專利名稱：利用改進(jìn)的循環(huán)測序方法進(jìn)行多點(diǎn)基因組分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸分析的方法，其中包括可用于序列分析以及細(xì)胞類型的診斷鑒別，如病理組織鑒定，的方法。
背景技術(shù)：
已知有多種核酸測序的方法。當(dāng)今使用的大多數(shù)DNA測序方法均來源于Sanger的雙脫氧鏈終止法(Sanger，F(xiàn).，S.Nicklen and A.R.Coulson(1977)“用能夠使鏈終止的抑制物對DNA進(jìn)行測序”PNAS USA745463-5467)。這些方法都是在聚合酶的催化下由一種與待測序鏈的一部分互補(bǔ)的標(biāo)記引物引發(fā)復(fù)制。這些方法通常需要進(jìn)行四組聚合酶反應(yīng)，每組使用四種雙脫氧核苷酸(ddNTPs)中的一種與普通的脫氧核苷酸混合。ddNTPs不能與隨后的核苷酸形成磷酸二酯鍵，因此各反應(yīng)混合物中的鏈聚合作用隨機(jī)終止于一種ddNTP，從而產(chǎn)生一系列被標(biāo)記的鏈，這些鏈的長度可表明序列中特定堿基的位置。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳可依據(jù)大小將所得標(biāo)記片段分離。片段在凝膠中的位置可通過對標(biāo)記的檢測來加以確定，例如，放射自顯影方法可用來檢測放射性標(biāo)記的片段。最近對Sanger測序法的一些變化進(jìn)行了修改，使其適于在采用多熒光標(biāo)記及毛細(xì)管凝膠電泳方法的大規(guī)模自動(dòng)測序中使用。
測序前的序列擴(kuò)增可采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR方法的各方面公開于以下美國專利中，在此均引入作為參考Mullis et al.于1987年7月28日發(fā)布的4,683,195和Mullis于1987年7月28日發(fā)布的4,683,202(另外還可參考美國專利號(hào)4,965,188；Saiki et al.，(1988)Science 239487-491；以及Mullis，K.B.et al.(eds.)，1994，“聚合酶鏈反應(yīng)”，Springer Verlag，ISBN 0817637508)。PCR是利用能夠在間插序列的任一端與對立鏈退火的引物來擴(kuò)增該間插序列的。在活性聚合循環(huán)之間要將聚合酶鏈反應(yīng)混合物加熱，以使互補(bǔ)鏈分離。在適當(dāng)條件下，這些循環(huán)可使靶序列擴(kuò)增上百萬倍。然后即可對擴(kuò)增DNA進(jìn)行測序。
核酸擴(kuò)增技術(shù)可有效用于許多種病原體或其它生物的檢測。同樣，將基因組的可變區(qū)擴(kuò)增可用來區(qū)分不同的生物，該方法有時(shí)被稱為DNA指紋法。但是當(dāng)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增時(shí)，由擴(kuò)增反應(yīng)可能會(huì)獲得假陽性結(jié)果。此問題的一種改進(jìn)方法是對單一樣品進(jìn)行多次擴(kuò)增反應(yīng)，這有時(shí)被稱為多重?cái)U(kuò)增法，其實(shí)例公開于Caskey et al.在1996年12月10日發(fā)布的美國專利號(hào)5,582,989、Diamandis et al.在1996年9月3日發(fā)布的美國專利號(hào)5,552,283以及Atwood et al.在1995年4月4日發(fā)布的美國專利號(hào)5,403,707(在此均引入作為參考)。專利號(hào)5,582,989指出，在上文提到的Mullis及Mullis et al的專利中公開的原始PCR方法不適用于同時(shí)發(fā)生的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。美國專利號(hào)5,403,707指出，在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中適合于使用長度非常相似因而解鏈溫度也類似的引物。
為了提供序列信息，可將核酸擴(kuò)增技術(shù)加以修改并與測序反應(yīng)化學(xué)相結(jié)合。這種系統(tǒng)可稱為“循環(huán)測序系統(tǒng)”，該系統(tǒng)通常涉及使用一對與擴(kuò)增引物相似并且能夠在所需序列的任一端與對立鏈退火的引物。對常規(guī)擴(kuò)增反應(yīng)化學(xué)的修改可包括，在反應(yīng)混合物中加入一種鏈終止核苷酸(如一種ddNTP)以使某些引物延伸產(chǎn)物終止于所需序列中出現(xiàn)該核苷酸的位置。但有些引物擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)延伸至對立的引發(fā)位點(diǎn)(opposite priming site)，從而可作為下一輪擴(kuò)增反應(yīng)中引物延伸的模板。在該方法的一種修改方案中，可利用兩種各帶一獨(dú)特標(biāo)記的鏈特異性引物對雙鏈DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行雙向測序。有多種商品形式的試劑盒可以使用，它們可提供適當(dāng)?shù)脑噭┮约袄脽岱€(wěn)定性聚合酶實(shí)現(xiàn)這些反應(yīng)的說明SequiTherm Long-Read循環(huán)測序試劑盒LC(目錄號(hào)S36100LC)，Epicentre Technologies，Madison，Wisconsin，U.S.A.；SequiTherm Excel Long-Read DNA 測序試劑盒LC(目錄號(hào)SE6100LC)，epicentre Technologies，Madison，Wisconsin，U.S.A.；帶有7-deaza-dGTP的熱測序酶熒光標(biāo)記引物循環(huán)測序試劑盒(目錄號(hào)RPN2438)，Amersham Life Science，Cleveland，Ohio，U.S.A.；以及CircumVent熱循環(huán)測序試劑盒(目錄號(hào)430-100)，New EnglandBiolabs，Beverly，Mass，U.S.A。
粘膜疾病(MD)是最常見于牛的一種可引起巨大經(jīng)濟(jì)損失的病毒性疾病。MD的特征為發(fā)熱、流涎、鼻分泌物、腹瀉、厭食、脫水和流產(chǎn)。該疾病是由一種稱為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的RNA病毒引起的。幾種BVDV變體的基因組序列已被了解(Collett，M.S.et al.，1988，“瘟病毒牛腹瀉病毒的分子克隆及核苷酸序列”，Virolgogy165191-199；Pellerin et al.，1994，“伴有重度蔓延及高死亡率的一種牛病毒性腹瀉病毒株新組群的鑒定”，Virolgogy 203260-268)。BVDV屬于瘟病毒家族，它與導(dǎo)致寄生性疾病和豬霍亂的病毒有很多相似之處。BVDV在非致細(xì)胞病變(ncp)及致細(xì)胞病變(cp)的毒株中均存在。ncp毒株可在不造成任何破壞的情況下存活于動(dòng)物組織中，這可作為一種潛在的發(fā)明。cp毒株則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞瓦解和疾病。
