(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)所述的雜交條件。尤其指在下列條件下發(fā)生雜交雜交緩沖液2xSSC；10xDenhardt’s溶液(Fikoll 400＋PEG＋BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鯡精DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液，pH7.2，1mMEDTA，7％SDS雜交溫度T＝65至68℃；洗滌緩沖液0.2xSSC；0.1％SDS；洗滌溫度T＝65至68℃。
優(yōu)選啟動(dòng)子與SEQ ID No.1所示啟動(dòng)子序列或其部分的序列同一性至少為30％，優(yōu)選至少為40％，優(yōu)選至少為50％，特別優(yōu)選至少為60％，更特別優(yōu)選至少為70％，甚至更優(yōu)選至少為80％，優(yōu)選至少為90％，最優(yōu)選至少為95％。優(yōu)選通過(guò)與SEQ ID No.1所示核苷酸序列進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定該啟動(dòng)子序列的序列同一性。如果比較的兩個(gè)序列具有不同的長(zhǎng)度，優(yōu)選序列同一性指的是較短序列中與較長(zhǎng)序列的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基所占的百分比。通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序，例如Bestfit程序(威斯康星序列分析包，版本8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive Madison，WI 53711)可以方便地測(cè)定序列同一性。Bestfit使用Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2(1981)，482-489的局部同源性算法尋找兩個(gè)序列之間序列同一性最高的區(qū)段。當(dāng)使用Bestfit或另一個(gè)序列算法程序來(lái)測(cè)定例如特定序列是否與本發(fā)明的參照序列95％相同時(shí)，優(yōu)選將參數(shù)調(diào)節(jié)為在全長(zhǎng)參照序列的基礎(chǔ)上計(jì)算同一性的百分比，同源性缺口可以占參照序列核苷酸總數(shù)的5％。當(dāng)使用Bestfit時(shí)，優(yōu)選使所謂的任選參數(shù)保持為其缺省值。比較給定序列與本發(fā)明的上述序列時(shí)出現(xiàn)的偏差可能是例如由添加，缺失，取代，插入或重組引起的。按上述與SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列雜交，或表現(xiàn)出與SEQID No.1的序列同一性的啟動(dòng)子序列優(yōu)選源自植物，優(yōu)選源自高等植物，特別優(yōu)選源自雙子葉植物，最優(yōu)選源自番茄屬植物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子具有SEQ IDNo.3(約1.4kb片斷)，SEQ ID No.4(約1.1kb片斷)，SEQ IDNo.5(0.9kb片斷)或SEQ ID No.6(0.55kb片斷)所示的完整序列。
另外，本發(fā)明還涉及啟動(dòng)子，其表現(xiàn)出所述序列的功能性部分，并導(dǎo)致由所述啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子具有SEQ IDNo.4(1.1kb片斷)所示的完整序列或其功能性部分。
不必受某些理論的束縛，可假定SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示啟動(dòng)子源自屬于一組伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)的植物基因。
因此，本發(fā)明還涉及編碼蛋白質(zhì)，優(yōu)選為一組伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子，所述蛋白質(zhì)表現(xiàn)出的與SEQ ID No.8所示完整氨基酸序列的同源性，即同一性至少為60％，優(yōu)選至少為70％，更優(yōu)選至少為80％，特別優(yōu)選至少為90％，最優(yōu)選至少為95％，其中這些啟動(dòng)子導(dǎo)致由所述啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，其中所述啟動(dòng)子導(dǎo)致由所述啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。
SEQ ID No.7所示的氨基酸序列編碼番茄的多肽(SEQ ID No.8)，假定該多肽屬于一組伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的上下文中，伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)是植物蛋白質(zhì)，其氨基酸序列表現(xiàn)出至少一個(gè)下列序列基元SPPPPP，SPPPPYY，SPPPPY，SPPPPVY，PPPPPYY，PPPPPSY，PPPPPTY，PPPPPAY，PPPPPEY，PPPPPXY，SOOOO，SPPPPKH，SPPPPKK，SPPPPKKPYYPP，SPPPPSP，SPPPPSPKYVYK，SPPPPSPSPPPP，SPPPPYYYH，SPPPPYYYK，SOOOOTOVYK，SPPPPTPVYK，SOOOOVYK，SPPPPVYK，SPPPPVYSPPPP，SPPPPVHSPPPPVA，SPPPPVK，SPPPPVKSPPPP，SOOOOVKP。
在本發(fā)明意義上，包含在SEQ ID No.8中的，表現(xiàn)出至少一個(gè)SPPPP-和/或(P)PPPPYY-基元的植物蛋白質(zhì)被稱為伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)。
例如，利用基于-計(jì)算機(jī)的與已知序列的序列比較，或者也通過(guò)用SEQ ID No.7所示序列或其部分篩選例如cDNA或基因組文庫(kù)，即可鑒定與SEQ ID No.7所示序列具有同源性的DNA序列。所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上)。基于計(jì)算機(jī)的序列比較也可在氨基酸水平上，用SEQ ID No.8所示氨基酸序列或其部分進(jìn)行。
細(xì)胞壁影響細(xì)胞的形態(tài)和功能。細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)組分含有酶和結(jié)構(gòu)蛋白。已被詳盡闡明的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白包括所謂的伸展蛋白(Cassab和Varner，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年評(píng)，39(1988)，321-353；Showalter，植物細(xì)胞5(1993)，9-23)。伸展蛋白屬于富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)家族。迄今為止，已從胡蘿卜(Chen和Varner，EMBOJ.4(1985)，2145-2151)，蠶豆(Corbin等，分子細(xì)胞生物學(xué)7(1987)，4337-4344)，油菜子(Evans等，Mol.Gen.Genet.223(1990)，273-287)，番茄(Showalter等，植物分子生物學(xué)，16(1991)，547-565)和煙草(Memelink等，EMBO J.6(1987)，3579-3583)中鑒定出編碼伸展蛋白的基因和cDNA。伸展蛋白的基因表達(dá)為發(fā)育-依賴型，相對(duì)于組成型調(diào)節(jié)而言，它更可能受組織-特異性調(diào)節(jié)(Sommer-Knudsen等，植物化學(xué)47(1998)，483-497；Ye等，植物細(xì)胞3(1991)，23-37)。在比較不同植物的不同伸展蛋白基因的組織特異性時(shí)，發(fā)現(xiàn)伸展蛋白基因的表達(dá)模式根據(jù)所分析的植物的種，細(xì)胞類型和組織類型的不同而明顯不同(Showalter等，植物分子生物學(xué)19(1992)，205-215)。
在大豆中，HRGP在分生細(xì)胞中表達(dá)得最集中。煙草的HRGPnt3-基因在中柱鞘和內(nèi)皮層中表達(dá)，尤其是可在參與形成側(cè)根的特定細(xì)胞中表達(dá)(Keller等，Proc.Nat.Acad.Sci.86(1989)，1529)。
已描述伸展蛋白的基因表達(dá)可受環(huán)境因子的調(diào)節(jié)，如光，病原體侵?jǐn)_，創(chuàng)傷，熱應(yīng)力(參見(jiàn)例如Cassab和Varner，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年評(píng)39(1988)，321-353；Cortin等，分子細(xì)胞生物學(xué)7(1987)，4337-4344；Niebel等，植物細(xì)胞5(1993)，1697-1710)。然而，并不是所有伸展蛋白都適用這一原則(Sommer-Knudsen等，植物化學(xué)47(1998)，483-497)。
成熟的伸展蛋白通常富含羥脯氨酸(Hyp)，絲氨酸和氨基酸纈氨酸，酪氨酸，賴氨酸和組氨酸的特定組合。通常，伸展蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)(有關(guān)綜述可參見(jiàn)例如Sommer-Knudsen等，植物化學(xué)47(1998)，483-497)的特征在于至少一個(gè)Ser-Pro3-6-肽單位，該單位也可重復(fù)出現(xiàn)或與類似序列，如下列序列基元相連SOOOO，SPPPPKH，SPPPPKK，SPPPPKKPYYPP，SPPPPSP，SPPPPSPKYVYK，SPPPPSPSPPPP，SPPPPYYYH，SPPPPYYYK，SOOOOTOVYK，SPPPPTPVYK，SOOOOVYK，SPPPPVYK，SPPPPVYSPPPP，SPPPPVHSPPPPVA，SPPPPVK，SPPPPVKSPPPP，SOOOOVKP(也參見(jiàn)Sommer-Knudsen等，文獻(xiàn)同上)。