作為一種多態(tài)性RNA病毒，BVDV是眾多生物的一個(gè)實(shí)例，針對這些生物需要有可靠的診斷協(xié)議，并且應(yīng)該有高效的多態(tài)性測定技術(shù)，這些多態(tài)性可表明與該生物的不同品系相關(guān)的不同病變。特定病原體的完整或部分核酸序列可作為其進(jìn)化譜系的證據(jù)，可有效確定該進(jìn)化譜系的技術(shù)還將提供有關(guān)該生物的流行病學(xué)信息。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一些方法，用于在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)分析多種核酸區(qū)段。例如，這些方法適于分析由多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)獲得的序列。這些信息可有效地用于可靠的診斷和病理組織的鑒別。這些信息還可用于通過常被稱為“DNA指紋”的方法對個(gè)體進(jìn)行基因組鑒別。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，用于在一種反應(yīng)混合物中對含有第一和第二靶核酸序列的核酸進(jìn)行測序。該靶序列可存在于相同的或不同的核酸分子上。提供的第一和第二標(biāo)記測序引物可分別與第一和第二靶核酸序列雜交。第二測序引物的長度應(yīng)至少與第一測序引物加第一靶序列的總長度相同。該反應(yīng)混合物可含有一種DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸和一種鏈終止脫氧核糖核苷酸，該反應(yīng)的條件需使第一和第二靶序列可通過第一和第二測序引物在聚合酶作用下的分別延伸而復(fù)制。與典型的Sanger測序反應(yīng)相同，鏈終止核苷酸在聚合酶作用下的定期摻入可使聚合作用終止，從而產(chǎn)生長度各異的引物延伸樣品庫。根據(jù)本發(fā)明，該樣品中由第二測序引物開始的各引物延伸產(chǎn)物要長于由第一測序引物開始的引物延伸產(chǎn)物。一旦測序反應(yīng)完成，即可通過已知方法，如凝膠電泳法，對該樣品中引物延伸產(chǎn)物的長度進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的方法經(jīng)過修改可在含有附加靶核酸序列的情況下使用。在此類實(shí)施方案中，需額外提供能夠與附加靶序列雜交的標(biāo)記測序引物。該附加測序引物的長度應(yīng)至少與引物延伸產(chǎn)物樣品庫中最長的序列相同。
這些測序引物可有一種或多種是含有與靶核酸序列不同源的一部分序列的“加尾”測序引物。加尾測序引物的非同源部分可位于其能夠與靶序列雜交的加尾測序引物區(qū)段的5’端。在可選實(shí)施方案中，該測序引物的“加尾”部分可含有非線性DNA分子，如支鏈DNA或枝狀核酸。作為選擇，也可由非DNA形成該測序引物，以使該引物具有適于在本發(fā)明中使用的分子量。
本發(fā)明的方法包括利用一種擴(kuò)增反應(yīng)對第一和第二靶核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。有多種擴(kuò)增反應(yīng)可以使用，其中包括聚合酶鏈反應(yīng)。舉例來說，該擴(kuò)增反應(yīng)可包括，在反應(yīng)混合物中加入各含有互補(bǔ)鏈的第一和第二雙鏈核酸待擴(kuò)增區(qū)段，其互補(bǔ)鏈需具有限定待擴(kuò)增區(qū)段的反向5’端。提供的第一對擴(kuò)增引物之一需能夠與第一待擴(kuò)增區(qū)段的互補(bǔ)鏈的各5’端雜交。第一待擴(kuò)增區(qū)段可包含或等同于將成為本發(fā)明所述測序反應(yīng)的主體的第一靶核酸序列。提供的第二對擴(kuò)增引物之一需能夠與第二待擴(kuò)增區(qū)段的兩條互補(bǔ)鏈的各5’端雜交。第二待擴(kuò)增區(qū)段可包含或等同于將至少被部分測序的第二靶核酸序列。該反應(yīng)混合物可含有一種DNA聚合酶，以及脫氧核糖核苷三磷酸，該反應(yīng)的條件需使第一和第二待擴(kuò)增區(qū)段可通過第一和第二對擴(kuò)增引物在DNA聚合酶作用下的分別延伸而復(fù)制。此后則與典型的聚合酶鏈反應(yīng)相同，即通過該反應(yīng)混合物在第一溫度和第二溫度間的循環(huán)來擴(kuò)增該核酸區(qū)段，其中第一溫度能夠使該待擴(kuò)增區(qū)段的互補(bǔ)鏈解鏈，第二溫度則能夠使擴(kuò)增引物與該待擴(kuò)增區(qū)段的互補(bǔ)鏈5’端退火，并能夠使第一和第二待擴(kuò)增區(qū)段在聚合酶的催化下分別由第一對和第二對擴(kuò)增引物延伸并復(fù)制。
本發(fā)明的測序反應(yīng)和擴(kuò)增反應(yīng)可在一次循環(huán)測序反應(yīng)中結(jié)合使用，其中第一對和第二對擴(kuò)增引物之一分別等同于第一和第二標(biāo)記測序引物。
在一項(xiàng)可選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括在擴(kuò)增過程中使序列延伸的步驟(可稱為“遞升”(step up)擴(kuò)增)。在該實(shí)施方案中，第一對擴(kuò)增引物之一可含有能夠與第一待擴(kuò)增區(qū)段的一條互補(bǔ)鏈的5’端雜交的序列。該遞升擴(kuò)增引物還可含有不能與該互補(bǔ)鏈的5’端雜交的附加序列。這些附加序列可用來在擴(kuò)增過程中使該序列延伸。
本發(fā)明所述在擴(kuò)增過程中使序列延伸的方法包括，在反應(yīng)混合物中加入一種雙鏈核酸待擴(kuò)增區(qū)段。該待擴(kuò)增區(qū)段含有第一和第二互補(bǔ)鏈。該待擴(kuò)增區(qū)段由第一和第二互補(bǔ)鏈的5’端界定。提供的第一擴(kuò)增引物含有與第一互補(bǔ)鏈的5’端互補(bǔ)的序列，并且含有不與第一互補(bǔ)鏈的5’端互補(bǔ)的附加序列。第一擴(kuò)增引物的這些附加序列可位于其靶序列互補(bǔ)序列的5’端。提供的第二擴(kuò)增引物含有與靶序列的第二鏈的5’端互補(bǔ)的序列。該反應(yīng)混合物可含有一種DNA聚合酶，以及脫氧核糖核苷三磷酸，該反應(yīng)的條件應(yīng)適于使擴(kuò)增引物在聚合酶的催化下延伸。通過該反應(yīng)混合物在第一溫度和第二溫度間的循環(huán)可使待擴(kuò)增區(qū)段擴(kuò)增和延伸，其中第一溫度能夠使靶核酸序列的互補(bǔ)鏈解鏈，第二溫度則能夠使擴(kuò)增引物與互補(bǔ)鏈的5’端退火，并能夠使擴(kuò)增引物在聚合酶的催化下延伸。
應(yīng)該了解的是，使序列延伸并擴(kuò)增的方法經(jīng)過修改可使用均帶有附加序列的系列引物，從而可使待擴(kuò)增區(qū)段的大小進(jìn)一步遞升。在上述實(shí)例的基礎(chǔ)上，通過提供一種含有第一擴(kuò)增引物附加序列的互補(bǔ)序列的第三擴(kuò)增引物可使待擴(kuò)增區(qū)段進(jìn)一步擴(kuò)增和延伸。該第三擴(kuò)增引物繼而可進(jìn)一步含有不與第一擴(kuò)增引物或待擴(kuò)增核酸序列互補(bǔ)的“增補(bǔ)”序列。這些增補(bǔ)序列可作為待擴(kuò)增區(qū)段進(jìn)一步延伸的基礎(chǔ)。該增補(bǔ)序列可位于第三擴(kuò)增引物中能夠與第二擴(kuò)增引物的附加序列互補(bǔ)的序列的5’端。