伸展蛋白經(jīng)受強(qiáng)烈的翻譯后修飾。例如，對(duì)胡蘿卜的伸展蛋白而言，大多數(shù)脯氨酸殘基被脯氨酰-羥化酶羥化。羥脯氨酸殘基可用作糖基化的靶(Lamport等，生物化學(xué)雜志133(1972)，125-132；vanHoist，植物生理學(xué)，74(1984)，247-251)。糖類，尤其是半乳糖和阿拉伯糖(Smith等，植物化學(xué)25(1986)，pp.1021；Holst等，植物生理學(xué)，74(1984)，247；Smith等，植物化學(xué)23(1984)，1233)可用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)(showalter，植物細(xì)胞5(1993)，9-23)。阿拉伯糖主要以Hyp-Ara1-4的形式出現(xiàn)，半乳糖以Ser-Gal的形式出現(xiàn)。
另外，已討論了多種伸展蛋白經(jīng)由異二酪氨酸鍵的連接，這種連接可導(dǎo)致例如細(xì)胞壁的進(jìn)一步強(qiáng)化以作為抵抗病原體進(jìn)攻的反應(yīng)(Brisson，植物細(xì)胞6(1994)，1703-1712；Epstein，植物化學(xué)23(1984)，1241-1246)。可在伸展蛋白中檢測(cè)到分子內(nèi)的異二酪氨酸鍵(Epstein等，植物化學(xué)，23(1984)，pp.1241)。然而，僅能在體外檢測(cè)到分子間的異二酪氨酸鍵(Everdeen等，植物生理學(xué)，87(1988)，pp.616；Huystee等，植物生理學(xué)和生物化學(xué)，33(1995)，pp.55)。
利用脯氨酸類似物3，4-脫氫-L-脯氨酸(Dhp)，可以選擇性抑制脯氨酰-羥化酶，以利用Dhp降低羥脯氨酸的生物合成。用Dhp處理胡蘿卜(Daucus carota)的根切片之后，可證實(shí)它們合成了結(jié)構(gòu)被修飾的HRGP。用Dhp處理煙草原生質(zhì)體也導(dǎo)致具有經(jīng)修飾結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁的再生(Cooper，植物生理學(xué)，104(1994)，747-752)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)盒。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”涉及本發(fā)明啟動(dòng)子與需表達(dá)的核酸序列的組合。該核酸序列可以是例如編碼多肽，即結(jié)構(gòu)基因的序列。它可以在有義或反義方向上與啟動(dòng)子相連。核酸序列也可編碼不可翻譯的RNA，例如反義-RNA或核酶。這些核酸序列可與本發(fā)明的啟動(dòng)子聯(lián)合使用，以產(chǎn)生具有經(jīng)修飾(優(yōu)選為經(jīng)改良)表型的植物。另外，利用本發(fā)明的啟動(dòng)子可影響根中的植物代謝。目的在于操縱轉(zhuǎn)基因植物代謝流程的異源(過(guò)量)表達(dá)和反義-抑制的一些例子概述于Herbers和Sonnewald(TIBTECH 14(1996)，198-205)。核酶的例子公開(kāi)于Feyter(Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-228)?？衫帽景l(fā)明啟動(dòng)子和載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的多種可能的應(yīng)用也描述于TIPTEC植物產(chǎn)物&作物生物技術(shù)13(1995)，312-397。
本發(fā)明的表達(dá)盒可進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄終止序列，其位于與啟動(dòng)子連接的核酸序列的3’末端下游。在本發(fā)明的上下文中，“轉(zhuǎn)錄終止序列”是位于編碼基因區(qū)域的3’末端，并能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，任選導(dǎo)致polyA-尾合成的DNA序列。這種終止序列的例子是章魚(yú)氨酸合酶基因的終止序列。
根據(jù)本發(fā)明，在啟動(dòng)子和核酸序列和/或核酸序列和終止子之間有一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)。
另外，本發(fā)明涉及含有至少一個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子的載體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該載體中的本發(fā)明啟動(dòng)子與多接頭相連，所述多接頭允許將任何序列整合至啟動(dòng)子的下游。在本發(fā)明的上下文中，“多接頭”是含有至少一個(gè)限制性酶(優(yōu)選為兩個(gè)或多個(gè)限制性酶)識(shí)別序列的DNA序列。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體在啟動(dòng)子和/或多接頭的下游還含有終止轉(zhuǎn)錄的序列，例如章魚(yú)氨酸合酶基因的終止序列。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明表達(dá)盒的載體。本發(fā)明的載體含有選擇標(biāo)記較為有利，該選擇標(biāo)記適于鑒定和選擇含有本發(fā)明載體的細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，特別優(yōu)選其適于將外源DNA整合至植物基因組。所述載體包括例如部分可商購(gòu)的二元載體。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的啟動(dòng)子，或本發(fā)明的表達(dá)盒或載體進(jìn)行基因工程改造所得的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的上下文中，“經(jīng)基因工程改造”指的是宿主細(xì)胞含有優(yōu)選穩(wěn)定整合至基因組的本發(fā)明啟動(dòng)子，或本發(fā)明的表達(dá)盒或載體，啟動(dòng)子或表達(dá)盒作為外源DNA被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或該細(xì)胞的祖代細(xì)胞。這意味著本發(fā)明的細(xì)胞自身可以是轉(zhuǎn)化事件的直接產(chǎn)物，或是由含有本發(fā)明啟動(dòng)子或本發(fā)明表達(dá)盒的細(xì)胞繁殖得到的細(xì)胞。原核(特別是細(xì)菌)以及真核細(xì)胞都可以用作宿主細(xì)胞。真核細(xì)胞可以是例如真菌細(xì)胞，尤其是糖酵母屬的細(xì)胞，優(yōu)選為釀酒酵母細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的載體，本發(fā)明的表達(dá)盒或本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化植物，植物細(xì)胞，植物組織或部分的用途。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，下文將稱之為轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
另外，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明植物細(xì)胞的植物。它們可屬于任何植物的種，屬，科，目或綱。它們可以是單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選本發(fā)明的植物是有用的植物，即在農(nóng)業(yè)，林業(yè)和/或園藝方面對(duì)人有價(jià)值的植物。在本發(fā)明的上下文中，在農(nóng)業(yè)上有用的植物如谷類植物(如小麥，燕麥，大麥，黑麥)，玉米，水稻，馬鈴薯，蘿卜，煙草，甘蔗，甜菜，向日葵，香蕉，油菜或草料或牧草(如苜蓿，白苜蓿，紅苜蓿)，亞麻，棉花，小米，蠶豆，豌豆等，蔬菜植物(如番茄，黃瓜，courgette，茄子，甘藍(lán)類，洋薊，菊苣等)，果樹(shù)，蛇麻草，wine等。草本植物和藥用植物也是有價(jià)值的，例如長(zhǎng)春花，曼陀羅，紅豆杉，三角葉薯蕷，罌粟，顛茄，蛇根木，天仙子；狹葉毛地黃，洋金花，毛地黃，Pilocarpus jaborandi，金雞納樹(shù)，烏頭。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于用本發(fā)明的載體，或本發(fā)明的表達(dá)盒，或本發(fā)明的微生物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，組織或部分或原生質(zhì)體，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，組織或部分或原生質(zhì)體，并任選由培養(yǎng)物再生植物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的載體，本發(fā)明的表達(dá)盒或本發(fā)明的宿主細(xì)胞利用毛根農(nóng)桿菌生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因毛根的用途。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法生產(chǎn)本發(fā)明的植物，例如通過(guò)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并由經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和/或組織再生整個(gè)植物?？梢允褂枚喾N技術(shù)將DNA導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括使用根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化劑，用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，原生質(zhì)體融合，DNA注射，DNA電穿孔，利用biolistic法導(dǎo)入DNA以及其它方法。優(yōu)選使用農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，優(yōu)選為雙子葉植物的方法已深入分析并詳細(xì)描述于EP0120516；Hoekema(二元植物載體系統(tǒng)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章)；Fraley等(Crit.Rev.Plant Sci.4(1993)，1-46)和An等(EMBO J.4(1985)，277-287)。有關(guān)馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，可參見(jiàn)例如Rocha-Sosa等(EMBO J.8(1989)，29-33)。