附圖簡述

圖1為多點(diǎn)基因組分析方案的示意圖，顯示對α、β、δ三種基因組區(qū)段的分析。這三種區(qū)段的擴(kuò)增各使用了一對PCR引物，α區(qū)段擴(kuò)增使用引物i和i’，β區(qū)段擴(kuò)增使用引物ii和ii’，δ區(qū)段擴(kuò)增使用引物iii和iii’。在α、β和δ區(qū)段被擴(kuò)增后即可對其進(jìn)行測序。α區(qū)段中A片段的測序使用測序引物a，β區(qū)段中B片段的測序使用測序引物b，δ區(qū)段中D片段的測序使用“加尾”測序引物d。測序引物b的長度大于測序引物a加A片段的總長度。測序引物d的長度大于測序引物b加B片段的總長度。另外還顯示了測序膠10的圖示。
圖2顯示利用引物e和e’以及選擇使用測序終止子t進(jìn)行的雙向測序示意圖。該終止子的Tm應(yīng)高于引物e和e’的Tm。
圖3顯示對F片段進(jìn)行“遞升”擴(kuò)增以用于由測序引物f進(jìn)行測序的示意圖。第一回合擴(kuò)增使用PCR引物v和v’，產(chǎn)生多聚核苷酸F’，第二回合擴(kuò)增使用測序引物vi和v’，產(chǎn)生多聚核苷酸F”，第三回合擴(kuò)增使用PCR引物vii和v’，產(chǎn)生多聚核苷酸F”’發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種對至少含有第一和第二待測區(qū)段的核酸，如DNA或RNA，進(jìn)行測序的方法。該待測區(qū)段可存在于相同的核酸分子(或基因組)上，也可存在于同一樣品中的不同分子上。
選擇的測序引物需能夠在適當(dāng)條件下與待測區(qū)段雜交，即該引物能夠與該區(qū)段的5’端退火以引發(fā)聚合作用。引物的選擇應(yīng)能夠使其在測序反應(yīng)中各產(chǎn)生一組不同的片段。例如，兩種引物中第二種引物的選擇應(yīng)使其長度至少與第一測序引物加第一待測區(qū)段的總長度相同。因此，由第二種引物起始的測序反應(yīng)產(chǎn)物將始終長于由第一種測序引物起始的測序反應(yīng)產(chǎn)物。
該測序反應(yīng)可通過在存在聚合酶、核苷酸和一種鏈終止核苷酸的情況下將測序引物與待測核酸相混合的已知方法來實(shí)現(xiàn)。采用的條件應(yīng)能夠使所需區(qū)段在聚合酶作用下由測序引物起始并復(fù)制。鏈終止核苷酸的定期摻入可使聚合作用終止，從而產(chǎn)生長度各異的一組序列樣品。在選擇適當(dāng)長度的引物方面，必須使該樣品中起始于一種引物的各序列的長度不同于由另一引物起始的序列的長度。某些實(shí)施方案中選定的適當(dāng)條件適合于使用優(yōu)選長度為10-600堿基對(bp)的測序引物，更優(yōu)選的則為16-500bp。舉例來說，當(dāng)使用兩種引物并且第二引物的長度大于第一引物加上由第一引物測定的第一區(qū)段的總長度時(shí)，由第二引物產(chǎn)生的所有序列的長度都將大于該樣品中由第一引物起始的序列的長度。圖1中的測序膠10圖示說明了測序反應(yīng)產(chǎn)物的這種長度差異。用長度大于由其它任何引物進(jìn)行的測序反應(yīng)中的產(chǎn)物的引物當(dāng)然可對附加區(qū)段進(jìn)行類似的測序。
通過對待測核酸的特定長度的選擇可限定測序反應(yīng)產(chǎn)物的長度。舉例來說，對特定長度的限制性片段(可利用已知技術(shù)進(jìn)行亞克隆)或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序可產(chǎn)生一組長度各異的測序反應(yīng)產(chǎn)物樣品，其長度的最小值為測序引物的長度，最大值為待測核酸片段的長度。
作為選擇，也可利用含有一種能與待測區(qū)段3’端雜交的寡聚核苷酸的測序終止子來限定測序反應(yīng)產(chǎn)物的長度，其中該測序終止子帶有一種不會(huì)啟動(dòng)聚合作用的3’末端，如3’端ddNTP。圖2說明了選擇使用測序終止子t來限定由測序引物e延伸的測序反應(yīng)產(chǎn)物長度的實(shí)例。終止子t可以是，例如，帶有3’雙脫氧核苷酸的一種多聚核苷酸，或3’端不能進(jìn)一步延伸的任何其它核苷酸或部分。
事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明所述使用加長的測序引物可提高由測序反應(yīng)產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的分子量，由一個(gè)引物產(chǎn)生的測序反應(yīng)產(chǎn)物不同于另一個(gè)引物產(chǎn)生的測序反應(yīng)產(chǎn)物。在可選實(shí)施方案中，也可使用帶有其它化學(xué)修飾的測序引物來類似地改變測序引物延伸產(chǎn)物的分子量，以使這些引物延伸產(chǎn)物能夠被區(qū)分開來?？蛇x修飾包括使用已知類型的非線性DNA分子，如支鏈DNA或枝狀核酸。有關(guān)支鏈DNA技術(shù)的描述可參考，例如Cao Y，et al，1995，“用于人血漿中1型HIV定量的支鏈DNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)的臨床評(píng)價(jià)”，AIDS研究與人逆轉(zhuǎn)錄病毒11(3)353-361；Collins M.L.et al.，1995，“用于支鏈DNA雜交定量測定的RNA標(biāo)準(zhǔn)的制備及其特性”，Analytical Biochemistry226(1)120-129；Dewar R.et al.，1994，“利用支鏈DNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)來監(jiān)測人血漿中的I型人免疫缺陷病毒”，Journal of InfectiousDiseases 1701172-1179。枝狀核酸為高度分支的分子，其創(chuàng)建可通過單鏈核酸的受控雜交和交連來實(shí)現(xiàn)，有關(guān)這方面的描述可參考Nilsen，T.W.et al.，1997，“枝狀核酸結(jié)構(gòu)”，J.Theor.Biol.187(2)273-84。一種可選方法是用亞磷酰胺對引物進(jìn)行修飾，以適當(dāng)增加其分子量。這些對測序引物的可選化學(xué)修飾方法經(jīng)過修改可使測序反應(yīng)產(chǎn)物的表現(xiàn)分子量發(fā)生改變，使得開始于一種引物的所有片段與開始于另一種引物的測序反應(yīng)產(chǎn)物在表觀分子量上有所不同。
因此，提供的測序引物除應(yīng)滿足第一和第二測序引物可分別與第一和第二靶序列雜交，以便對該靶序列進(jìn)行分析之外，還應(yīng)滿足“第二”引物在凝膠電泳上的表觀分子量至少等于延伸的“第一”測序引物，即延伸并包含了第一靶序列的第一測序引物，的表觀分子量。
對測序反應(yīng)產(chǎn)物的分析可采用已知的測序技術(shù)，如根據(jù)長度將樣品中的序列分離，并檢測該樣品中序列的長度。由放射性標(biāo)記測序引物產(chǎn)生序列，然后在聚丙烯酰胺凝膠上分離，再進(jìn)行放射自顯影的方法即屬于此類技術(shù)?？蛇x方法還包括，將熒光標(biāo)記的測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管凝膠電泳分離后進(jìn)行檢測。