利用基于-農(nóng)桿菌的載體轉(zhuǎn)化單子葉植物也已被描述(Chan等，植物分子生物學(xué)，22(1993)，491-506；Hiei等，植物雜志，6(1994)，271-282；Deng等，中國(guó)科學(xué)33(1990)，28-34；Wilmink等，植物細(xì)胞報(bào)道11(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13(1995)，486-492；Conner和Domisse，國(guó)際植物科學(xué)雜志，153(1992)，550-555；Ritchie等，轉(zhuǎn)基因研究，2(1993)，252-265)。另一種單子葉植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是利用biolistic法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，植物生理學(xué)，104(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，植物分子生物學(xué)，24(1994)，317-325；Spencer等，應(yīng)用遺傳學(xué)理論，79(1990)，625-631)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔部分透化的細(xì)胞或利用玻璃纖維導(dǎo)入DNA。對(duì)玉米的轉(zhuǎn)化描述于不同時(shí)間的文獻(xiàn)中(如WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等，生物技術(shù)8(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，植物細(xì)胞2(1990)，603-618；Koziel等，生物技術(shù)11(1993)，194-200；Moroc等，應(yīng)用遺傳學(xué)理論，80(1990)，721-726)。
對(duì)其它谷類植物的成功轉(zhuǎn)化也已被描述，例如大麥(Wan和Lemaux，文獻(xiàn)同上；Ritala等，文獻(xiàn)同上；Krens等，自然296(1982)，72-74)和小麥(Nehra等，植物雜志，5(1994)，285-297)。
已描述了多種適用于轉(zhuǎn)化水稻的方法，例如農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hiei等，植物雜志，6(1994)，271-282；Hiei等，植物分子生物學(xué)，35(1997)，205-218；Park等，植物生物學(xué)雜志，38(1995)，365-371)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Datta，″植物基因轉(zhuǎn)移″，Potrykus，Spangenberg(編)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，66-75；Datta等，植物分子生物學(xué)，20(1992)，619-629；Sadasivam等，植物細(xì)胞再生，13(1994)，394-396)，植物轉(zhuǎn)化所用的biolistic法(Li等，植物細(xì)胞再生，12(1993)，250-255；Cao等，植物細(xì)胞再生，11(1992)，586-591；Christou，植物分子生物學(xué)，(1997)，197-203)以及電穿孔(Xu等，″植物基因轉(zhuǎn)移″，Potrykus，Spangenberg(編)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，201-208)。
另外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明植物的繁殖和收獲材料，所述植物含有本發(fā)明的植物細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“繁殖材料”包括適用于通過(guò)無(wú)性或有性的方法產(chǎn)生后代的植物部分。適用于無(wú)性繁殖的植物部分是例如插條，愈傷組織培養(yǎng)物，根莖，根狀莖或塊莖。其它繁殖材料包括例如果實(shí)，種子，幼苗，原生質(zhì)體，細(xì)胞培養(yǎng)物等。優(yōu)選繁殖材料是塊莖和種子。
本發(fā)明還涉及鑒定和分離啟動(dòng)子的方法，所述啟動(dòng)子可導(dǎo)致由其控制的編碼核酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)，所述方法包括下列步驟a)使植物基因組文庫(kù)與編碼伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)的eDNA雜交；b)分離陽(yáng)性克隆；c)檢測(cè)分離克隆的啟動(dòng)子活性。
優(yōu)選在嚴(yán)緊條件下發(fā)生步驟a)中進(jìn)行的雜交。為此，使用編碼伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)或其部分的已知序列與相應(yīng)的文庫(kù)雜交，優(yōu)選在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交。優(yōu)選使用SEQ ID No.7所示序列或其部分。所用方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并詳細(xì)描述于Sambrook等(文獻(xiàn)同上)。
如上所述，在本發(fā)明意義上，伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)是氨基酸序列表現(xiàn)出至少一個(gè)下列序列基元的蛋白質(zhì)SPPPPP，SPPPPYY，SPPPPY，SPPPPVY，PPPPPYY，PPPPPSY，PPPPPTY，PPPPPAY，PPPPPEY，PPPPPXY，SOOOO，SPPPPKH，SPPPPKK，SPPPPKKPYYPP，SPPPPSP，SPPPPSPKYVYK，SPPPPSPSPPPP，SPPPPYYYH，SPPPPYYYK，SOOOOTOVYK，SPPPPTPVYK，SOOOOVYK，SPPPPVYK，SPPPPVYSPPPP，SPPPPVHSPPPPVA，SPPPPVK，SPPPPVKSPPPP，SOOOOVKP，所述蛋白質(zhì)表現(xiàn)出的與SEQ ID No.7所示編碼區(qū)的同源性至少為60％，優(yōu)選至少為70％，優(yōu)選至少為80％，特別優(yōu)選至少為90％，最優(yōu)選至少為95％。可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，詳細(xì)描述于Sambrook等(文獻(xiàn)同上)的方法，來(lái)進(jìn)行步驟b)中所述的陽(yáng)性克隆的鑒定和啟動(dòng)子序列的分離。
可利用報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)來(lái)分析分離的啟動(dòng)子的表達(dá)特性。為了檢測(cè)步驟c)中所述的分離的啟動(dòng)子序列在根細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性，例如，可在植物轉(zhuǎn)化所用表達(dá)盒或載體中使啟動(dòng)子與報(bào)道基因，如大腸桿菌的β-葡糖醛酸酶基因可操作相連。使用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物。隨后，通過(guò)例如Martin等(GUS報(bào)道基因系統(tǒng)可用作研究植物基因表達(dá)的工具，GUS法使用GUS基因作為基因表達(dá)的報(bào)道基因，Academic出版社(1992)，23-43)所述，測(cè)定β-葡糖醛酸酶的器官-特異性表達(dá)。選擇表現(xiàn)出根特異性的啟動(dòng)子，然后分離該啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的上下文中，可操作相連是啟動(dòng)子，編碼序列，終止子，任選包括其它調(diào)節(jié)元件的依次排列，使得所述的每個(gè)元件都能在基因表達(dá)的過(guò)程中根據(jù)需求完成其功能。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的啟動(dòng)子或利用本發(fā)明的方法鑒定的啟動(dòng)子在植物中根-特異性地表達(dá)轉(zhuǎn)基因的用途。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指的是人工導(dǎo)入植物的DNA序列。
這些和其它實(shí)施方案是公開(kāi)的，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見(jiàn)的，其包含在本發(fā)明的描述和實(shí)施例中。可在本發(fā)明意義上使用的，關(guān)于上述方法，工具和用途之一的其它文獻(xiàn)可得自現(xiàn)有技術(shù)，例如可借助于電子工具得自公共圖書館。為此，可使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如“Medline”，可經(jīng)由國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入此數(shù)據(jù)庫(kù)，地址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它數(shù)據(jù)庫(kù)和地址是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可得自國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)，例如，地址為http//www.lycos.com。有關(guān)生物技術(shù)專利和/或?qū)＠暾?qǐng)的來(lái)源和信息的綜述可參見(jiàn)Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364。
下列實(shí)施例將闡明本發(fā)明。實(shí)施例1分離根-特異性基因植物材料和根毛的提取將生長(zhǎng)在溫室地中的番茄植物，即番茄品種Moneymaker的多個(gè)器官用作植物材料。為了提取根和根毛，在無(wú)菌條件下將8000個(gè)表面-滅菌的種子置于培養(yǎng)皿中，放在紙上的金屬格內(nèi)(No.0858，Schleicher & Schuell，德國(guó))。在此之前，用0.5xHoagland’s溶液將紙弄濕。于22℃，以16小時(shí)/8小時(shí)的光照/黑暗周期使種子萌發(fā)。萌發(fā)后第3天，通過(guò)推動(dòng)金屬格和紙之間的無(wú)菌玻璃珠，將金屬格往上提，使其比紙高約4mm。這樣可以使幼苗的根垂直生長(zhǎng)，并使根毛形成最優(yōu)化。第5天，將幼苗與金屬格一起浸入液氮中，用抹刀從金屬格中剝下根。然后在液氮中從根上刷下根毛，通過(guò)250μm篩的濾器純化根毛，按Rohm和Werner(Physiologia Plantarum 69(1987)，129-136)所述進(jìn)行分析。
為了對(duì)不同齡的幼苗根進(jìn)行Northern印跡分析，按上述將幼苗保溫7，14和18天，相應(yīng)地進(jìn)行根的分離。為了分離在土壤中生長(zhǎng)的植物根毛，從溫室土壤中取出含有密集生長(zhǎng)的幼苗的植物盆。用鑷子收集在側(cè)面土壤表面生長(zhǎng)的根，立即置于液氮中冷凍。為了進(jìn)行光照/黑暗試驗(yàn)，按上述將幼苗保溫于16小時(shí)/8小時(shí)暴露的光照/黑暗周期。在白天周期開(kāi)始后暴露4小時(shí)之后收獲7-天齡的根。平行地，在總是黑暗的環(huán)境中將幼苗保溫7天，收獲它們的根。按Pena-Cortes等(植物186(1992)，495-502)所述使番茄葉受傷，24小時(shí)之后收獲受傷的葉。將未-受傷的葉用作對(duì)照。RNA提取和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)Verwoerd等(核酸研究17(1989)，2362)所述的方法，提取所述器官的總RNA。通過(guò)使用磁性寡dT珠(Dynabeads，Dynal，德國(guó))，用7-60μg根毛總RNA分離poly(A)+RNA。使用700ng poly(A)+RNA生產(chǎn)雙鏈cDNA(Pharmacia，德國(guó))。結(jié)合EcoRI/NotI接頭之后，將cDNA克隆至表達(dá)載體λZAPII(Stratagene，德國(guó))。使用Stratagene(德國(guó))的Gigapack II Gold包裝提取試劑盒將其包裝至λ噬菌體。示差篩選根毛-特異性cDNA文庫(kù)將500,000個(gè)包裝于噬菌體中的cDNA鋪于瓊脂平皿中的YT瓊脂上，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等(1989)，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，紐約)，用680ng得自根毛或刷下的根的經(jīng)放射性標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄mRNA進(jìn)行篩選。對(duì)100個(gè)推定的陽(yáng)性噬斑進(jìn)行第二次篩選以避免人為假象。最后，將76個(gè)陽(yáng)性噬斑用于體內(nèi)切除。于28℃，在96孔微滴板的2xYT培養(yǎng)基(Sambrook等，文獻(xiàn)同上)中將所得細(xì)菌培養(yǎng)物振蕩過(guò)夜。使用如Bucher等(植物分子生物學(xué)35(1997)，497-508)所述的一種反向Southern法，將得自上述培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA用于第二次篩選。用EcoRI消化有希望的質(zhì)粒之后，分離相應(yīng)的插入物，將其用于Northern印跡分析。Northern印跡分析和DNA測(cè)序乙二醛化之后，將5-10μg得自所述器官的總RNA上樣于1.2％瓊脂糖乙二醛凝膠(Hull(1985)，關(guān)于植物病毒的病毒純化，生物物理和生物化學(xué)特征的鑒定，Mahy編，病毒學(xué)，操作方法，IRL出版社，牛津，英國(guó)，pp.1-24)。Northern印跡分析和雜交條件取自標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，文獻(xiàn)同上)。于68℃雜交印跡。使用LeExtl cDNA作為放射性探針來(lái)檢測(cè)LeExt1 mRNA。最后一次于68℃，用0.1xSSC洗滌印跡。洗滌之后，于-80℃將印跡暴露于X-射線膠片(Kodak，德國(guó))。通過(guò)與乙二醛化的標(biāo)記DNA(BRL，德國(guó))進(jìn)行比較，測(cè)定轉(zhuǎn)錄物的大小。結(jié)果示于

圖1和2。
通過(guò)使用雙脫氧測(cè)序法，用T7 DNA聚合酶(Amersham，德國(guó))對(duì)LeExt1 cDNA(＝SEQ ID No.7)進(jìn)行測(cè)序。利用威斯康星大學(xué)的GCG程序包進(jìn)行序列分析(Devereux等，一套全面的VAX序列分析程序核酸研究12(1984)，387-395)。實(shí)施例2分離含有根-特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域的基因組片斷用經(jīng)放射性標(biāo)記的LeExt1 cDNA篩選番茄的基因組DNA文庫(kù)(Clontech Laboratories，美國(guó))(參見(jiàn)實(shí)施例1)。將500,000個(gè)噬斑形成單位(PFU)的DNA文庫(kù)鋪于瓊脂平皿中的YT瓊脂上，37℃保溫6至8小時(shí)，轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Hybond N，Amersham，德國(guó))(Sambrook等，文獻(xiàn)同上)。雜交條件取自標(biāo)準(zhǔn)方法(比活性，Sambrook等，文獻(xiàn)同上)。從第一次篩選中選擇出30個(gè)噬斑用于第二輪篩選。在第二輪篩選之后，將選定的2個(gè)噬斑的噬菌體懸浮液再次鋪板，產(chǎn)生噬菌體裂解物。根據(jù)Lockett(分析生物化學(xué)185(1990)，230-234)所述，由這些噬菌體裂解物制備λDNA。用多種限制性酶消化600ng各種λDNA，使用溴化乙錠在瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)出所得片斷。用經(jīng)放射性標(biāo)記的LeExt1 cDNA進(jìn)行Southern印跡雜交(Sambrook等，文獻(xiàn)同上)之后，分離出長(zhǎng)度約為3.4kb，與LeExt1 cDNA雜交的基因組片斷，將其克隆至也用Asp718消化的pBluescript II SK-質(zhì)粒。首先，通過(guò)使用T7 DNA聚合酶(Amersham，德國(guó))的雙脫氧測(cè)序法，對(duì)片斷進(jìn)行部分測(cè)序。發(fā)現(xiàn)基因組片斷與LeExt1 cDNA序列重疊204個(gè)堿基對(duì)，并進(jìn)一步將5’上游延伸至LeExt1基因的非-編碼區(qū)。隨后，對(duì)基因組片斷(約3.4kb)的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序(SEQ ID No.13)。實(shí)施例3產(chǎn)生GUS表達(dá)盒以分析啟動(dòng)子的功能性總共產(chǎn)生了3個(gè)不同的GUS表達(dá)盒。
A.3.4kb的基因組片斷與GUS盒的翻譯融合，其中片斷含有約200個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的LeExt1 cDNA編碼序列。通過(guò)KpnI消化從pBluescriptII SK-質(zhì)粒上切下基因組片斷，通過(guò)使用T7 DNA聚合酶的補(bǔ)平反應(yīng)使其成為平端(Ausubel等，最新分子生物學(xué)方法，John Wiley & Sons，Inc.，紐約，1998)，并克隆至經(jīng)SmaI消化和去磷酸化的二元載體pBIl01.3(Clontech，美國(guó))。pBIl01.3是含有GUS盒的質(zhì)粒，其中不含二元載體pBIN19的啟動(dòng)子。該構(gòu)建體被稱為roh1。
B.經(jīng)修飾的基因組片斷與GUS盒的轉(zhuǎn)錄融合。使用含有SalI限制性位點(diǎn)的寡核苷酸42trx3(5’-GAGAGTCGACGATATCGGGCGAATTGGGTACC-3’，SEQ ID No.9)，和含有XbaI限制性位點(diǎn)的42trx4(5’-GAGATCTAGAGGTACCGGACTTTATATAACATAAC-3’，SEQ ID No.10)，使用Taq DNA聚合酶[Fermentas，Lithuania]，經(jīng)PCR合成長(zhǎng)度為3200bp的基因組片斷，該片斷缺乏與LeExt1 cDNA重疊的ORF(開(kāi)放閱讀框)，所述PCR的每輪循環(huán)的條件是94℃30秒解鏈DNA，60℃1分鐘退火引物，72℃1分鐘合成DNA，3秒延伸。用SalI和XbaI消化片斷，克隆至經(jīng)相應(yīng)消化和去磷酸化的pBluescript II SK-質(zhì)粒。從大腸桿菌DH5α培養(yǎng)物(Sambrook等，文獻(xiàn)同上)中分離質(zhì)粒之后，通過(guò)SalI/XbaI消化分離片斷，通過(guò)使用T7 DNA聚合酶的補(bǔ)平反應(yīng)使其成為平端。然后將末端產(chǎn)物克隆至經(jīng)SmaI消化和去磷酸化的二元載體pBI101.3。此構(gòu)建體被稱為rohtrx。