作為一個(gè)方面，本發(fā)明的測序反應(yīng)可以只使用一種鏈終止核苷酸。在該實(shí)施方案中，只能獲得所需區(qū)段的四種核苷酸中的一種核苷酸序列信息。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于只需進(jìn)行一次測序反應(yīng)，其結(jié)果也可由單次檢測過程，如聚丙烯酰胺測序凝膠上的單一泳道，來加以測定。這種技術(shù)特別適用于已知區(qū)段的常規(guī)序列，并希望測定所需樣品中包含的該區(qū)段是否與該已知序列相符的情況。例如，為了排除發(fā)生假陽性擴(kuò)增反應(yīng)的可能性，需要對擴(kuò)增反應(yīng)正確擴(kuò)增了靶序列的結(jié)果加以證實(shí)。部分序列信息也可用來區(qū)分特定機(jī)體的亞類。舉例來說，諸如病毒等病原體的不同變異體或與疾病或疾病易感性相關(guān)的等位基因可通過部分測序來加以區(qū)分。
在一項(xiàng)可選實(shí)施方案中，可如圖2所示對所需區(qū)段進(jìn)行雙向測序。圖2顯示的雙向測序引物e和e’標(biāo)定出待測區(qū)段E。在本發(fā)明的一項(xiàng)派生方案中，當(dāng)使用了諸如能在不同波長下吸收或發(fā)射的熒光標(biāo)記引物等可辨別標(biāo)記進(jìn)行雙向測序反應(yīng)時(shí)，則可利用測序凝膠上的單一泳道對兩次雙向測序反應(yīng)的測序反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳。根據(jù)本項(xiàng)發(fā)明，這些技術(shù)可應(yīng)用于多種所需區(qū)段。
作為本發(fā)明的一個(gè)方面，待測區(qū)段可首先被擴(kuò)增。待測區(qū)段的擴(kuò)增可采用，例如，聚合酶鏈反應(yīng)方法。待測區(qū)段可含有全部的或只含部分的擴(kuò)增序列。若只有部分?jǐn)U增區(qū)段要測序，那么測序引物將嵌套在擴(kuò)增區(qū)段范圍內(nèi)。若整個(gè)擴(kuò)增區(qū)段都要測序，那么測序引物可選自擴(kuò)增引物，每個(gè)擴(kuò)增區(qū)段選擇一種測序引物。圖1的示意圖說明了本發(fā)明該方面的多點(diǎn)基因組分析協(xié)議，該圖顯示了對α、β、δ三種基因組區(qū)段的分析。在該實(shí)施方案中，這三種區(qū)段的擴(kuò)增各使用一對PCR引物α區(qū)段擴(kuò)增使用引物i和i’，β區(qū)段擴(kuò)增使用引物ii和ii’，δ區(qū)段擴(kuò)增使用引物iii和iii’。在α、β和δ區(qū)段被擴(kuò)增后即可對其進(jìn)行測序。在該說明性實(shí)施方案中，α區(qū)段中A片段的測序使用測序引物a，β區(qū)段中B片段的測序使用測序引物b，δ區(qū)段中D片段的測序使用“加尾”測序引物d。如圖1的公式“b＞a＋A”所示，測序引物b的長度大于測序引物a加A片段的總長度。與此類似，如圖1的公式“d＞b＋B”所示，測序引物d的長度大于測序引物b加B片段的總長度。另外還顯示了測序膠10的圖示，a與a＋A之間的帶為α區(qū)段測序產(chǎn)生的片段，b與b＋B之間的帶為β區(qū)段測序產(chǎn)生的片段，d與d＋D之間的帶為δ區(qū)段測序產(chǎn)生的片段。
有關(guān)PCR實(shí)施方法的描述可見，例如，Innis et al.(eds)1995“PCR策略”，Academic Press，Inc.San Diego；及Erlich(ed)，1992，“PCR技術(shù)”，Oxford University Press，New York，它們均在此引入作為參考。常規(guī)PCR擴(kuò)增可在緩沖水溶液中進(jìn)行，溶液的優(yōu)選pH為7-9，最優(yōu)選的約為8。加入適量(與靶序列的適當(dāng)摩爾比)的引物對。再將過量的脫氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP加入合成混合物，并將所得溶液加熱至約85℃-100℃，保持約1-10分鐘，優(yōu)選的為1-4分鐘。然后將該溶液冷卻，一般冷卻至約20℃-40℃，即適于引物雜交的溫度。在冷卻的混合物中引發(fā)聚合作用，一般是通過加入酶，如DNA聚合酶，來實(shí)現(xiàn)。在特定實(shí)施方案中，可用于此的適當(dāng)?shù)拿赴?，例如，E.coli DNA聚合酶I、E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶或其它DM聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或其它酶，其中包括可促進(jìn)脫氧核糖核苷三磷酸以適當(dāng)方式結(jié)合從而形成與各核酸鏈模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的熱穩(wěn)定酶。該合成通常起始于引物的3’端，并沿模板鏈持續(xù)進(jìn)行，直至合成終止。新合成的互補(bǔ)鏈可作為模板用于隨后的擴(kuò)增步驟。下一步，如上文所述將互補(bǔ)鏈分離，并作為可與引物雜交的單鏈分子用于鏈的延伸。鏈的分離和延伸步驟可根據(jù)需要屢次重復(fù)，以產(chǎn)生預(yù)期量的靶核酸序列。由此可以使產(chǎn)生的靶核酸序列的量呈指數(shù)累加。
適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增條件可由本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)已知技術(shù)來建立。例如，在某些實(shí)施方案中，適當(dāng)?shù)臈l件包括0.2mM dNTP、2.2mMMgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl pH9.0、0.1％Triton X-100。
利用該領(lǐng)域的已知標(biāo)準(zhǔn)，如上述有關(guān)常規(guī)擴(kuò)增的參考文獻(xiàn)中擬定的標(biāo)準(zhǔn)，可選定適用于本發(fā)明所述特定分析方法的擴(kuò)增引物。就PCR擴(kuò)增而言，設(shè)計(jì)的引物一般應(yīng)使各引物沿雙鏈靶序列的雜交位置能夠使一種引物合成的延伸產(chǎn)物在與模板分離后可作為另一種引物延伸的模板。擴(kuò)增引物的長度一般約為10-30個(gè)核苷酸，更常見的約為14-24個(gè)核苷酸。但在本發(fā)明的“循環(huán)測序”反應(yīng)和“遞升”擴(kuò)增反應(yīng)中，優(yōu)選的是使用更長的引物。