C.利用下列引物產(chǎn)生約3270bp的PCR產(chǎn)物42Xba(5’-GAGATCTAGACCATGGAGAAGAATTGG-3’，SEQ ID No.11)和42Sa1(5’-GAGAGTCGACGGGCGAATTGGGTACCG-3’，SEQ ID No.12)。PCR條件是利用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，德國(guó))，94℃20秒解鏈DNA，50℃45秒退火引物，72℃2分鐘合成DNA。根據(jù)廠商的說(shuō)明(Stratagene，德國(guó))將PCR產(chǎn)物直接克隆至質(zhì)粒pCR-Script。經(jīng)SalI/NotI消化之后，用Klenow酶使PCR產(chǎn)物的末端成為平端[Sambrook，1989#68]，并克隆至經(jīng)SmaI消化和去磷酸化的pBluescript II SK-質(zhì)粒。制備質(zhì)粒(Sambrook，文獻(xiàn)同上)之后，用BstXI消化質(zhì)粒并線性化。根據(jù)廠商[Fermentas，Lithuania]提供的方法，用外切核酸酶III和S1核酸酶從5’末端連續(xù)截短PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生了約具有下列長(zhǎng)度的截短的基因組片斷2.2kb，1.7kb，1.4kb，1.1kb，0.9kb和0.55kb。使用SacI分離質(zhì)粒5’-AKT1-320.X(Lagarde等，植物雜志，9(1996)，195-203)中的AKT1-GUS-3’NOS盒，利用綠豆核酸酶(New Englands BioLabs Inc.，Bioconcept，瑞士)處理使末端成為平端，然后用NcoI消化。將通過(guò)此方法得到的GUS-3’NOS盒克隆至經(jīng)NcoI/EcoRV消化并去磷酸化的pBluescriptII SK-質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有截短的基因組片斷。通過(guò)用SacI和SalI消化從每個(gè)質(zhì)粒中分離通過(guò)此方法得到的啟動(dòng)子-GUS-3’NOS盒，將其克隆至經(jīng)SacI/SalI消化并去磷酸化的二元載體Bin19(Bevan等，核酸研究12(1984)，8711)。所得構(gòu)建體被稱為BIN-Δgenx-GUS，其中x表示片斷的相應(yīng)長(zhǎng)度2.2kb(SEQ ID No.1)，1.7kb(SEQ IDNo.2)，1.4kb(SEQ ID No.3)，1.1kb(SEQ ID No.4)，0.9kb(SEQID No.5)或0.55kb(SEQ ID No.6)。
另外，按RochaSosa等(EMBO J.8(1989)，23-29)所述進(jìn)行馬鈴薯的轉(zhuǎn)化。
按Omirulleh等(″植物的基因轉(zhuǎn)移″，Potrykus，Spangenberg(編)，Springer Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，pp.99)所述轉(zhuǎn)化玉米。
另外，通過(guò)電穿孔(Jung等，生物技術(shù)通訊，14(1992)，695-700)將上述構(gòu)建體導(dǎo)入毛根農(nóng)桿菌菌株15834，隨后，根據(jù)Toivonen等(植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)18(1988)，pp.79)的說(shuō)明，利用毛根農(nóng)桿菌將上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至長(zhǎng)春花中。可在毛根中檢測(cè)到GUS的強(qiáng)表達(dá)。按Christou(植物分子生物學(xué)，35(1997)，197-203)所述，利用顆粒轟擊轉(zhuǎn)化水稻。實(shí)施例5LeExt1啟動(dòng)子活性的組化定位用0.1％X-gluc溶液(預(yù)先將0.1g X-gluc溶解于1ml二甲基甲酰胺中，加入1ml 10％Triton和5ml 1M磷酸鈉緩沖液，pH7.2，補(bǔ)加蒸餾水至總體積為100ml)真空-浸潤(rùn)植物材料，37℃保溫過(guò)夜。染色之后，在乙醇∶醋酸(3∶1)中固定植物，并在100％乙醇中脫色。結(jié)果，植物的綠色部分變成無(wú)色，而藍(lán)色部分保持穩(wěn)定；參見(jiàn)圖3。實(shí)施例6分析啟動(dòng)子的特異性和活性為了分析啟動(dòng)子的特異性，根據(jù)Jefferson等(EMBO J.6(1987)，3901-3907)所述的方法，與根中的活性相比較來(lái)測(cè)定馬鈴薯和番茄植物葉中的GUS活性。在番茄中，根中的GUS活性比成熟葉中的活性高20至300倍。所檢查的大多數(shù)GUS-陽(yáng)性馬鈴薯植物根中的GUS活性高，但成熟的葉中沒(méi)有GUS活性。為了測(cè)定啟動(dòng)子的活性，將GUS活性與35S啟動(dòng)子的活性相比較。具有最高啟動(dòng)子活性的品系表現(xiàn)出的活性約為CaMV 35S啟動(dòng)子活性的一半。
序列表<110> ETH ZrichRIESMEIER，JrgWILLMITZER，Lothar<120> 植物根中基因表達(dá)所用的啟動(dòng)子<130> C 2645 PCT<140><141><160> 13<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 2205<212> DNA<213> 番茄<400> 1aaagttatta acacaacttc catcacatta aagacatcat ttgataacat tcatgtcagc 60atacttatac taaagttgac gggcttcaat ataaaattaa taaggataaa ttttaagaat 120cacatagttt ttaactatga aattacaatc tattcgtctt tagtttgtaa ttacattaat 180accttaaaaa gcaataaaaa tcgattatat taatatgcag cttgaataca ttaaagagta 240tctcagatac attacaatat aaatcgggta aataatatgt agctcggata cattatatta 300ataagtagct tatatacaat aaagaaataa gagattttag aggtttatag aaatagaagg 360gaatattgaa aataaggaaa agaaaggtgt gtatttaagt attttttcca attaagaata 420catttttcac gaaagaggtg ttcaagccaa atgaaagaag attgggccac ccaaaaccca 480ataaaagagt ctaaaaagct gaacgcttta agtcaagagt tcctatttta aaagtttcct 540agtttaaaaa gtttgttagt ttaaaaagtt tcctagttaa agtttttcag ctttcttagt 600ttaatgtttc ctagtttaaa agttttcata aaagtaggat ttaaatcgag gaaaggctca 660aaataatctc tcatctttag gttaagactc aaagtgatcc ttaagttttc acatggagca 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atttttttca taagcccttc 180aatattaatc atttagtgat tgtttaggtg tatttgattt atattgcaga agttttaagc 240tctaagtatg aattttttta atatcggaac ttctaaaata ttttcagaaa attttcaaaa 300taatttgatc tactcaattt ttttccggtg gggttcgata ttcgggaatg aagtaatatc 360tcatacaaca cttttttctc aagactagat catacgggac acaaatttga attattataa 420ttaataacca aaaatatgaa aatatgacat taaaaacaat agcgtctaat tattcccgtt 480ggtatcatta actaatcaaa cccaaaatat tgtcattctt ggtgatgaaa agtatgtatg 540gtactcgcaa gggtacgcaa aataatcgat acaatttgtc taatctgttt gaatttaaaa 600gaagaaaaat aaattgattg ctattgttat aaacatatga ttcctgagag ataaaagaaa 660taaagcgaat cgtagtgaat cattttaatc aaataaaaac aaactcgtag ataaatgttc 720cacaaagata aaatattacg atttttttca taagcccttc aatattcagt gaatcgattt 780cttctatcaa cgttttttca gttgatttgt cacaacggag ttgctcaaag cagcttttat 840atgatttgca agtaaatgca catgagcaat ttatcggcgg gcacccgaag aatagcttac 900ccatttattt ttttaaaaaa agattaagta caataccatg atgtggattg taagttgtgc 960tcaacaagta caaataatta atcgacacca aataatggac agtatttgtt aagcctacac 1020atatctcaac ttttaaatat taattttatc aatttttcac aaccaaaaga aatgaacaaa 1080caacattctt gcaagtcaac aaataatcga ttcaaagttt agaaataggt gagtcaagca 1140aatgtgtatg aatagtttat gacttcccat tatctcaaaa ccaaccttag tggaacagca 1200ttaaccaaaa aacggctgat atgtttggat tatttaattt ctaatttatc aaatcacatg 1260ttagttatgt tatataaagt cctaattcct ccattctaaa acacacaaga aaaagaaaaa 1320caaagatata tctagcctta gaatccaatt cttctcc 1357<210> 4<211> 1121<212> DNA<213> 番茄<400> 4aagctctaag tatgaatttt tttaatatcg gaacttctaa aatattttca gaaaattttc 60aaaataattt gatctactca atttttttcc ggtggggttc gatattcggg aatgaagtaa 120tatctcatac aacacttttt tctcaagact agatcatacg ggacacaaat ttgaattatt 180ataattaata accaaaaata tgaaaatatg acattaaaaa caatagcgtc taattattcc 240cgttggtatc attaactaat caaacccaaa atattgtcat tcttggtgat gaaaagtatg 300tatggtactc gcaagggtac gcaaaataat cgatacaatt tgtctaatct gtttgaattt 360aaaagaagaa aaataaattg attgctattg ttataaacat atgattcctg agagataaaa 420gaaataaagc gaatcgtagt gaatcatttt aatcaaataa aaacaaactc gtagataaat 480gttccacaaa gataaaatat tacgattttt ttcataagcc cttcaatatt cagtgaatcg 540atttcttcta tcaacgtttt ttcagttgat ttgtcacaac ggagttgctc aaagcagctt 600ttatatgatt tgcaagtaaa tgcacatgag caatttatcg gcgggcaccc gaagaatagc 660ttacccattt atttttttaa aaaaagatta agtacaatac catgatgtgg attgtaagtt 720gtgctcaaca agtacaaata attaatcgac accaaataat ggacagtatt tgttaagcct 780acacatatct caacttttaa atattaattt tatcaatttt tcacaaccaa aagaaatgaa 840caaacaacat tcttgcaagt caacaaataa tcgattcaaa gtttagaaat aggtgagtca 900agcaaatgtg tatgaatagt ttatgacttc ccattatctc aaaaccaacc ttagtggaac 960agcattaacc aaaaaacggc tgatatgttt ggattattta atttctaatt tatcaaatca 1020catgttagtt atgttatata aagtcctaat tcctccattc taaaacacac aagaaaaaga 1080aaaacaaaga tatatctagc cttagaatcc aattcttctc c 1121<210> 5<211> 891<212> DNA<213> 番茄<400> 5taattattcc cgttggtatc attaactaat caaacccaaa atattgtcat tcttggtgat 60gaaaagtatg tatggtactc gcaagggtac gcaaaataat cgatacaatt tgtctaatct 120gtttgaattt aaaagaagaa aaataaattg attgctattg ttataaacat atgattcctg 180agagataaaa gaaataaagc gaatcgtagt gaatcatttt aatcaaataa aaacaaactc 240gtagataaat gttccacaaa gataaaatat tacgattttt ttcataagcc cttcaatatt 300cagtgaatcg atttcttcta tcaacgtttt ttcagttgat ttgtcacaac ggagttgctc 360aaagcagctt ttatatgatt tgcaagtaaa tgcacatgag caatttatcg gcgggcaccc 420gaagaatagc ttacccattt atttttttaa aaaaagatta agtacaatac catgatgtgg 480attgtaagtt gtgctcaaca agtacaaata attaatcgac accaaataat ggacagtatt 540tgttaagcct acacatatct caacttttaa atattaattt tatcaatttt tcacaaccaa 600aagaaatgaa caaacaacat tcttgcaagt caacaaataa tcgattcaaa gtttagaaat 660aggtgagtca agcaaatgtg tatgaatagt ttatgacttc ccattatctc aaaaccaacc 720ttagtggaac agcattaacc aaaaaacggc tgatatgttt ggattattta atttctaatt 780tatcaaatca catgttagtt atgttatata aagtcctaat tcctccattc taaaacacac 840aagaaaaaga aaaacaaaga tatatctagc cttagaatcc aattcttctc c 891<210> 6<211> 575<212> DNA<213> 番茄<400> 6tctatcaacg ttttttcagt tgatttgtca caacggagtt gctcaaagca gcttttatat 60gatttgcaag taaatgcaca tgagcaattt atcggcgggc acccgaagaa tagcttaccc 120atttattttt ttaaaaaaag attaagtaca ataccatgat gtggattgta agttgtgctc 180aacaagtaca aataattaat cgacaccaaa taatggacag tatttgttaa gcctacacat 240atctcaactt ttaaatatta attttatcaa tttttcacaa ccaaaagaaa tgaacaaaca 300acattcttgc aagtcaacaa ataatcgatt caaagtttag aaataggtga gtcaagcaaa 360tgtgtatgaa tagtttatga cttcccatta tctcaaaacc aaccttagtg gaacagcatt 420aaccaaaaaa cggctgatat gtttggatta tttaatttct aatttatcaa atcacatgtt 480agttatgtta tataaagtcc taattcctcc attctaaaac acacaagaaa aagaaaaaca 540aagatatatc tagccttaga atccaattct tctcc575<210> 7<211> 1420<212> DNA<213> 番茄<220><221> CDS<222> (256)..(1197)<400> 7taaacaaaga tatatctagc cttagaatcc aattcttctc aatgggaagc caaataaaga 60agcaatggct tcaatttgct tgtcttttga catttttctt gattgccaca tgctctatgg 120catattcacc ttacaattct tatgaatcat cagactcaac atataataaa gtaccaacca 180cagtagtcaa aagtgaagac ttcaaggtac cctcagagtc ggaaaaggaa tataagtcgt 240catttttgcc aaaaa atg att act ata aga agc cat caa ttt cag agg ata 291Met Ile Thr Ile Arg Ser His Gln Phe Gln Arg Ile1 5 10act ata aga aag tat cat ttg ttc ccg aac atg aat cat tcc tgc caa 339Thr Ile Arg Lys Tyr His Leu Phe Pro Asn Met Asn His Ser Cys Gln15 20 25aga atg act act aca aga agc cat tat ttt cgg aag ata act aca aga 387Arg Met Thr Thr Thr Arg Ser His Tyr Phe Arg Lys Ile Thr Thr Arg30 35 40agg agt cat atg ttc aag agg tac cct cga agg cta aac cag aat ata 435Arg Ser His Met Phe Lys Arg Tyr Pro Arg Arg Leu Asn Gln Asn Ile45 50 55 60agg agt cat ttt ttt caa aat ttg act act tca aga agc cat cat ttt 483Arg Ser His Phe Phe Gln Asn Leu Thr Thr Ser Arg Ser His His Phe65 70 75tcg aag aca act aca aga acg acg tca tat gtt cca aag gta ccc tcg 531Ser Lys Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Tyr Val Pro Lys Val Pro Ser80 85 90atg gct aaa cca gaa tat aag gag tca ttt ttt cca aaa ttt gac tac 579Met Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Glu