也可根據(jù)本發(fā)明的不同方面使用替代的序列擴(kuò)增方法。例如，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可由以下技術(shù)修改出適當(dāng)?shù)姆椒ㄦ溨脫Q擴(kuò)增法(可參考，例如，Persing et al.(eds)“診斷分子微生物學(xué)原理及應(yīng)用”，American Society for Microbiology，Washington，D.C.)；連接酶鏈反應(yīng)法(可參考，例如，Wu(1989)Genomics 4560或Landegrin(1988)Science 2411077或Barringer(1990)Gene 89117)；基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法(可參考，例如，Kwoh Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，861173(1989))；自動(dòng)維持序列擴(kuò)增法(參考Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，971874)；Q Beta復(fù)制酶擴(kuò)增法；或其它使用RNA聚合酶的技術(shù)(如NASBA，Cangene Corporation，Mississauga，Ontario)。有助于該領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明所述方法的可選參考文獻(xiàn)如下Berger and Kimmel，“分子克隆技術(shù)指南”，Methods in Enzymology 152307-316，Academic Press，Inc.，SanDiego，California U.S.A；Sambrook et al.(1989)“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊”(第二版)Vol.1-3，Cold Spring Harbour Laboratory，ColdSpring Harbour Press，New York。
由生物資源分離出用于本發(fā)明所述分析方法的核酸可通過多種已知方法或其等效方法或改進(jìn)方法中的任意方法來實(shí)現(xiàn)。如Rothbart etal.(1989)，“PCR技術(shù)”，Stockton Press，New York和Han et al.(1987)Biochemistry 261617-1625中描述的方法。也可根據(jù)廠商說明利用商品形式的試劑盒來方便地實(shí)現(xiàn)此目的，例如可由以下廠商購得的試劑盒Invitrogen，San Diego，California U.S.A.；Stratagene，La Jolla，California U.S.A.。
在如圖3所示的可選實(shí)施方案中，本發(fā)明采用“遞升”擴(kuò)增協(xié)議來增加要進(jìn)行序列分析的區(qū)段的長度。該“遞升”擴(kuò)增法可通過如1PCR、2PCR和3PCR所示的逐次反復(fù)擴(kuò)增來產(chǎn)生圖3中顯示為s和s’的一種合成區(qū)段，該區(qū)段可位于圖3中顯示為F、F’、F”和F”’的所需基因組區(qū)段的一端(如圖所示)或兩端(未顯示)。圖3以線性表示法用一條直線來簡單顯示待擴(kuò)增分子，事實(shí)上，擴(kuò)增底物一般為雙鏈分子，這與常規(guī)PCR反應(yīng)中的情況相同。如圖3所示，第一回合擴(kuò)增使用PCR引物v和v’，產(chǎn)生含有F’區(qū)段的多聚核苷酸。第二回合擴(kuò)增(在圖3中顯示為2PCR)使用測序引物vi和v’，產(chǎn)生含有F”區(qū)段和新合成的s區(qū)段的多聚核苷酸，其中s區(qū)段相當(dāng)于vi引物中不與F’區(qū)段互補(bǔ)的區(qū)段。第三回合擴(kuò)增，3PCR，使用PCR引物vii和v’，產(chǎn)生含有F”’區(qū)段和合成的s’區(qū)段的多聚核苷酸，其中s’區(qū)段含有與擴(kuò)增引物vi和vii互補(bǔ)的區(qū)段。該遞升擴(kuò)增法可如圖3所示用來在所需區(qū)段的一端創(chuàng)建合成區(qū)段，也可將圖3所示方法經(jīng)適當(dāng)修改后用來在所需區(qū)段的兩端創(chuàng)建合成區(qū)段。利用遞升擴(kuò)增法產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)用來與測序引物f雜交的合成區(qū)段s的方法可作為使用“加尾”測序引物，如d，的替代方法，也可在不了解所需區(qū)段5’或3’端，如圖3中F的5’端，的基因組區(qū)段序列的情況下使用。在區(qū)段兩端進(jìn)行遞升擴(kuò)增有利于使用Tms連續(xù)增加的擴(kuò)增引物對。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，利用以下引物組可對BVDV基因組的一部分(BVDV基因組的6941-7255序列)進(jìn)行遞升擴(kuò)增。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，將引物組3的一種引物作為標(biāo)記測序引物可進(jìn)行“循環(huán)測序”(擴(kuò)增反應(yīng)和測序反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，即在存在一種ddNTP和一種標(biāo)記引物的情況下進(jìn)行擴(kuò)增)。
引物組15’-GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3’(與BVDV基因組的6941-6961序列互補(bǔ)，并且與圖3中的擴(kuò)增引物v類似)5’-CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3’(與BVDV基因組的7255-7245序列互補(bǔ))引物組25’-(dG)30GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3’(與圖3中的擴(kuò)增引物vi類似)5’-(dG)30CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3’引物組35’-(dA)30(dG)30GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3’(與圖3中的擴(kuò)增引物vii類似)5’-(dA)30(dG)30CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3’作為本發(fā)明的另一方面，遞升擴(kuò)增引物的選擇應(yīng)能夠使各連續(xù)擴(kuò)增所用引物的解鏈溫度高于前一擴(kuò)增所用引物的解鏈溫度。Tm最低的引物對可首先加入，然后再順序加入Tms較高的引物對。由此，各延伸反應(yīng)可在足夠高的溫度下進(jìn)行，以防止前一擴(kuò)增反應(yīng)使用的引物退火。這樣可以使遞升擴(kuò)增反應(yīng)在無需插入自前一擴(kuò)增反應(yīng)中去除擴(kuò)增引物這一步驟的情況下連續(xù)進(jìn)行，同時(shí)也有助于確保每一步擴(kuò)增只發(fā)生于最近加入的擴(kuò)增引物。例如在圖3中，引物的解鏈溫度應(yīng)符合v＜vi＜vii的順序。
在另一項(xiàng)可選實(shí)施方案中，可在第二引物及后隨引物被融點(diǎn)漸增物質(zhì)，如蠟，封裝的情況下將各連續(xù)遞升擴(kuò)增引物于一開始即加入擴(kuò)增反應(yīng)。由此，當(dāng)需要釋放下一種引物時(shí)，可將反應(yīng)混合物升高到可使引物釋放的下一較高溫度。該方法無需在擴(kuò)增過程中將引物逐次加入反應(yīng)混合物。