Ser Phe Phe Pro Lys Phe Asp Tyr95 100 105ttt aag aag cca tca gtt tca gaa gat aac tac aag aag acg tca tat 627Phe Lys Lys Pro Ser Val Ser Glu Asp Asn Tyr Lys Lys Thr Ser Tyr110 115 120gtt tca gag gtg ccc tcg atg 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gtg cct aaa gaa gaa tac aag gtg 1011Pro Leu Ile Ser Lys Leu Pro Ser Val Pro Lys Glu Glu Tyr Lys Val240 245 250cct tct ttg tca aaa aaa gac tac tac aag aag cca tta gtt tct gaa 1059Pro Ser Leu Ser Lys Lys Asp Tyr Tyr Lys Lys Pro Leu Val Ser Glu255 260 265gat aac tac aaa aag gtt tca tat gtt cca aag gtg ccc tcc gtg cct 1107Asp Asn Tyr Lys Lys Val Ser Tyr Val Pro Lys Val Pro Ser Val Pro270 275 280aaa gaa gaa tac aag gcc cct tct ttg tca aag aat gac tac tac aag 1155Lys Glu Glu Tyr Lys Ala Pro Ser Leu Ser Lys Asn Asp Tyr Tyr Lys285 290 295 300aag tca tcg cct tct cca tca cca cca cca cct cca tat tat 1197Lys Ser Ser Pro Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr305 310taaatttctt ttcatgttaa gcatggctgt ttaattaaag tccttctcca gctcaacatt 1257tataactcat ggagttctca tattatgagt tagaaggcat gatataaaaa tttgcattta 1317tttatttatt tttccttttc ctaccttggt ttgtaattga tttgtcattt aatttctata 1377ttttgtatga gaaatttatt tcaattgaat acaagttttt tta1420<210> 8<211> 314<212> PRT<213> 番茄<400> 8Met Ile Thr Ile Arg Ser His Gln Phe Gln Arg Ile Thr Ile Arg Lys1 5 10 15Tyr His Leu Phe Pro Asn Met Asn His Ser Cys Gln Arg Met Thr Thr20 25 30Thr Arg Ser His Tyr Phe Arg Lys Ile Thr Thr Arg Arg Ser His Met35 40 45Phe Lys Arg Tyr Pro Arg Arg Leu Asn Gln Asn Ile Arg Ser His Phe50 55 6OPhe Gln Asn Leu Thr Thr Ser Arg Ser His His Phe Ser Lys Thr Thr65 70 75 80Thr Arg Thr Thr Ser Tyr Val Pro Lys Val Pro Ser Met Ala Lys Pro85 90 95Glu Tyr Lys Glu Ser Phe Phe Pro Lys Phe Asp Tyr Phe Lys Lys Pro100 105 110Ser Val Ser Glu Asp Asn Tyr Lys Lys Thr Ser Tyr Val Ser Glu Val115 120 125Pro Ser Met Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Glu Ser Phe Phe Pro Lys Phe130 135 140Asp Tyr Phe Lys Lys Ser Leu Ala Pro Glu Asp Lys Tyr Lys Lys Ala145 150 155 160Pro Tyr Val Pro Glu Val Ser Thr Glu Pro Lys Pro Glu Tyr Lys Val165 170 175Pro Ser Leu Pro Lys Asn Asp Tyr Tyr Lys Lys Pro Thr Ile Pro Glu180 185 190Asp Asn Tyr Lys Lys Val Ser Tyr Val Ser Lys Val Pro Ser Val Pro195 200 205Lys Glu Glu Tyr Lys Ala Pro Thr Leu Pro Lys Asn Asp Tyr Tyr Lys210 215 220Lys Pro Ser Val Gln Glu Glu Asn Tyr Lys Lys Val Pro Leu Ile Ser225 230 235 240Lys Leu Pro Ser Val Pro Lys Glu Glu Tyr Lys Val Pro Ser Leu Ser245 250 255Lys Lys Asp Tyr Tyr Lys Lys Pro Leu Val Ser Glu Asp Asn Tyr Lys
260 265 270Lys Val Ser Tyr Val Pro Lys Val Pro Ser Val Pro Lys Glu Glu Tyr275 280 285Lys Ala Pro Ser Leu Ser Lys Asn Asp Tyr Tyr Lys Lys Ser Ser Pro290 295 300Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr305 310<210> 9<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<220> 人工序列的描述人工的<400> 9gagagtcgac gatatcgggc gaattgggta cc 32<210> 10<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工的<400> 10gagatctaga ggtaccggac tttatataac ataac 35<210> 11<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工的<400> 11gagatctaga ccatggagaa gaattgg 27<210> 12<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工的<400> 12gagagtcgac gggcgaattg ggtaccg27<210> 13<211> 3259<212> DNA<213> 番茄<400> 13ggtaccattg tttctccatc aggccccttt ttcataggaa tagtaggacc atctaagact 60acactcaaga gatcaggatt ttctcctatc agatgatcca tcaagcgatt cttccaccat 120ccatagtatt ttccattgaa caatgggggc cgagtttgag aagctccttc ttggggggta 180ggtggtgctg ccatttaatt ttcaagatgt taatctttta gtgaaaagat cctgctctga 240taccaattga agaaacctta cccctaaatc aagaaccagg ttcttgattg tttgcctaag 300aaaagagtta attaaaacaa tatactttaa ctcaaacctt cctatctcaa cgaaggaaaa 360actcaacttc gttttattac tttttcttac tcaataataa ttttcgatta actctaatcg 420aattctctaa atttacaaaa agccaaaccc acttcttgca aacttactca ctaatctcct 480ctctccacaa gaagccaaac ccacttcttg tttacaatca cacaagctta agatcttact 540aagaacaaag ctcacaagtt aacaaaatac acagaactta gaaaaacgct ctttgctgcc 600tctctctttg tcttacctca ccctttcttt cattgcaaag aactgctctc tttgtcttga 660aatctctgtt tatatagact tttgaacaag agttatttcc tctctttgaa gttgataata 720attagatttc tgtatccttc tttgatatga aaaagaattg ctttcttttt tctgtttata 780cgcaaccttt tttgaaaagg ttttgtcttc atataaagta gacaactttt tcagaaaaga 840ttttatctta tttatttatg gaaataatta ttatattcat ttttttcatc aatacatttg 900tgccttaata tttgtccttc gcctcttttc aattagaacg acaactgctt taataaatga 960gcctggttca taagtgagtc aacatcaaaa gtatttgtca ttatcaatga acctggttca 1020tgattgatga catcaaaagt atttgtcatt ataaaaagtt attaacacaa cttccatcac 1080attaaagaca tcatttgata acattcatgt cagcatactt atactaaagt tgacgggctt 1140caatataaaa ttaataagga taaattttaa gaatcacata gtttttaact atgaaattac 1200aatctattcg tctttagttt gtaattacat taatacctta aaaagcaata aaaatcgatt 1260atattaatat gcagcttgaa tacattaaag agtatctcag atacattaca atataaatcg 1320ggtaaataat atgtagctcg gatacattat attaataagt agcttatata caataaagaa 1380ataagagatt ttagaggttt atagaaatag aagggaatat tgaaaataag gaaaagaaag 1440gtgtgtattt aagtattttt tccaattaag aatacatttt tcacgaaaga ggtgttcaag 1500ccaaatgaaa gaagattggg ccacccaaaa cccaataaaa gagtctaaaa agctgaacgc 1560tttaagtcaa gagttcctat tttaaaagtt tcctagttta aaaagtttgt tagtttaaaa 1620agtttcctag ttaaagtttt tcagctttct tagtttaatg tttcctagtt taaaagtttt 1680cataaaagta ggatttaaat cgaggaaagg ctcaaaataa tctctcatct ttaggttaag 1740actcaaagtg atccttaagt tttcacatgg agcactagta atctatcatg tttgcaatat 1800tggtacactt ttggtcctaa aaaaactcta acatacttca aaaataggta actaagaata 1860atactattga tatattacgc aaaataatcg atacaatttg tctaatctgt ttgaatttaa 1920aagaagaaaa ataaattgat tgttatagtt ataaacatat gattcctgag agataaaaga 1980aacaaaagga atcgtagtga atcattttaa tcaaataaaa agaaaatcga agataaatgt 2040tccacaaaga taaaatatca cgattttttt cataagccct tcaatattaa tcatttagtg 2100attgtttagg tgtatttgat ttatattgca gaagttttaa gctctaagta tgaatttttt 2160taatatcgga acttctaaaa tattttcaga aaattttcaa aataatttga tctactcaat 2220ttttttccgg tggggttcga tattcgggaa tgaagtaata tctcatacaa cacttttttc 2280tcaagactag atcatacggg acacaaattt gaattattat aattaataac caaaaatatg 2340aaaatatgac attaaaaaca atagcgtcta attattcccg ttggtatcat taactaatca 2400aacccaaaat attgtcattc ttggtgatga aaagtatgta tggtactcgc aagggtacgc 2460aaaataatcg atacaatttg tctaatctgt ttgaatttaa aagaagaaaa ataaattgat 2520tgctattgtt ataaacatat gattcctgag agataaaaga aataaagcga atcgtagtga 2580atcattttaa tcaaataaaa acaaactcgt agataaatgt tccacaaaga taaaatatta 2640cgattttttt cataagccct tcaatattca gtgaatcgat ttcttctatc aacgtttttt 2700cagttgattt gtcacaacgg agttgctcaa agcagctttt atatgatttg caagtaaatg 2760cacatgagca atttatcggc gggcacccga agaatagctt acccatttat ttttttaaaa 2820aaagattaag tacaatacca tgatgtggat tgtaagttgt gctcaacaag tacaaataat 2880taatcgacac caaataatgg acagtatttg ttaagcctac acatatctca acttttaaat 2940attaatttta tcaatttttc acaaccaaaa gaaatgaaca aacaacattc ttgcaagtca 3000acaaataatc gattcaaagt ttagaaatag gtgagtcaag caaatgtgta tgaatagttt 3060atgacttccc attatctcaa aaccaacctt agtggaacag cattaaccaa aaaacggctg 3120atatgtttgg attatttaat ttctaattta tcaaatcaca tgttagttat gttatataaa 3180gtcctaattc ctccattcta aaacacacaa gaaaaagaaa aacaaagata tatctagcct 3240tagaatccaa ttcttctca 3259
權(quán)利要求
1.選自下列的啟動(dòng)子a)啟動(dòng)子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的核酸序列；b)啟動(dòng)子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核酸序列的功能性部分，并可導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)；c)啟動(dòng)子，其具有能與SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列之一雜交的序列，并可導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)；d)編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQID No.8所示氨基酸序列具有至少60％同源性，其中這些啟動(dòng)子導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列在植物中的根-特異性表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的啟動(dòng)子，其為植物啟動(dòng)子。
3.表達(dá)盒，其含有根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子。
4.載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子或根據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其適用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
6.宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞被根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子，根據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)盒或根據(jù)權(quán)利要求4或5的載體進(jìn)行了基因工程改造。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其為植物細(xì)胞。
8.毛根，其含有根據(jù)權(quán)利要求7的植物細(xì)胞。
9.植物，其含有根據(jù)權(quán)利要求7的植物細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的植物的繁殖或收獲材料，所述植物含有根據(jù)權(quán)利要求7的植物細(xì)胞。
11.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于用根據(jù)權(quán)利要求4或5的載體，或根據(jù)權(quán)利要求3的表達(dá)盒，或根據(jù)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，組織或部分或原生質(zhì)體，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織，植物部分或原生質(zhì)體，并任選由培養(yǎng)物再生植物。
12.鑒定和分離啟動(dòng)子的方法，所述啟動(dòng)子可導(dǎo)致由其控制的編碼核苷酸序列的根-特異性表達(dá)，所述方法包括下列步驟a)使植物基因組文庫(kù)與編碼伸展蛋白-樣蛋白質(zhì)的cDNA雜交；b)分離陽(yáng)性克??；c)檢測(cè)分離克隆的啟動(dòng)子活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所用cDNA與SEQ ID No.7所示核苷酸序列的部分相同。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子或根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法鑒定的啟動(dòng)子用于在植物中根-特異性地表達(dá)轉(zhuǎn)基因的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了啟動(dòng)子,其導(dǎo)致由所述啟動(dòng)子控制的編碼核苷酸序列的根－特異性表達(dá),本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子的表達(dá)盒,重組載體和微生物。另外,本發(fā)明還描述了轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物,以及生產(chǎn)該轉(zhuǎn)基因植物的方法和分離根－特異性啟動(dòng)子的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1326507SQ99813354
公開(kāi)日2001年12月12日 申請(qǐng)日期1999年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月16日
發(fā)明者約爾格·里斯梅爾, 洛特爾·維爾米策, 瑪塞爾·布赫 申請(qǐng)人:Eth蘇黎世公司, 約爾格·里斯梅爾, 洛特爾·維爾米策