作為一個(gè)方面，本發(fā)明的一種或多種測序引物可含有不與使用該引物的待測區(qū)段同源的區(qū)段。此類引物可被稱為“加尾”測序引物。如圖1的測序引物d所示，加尾引物的非同源區(qū)段可位于該引物的5’端，因此，為了引發(fā)聚合作用，該引物的同源3’端可與所需區(qū)段退火。在可選實(shí)施方案中，該加尾引物的非同源部分可位于與所需區(qū)段同源的3’端和同樣與所需區(qū)段同源的5’端區(qū)域之間。非同源序列在“加尾”引物中的任何排列方式均可接受(因此其必然具有的錯(cuò)配片段可能并不形成一種字面上的“尾巴”)，前提是該引物仍能夠引發(fā)所需區(qū)段的聚合作用。加尾引物中非同源序列的存在將影響其解鏈溫度，從而會(huì)影響由該領(lǐng)域已知的測序引物雜交參數(shù)確定的實(shí)施測序反應(yīng)的條件。
本發(fā)明的測序方法可有效地與核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合使用，以減少擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。例如，可利用PCR(對于RNA病毒可先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，即以一種RNA分子為模板并以一種寡核苷酸為引物產(chǎn)生cDNA拷貝，其縮寫為“RT PCR”)來檢測諸如病毒核酸等樣品中的靶核酸序列存在情況。該方法的公認(rèn)優(yōu)點(diǎn)是能夠檢測極少量的靶核酸。但如果非目的核酸被錯(cuò)誤地?cái)U(kuò)增，那么該擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。通過對所需核酸的一個(gè)以上的目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增可增加擴(kuò)增測定的可靠性，這種方法被稱為多重PCR。但如果發(fā)生對一個(gè)以上區(qū)段的非特異性擴(kuò)增，那么仍會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本發(fā)明的測序方法可通過提供被擴(kuò)增區(qū)段的部分或完整序列而被用來檢測此類假陽性結(jié)果的發(fā)生情況。因此，本發(fā)明的測序方法特別適用于利用單次測序反應(yīng)對至少兩種非同源區(qū)段同時(shí)進(jìn)行測序。
由本發(fā)明所述方法產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)可用來提供有關(guān)生物亞型的信息。舉例來說，陽性擴(kuò)增反應(yīng)可表明樣品中存在來自該生物的靶核酸，而該檢測的可靠性可通過本發(fā)明的測序方法來加以證實(shí)。由此產(chǎn)生的序列信息可隨目標(biāo)生物的不同亞型而有所不同。例如，病毒核酸經(jīng)常隨毒株的不同而表現(xiàn)出明顯的可變性，尤其是諸如HIV等RNA病毒。通過選擇與該生物所有毒株的普遍保守序列同源的擴(kuò)增引物可對其眾多毒株進(jìn)行檢測。然后可通過評(píng)定根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)來測定毒株間的差異。
實(shí)施例1該實(shí)施例公開的是本發(fā)明可用來檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的方面。該實(shí)施例的方法經(jīng)過修改可用來檢測和鑒別來自其它生物，如其它RNA病毒，的核酸。
該實(shí)施例的序列分析采用了一種雙染料系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用兩種激光來檢測其測序反應(yīng)的標(biāo)記產(chǎn)物。一種激光在700nm波長下激發(fā)，另一種在800nm波長下激發(fā)。測序反應(yīng)的引物用兩種不同的近紅外熒光染料(如購于LI-COR，Inc.of Lincoln，Nebraska，U.S.A.的染料)進(jìn)行標(biāo)記，一種染料可對700nm激光的照射起反應(yīng)，記為IRD700，另一種染料可對800nm激光起反應(yīng)，記為IRD800。利用該系統(tǒng)可將不同測序反應(yīng)產(chǎn)生的分子大小相同但各自被不同染料標(biāo)記的兩種不同的DNA片段通過其在可選波長的激光照射下的發(fā)射來加以區(qū)分。在電泳過程中可利用熒光掃描顯微鏡來自動(dòng)檢測染料標(biāo)記的DNA片段。該實(shí)施例中使用的兩組引物為引物組1[IRD700標(biāo)記的]5’GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG(可在6941-6961位置與BVDV基因組的第一鏈雜交)[IRD800標(biāo)記的]5’CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC(可在7255-7245位置與BVDV基因組的互補(bǔ)鏈雜交)引物組1可擴(kuò)增一種314個(gè)堿基對的區(qū)段，即第6941-7255位的區(qū)段。
引物組2[IRD700標(biāo)記的]5’(dG)300AGG CTA GCC ATG CCC TTA GT
(可在99-118位置與BVDV基因組雜交)[IRD800標(biāo)記的]5’(dG)300TCT GCA GCA CCC TAT CAG G(可在324-342位置與BVDV基因組的互補(bǔ)鏈雜交)引物組2可擴(kuò)增一種243個(gè)堿基對的區(qū)段，即第99-342位的區(qū)段，以及兩端各300bp的一段合成序列，整個(gè)片段的總長度為843。
在該實(shí)施例中，基因組分析的實(shí)施方法如下1.總RNA制備總RNA提取采用的是TRIZOLTM試劑以及其廠商，LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，Maryland，U.S.A.，推薦的該試劑的使用方法。作為選擇，也可使用該領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的任何適當(dāng)方法來制備總RNA(一種可選試劑盒為購于Stratagene Corp.of LaJolla，CA，USA的RNA分離試劑盒；也可參考Chomczynski，et al.(1987)Analytical Biochemistry 162，156.“利用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提方法單步法分離RNA”)。一項(xiàng)實(shí)施方案采用的方法如下a.在750μl Trizol試劑中加入250μl細(xì)胞懸浮液b.室溫下放置5分鐘c.加入200μl氯仿，充分混合15秒d.混合物在12800rpm和4℃條件下離心10分鐘e.將上層的水性部分轉(zhuǎn)移到新的1.5ml Eppendorf管中。
f.加入500μl異丙醇，混勻g.室溫下放置5分鐘h.混合物在12800rpm和4℃條件下離心10分鐘i.棄上清，再加入200μl 85％乙醇j.混合物在12800rpm和4℃條件下離心10分鐘k.棄上清，并將管空氣干燥1.將總RNA懸浮于20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中。
2.cDNA制備可根據(jù)該領(lǐng)域已知的方法由分離的RNA制備出cDNA。一種實(shí)施方案如下a.在1.5ml離心管中將以下試劑混合總RNA 1-2μl；下游引物(10pM/ml)2μl；
水8μlb.將混合物加熱至70℃，保持10分鐘；c.在加熱的混合物中加入以下試劑5×第一鏈合成緩沖液4μl；dNTP(10mM)1μl；0.1M DTT 2μl；d.將混合物加熱至42℃，保持2分鐘；e.在上述混合物中加入1μl SUPERSCRIFT II(一種購于LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，Maryland，U.S.A.的逆轉(zhuǎn)錄酶)；f.42℃保溫50分鐘；g.加熱至70℃并保持10分鐘，以終止反應(yīng)。
3.特定區(qū)段的擴(kuò)增cDNA擴(kuò)增的實(shí)施可采用該領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的任何適當(dāng)方法。在該實(shí)施例的實(shí)施方案中，使用的方法如下利用該實(shí)施例指定的引物對，在GeneAmpTM2400熱循環(huán)儀上根據(jù)其廠商，Perkin-Elmer Corporation，指定的方法由2μl逆轉(zhuǎn)錄混合物擴(kuò)增出該cDNA的兩種區(qū)段a.在下列25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行反應(yīng)dH2O 16.0μl模板 2.0μlb.將混合物加熱至95℃，保持10分鐘c.制備如下標(biāo)準(zhǔn)混合物引物1(10pmol/μl)5μl引物2(10pmol/μl)5μldNTP(10mM) 2.5μl10×緩沖液 2.5μlMgCl225mM 7.5μlTaq 5U/μl 2.5μl加入7.0μl標(biāo)準(zhǔn)混合物d.PCR可根據(jù)廠商說明在GeneAmpTM2400熱循環(huán)儀(Perkin-ElmerCorporation)上進(jìn)行。
4.PCR產(chǎn)物的純化從未反應(yīng)引物中分離擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可任意選擇，如選擇凝膠過濾方法。在該實(shí)施例中，擴(kuò)增物的純化采用的是SephadexTMG-50凝膠過濾填料(購于Sigma Chemical，St.Louis，MO，USA)。也可使用該領(lǐng)域所了解的其它方法來純化擴(kuò)增產(chǎn)物，也可將該步驟省略。
5.測序用于雙向多點(diǎn)循環(huán)測序的(熒光)標(biāo)記引物組1和2可用來對擴(kuò)增片段進(jìn)行循環(huán)測序。在每組引物中，一種引物用可在700nm下吸收的熒光染料標(biāo)記，另一種引物用可在800nm下吸收的熒光染料標(biāo)記。在該實(shí)施方案中只使用一種雙脫氧核苷酸(單道測序)。作為選擇，也可制備4管，每管加入四種可能的雙脫氧核苷酸中的一種，這樣就可獲得完整序列。
用自動(dòng)測序儀(LI-COR Inc.，Lincoln，NE，USA)以1500伏電壓在0.25mm厚的6％聚丙烯酰胺凝膠上分離循環(huán)測序產(chǎn)物。
單道序列的分析可使用適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)軟件，并將其與BVDV DNA亞型數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。這種分析方法可用來鑒定該樣品中的BVDV亞型。
實(shí)施例2該實(shí)施例提供的是利用不同分子量的引物和不同的熒光標(biāo)記對BVDV基因組的四種區(qū)段進(jìn)行分析。該實(shí)施方案是利用實(shí)施例1所述的雙染料測序系統(tǒng)來分辨由引物組1和2產(chǎn)生的共遷移測序反應(yīng)產(chǎn)物，以及分辨由引物組3和4產(chǎn)生的共遷移測序反應(yīng)產(chǎn)物，而引物組1和2的延伸產(chǎn)物是通過分子量與引物組3和4的延伸產(chǎn)物區(qū)分開來。該實(shí)施例使用的引物如下引物組1[IRD700標(biāo)記的]5’GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG(可在6941-6961位置與BVDV基因組的第一鏈雜交)[未標(biāo)記的]5’CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC(可在7255-7245位置與BVDV基因組的互補(bǔ)鏈雜交)引物組1可擴(kuò)增一種314個(gè)堿基對的區(qū)段，即第6941-7255位的區(qū)段。
引物組2[IRD800標(biāo)記的]5’AGG CTA GCC ATG CCC TTA GT(可在99-118位置與BVDV基因組雜交)[未標(biāo)記的]5’TCT GCA GCA CCC TAT CAG G
(可在7255-7245位置與BVDV基因組的互補(bǔ)鏈雜交)引物組2可擴(kuò)增一種243個(gè)堿基對的區(qū)段，即第99-342位的區(qū)段。
加尾引物組3[IRD700標(biāo)記的]5’(dG)300GCA GAT TTT GAA GAA AGA CA(可在4937-4960位置與BVDV基因組雜交)[未標(biāo)記的]5’(dG)300TTG GTG TGT GTA AGC CCA(可在5591-5609位置與BVDV基因組的互補(bǔ)鏈雜交)加尾引物組4[IRD800標(biāo)記的]5’(dG)300ACG TGG ACG AGG GCA TGC CC(可在234-253位置與BVDV基因組雜交)[未標(biāo)記的]5’(dG)300TGT GCC ATG TAC AGC AGA GA(可在365-384位置與BVDV基因組的互補(bǔ)鏈雜交)基因組分析的實(shí)施可采用與實(shí)施例1公開的類似方法一致的已知方法，或其已知的可選方法。
盡管文中公開了本發(fā)明的多種實(shí)施方案，但根據(jù)該領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)知識(shí)可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行多種修改和更正。這些修改包括能夠以基本相同的方式獲得相同結(jié)果的與本發(fā)明各方面等效的替代方案。
權(quán)利要求
1.一種核酸測序方法，該方法包括a.在一種反應(yīng)混合物中加入第一和第二靶核酸序列；b.在該反應(yīng)混合物中加入可分別與第一和第二靶核酸序列雜交的第一和第二標(biāo)記測序引物，第二測序引物的長度至少與第一測序引物加第一靶序列的總長度相同；c.在該反應(yīng)混合物中加入一種DNA聚合酶、脫氧核糖核苷和一種鏈終止脫氧核糖核苷酸，并置于使第一和第二靶序列可通過第一和第二測序引物在聚合酶作用下的分別延伸而復(fù)制的條件下，其中，鏈終止核苷酸在聚合酶作用下的定期摻入可使聚合作用終止，從而產(chǎn)生長度各異的一組引物延伸產(chǎn)物樣品庫，該樣品庫中由第二測序引物開始的各引物延伸產(chǎn)物要長于由第一測序引物開始的引物延伸產(chǎn)物；以及d.檢測該樣品庫中引物延伸產(chǎn)物的長度。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括利用一種擴(kuò)增反應(yīng)對第一和第二靶核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的擴(kuò)增反應(yīng)為聚合酶鏈反應(yīng)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中的擴(kuò)增反應(yīng)包括a.在該反應(yīng)混合物中加入各含有互補(bǔ)鏈的第一和第二雙鏈核酸待擴(kuò)增區(qū)段，其互補(bǔ)鏈需具有界定待擴(kuò)增區(qū)段的反向5’端；b.在該反應(yīng)混合物中加入第一對擴(kuò)增引物，第一對擴(kuò)增引物之一需能夠與第一待擴(kuò)增區(qū)段的兩條互補(bǔ)鏈的各5’端雜交，第一待擴(kuò)增區(qū)段包含有第一靶核酸序列；c.在該反應(yīng)混合物中加入第二對擴(kuò)增引物，第二對擴(kuò)增引物之一需能夠與第二待擴(kuò)增區(qū)段的兩條互補(bǔ)鏈的各5’端雜交，第二待擴(kuò)增區(qū)段包含有第二靶核酸序列；d.在該反應(yīng)混合物中加入一種DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸，并置于使第一和第二待擴(kuò)增區(qū)段可通過第一和第二對擴(kuò)增引物在DNA聚合酶作用下的分別延伸而復(fù)制的條件下；e.通過該反應(yīng)混合物在第一溫度和第二溫度間的循環(huán)來擴(kuò)增該核酸區(qū)段，其中第一溫度能夠使該待擴(kuò)增區(qū)段的互補(bǔ)鏈解鏈，第二溫度能夠使擴(kuò)增引物與該待擴(kuò)增區(qū)段的互補(bǔ)鏈5’端退火，并能夠使第一和第二待擴(kuò)增區(qū)段在聚合酶的催化下分別由第一對和第二對擴(kuò)增引物延伸并復(fù)制。
5.權(quán)利要求4的方法，該方法進(jìn)一步包括一種循環(huán)測序反應(yīng)，其中第一對和第二對擴(kuò)增引物之一分別等同于第一和第二標(biāo)記測序引物。
6.權(quán)利要求4的方法，該方法進(jìn)一步包括在擴(kuò)增過程中使序列延伸的步驟，其中第一對擴(kuò)增引物之一包含有能夠與第一待擴(kuò)增區(qū)段的一條互補(bǔ)鏈的5’端雜交的序列，以及不能與該互補(bǔ)鏈的5’端雜交的附加序列。
7.一種在在擴(kuò)增過程中使序列延伸的方法，該方法包括a.在該反應(yīng)混合物中加入一種雙鏈核酸待擴(kuò)增區(qū)段，該待擴(kuò)增區(qū)段含有第一和第二互補(bǔ)鏈，該待擴(kuò)增區(qū)段由第一和第二互補(bǔ)鏈的5’端界定；b.在該反應(yīng)混合物中加入第一擴(kuò)增引物，該第一擴(kuò)增引物含有與第一互補(bǔ)鏈的5’端互補(bǔ)的序列，并含有不與第一互補(bǔ)鏈的5’端互補(bǔ)的附加序列；c.在該反應(yīng)混合物中加入第二擴(kuò)增引物，該第二擴(kuò)增引物含有與靶序列的第二鏈的5’端互補(bǔ)的序列；d.在該反應(yīng)混合物中加入一種DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸，并置于適合擴(kuò)增引物在聚合酶的催化下延伸的條件下；e.通過該反應(yīng)混合物在第一溫度和第二溫度間的循環(huán)來使待擴(kuò)增區(qū)段擴(kuò)增和延伸，其中第一溫度能夠使靶核酸序列的互補(bǔ)鏈解鏈，第二溫度能夠使擴(kuò)增引物與互補(bǔ)鏈的5’端退火，并能夠使擴(kuò)增引物在聚合酶的催化下延伸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，通過提供一種含有第一擴(kuò)增引物附加序列的互補(bǔ)序列的第三擴(kuò)增引物來使該待擴(kuò)增區(qū)段進(jìn)一步擴(kuò)增和延伸，該第三擴(kuò)增引物可進(jìn)一步含有不與第一擴(kuò)增引物或待擴(kuò)增區(qū)段互補(bǔ)的增補(bǔ)序列。
9.權(quán)利要求7的方法，其中第一擴(kuò)增引物的附加序列位于第一擴(kuò)增引物中與靶序列互補(bǔ)的序列的5’端。
10.權(quán)利要求8的方法，其中第三擴(kuò)增引物的增補(bǔ)序列位于第三擴(kuò)增引物中與第二擴(kuò)增引物的附加序列互補(bǔ)的序列的5’端。
11.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括利用凝膠電泳方法將該樣品庫中的序列根據(jù)長度加以分離的步驟。
12.權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二靶核酸序列存在于不同的核酸分子上。
13.權(quán)利要求1的方法，其中的反應(yīng)混合物進(jìn)一步含有a.一種附加靶核酸序列；以及b.一種能夠與附加靶序列雜交的附加標(biāo)記測序引物，該附加測序引物的長度至少與引物延伸產(chǎn)物樣品庫中最長的序列相同。
14.權(quán)利要求1的方法，其中至少有一種測序引物為加尾測序引物，該加尾測序引物含有與靶核酸序列不同源的一部分序列。
15.權(quán)利要求14的方法，其中加尾測序引物的非同源部分位于其能夠與靶序列雜交的加尾測序引物區(qū)段的5’端。
16.一種核酸測序方法，該方法包括a.在一種反應(yīng)混合物中加入第一和第二靶核酸序列；b.在該反應(yīng)混合物中加入可分別與第一和第二靶核酸序列雜交的第一和第二標(biāo)記測序引物，當(dāng)?shù)谝粶y序引物延伸并包含了第一靶序列時(shí)，第二測序引物在凝膠電泳上的表觀分子量至少與該第一測序引物的表觀分子量相同；c.在該反應(yīng)混合物中加入一種DNA聚合酶、脫氧核糖核苷和一種鏈終止脫氧核糖核苷酸，并置于使第一和第二靶序列可通過第一和第二測序引物在聚合酶作用下的分別延伸而復(fù)制的條件下，其中，鏈終止核苷酸在聚合酶作用下的定期摻入可使聚合作用終止，從而產(chǎn)生長度各異的一組引物延伸產(chǎn)物樣品，該樣品庫中由第二測序引物開始的各引物延伸產(chǎn)物在凝膠電泳上的表觀分子量至少等于由第一測序引物開始的引物延伸產(chǎn)物的表觀分子量；以及d.檢測該樣品中引物延伸產(chǎn)物的表觀分子量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種方法,用于在一種反應(yīng)混合物中對含有第一和第二靶核酸序列的核酸進(jìn)行測序。該靶序列可存在于相同的或不同的核酸分子上。提供的第一和第二標(biāo)記測序引物可分別與第一和第二靶核酸序列雜交。第二測序引物的長度應(yīng)至少與第一測序引物加第一靶序列的總長度相同。由第二測序引物開始的各測序引物延伸產(chǎn)物要長于樣品中由第一測序引物開始的引物延伸產(chǎn)物。一旦測序反應(yīng)完成,即可通過已知方法,如凝膠電泳法,對該樣品中引物延伸產(chǎn)物的長度進(jìn)行檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1329673SQ99813946
公開日2002年1月2日 申請日期1999年10月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月1日
發(fā)明者T·維納雅加莫爾蒂 申請人:生物－特性診斷公司